Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Monet eri geneettisiä muutoksia havaitaan syöpäsoluja. Yksittäiset syöpä geenit näyttää pistemutaatioita, kuten pohja muutokset, lisäykset ja poistot, jotka käynnistävät ja edistävät syövän kasvua ja leviämistä. Somaattisen hypermutaatio on tehokas mekanismi sukupolven eri mutaatioita. Se oli osoitettu aiemmin, että somaattisia hypermutatoitavuuden proto-onkogeenien voi aiheuttaa lymfooma.

Menetelmät /Principal Havainnot

Olemme löytäneet poikkeuksellisen suuri esiintyvyys yksipohjaiseksi mutaatioita tuumorisuppressorigeeneille

RASSF1

ja

RBSP3 (CTDSPL) B molemmat sijaitsevat 3p21.3 alueilla, LUCA ja AP20 vastaavasti. Nämä alueet sisältävät klustereita tuumorisuppressorigeeneille mukana useita syövän tyyppejä, kuten keuhko-, munuais-, rinta-, kohdunkaulan, pään ja kaulan, nenänielun, eturauhas- ja muut syövät. Kaikkiaan 144 sekvensoitiin

RASSF1A

klooneja (eksonit 1-2), 129 mutaatioita havaittiin (mutaatio taajuus, MF = 0,23 100 bp) ja 98 kloonia eksonien 3-5 löysimme 146 mutaatiot (MF = 0,29). 85 sekvensoitu

RBSP3

klooneja, 89 mutaatioita havaittiin (MF = 0,10). Mutaatiot eivät sytidiiniin-spesifinen, koska voisi odottaa muutoksia tuottama AID /APOBEC perhe entsyymejä, ja esiintyi

de novo

aikana solujen lisääntymistä. Ne vähentynyt kyky vastaavien siirtogeenien tukahduttaa solujen ja kasvaimen kasvu mikä merkitsee toiminnan menetys. Nämä korkeat somaattisten mutaatioiden todettiin sekä syövän koepaloja ja syövän solulinjoissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä on ensimmäinen raportti korkeiden taajuuksien somaattisten mutaatioiden

RASSF1

ja

RBSP3

eri syövissä viittaa se voi aluskate mutaattorikannasta fenotyypin syövän. Somaattiset hypermutaatiot in tuumorisuppressorigeeneille mukana suurissa ihmisen maligniteettien tarjoavat uudenlaisen käsityksen syövän kehittymisessä, etenemiseen ja leviämiseen.

Citation: Kashuba VI, Pavlova TV, Grigorieva EV, Kutsenko A, Yenamandra SP, Li J, et al. (2009) Korkea mutability on tuumorisuppressorigeeneille

RASSF1

ja

RBSP3 (CTDSPL)

in Cancer. PLoS ONE 4 (5): e5231. doi: 10,1371 /journal.pone.0005231

Editor: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2008; Hyväksytty 18 maaliskuuta 2009; Julkaistu: toukokuu 29, 2009

Copyright: © 2009 Kashuba et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusmäärärahat Ruotsin Cancer Society, Ruotsin Research Council, Ruotsin Foundation for kansainvälistä tutkimus- ja Higher Education (työjakso), Ruotsin instituutti, Ruotsin kuninkaallinen tiedeakatemia, INTAS ja Karolinska Institute. A. K. haluaa kiittää Ruotsin tutkimusneuvoston varten Kohdeapuraha nuorille tutkijoille. EB tuettiin Venäjän perustutkimusrahaston (Grant 07-04-00097-a). IK ja MIL rahoitti Intramural tutkimusohjelma NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. VNS ja LLK tuettiin Venäjän perustutkimusrahaston ja opetus- ja Science (apurahaa tukea johtavien Venäjän tieteellisen koulut). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Olemme toteuttaneet kattavan poisto tutkimus 3p yli 400 keuhkosyövän, munuais-, rinta-, kohdunkaulan ja munasarjojen karsinoomien (suuret epiteelin syövät) käyttäen määritellyistä markkereita, jossa yhdistyvät perinteisen LOH kanssa kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (QPCR), vertailevat genomiset ja NotI microarray hybridisaatiot [1], [2], [3], [4], [5]. Havaitsimme kaksi useimmin vaikuttaa 3p21.3 alueilla, LUCA (keuhkosyöpä) klo sentromeerisen ja AP20 on telomeerisesti rajalla 3p21.3. Aberraatioita joko alueen havaittiin yli 90%: n tutkittu kasvaimia ikään kuin he satama monituumorisuppressori geenejä (APT) [5], [6], [7].

Yksi niistä on

RASSF1

geeni (Luca alue), joka voi esiintyä erilaisia ​​vaihtoehtoisia silmukointimuotoa (ainakin 7 eri isoformit). Tässä työssä tutkittiin tärkeimpiä

RASSF1A

, suurin silmukoinnin muodossa [8]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että menetys

RASSF1A

ilmentymistä tapahtuu, koska kasvaimen hankitun promoottorin DNA: n metylaation monissa eri syövissä. Esimerkiksi

RASSF1A

on vaiennetaan promoottori hypermetylaation yli 90% pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) ja selkeä solu munuaiskarsinoomia (RCC) ja noin 40% ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC ). Geeni voi tukahduttaa kasvua keuhkosyövän ja munuaissyövän viljelmässä ja kasvainten muodostumista hiirillä [6]. Lisäksi satunnaisesti missense mutaatioiden

RASSF1A

on raportoitu.

RASSF1A

koodaa 340 aminohappoa. Aminohapposekvenssi on

RASSF1A

sisältää ennustetusti diasyyliglyserolia (DAG) sitovan domeenin ja Ras yhdistys verkkotunnuksen. RASSF1A voi aiheuttaa solusyklin pidätyksen saamalla Rb-perheen solukierron tarkastuspiste [9]. Nämä ja muut tulokset viittaavat vahvasti siihen, että RASSF1A on tärkeä ihmisen tuumorisuppressoriproteiinia toimivat eri tasoilla syövän etenemisen [6].

Toinen geeni on

RBSP3

kutsutaan myös

HYA22

ja

CTDSPL

. Se esiintyy kahden liitos muodot (A, 265 aminohappoa ja B, 276 aminohappoa), joka kartta AP20 alue ja alue geenin perheen pieniä C-terminaalinen domeeni fosfataasit, jotka voivat ohjata RNA-polymeraasi II transkription koneet [10]. Geenin ilmentyminen oli huomattavasti vähentynyt useissa SCLC ja NSCLC solulinjoissa.

RBSP3

osoitti kasvun hidastuminen säänneltyjen siirtogeenien kulttuuriin ja tukahduttaminen kasvainten muodostumista SCID hiirillä. On osoitettu, että lyhytaikaisen ekspression sekä A- ja B-muotojen johti olennaisesti vähentämään fosforyloidun muodon RB-proteiinin oletettavasti johtaa lohkon solusyklin on G1 /S-rajan. Tämän jälkeen löytää geenin nimi muutettiin (RB-proteiini seriini fosfataasin kromosomista 3). Kaikki nämä ominaisuudet ovat sopusoinnussa klassisen ominaisuuksia APT.

Mielenkiintoista, sekä

RASSF1

ja

RBSP3

voisivat tehdä solusyklin pysähtymiseen: entinen estämällä sykliini D1 [ ,,,0],9] ja jälkimmäinen defosforyloimaan RB [10]. Tämä tukee oletusta, että APT näillä kahdella alueella voivat toimia synergistisesti [4], [5]. Lisäksi kaksi muuta APT näiltä alueilta voi aiheuttaa yhä mutaatio taajuuksilla kasvaimissa (

MLH1 myynnissä maassa AP20 ja

G21 /NPRL2 myynnissä maassa LUCA) [11], [12], [13].

on hyvin tunnettua, että syöpä on tulosta geneettisten ja epigeneettisten muutoksia ja pistemutaatioita on yksi tärkeimmistä mekanismeista syövän kehittymiseen [14], [15].

Aiemmin toiset ja me havainneet lukuisia yksipohjaiseksi muutosten /mutaatioiden

RASSF1A

että uskottiin olevan SNP [8], [16], [17]. Lisäksi

RBSP3

mutaatioita havaittiin kaikissa 14 kasvaimet eri alkuperää ilmentävien geeniä [10].

Tutkia ilmeisesti korkea mutaatio taajuuksilla TSG (t) näillä alueilla 3p21. 3, suoritimme laajan mutaation analyysi

RASSF1A

[18], [19] ja

RBSP3 /HYA22

[10] useissa syövissä. Tässä osoitamme, että poikkeuksellisen usein yhden emäksen mutaatiot esiintyvät näiden geenien useita syövän tyyppejä. Mutaatiot eivät sytidiiniin-spesifisiä kuten olisi odotettavissa, jos syntyy AID [20], tai muiden APOBEC perheen [21], [22] entsyymejä. Nämä mutaatiot eivät johdu RNA editointiin ja esiintyi

de novo

aikana solunjakautuminen.

Tulokset

Bioinformatics analyysi EST-cDNA-kloonien paljastaa suuren mutaation taajuus

RASSF1

ja

RBSP3

ensin tarkasteltiin julkisesti saatavilla EST-sekvenssin tiedot

RASSF1A

ja

RBSP3

(varten

RASSF1A

hakunumero NM_007182;

RBSP3A

, hakunumero AJ575644, ja

RBSP3B

, tulonumerolla AJ575645). Sekvenssit homologia kynnyksen alapuolella (katso materiaalit ja menetelmät) eli joka sisältää useita erillisiä epäsuhta on selityksin geenien ja tuntematon nukleotidin (N) ei otettu huomioon. Sekvenssit, lähelle loppua lukee myös ulkopuolelle. Tiedot esitetään taulukossa 1 osoittavat, että

RASSF1A

ja

RBSP3

geenit mutatoitiin erittäin korkeat hinnat. Sillä

RASSF1A

me katsotaan vain 17 kloonia (Mutaatiofrekvenssi 100 emäsparin, MF = 0,22). Kuusi niistä saatiin syöpäkudosten ja ne kaikki sisälsivät mutaatioita (MF = 0,42). Yksitoista sekvenssit olivat normaaleista kudoksista (neljä klooneja yksi mutaatio) ja MF = 0,1, eli mutaatio taajuudet olivat tilastollisesti merkitsevästi erilaisia ​​(p = 0,025).

Kahdeksankymmentä yksi prosentti

RBSP3

sekvenssit (63 out of 79) sisälsi mutaatioita /epäsuhta. MF

RBSP3

EST oli 0,63. Taas se oli paljon suurempi eristettyjen kloonien syöpään (MF = 1,05) kuin normaaleista kudoksista (MF = 0,45). Tämä ero oli myös merkittävä (P 0,001). Ero oli vieläkin selvempi mutaatioita muuttuviin aminohapposekvenssejä (MF 0,72 vs. 0,24) ja samanlaiset RASSF1A klooneja (MF 0,33 vs. 0,1).

Käytettävissä olevien (ja mutatoidun) EST-sekvenssit oli merkitsevästi suurempi molemmat

RASSF1A

ja

RBSP3

, mutta koska hyvin tiukat kriteerit monet jätettiin analyysin ulkopuolelle.

Mikä tärkeintä, olemme myös havainneet hypermutaatiot muissa eksonien

RASSF1A

, jaettu

RASSF1C

(äskettäin osoitettu olevan TSG eri kudosspesifisyys kuin

RASSF1A

, katso [23]. MF varten eksonit 3-6 oli 0,43 ja että mutaatiot muuttuvat aminohapot MF = 0,25, ja siksi

RASSF1C

myös hypermutated.

samanlainen bioinformatiikan analyysi tehtiin insuliinin geenin (333 emäsparia, täydellinen ORF). Ei mutaatioita havaittu yli 1000 sekvensoitiin kloonit eristettiin solulinjoista ja somaattisten kudosten. vuonna 20 käytettävissä

p16 /INK4a

(eksonit 1-3, 447 emäsparia) kloonit sekvensoitiin syöpään ja normaalit solut löysimme mitään mutaatioita ja 6 klooneja for

GPR14

(1170 bp) vain 1 mutaatio löytyi syöpäsoluja (MF = 0,01). Meidän kokeissa kuvattu alla (katso seuraava jakso ja jakso ”Eri mutaatioiden taajuuksia muiden geenien”) 31 sekvensoitiin

GPR14

klooneja ei mutaatioita havaittu, mikä osoittaa, että tämä mutaatio on melko harvinaista. Mutaatiofrekvenssi GPR14 oli tilastollisesti merkitsevästi erilainen verrattuna sekä että RASSF1A ja RBSP3 (P = 0,01).

Usein mutaatioita

RASSF1A

ihmisen karsinoomien, syöpä ja verta muodostavien solulinjoissa

aikana analyysi

RASSF1A

olemme eristäneet useita mutanttiklooneissa myös yksi kahden mutantti [16]. Tämä tiheä mutaatioiden oli yllättävää, koska varten

RASSF1A

ja muut ehdokas geenien AP20 ja LUCA alueilla mutaatio taajuudet raportoitiin olevan alhainen vailla [6], [19]. Samaan aikaan monet polymorfismien kirjattiin

RASSF1A

ja monissa tapauksissa ei ole selvää, oliko se todellinen yhden emäksen monimuotoisuus tai somaattinen mutaatio syöpäsoluissa koska ohjaus normaalit solut puuttuivat [8]. Mikä tärkeintä, kaikissa näissä tutkimuksissa yksijuosteisen konformaation (SSCP) ja suoralla sekvensoinnilla PCR tuotteista käytettiin. Sekoittumisen strooman verisuonten, lymfosyytit ja muut normaalit solut haitata mutaatiot näitä menetelmiä käyttäen (ks M /M). Kasvain heterogeenisyys aiheuttaa lisäongelmia tunnustaa mutaatioita. Siksi päätimme tutkia uudelleen mutaation tilan

RASSF1A

useita kasvaintyypeissä lukien ensisijainen kasvaimia ja syövän solulinjoissa. Ensimmäinen,

RASSF1A

cDNA eristettiin RCC biopsia (T356) ja ympäröivän yleensä etsii munuaisen peruskudoksen (N356). Useita cDNA-kloonit sekvensoitiin. Kuudessa kloonit on johdettu normaalista munuaisten parenchyma ei mutaatioita löydettiin. Kuitenkin seitsemän kloonia kasvainkudoksen, mutaatioita havaittiin kolme (P = 0,14). Kaikki olivat A-G vaihdot. Sulkea pois RNA editointi, genominen DNA samasta potilaasta eristettiin ja kaksi ensimmäistä eksonia (DAG domeenin)

RASSF1A

monistettiin PCR: llä. Useita klooneja johdettu normaalista ja kasvainkudoksen sitten sekvensoitiin: kaikki kuusi kloonia Tuumorinäytteiden osoitti mutaatioita samalla neljästätoista analysoitu kloonit normaalista kudoksesta vain yksi oli mutatoitunut (P 0,001). Havaitut mutaatiot cDNA kasvainsoluja ole syntynyt RNA muokkausta, koska mutaatiot havaittiin myös genomista DNA-tasolla. Normaalin solun saastuminen ja korkea ilmentyminen

RASSF1A

normaaleissa soluissa, verrattuna syöpäsolut, voi selittää eri suhdelukua mutatoitunut ja normaalin

RASSF1A

klooneja cDNA- ja genomi-DNA: ta. Yllättävin oli se, että lukuun ottamatta kaksi genomista kloonia Tuumorinäytteiden on deletoitu C asemassa 254 (Accession No. NM_007182), kaikki muut havaitut mutaatiot olivat eri asennoissa.

kontrollina meidän monistettu

GPR14

samasta potilaasta ja sekvensoitiin 10 kloonia syövän ja ympäröivästä normaalista kudoksesta. Ei mutaatioita löydettiin todistetaan korkea mutaatioaste on spesifinen

RASSF1A

geeni.

Voit tarkistaa, onko eri mutaatioita samassa kasvain johtunut kasvain heterogeenisuus tai jonkin muun mekanismin (t) olemme eristää ja sekvensoida

RASSF1A

kloonia (vain eksoni 1 ja 2, 391 bp) genomisesta DNA: sta neljän RCC solulinjoissa. Vuonna TK164 kaikki kolme ja KRC /Y (2 + 2) kaikki neljä sekvensoitiin kloonit sisälsivät mutaatioita. Vuonna TK10, joukossa 22 kloonit, 9 mutatoitiin. Tärkeää on, että suurin osa klooneista sisälsi erilaisia ​​mutaatioita. Ainoastaan ​​yksi klooni sekvensoitiin Caki1, ja se oli mutatoitunut.

myös sekvensoitiin tämä geeni genomisesta DNA: sta neljän lymfoidisolulinjojen (BL2 ja RAMOS ovat Burkittin solulinjoja, ja IARC171 ja MutuIII ovat lymfoblastisolulinjoissa) ja tulokset olivat hyvin samankaltaisia ​​kuin RCC solulinjoja (taulukko 2). Kaikkiaan joukossa 84 sekvensoitiin kloonit 55 mutaatiot, että useimmissa tapauksissa erosivat. MF

RASSF1A

näissä kokeissa oli välillä 0,14 ja 0,70.

Kaikissa lisäksi kokeissa analysoitiin genomista DNA (eksoni 1 ja 2

RASSF1A

ja koko

RBSP3

siirtogeenin Pete vektori), jos ei erityisesti mainittu.

Mutaatiot

RASSF1A

voidaan tuottaa

de novo

erottaa mahdollisuutta, että eri mutatoidut

RASSF1A

geenit mutatoitiin kerralla ( ”puhkeamisen mutaatioiden”) tai olivat jatkuvasti syntyy ajan myötä, suoritimme kokeita yhdellä soluja. Tässä kokeessa BL2-soluissa, (joka aiemmin osoitti korkeinta mutaation: 10 kloonia 25 mutaatioita), laimennettiin ja maljattiin kuoppiin, jonka odotettu taajuus 0,3 solua kuoppaa kohti. Kolme satunnaisesti valittu kuoppiin (nimetty BL2-cl.1, 2 ja 3), joka sisältää yhden soluja laajennettiin ja analysoitiin edelleen. DNA eristettiin näistä klooneista jälkeen 10 päivää (noin 10 rajapintoja, 10

3-soluja).

Tulokset olivat seuraavat: ja BL2-cl.1 viisi 10 sekvensoitiin kloonit mutatoitiin (mutaatio taajuus 100 emäsparin (MF), oli 0,14), ja BL2-cl.2, viisi 13 kloonia (MF = 0,15; kaksi kloonia sisälsivät T43T mutaatiot kodonissa muuttunut ACA ACG) ja BL2-cl.3, kolme 17 kloonia mutatoitunut (MF = 0,07; kaksi kloonia sisälsivät N70G mutaatioita). Kaikkiaan 16 yhden emäsparin mutaatiot havaittiin, olivat kaikki siirtymät ja vain viisi niistä osoitti mutatoitunut G tai C. Tämä koe osoittaa selvästi, että mutaatiot

RASSF1A

lokuksen voitaisiin tuottaa

de novo

aikana solujen lisääntymistä.

täydellinen lista 129 mutaatioiden (111 mutaatiot olivat erilaisia) löytyy eksonien 1 ja 2

RASSF1A

kaikissa kokeissa on esitetty taulukossa S1A. Katso myös taulukko 2 ja 3 ja kuva 1

. Kaikkiaan 144 kloonia sekvensoitiin (56,3 KB) ja keskimääräinen tiheys mutaatioiden oli 0,23 /100 bp transkriptoidaan sekvenssit ja 0,17 /100 bp koodaussekvenssit. Joukossa oli neljä nukleotidin muutoksia, jotka tapahtuivat ei-koodaavan 5 ’, kolme seis (roskaa) ja viisi kehyksenvaihdon (poistot) mutaatioita. Lopuista 127 mutaatioita, 82 olivat missense ja 35 synonyymejä.

kanta mutaatioiden havaittu

RASSF1A

ja

RBSP3

esitetään A ja B.. Esimerkkejä mutaatioista on esitetty C.

RASSF1A

vain mutaatioiden koodaavat sekvenssit eksonien 1 ja 2 on esitetty. Mutaatiot koko koodaavan osan RBSP3 näkyvät. Punainen ”X” merkitsee pysäyttää nonsensemutaatiota tai deleetioita. ”Z” tarkoittaa samaa mutaatiota.

RBSP3

myös hypermutated erilaisissa syövissä

aikana edellinen analyysit pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) solu line N417, kaksi RCC, yksi rintasyöpä (BC) ja kaksi munasarjakarsinooman (OC) koepaloja että kaikki ilmaistu

RBSP3

havaitsimme mutaatiot

RBSP3

cDNA kaikissa kuudessa tapauksessa [10 ; katso taulukko S2A].

testata, onko hypermutaatio ominaisuus on ominaista vain

RASSF1A

geeniä tai enemmän yleinen ilmiö, me analysoidaan samoin äskettäin tunnistettu useita tuumorisuppressorigeenin

RBSP3

sijaitsee AP20, 3p21.3 telomeerisesti alueella [10].

Käyttämällä RT-PCR: llä, cDNA eristettiin kaksi kutakin RCC, BC ja OC koepaloja ja SCLC solulinja N417. Useita klooneja sekvensoitiin. Tulokset, esitetty taulukossa S2A, taulukko 3 ja kuvio 1 B, osoitti, että lähes kaikki eristetyt kloonit kärsinyt mutaatioita. Kuten käänteistranskriptaasi käytetään RT-PCR on merkittävästi suurempi virhemäärä kuin muut polymeraaseja käytettiin PCR, yritimme toistamaan havaittu korkea mutaatio nopeuden perimän DNA tasolla, kuten tapauksessa, jossa

RASSF1A

. Valitettavasti se oli vaikea suorittaa tätä kokeilua genomiseen

RBSP3

johtuen suuresta koosta geenin (yli 120 kb), lukuisat pienet eksonit (ainakin 9), ja korkea GC-pitoisuus (maahan 100 % joillakin alueilla). Kuitenkin ongelma on ratkaistu käyttämällä kloonattiin

RBSP3

SCID-hiirissä.

RBSP3

paljasti korkeat mutability SCID-hiirissä genomi tasolla

SCLC solulinja ACC -LC5 ja RCC solulinja KRC /Y transfektoitiin

RBSP3A

ja

RBSP3B

silmukoinnin isomuotojen Pete vektorin ja vakaa solun kloonit eristettiin. Neljä näistä klooneista (AHA1 ja AHB1 ACC-LC5 ja KHA4 ja KHB9 varten KRC /Y) ympättiin SCID-hiirten (ks M /M).

Solukloonit KHA4 ja KHB9, jotka sisältävät

RBSP3A

tai

RBSP3B

kasvatettiin

in vitro

rinnan kasvaimia SCID-hiirissä. Sen jälkeen kun 8 viikkoa DNA eristettiin kasvatettiin kasvaimia ja solulinjoissa, ja

RBSP3A

ja

B

geenit monistettiin PCR: llä Pete vektorin ja kloonattiin. Jälleen useita kloonit sekvensoitiin ja kokeilun tuloksista on esitetty taulukossa 4 ja taulukossa S2B. Vain 30%

RBSP3

KHA4 ja KHB9 plasmidikloonien mutatoitiin

in vitro

, verrattuna 85%: mutatoituja klooneja jälkeen kasvua SCID-hiirissä. Tämä ero mukaan Fischerin testi on tilastollisesti merkitsevä (P 0,001).

Yhteenvetona in

RBSP3

kokeita tunnistimme 89 mutaatiot joista 79 oli erikseen erillisiä (katso taulukot S2A ja S2B). Keskimääräinen tiheys mutaatioiden oli 0,10 /100 emäsparia puhtaaksi sekvenssit. Tämä taajuus on yli 0,11 /100 bp koodaavat sekvenssit (katso taulukko 3 ja kuvio 1 B). Niistä seitsemän nukleotidin tapahtunut muutoksia ei-koodaavat alueet ja viisi oli lukukehyksen (deleetioita) mutaatioita. Jäljellä 77 mutaatiot, 68 oli missense ja 9 synonyymi.

Näin ollen mutaation taajuus oli 2,5 kertaa vähemmän kuin kaksi ensimmäistä eksonia

RASSF1A

(katso edellä). Merkittävä ero mutaatio taajuuksia voitaisiin antaa selvitys eroista nukleotidin koostumus geenit, tai se voi heijastaa luontainen eroja hypermutaatio hinnat geenien. Se voisi myös olla tärkeää, että

RBSP3

koko geeni sekvensoitiin kun taas

RASSF1A

vain sen 5 ’päähän.

RASSF1A

ja

RBSP3

monistettiin PCR: llä

E. coli

DNA ei näytä korkealla taajuudella mutaatioita

Olemme suorittaneet PCR-monistus

E. coli

sisältävä DNA plasmideja (eli kokonais-DNA eristettiin

E.coli

sisältävä sekoitus genomista ja plasmidi-DNA), jossa nämä kaksi geeniä. Kunkin geenin kymmenen ja neljä ng DNA: ta on käytetty. Valitettavasti alhaisempi määrä

E. coli

DNA ei tuota riittävästi PCR-tuotteiden edelleen kloonausta. Kymmenen kloonia, kussakin kokeessa sekvensoitiin ja mutaatioita ei havaittu. Nämä tulokset osoittavat, että havaittu hypermutaatioon nopeudella

RASSF1A

ja

RBSP3

ei voida selittää PCR polymeraasin virheitä.

Etsi perustaja mutaatioiden

RASSF1A

yhden solun klooneja

pääajatuksena tässä kokeessa oli seuraava. Jos mutaatio on peräisin soluun eikä putki

in vitro

sitten solupopulaation kasvanut yhdestä solusta joidenkin osa (riippuen määrä alleelien läsnä yksittäinen solu) on plasmidiklooneille tulisi sisältää sama (eli perustaja) mutaatio. Suorittamaan tätä kokeilua me eristetty 15 yksisoluisia KRC /Y klooneja kuten kuvattu kohdassa ”Mutaatiot syntyy de novo”. Tässä tapauksessa me kasvoi solut kolme viikkoa saadakseen lisää DNA ja tuottaa enemmän mutatoitunut klooneja. KRC /Y-soluja käytettiin sen sijaan, BL2-soluissa, koska se oli helpompi havaita, että meillä on yksi solu hyvin. Emme kuitenkaan tietenkään voi sulkea pois, että joitakin 15 valitun kuopat oli enemmän kuin yhden solun.

RASSF1A

eksonit 3-5 testattiin tässä kokeessa (katso M /M), koska ne olivat helpommin eristyksissä kuin eksonit 1 ja 2 ja sisälsi enemmän sekvenssi-informaation (516 nt vs. 391 nt). Lisäksi mukaan EST-sekvenssin tietoja tässä osassa

RASSF1A

on korkeampi MF. Kustakin PCR-reaktion 10 plasmidia kloonit valittiin, ja DNA eristettiin. Kuitenkin, koska eri teknisten ongelmien (ei tai uudelleen insertti, huonoa DNA: n tai sekvensointi jne) on yleensä vain kuusi-seitsemän plasmidia kloonia analysoitiin edelleen. Täysin 98 plasmidi sekvensoitiin (taulukko 5). Yksi perustaja mutaatio havaittiin kaikissa solukloonien ja 46 (47%) plasmidiklooneille. Se oli muutos A-G (nt26735, hakunumero AC002481) juuri rajalla intronin 2 ja eksonin 3. Tämä mutaatio tuhosi akseptorisilmukointikohtien sivuston AG /G ja siten inaktivoida geeni. Koska tämä perustaja mutaatio ilmestyi kaikissa yksisoluklooneista todennäköisesti se sai alkunsa ennen kuin aloitimme tekemään tämän kokeilun. Neljäkymmentä muut perustaja mutaatioiden spesifisiä jokaisen solun klooni havaittiin myös (katso taulukko 5 ja taulukko S1B). Mielenkiintoista yhdessä tapauksessa oli mahdollista rakentaa puun, joka näyttää miten perustaja mutaatioita kertynyt. Aluksi se oli vain yksi mutaatio kuin kaksi ja sitten vielä itsenäisestä mutaatiosta (kuvio 2).

synonyymi mutaatio Pro122Pro aiheutti nukleotidin muutos ATC → AAC. Mutaatio GTC → GTA ei myöskään aiheuta mitään aminohapon muutos (Val174Val).

Eri mutaatio taajuuksia muiden geenien

Samanlaisia ​​sekvensointi kokeet suoritettiin insuliinin ja albumiini eristetyn geenin KRC /Y solulinja (ks M /M). Toisin kuin

RASSF1A

ja

RBSP3

tulokset, ainoastaan ​​yksi 21 sekvensoitiin insuliinin genomisten kloonien (999 bp, mukaan lukien täydellinen ORF) ja yksi 19 albumiinin cDNA-kloonien (700 bp, eksonit 12-15 ) mutatoitiin (MF molemmat geenit oli alle 0,01). Kuitenkin molemmissa tapauksissa, emme voi sulkea pois mahdollisuutta polymorfismien. Lisäksi kaksi geenejä testattiin mutaatioiden genomista DNA: ta.

GPR14

(G-proteiiniin kytketty reseptori 14, 1018 bp) ja transkription elongaatiotekijä A (SII)

TCEA1

(1066 bp), amplifioitiin PCR-menetelmällä (ks M /M) DNA: sta KRC /Y-soluja ja 11 kloonien kunkin geenin sekvensoitiin. Kaikki kloonit sisälsivät normaalia kopiota geenistä. Ei mutaatioita löydettiin muissa 3p21.3 kandidaattigeenit:

BLU

(15 kloonia sekvensoitiin),

101F6

(6 kloonia),

PL6

(6 kloonia) jälkeen KRC /Y stabiileja klooneja, jotka sisältävät näitä geenejä ympättiin SCID-hiiriin. Lisäksi sillä jo muuntunut mut

FUS1

(10 kloonia) ja mut

P53

(6 kloonia) ilman ylimääräisiä mutaatioita havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

Mutaatiot

RASSF1A

,

RBSP3A

ja

RBSP3B

eivät luo AID tai APOBEC liittyvien mekanismien

äskettäin on osoitettu, että aktivointi aiheuttama sytidiinideaminaasin ( AID) vastaa somaattisten hypermutaatiot aktivoiduissa B-soluissa. Lisäksi hypermutaatiot syntyy tämän entsyymin onkogeenien voi aiheuttaa pahanlaatuisten hematopoieettisten solujen [24]. Vaikka paljon on vielä oppinut tuesta, useat kohdesekvenssi motiivit mutaatioita on tunnistettu, eli WRC, RGYW ja DGYW aiheuttaen C /G mutaatioita. Suuri perhe APOBEC geenien myös osoittanut hiljattain muuttua geenien DNA-tasolla [21], [22], enimmäkseen suunnattu RCW motiivit aiheuttaa mutaatioita C /G. Siksi me tarkistetaan onko nämä motiivit oli suunnattu tai useammin

RASSF1

ja

RBSP3

sekvenssit verrattuna vakaa insuliinin geeni. Taajuus WRC motiivin 100 emäsparin vaihtelee 12,3-14,3 varten

RASSF1

ja

RBSP3

geenejä, ja insuliini geeni sisältää 16,5 tällaisia ​​motiiveja 100 emäsparin. Muut kuviot osoittivat samaa jakelu (myös suurempi insuliini geeni), vastaan ​​puhuu, joka edistää näiden entsyymien hypermutating

RASSF1

ja

RBSP3

geenejä kuvata tässä. Todellakin, APOBEC ja AID entsyymit aiheuttavat mutaatiot lähes yksinomaan C /G nukleotidia, vaikka havaitsimme mutaatiot kaikkien 4 nukleotidin (kuva 3). Tulokset itse asiassa osoittivat, että mutaatiot A /T olivat jopa useammin kuin C /G. Yritimme löytää tunnustusta motiivi. Tutkimme kaikki mutaatiot (kuvio 3A) tai osan mutaatioita (kuviot 3B ja 3C), mutta mitään selvää motiivia ole vielä tunnistettu.

RASSF1A

kaikki mutaatiot analysoitiin. Sillä

RBSP3

mutaatioita löydettiin GIT (

B

) ja ihmisen syövän (

C

) analysoitiin erikseen. Bubble kuvaajat kuvaavat osuus substituutiot esiintyvät kussakin neljässä emästä

RASSF1A

ja

RBSP3

, riippuen etäisyydestä mutatoidun nukleotidisekvenssin (nro 0). N, mikä tahansa nukleotidi; B = C, G tai T; D = A, G tai T; S = G tai C; V = A, C tai G; W = A tai T.

Lisää tutkimuksia tarvitaan ratkaisemaan tätä kysymystä tämä kuvio voi olla erilainen normaalissa ja syöpäsolujen ja voi olla riippuvainen nukleotidin koostumuksesta geenin. Nämä pienet erot kuvioita voisi peittää tunnustamista motiivi.

RASSF1A

ja

RBSP3

mutanttia RCC koepala ja keuhkosyövän solulinjaa ovat merkittävästi vähentäneet kasvua estävä aktiivisuus

Testasimme yksi

RASSF1A

geeni, eristetty RCC koepala, joka sisälsi kaksi mutaatiota (Cys65Arg ja Val211Ala), kasvua inhibition soluviljelmässä olosuhteissa seuraavan transfektiolla KRC /Y ja eturauhassyövän LNCaP . In KRC /Y-solujen mutatoitunut geeni oli merkittävästi vähentynyt kasvun hidastuminen aktiivisuutta (kuvio 4A), kun taas LNCaP se oli lähes olematon tukahduttava aktiivisuus (sama kuin tyhjän vektorin, katso [16], [17]).

. Kasvu Pysyvästi transformoitujen KRC /Y RCC solujen villityypin ja mutantti

RASSF1A

(Cys65Arg ja Val211Ala) ilman doksisykliiniä (geeni on päällä) esitetään A. Päivänä 6 määrä solujen paino

RASSF1A

oli 3 x 10

5 ja solujen määrä mutantti

RASSF1A

oli 5 x 10

5 (1,7 kertaa enemmän kuin paino). Päivänä 10, määrä solujen paino

RASSF1A

oli 6 x 10

5 ja solujen määrä mutantti

RASSF1A

oli 1,8 x 10

6 (3 kertaa yli painosta). Vaikutus ilmentymisen villityypin ja mutantti

RBSP3A

ja

RBSP3B

pesäkkeiden muodostumisen tehokkuus KRC /Y soluissa esitetään B. Mutantit eristettiin N417 SCLC solulinja (His139Tyr) , munasarjojen Tuumorinäytteiden T4 (kolme mutaatiota: Asn31Asp, Pro79Ser ja Glu87Lys) ja KRC /Y solulinja (kolme mutaatiota: Lys35Met, Asp103Gly ja Leu181Pro). Määrä blastisidiinia-resistenttejä pesäkkeitä verrattuna tyhjään Pete olivat: 90%, mutantti N417, 15% mutantti T4 biopsia ja 25% mutantti KRC /Y. Pesäkkeiden lukumäärä varten wtRBSP3A olivat 5-10% verrattuna Pete pesäkkeitä.

Toisessa kokeessa käytimme

RBSP3

klooneja eristettiin N417 SCLC solulinjan His139Tyr mutaatio . Jälleen merkittävä lasku kasvua suppressoriaktiivisuutta havaittiin (kuva 4B) .Clearly, ei kaikkia mutaatioita löydy tässä tutkimuksessa olisi inaktivoimiseksi

RBSP3

ja

RASSF1

geenejä, ja tämä voi olla erityisen totta mutantit eristettiin normaaleista soluista joista jotkut voivat olla polymorfismit. Todellakin, eri mutantteja

RBSP3

oli merkittävästi erilainen kasvun hidastuminen aktiivisuutta (kuvio 4B).

Johtopäätökset

Järjestämällä 327

RASSF1A

ja

RBSP3

klooneja, havaitsimme 364 mutaatiot taajuuksilla saavuttaa 0,70 per 100 emäsparin. Mielenkiintoista monet kloonit sisälsivät yli 1 mutaatioita (katso taulukko S3A, B, C). Vain yksi SNP havaittiin

RASSF1A

kymmenen kloonia (exon1α – AAG → CAG, K21Q), ja se on jätetty pois luettelosta mutaatioiden [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi? locusId = 11186]. Ei SNP löytyivät RBSP3 sekvenssit.

taajuus mutaatioiden muistutti muita raportoitu tapauksia somaattisten hypermutaatiot löytyy Rho /TTF, MYC ja BCL6 suuren solulymfooma (MF oli 0,12 varten MYC 0,69 for BCL6). Kuitenkin se oli huomattavasti alhaisempi kuin immunoglobuliinigeenien (12,7 mutaatiota 100 emäsparin, katso [25]. Kuitenkin ensimmäistä kertaa löysimme korkealla taajuudella somaattisten mutaatioiden eri kudoksissa, kuten ei-hematopoeettisten ja tuumorisuppressorigeeneille toisin kuin edellisessä raportit jossa onkogeenit tutkittiin.

Kuten AccuPrime ™

Pfx

DNA-polymeraasi luo maksimaalisesti yksi virhe 3 x 10

6 emäsparin, tuloksemme osoittivat, että havaitut hypermutaatio taajuudet kokeissa voitaisiin ei voida selittää virheellinen suorituskykyä polymeraasien. meidän kokeilla SCID kun AccuPrime ™

Pfx

DNA-polymeraasia ja 25 sykliä käytettiin, 85%

RBSP3

kloonit sisälsivät mutaatioita.

aikana kasvun saman solulinjojen

in vitro

, 30%

RBSP3

klooneja (myös 25 kierrosta ja AccuPrime ™

Pfx

DNA-polymeraasi) oli mutantti .

kokeissa

RASSF1A

(391 bp ensimmäisen ja toisen eksonin), 65% klooneista sisälsi mutaatioita (kokeet normaalit solut eivät sisälly).