Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta parantunut tuloksia viimeisten 30 vuoden aikana alle puolet naisista diagnosoitu epiteelin munasarjasyöpä elää viisi vuotta kuin niiden diagnoosi. Vaikka tyypillisesti käsitellään yksittäisenä sairaus, epiteelin munasarjasyöpä sisältää useita erillisiä histologinen alatyyppi, kuten papillaarinen serous ja endomet- karsinoomat. Puuttumaan onko morfologiset erot nähdään näissä karsinoomat edustavat erityispiirteitä molekyylitasolla analysoimme DNA metylaatiovyöhykkeiden 11 papillaarisen vakavien kasvaimia, 9 endomet- munasarjakasvainten, 4 normaali munanjohdin näytteet ja 6 normaalia kohdun limakalvon kudoksissa, plus 8 normaali munanjohdin ja 4 serous näytteitä TCGA. Vertailun sisällä endomet- alatyypin lisäsimme 6 ensisijainen kohdun endomet- kasvaimia ja 5 endomet- etäpesäkkeiden kohtu munasarja-. Tiedot saatiin 27578 CpG dinukleotideissä esiintyvät tai lähellä promoottorialueet 14495 geenejä. Havaitsimme 36 paikkoihin, joissa on merkittävä nousu tai pienennyksen metylaatio vertailuissa vakavien kasvainten ja normaali munanjohdin näytteitä. Lisäksi valvomattoman kasaustekniikoiden sovellettiin kaikkiin näytteisiin kolme suurta profiilit käsittävät enimmäkseen normaali näytteitä, vakavien kasvaimia, ja endomet- kasvaimet mukaan lukien munasarja-, kohtu- ja metastaattisen alkuperää. Klusterijärjestelyssä analyysi tunnistettu 60 erilaisesti metyloituja sivustojen välillä serous ryhmän ja normaalin ryhmä. Liity sarja 25 serooseista kasvainten validoitu toistettavuus metylaatiovyöhykkeiden. Sen sijaan, 1000 geenit differentiaalisesti metyloituja välillä endomet- kasvainten ja normaali näytteitä. Tämä havainto on sopusoinnussa yleisen sääntelyn aiheutuva häiriö methylator fenotyypin. Kautta DNA: n metylaatio analyysit olemme tunnistaneet geenejä, joiden tiedetään rooleja munasarjasyöpäpotilailla etiologiassa, kun taas reitin analyyseihin biologinen oivalluksen roolia uusien geenien. Meidän toteaminen eroista vakavien ja endomet- munasarjojen kasvaimia osoittaa, että interventio strategioita voitaisiin kehittää erityisesti käsitellä alatyyppejä epiteelin munasarjasyöpä.

Citation: Kolbe DL, DeLoia JA, Porter-Gill P, Strange M, Petrykowska HM , Guirguis A, et al. (2012) Differential analyysi munasarjojen ja kohdun limakalvon Syöpä Tarkoittaa Methylator fenotyyppiin. PLoS ONE 7 (3): e32941. doi: 10,1371 /journal.pone.0032941

Editor: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 syyskuu 2011; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2012 Julkaistu: 05 maaliskuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Rahoitusta myönnetään The Intramural tutkimusohjelma National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health (LE ja LB), DoD GOC # 04-124 ja Magee Womens tutkimuslaitos /scaife Grant (TCK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on esiintyvyys 21500 tapausta vuodessa Yhdysvalloissa ja 204000 maailmanlaajuisesti, joiden arvioitu vuotuinen kuolleisuus 125.000 naisia. Ehto riveissä kuin 5

th suurin syy syöpään liittyvien kuolemien naisten Yhdysvalloissa; korkea kuolleisuus on seurausta oireeton luonteesta Taudin alkuvaiheessa ja puuttuminen luotettavan seulontatestinä. Suurin osa tapauksista (75%) diagnosoidaan myöhäisessä vaiheessa (III tai IV), jossa 5 vuoden pysyvyys on alle 30% [1].

Neljästä suuresta histopatologiset alatyyppiä, serous on yleisin, jonka jälkeen endomet-, mucinous ja selkeä solutyyppejä. Nämä alatyyppejä on erottuva geeniekspressioprofiilien [2] ja ne luokitellaan johtuen niiden morfologisia yhtäläisyyksiä normaali munanjohdin, kohdun limakalvo, endocervix ja kohdun limakalvon selkeä soluja, vastaavasti [3]. Samankaltaisuus kasvain alatyyppejä ja etäinen kudoksia on yhdenmukainen malleja, jotka ehdottavat migraatio esiasteleesioita erillisistä alkuperää, kuten munanjohtimen [4] tai mesothelial peittäminen vatsaonteloon [5]. Tästä syystä, munasarjojen vakavien kasvaimia (jotka muistuttavat Mullerian epiteeli) voidaan perustellusti verrattuna normaaliin munanjohdin (joka on peräisin Mullerian epiteelin). Kuitenkin munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) kerros [6] jakaa sen alkuperä kanssa epiteelin kohdun limakalvon (tunnetaan celomic epiteelin [7]) ja edelleen uskottavaa vaihtoehtoista selitystä ”de novo” kasvaimien syntyyn.

Like serous kasvaimia, alkuperä endomet- kasvaimia on kiistanalainen [8], ja esisolut on ehdotettu olevan peräisin kuin munasarjojen lähteistä, kuten endometrioosi [9]. Kasvaimista endomet- histopatologia diagnosoidaan sekä kohdun ja munasarjojen. He usein yhteistyössä esiintyä, koska synkroninen ensisijainen kasvaimia tai etäpesäkkeitä kohtu munasarja- [10]. Kun taas molekyylitason eroja on raportoitu dual primaarikasvaimia, etäpesäkkeitä ovat kloonaamalla identtisiä [11].

Geenien ilmentyminen tutkimukset ovariokasvainten määrä havaita syöpää profiileihin ovat tuottaneet vaatimattomia menestys ja rajallinen toistettavuus [12], [13], [14], [15]. Kuitenkin mutaatiotutkimukset profilointi tutkimukset ovat tuottaneet enemmän johdonmukaisia ​​tuloksia, jotka osoittavat, että sekä vakavien ja endomet- kasvaimet ovat aggressiivisia, laadukkaat alatyyppejä [16], [17], [18] kanssa mutaatiot

TP53

geeni [19 ], [20], [21], vaikka niiden ilmeinen histologisia eroja [16], [17], [18]. Heikompilaatuinen alatyyppejä ovat yleisimpiä endomet- kasvaimissa, joissa mutaatiot pääasiassa esiintynyt

WNT

ja

PIK3CA

reittejä [2].

konsertti geenien ilmentyminen ja Mutaatioiden, rajata epigenome syöpäsoluja pitäisi paljastaa välisiä suhteita näytteitä korostavat yleisiä Embryologiset alkuperää, samanlainen histopatologiset tulokset, tai jaettu mutaatiotapahtumat. Ovarioiden, DNA: n metylaatio vaientaa ilmentymistä kriittisten geenien [22], [23], ja luo geneettinen haploinsufficiency [24], kun taas hypometylaatio muissa kohdissa mahdollistaa ilmentymisen yleensä vaiennettu geenejä. Todisteena periaatteessa paikkasidonnainen malleja DNA: n metylaatio äskettäin käytetään erottamaan neljä alatyyppiä munasarjan epiteelin syöpien, käyttäen yhteensä 1505 tavoite CpG loci [25], [26].

Oletimme, että DNA metylaatiovyöhykkeiden munasarjakasvaimia muistuttaisi soluja niiden otaksuttu kudoksesta peräisin olevan muutamia muutoksia, jotka edustavat liittyviä tapahtumia maligniteetti, joka ainutlaatuisesti edustavat kukin kasvain alatyypin. Lisäksi olemme myös arveltu, että kohdun ja munasarjojen endomet- kasvaimia kertoneet patogeeniset mekanismit, mikä on havaittavissa DNA metylaation. Vastatakseen näihin ideoita, tutkimme metyloinnin profiilit 27578 tavoite CpG sivustoja, jotka edustavat 14.495 geenien ihmisen genomin, käyttämällä DNA johdettu serous ja endomet- munasarjojen kasvaimia, normaali munanjohdin ja normaalin kohdun limakalvon, ja ensisijainen ja metastaattinen endomet- kohdun limakalvon kasvaimet. Tämä suuri aineisto analysoitiin käyttämällä valvottua analyysiä seurasi

de novo

tuotteiden luokittelu valvomattoman laskennallisen klusterointi. Parantaakseen vahvuus epigeneettiset profilointi tekniikka, olemme mukana raaka metylaatio tietoja vakavasta kasvaimista ja normaalista munanjohtimen saaduilla Cancer Genome Atlas (TCGA). Nämä näytteet analysoitiin käyttäen samaa metylaatio alustalle, ja suorittaa puolueeton tutkimuslaboratorioiden käyttää riippumattomia kasvain näytteitä.

Tulokset

Kokeellinen määritys ja suunnittelu

Analysoimme DNA metylaatiostatus genomista näytteiden avulla Illumina Infinium alustalla. DNA käsiteltiin bisulfiitin muuntaa metyloitumattomat sytosiinit urasiiliksi jättäen metyloituja sytosiineja ennallaan. Hybridisaatioreaktion on HumanMethylation27 Illumina BeadChip säädetty signaali ominaisia ​​metyloitu ja metyloitumaton todetaan, käyttäen Illumina single base extension määritysprotokollassa [27]. Ero hybridisaatio koettimien metyloidut ja metyloitumattomat kohdesivustot on taulukoidaan osa koko signaalin, joka vastasi metyloitu tilaan. Alkuperäisen näytteen joukko edusti eri kudosten ja kasvain tyypit sisältää normaalit munanjohdin, normaali kohdun limakalvon, munasarjojen papillaarinen vakavasta kohdunkaulan, munasarja- endomet- syöpä, ja primaarinen ja metastaattinen kohdun limakalvon endomet- karsinooma 42 potilasta (taulukko 1). Tekninen rinnakkaisnäytettä osoitti erittäin toistettavia tuloksia määritystä varten (kuva S1). Lisäksi olemme mukana tiedot samasta Illumina metylaation alustan 12 ylimääräisiä näytteitä julkista tietokantaa Cancer Genome Atlas hanke (TCGA). Tämä joukko koostui 8 kontrollinäytteitä (normaali munanjohdin) ja 4 kasvaimen näytettä (munasarjojen vakavasta), vaikutti yhdessä erässä näytteiden tutkitaan johdonmukainen koeolosuhteissa yhdeltä tietojen toimittaja.

Bulk metylaatio

arvioimiseksi brutto muutoksia verran metylaation, tutkimme yhteenlaskettu metylaatiotasoilla kaikista näytteistä. Pitoisuus-arvot on ilmoitettu osuus fluoresenssin johtuvat koetin metyloitu tila, 0 (DNA metyloitumaton) 1 (DNA metyloitu). Vertaamalla kaikki näytteet, valtaosa osoittivat johdonmukaisesti metylaatio profiileja. Koko genomin, kaikkein määritettiin kohdissa oli metylaatiotasoilla välillä 0 ja 0,2, pieniä määriä sivustoilta oli tasojen välillä 0,2 ja 0,8, ja hieman suurempi määrä oli tasoilla 0,8-1 (kuvio 1).

Taajuus metylaatio ollenkaan loci tietyn tason metylaation (alue 0 1). Jokainen biologinen näyte esittää yhtenä rivi; kaikki ei-metastasoituneen näytteitä piirrettiin. Vastaavasti paneelit vasemmalta oikealle sisältävät kaikki loci (N = 27561), X-kromosomin vain (N = 1038) tai kromosomin 10 vain (N = 1044).

Sen sijaan, ottaen huomioon ainoastaan X-kromosomi, yhden kopion hiljentäminen satunnaisilla X-inaktivaation odotettiin tuottaa metyloinnin taso 0,5. Havaittu osoittivat laaja piikki, 0,5 useimmille näytteille, vaikka kasvain näytteissä oli laajempi heterogeenisyyttä. Viisi serous kasvain näytteet osoittivat poikkeava profiili, jossa monet loci on metyloimatonta (ts metylaatio taso 0,2), mikä osoittaa joko kyetä ylläpitämään X-inaktivaation tai kopioida useita muutoksia suhteellisen ylittävät aktiivisen X [28]. Sen arvioimiseksi, onko tämä havaittu vaihtelu johtui yksinkertaisesti pieni määrä DNA-kohtien X-kromosomi, me katsotaan myös metylaatiotasoilla kromosomissa 10, joka oli samanlainen joukko koettimia. Kaavat kromosomi 10 muistuttivat kuvio kaikissa peittyvästi loci, joilla on korkea samankaltaisuus otoksesta toiseen.

Ohjattu analyysi

ensimmäinen tutkittava kasvain alatyyppejä (määritelty histopatologia) vastasi tiettyihin metylaatio profiileja. Kun sisällyttäminen TCGA näytteiden, 12 normaali munanjohdin näytteitä ja 16 munasarjojen serous kasvaimia tuottaneet riittävää tilastollista voimaa suoraa vertailua. Koettimet huono laadunvalvonta, laatu vaihteli säätimet, tai joka sijaitsee X tai Y-kromosomia ei katsottu (katso menetelmät). Käyttämällä Wilcoxonin summatun rank testi tunnistaa sivustoja, jotka johdonmukaisesti liittyvät ennen luokitusta, 36 oli merkitsevä p 0,05 toistuvassa-testaus korjaus (14 p 0,01, taulukko 2). Kolme geeniä tunnistettiin jäseniksi kanoninen koulutusjakson munasarjasyövän käytettäessä Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (taulukko 2; [29] [30] [31] [32]). Ohjattu analyysi munasarjojen endomet- kasvaimia vastaan ​​munanjohtimeen tai kohdun limakalvon valvontaa ei suoritettu koska pieniä määriä näytteitä.

valvomaton klustereiden

Vastatakseen onko muita näyte osastojen kanssa yhteinen molekyyli fenotyyppejä olemassa ja saada laajemman kuvan välisiä suhteita näytetyypeillä muutimme ilman valvontaa klustereiden. Hyödyntämällä täydellinen 31 primaarikasvaimen näytteitä ja 18 normaaleista kudoksista (ja ilman 5 metastaattisen käytetyt näytteet jälkianalyysi), me rajattu tämän analyysin antureista, jotka olivat 500, kun paremmuusjärjestykseen varianssi, on raportoinut Houseman et al. [33] vähentää dimensionaalisuus tietoja. Tulokset Useiden klusterointialgoritmeja lähentyneet saman tulkinnan erillisten fenotyyppisten ryhmien (kuva S2). K-means klusterointi ja osiointi käyttäen β-seoksen suunniteltu malli dataa tätä alustaa [33] sekä tuki voimakkaasti olemassaolo 3 ensisijainen ryhmien vastaavat karkeasti hallita tyyppisten näytteiden, serous kasvaimen tyypin näytteitä, ja endomet- näytteitä. Muita analyysi hierarkkinen klusterointi (useiden etäisyys mittareita ja nostolaitteen menetelmät) tuki voimakkaasti ohjaus-tyyppi ja kohdun limakalvon tyyppi klustereita, ja osoitti serous kasvain-tyyppinen näytteet olivat outgroup päässä kontrollinäytteistä, mutta oli ristiriidassa, onko näiden näytteiden muodostivat selvä alaryhmä (kuvio S2).

konsensus ryhmiä, kuten on esitetty kuviossa 2, on merkitty väripalkilla osoittamaan normaalin-tyyppi, vakavien-tyypin tai endomet–tyyppiä. Erityisesti kontrolliryhmä sisälsi normaalia munanjohtimen ja normaali kohdun limakalvo, mikä osoittaa yhtenäisen fenotyyppi poikki sekä kudosten sisällä sarja varustellun antureista. TCGA Näytteet ryhmittyneet niiden tunnistettu näyte tyyppejä, mikä vahvistaa toistettavuus ja tulosten luotettavuus, koska nämä kasvaimet saatiin ja luokitellaan eri toimielimissä. Poissulkeminen TCGA näytteitä analyysissä oli suhteellisen pieni vaikutus tuloksiin, jossa merkitty jako jäi väliin endomet- ja vakavien tai kontrollinäytteitä; kuitenkin vain heikko tuki pysyi alaosasto vakavien-tyypin kasvainten kontrollinäytteistä.

Heatmap of metylaatiotasoilla; sininen = 0,0, musta = 0,5, keltainen = 1,0. Tällä vasemmalle, edustava otos hierarkkinen klusterointi, ja väri estää antamalla yksimielisyys ryhmissä. Kuusi sarakkeet oikealla antaa näytteen ominaisuudet: numero; kasvain (T) tai normaali (N); paikalla munasarjojen (O), munanjohtimen (F), tai kohdun limakalvon (E); histologiaa vakavien (S) tai endomet- (O); arvosana (1-3; jossa käytetyt symbolit ovat ”-” varten normaalit ja ”NA” varten tietoja ei ole.) ja oikeassa reunassa, pisteiden julkisen TCGA tietoja. Viisi näytettä alareunassa ovat munasarjojen etäpesäkkeiden endometriumin endomet- kasvaimista, jätetty alustava arviointi ja klusterointi.

klusterin endomet- näytteistä, mukaan lukien kasvaimet sekä munasarjojen ja kohdun sivustoja, näyttää hämmästyttävän muuttunut profiili, metylaatiospesifisiin lukuisissa sivustoja, jotka ovat yleensä metyloimattoman CpG saaria, ja menetys metylaation sivustoja, jotka normaalisti metyloituja. Laajuus ja toistettavuus näistä muutoksista on vahvasti mieleen methylator fenotyyppien totesi muissa syövissä [34] [35]. Methylator fenotyyppi on aikaisemmin ehdotettu kohdun limakalvon endomet- karsinooma, joka perustuu metylaatio promoottorit muutaman kohdegeenien [36], mutta ei meidän tietomme mukaan ole kuvattu genomin tasolla tutkimuksen tai munasarjasyöpä.

Nämä tiedot vahvistavat oletusta, että endomet- tyyppi kasvaimia, joko munasarjojen tai kohdun sivustoja, osuus yhtäläisyyksiä molekyylitasolla. Edelleen käsitellä tätä päätelmää, analysoimme viisi munasarjojen etäpesäkkeitä johdetut kohdun limakalvon kasvaimia käyttäen sisäkkäisiä log-uskottavuusosamäärä. Tämä testi osoitettu johdonmukaisuus klustereiden kanssa ensisijaisen endomet- näytteet verrattuna yhdistettyyn serous kasvaimia ja valvontaa, ja toissijaisesti käytössä luokituksesta vakavien tai verrokkiryhmien tarvittaessa. Neljä viidestä näytteitä voimakkaasti tunnistettiin endomet–tyyppi, kun taas viides oli samanlainen kuin vertailunäytteet (näyte 54, kuvio 2). Viides näyte ei näy selvästi muuttunut alkaen metylaatio normaalin kohdun limakalvon kudos, mikä osoittaa, että suurin osa kasvain fenotyyppi ei ole universaali. Tämä harha voi edustaa harvinaista osastoimisesta endomet- kasvaimia, jotka johtuvat erilaisista taustalla oleva sairaus, mutta se ei edusta huonolaatuisen kasvain (kuva 2).

arviointi primaarikasvainten kaikkien histopathologies myös tunnistettu harvoin poikkeavia havaintoja. Esimerkkeinä mainittiin kohdun limakalvon endomet- näytteet 47 ja 49, jotka ryhmittyivät normaali kudosten ja osaltaan 15% näytteistä, joka osoitti ristiriitainen sijoittaminen suhteessa heille määrätyt histopatologia (luokka 1 ja luokka ei ole saatavilla, vastaavasti, kuvio 2). Neljä munasarjojen serous kasvaimia myös ryhmittyneet kanssa normaaleissa kudoksissa, jotka osoittavat hyvin vähän muutoksia metylaatio suhteessa kontrolleihin (asteet 2 ja 3). Koska fenotyyppinen samankaltaisuus näiden näytteiden normaaliin valvontaa, biologinen perustana tämän kasvaimen osajoukko edellyttää lisätutkimuksia. Lisäksi yksi munasarjojen endomet- näyte ryhmitetty vakavien kasvaimia (näyte 36, luokka 2), mikä viittaa joko harvinainen endomet- alatyypin aggressiivisemman, serous kaltainen profiilin, tai kirjoitusvirheet huonosti eriytetty näyte.

Differential analyysi klustereiden

Koska kolme ensisijaista ryhmittymien tarjoamat valvomatta klusterointi analyysi, halusimme tunnistamaan metyloinnin loci eniten ennustavia jäsenyyden tiettyyn luokkaan. Olemme toistaneet Wilcoxonin summatun rank-testiä käytetään valvotun analyysin jälkeen poistamalla huomioon 500 käyttämien anturien klusterointi. Verrattaessa serous-tyyppinen klusterin ohjaus–tyyppinen klusteri, 35 antureista pysyi merkitsevä p 0,01, kun tiukat Bonferroni korjauksen useita testejä ja 60 pysyi p 0,05 (taulukko 3). Tulokset osoittivat, että seos hyper- ja hypometylaatio kontrolleihin verrattuna (kuvio S3). IPA analyysi tunnistaa tunnettu biomarkkereita munasarjasyöpä keskuudessa tähän listaan ​​(kuviot S4 ja S5). Kaksi geeniä, jolle on tallennettu merkitystä DNA: n metylaatio havaittiin, kuten

DNMT3A

, DNA metyylitransferaasin geenin ja

RB1 ​​

.

APC

(beta-kateniinin reitti),

RBAK1

(an

RB1 ​​

vuorovaikutus kumppani),

MAPK15

ja

MAP2K2

kinaasit, ja histonideasetylaasi

HDAC1

olivat myös luettelossa (taulukko 3). Vaikka valvottu ja valvomatta analyysejä hyödynnetään eri vertailuryhmässä sarjaa, geeni luetteloihin 10 päällekkäisiä merkintöjä (taulukko 3).

Kun otetaan huomioon endomet–klusterin verrattuna kontrolliryhmään klusterin, että annettu määrä ja aste differentiaalisesti metyloitu sivustoja kasvoi yli kertaluokkaa. Esimerkiksi 954-koettimet olivat merkitseviä p 0,01. Pelkkä määrä hypermetyloitunut sivustojen ehdottaa taustalla viasta DNA: n metylaation polkuja, ja rajoittaa hyödyllisyys huomioon muuttunut metyloinnin yksittäisten geenien.

validointi ero metylaation

tutkia, meidän joukko 60 differentiaalisesti metyloitu sivustoja serous kasvaimissa oli toistettavissa, arvioimme metyloinnin 25 lisänäytteitä, jotka olivat riippumattomia alkuperäisen analyysin asetettu. Kaikki olivat kirjoitettu kuten munasarja- serous syöpä ja analysoitiin itsenäisesti (itsenäinen toteamista ja aika-analyysi) alkuperäisistä. Jokaisen päällä ja jokaiselle validointi näytteestä, olemme arvioineet metylointi muistuttaa enemmän normaaliin näytteeseen klusterin tai vakavien kasvainnäyte klusteri. 25 tuumorinäytteet, 4 muistutti läheisesti metylaatio normaalia näytettä, seitsemän muutettiin 21 tai enemmän 60 loci, ja 14 näytettä osoitti muuttaa kuvion 40 tai enemmän 60 loci (kuvio 3).

metylointi 60 loci käytettiin arvioimaan riippumaton sarja vakavasta kasvaimia. Kukin rivi edustaa yksittäistä näytettä; jokainen sarake vastaa yhtä aiemmin tunnistettu differentiaalisesti metyloitu sivustoja. Tyhjä ruutu tarkoittaa metylaation lähempänä valvonnan klusterin (ei välttämättä metyloimaton); Täytetyn musta laatikko osoittaa metylaatio lähempänä klusterin munasarjojen vakavasta kasvaimia. Näytteet tilataan useissa sivustoja, joilla metylaation muistuttaa vakavasta kasvain ryhmään.

arviointi julkaistu metylaation tapahtumien

analyysi ero metylaation keskittynyt muutoksiin, jotka on määritelty ominaisuuksia kunkin ryhmän ja ne jaetaan kaikkien tai lähes kaikki näytteet. Monet tärkeät muutokset metylaatiotila, aiemmin raportoitu kirjallisuudessa, on alhaisempi yleisyys ja ei suoraan tunnistaa lähestymistapamme. Kun arvioimme meidän näytteitä malleja tunnettujen metylaation, meidän tiedot olivat yhdenmukaiset julkaistun tuloksia. Esimerkiksi

BRCA1

oli hypermetyloitunut 2 16 (12,5%) munasarjan vakavasta näytteitä. Kasvain vaimennin

RASSF1A

ilmeni merkkejä täydellisen metylaation 11 kasvaimissa, sekä yhden kopion metylaation 4 enemmän (31% vakavasta, ja 60% endomet-). Nämä muutokset, ja toiset ovat todennäköisesti tärkeitä transformative tapahtumista, mutta on rajoitettu pienempiä osajoukkoja näytteitä.

Gene ontologia polku analysoi

sitoa näiden tulosten kirjallisuutta munasarjasyöpä, suoritimme geeni ontologian (GO) analyysi ja IPA analyysi differentiaalisesti metyloitua geenit klusteripohjaisen vertailun vakavien kasvainten vastaan ​​kontrollit. Geenit vastaavat metyloidut loci listalta tilastollisesti merkitsevä rikastamiseen GO termejä, joihin säätely solusyklin (taulukko 4). Top kaksi verkkoa tunnistaa IPA mukana ”Cell Cycle ja Solumorfologia” ja ”tulehdusreaktio” verkon tulokset 24 ja 23, tässä järjestyksessä. Verkko pisteet perustuu hypergeometrisen jakelu- ja lasketaan oikea-pyrstö Fisherin testiä, ymmärtää, että on olemassa 1 10

23 tai 10

24 todennäköisyys joko verkon peräisin olevat satunnainen lista geenien (taulukko 4, kuvio S4, S5). Erityisesti differentiaalisesti metyloitu geenit oli suuri läsnäolo näissä verkoissa, vuorovaikutuksessa tärkeitä geenejä munasarjakasvain kehittämiseen myös

AKT

,

PI3K

,

VEGF

, ja estrogeenireseptori.

keskustelu

Tämä työ on yksi suurimmista tutkimuksista metylaation käytetään useita normaaleja ja kasvaimen alatyyppejä gynekologiset syövät. Alussa tutki metylaatiostatuksen 27578 sivustoja 49 näytettä, myös normaali munanjohdin ja kohdun limakalvon, serous munasarjasyöpä, endomet- munasarjasyöpä, ensisijainen endomet- kohdun limakalvon syöpä, ja munasarjojen etäpesäke kohdun limakalvon syöpään. Riippumatta kasvain tai normaali tila, kaikki näytteet osoittivat samanlaisia ​​profiileja yleinen jakautuminen metyloitu sivustoja. Vaikka emme löytäneet maailmanlaajuinen muutoksia kohti hyper- tai hypometylaatio poikki määritetään näytteiden osajoukko näytteessä oli radikaalisti muuttunut metylaation X-kromosomi, sopusoinnussa menetys aktiivinen X-kromosomi, vahvistus jäljellä aktiivisen X, tai molemmat [28 ]. Esimerkkejä aneuploidian, mukaan lukien autosomeiksi, ovat yleisiä korkealaatuisesta serous munasarjasyövän ja ei suoraan varmistettu tämän analyysin, mutta vaikuttaa suhteellinen metylaatiotasoilla kussakin lokuksessa. Siksi poistimme kaikki antureista X-kromosomin meidän aineisto.

tiedot vahvistavat, että eri histologisia alatyyppejä ovat eri malleja metylaation. Lisäksi munasarjojen serous kasvaimia ovat lähempänä normaalin munasarjan ja kohdun limakalvon kudoksissa kuin munasarjojen tai kohdun limakalvon endomet- kasvaimia, jotka ovat erittäin lähellä toisiaan ja näyttää voimakkaasti ja johdonmukaisesti muutoksiin niiden metylaatio. Tämä tulos on yhdenmukainen methylator fenotyyppi ja suostumuksella malli munasarjojen endomet- kasvaimia, jotka johtuvat endometrioosi, jossa solut lopulta ovat peräisin kohdun linjaa. Endomet- kasvaimet munasarja ja kohtu osuus useita yhteisiä somaattiset mutaatiot [6], ja nämä tulokset tukevat samanlaista patogeeninen mekanismi. Merkityt erot metylaatio profiilien välillä histologisia alatyyppejä korostettaisiin kuvaavat kasvainten molekyylitasolla, jotta voidaan kehittää räätälöidyn hoitostrategioita.

tunnistamiseksi differentiaalisesti metyloitua loci käytimme tunnettuja merkkejä ja sokaissut (tieto- suunnattu) alaryhmiin. Tunnetut etiketit tunnistettu muutamia kymmeniä geenejä, joista osa on tunnettu rooleja munasarjasyöpä. Ottaen kuitenkin huomioon tiukat rimaa tilastollista merkittävyyttä testaus hyvin lukuisat asemat, huomasimme, että muutamia harha ryhmässä voi peittää tärkeää kuvioita. Ryhmittelemällä dataa puolueeton lähestymistapa, löysimme samanlainen metylaation keskuudessa normaalia näytettä ja jotkut kasvain harha, mikä osoittaa, että nykyinen histologinen alatyypitys strategiat voivat menettää tärkeitä molekyyli- eroja kasvaimia. Tämä kohta tukee myös metastaattisessa endomet- kasvaimissa, joka sisälsi myös Peränpitäjänä joka näytti normaalissa näytteessä sen metylaation. Meidän klustereiden lähestymistapa selkeästi joukko 500 geenejä, jotka voivat erottaa enemmistö vakavien näytteitä endomet- näytteistä ja normaalit kontrollit. Vaikka klusterointia oli erottuva kolmen pääluokkaa näytteitä, sen käyttö esti tilastollinen arviointi merkitys geenien määräaikaan. Kuitenkin lisääntynyt voima klustereiden 49 näytteiden tunnistettu ylimääräistä 60 lokuksen, jotka olivat riippumattomia klustereiden asettaa ja erilliset näytteet normaaliin tai vakavasta alatyyppejä kanssa tilastollista merkittävyyttä. Useat näistä geeneistä vastaavat verkot osallisena kehittämiseen munasarjasyöpä (kuviot S4 ja S5). Olemme tutkineet päällekkäisyyttä geeni luettelot tilastollisesti merkitsevä geenien tunnistettu valvottavan ja valvomatta lähestymistapoja ja löysi 10 geenit. On huomattava, että kinaasi

PDPK1

on PI3K signalointireitillä mukana serous munasarjasyöpä [37].

PDPK1

ja

PLEKHF1

jakaa pleckstrin homologiadomeeni, joka kykenee sitomaan inositolin polyfosfaatteja.

PARP3

on mukana DNA: n korjaukseen ja genomin vakauteen. Koska toistettavissa signaalin näistä geeneistä riippumatta menetelmän, voimme päätellä, että tuntemattomia geenejä tähän luetteloon vahvasti sekaantuneet munasarjojen kasvainten kehittymiseen ja vaativat Lisäkarakterisoiminen.

rajoitus meidän analyysi on, että emme seuloa kasvain DNA-geenin mutaatioiden tai varmistumaan geenin ekspressiotasot; siitä huolimatta, huomasimme, että

RB1 ​​

ja

RBAK

ovat differentiaalisesti denaturoidulla välillä papillaarinen serous ja normaali munanjohdin näytteitä.

RB1 ​​

äskettäin raportoinut TCGA olla mukana vakavien kasvain etiologiassa, mutaation kautta tai poistamisesta 67% kasvainten [38]. Osallistuminen

RB1 ​​

reitti on johdonmukainen samanaikainen RB1 ja Tp53 mutaatio hiirissä, joka simuloi ominaisuudet aggressiivinen vakavien munasarjojen syöpiä, mukaan lukien muodostuminen vatsaonteloon sekä etäpesäkkeiden [39]. Vaikka emme löytäneet merkittävää päällekkäisyyttä luettelon metyloitu geenien serous kasvaimissa julkaiseman TCGA, tämä ristiriita saattaa johtua menetelmäkysymyksistä. Esimerkiksi, emme rajoita geeniä luettelon ehdokkaille, joista tulee hypermetyloitunut ja löysi monta menettävät metylaatio. Lisäksi me tarvitaan, että pisteytys oltava kaikkien kasvaimia. TCGA rajat pisteytys alkuun 10% kasvaimista. Lisäksi emme rajoittuneet tuloksia geenejä, jotka tulevat äänieristys, koska metylointi on osoitettu aiheuttavan sekä positiivisia että negatiivisia sääntelyn lopputulosta [40].

analyysi metylaation profiilien munasarjojen ja kohdun limakalvon kasvaimet osoittaa arvoa kuvaavat kasvaimen molekyylitasolla. Methylator fenotyyppi ilmaisee erehdykseltä molekyyli toimintaa entsyymien säännellä DNA metylaatiotasoilla ja ehdottaa, että molekyyli toimii ylävirtaan kandidaattigeeneihin vastaa kaskadin johtavien tapahtumien kasvainten kehittymiseen. Tutkimukset maksasolukarsinoomassa on tunnistettu mutaatioita beeta-kateniinin geeni yhdessä sellaisen methylator fenotyyppi. Mutaatiot beeta-kateniinin ovat yleisiä myös kohdun limakalvon kasvaimet [1], ja ehdottaa jatkokokeilu arvioimiseksi suora suhde DNA-metylaation endomet- kasvaimia. Lisäksi terapeuttiset strategiat, joilla pyritään ehkäisemään laaja metylaatio (kuten 5-atsa-2′-deoksisytidiini) olisi arvioitava yhteydessä kasvainten kanssa methylator fenotyyppiin.

johdonmukaisuus metylaation profiilien huolimatta itsenäinen näyte valmistelu ja tiedonkeruu TCGA näytteitä, käytettiin vahvistamaan ja laajentaa tuloksia. Nämä tiedot osoittavat, että näyte-erän vaikutukset ovat vähäisiä eivätkä häiritse tietojen johdonmukaisuus. Tuloksemme antavat pohjan tulevaisuuden genomista ja geneettisiä analyysejä kohdun limakalvon ja vakavien kasvainten diagnostisia ja hoitoon sovelluksia. Erityisesti tuloksemme osoittavat, että metylaatio tasot serous kasvaimet ovat vähemmän yhdenmukaisia ​​kuin endomet- kasvaimia, mutta lisätä ja vähentää tavoitteellisesti riippuvan tavalla. Toisin endomet- kasvaimia osoittavat laajoja muutoksia, joita todennäköisesti liittyy yhteiseen alkupään mekanismi mennyt pieleen.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden kerääminen

munasarjojen, kohdun limakalvon ja munanjohtimen kudokset saadut Magee-Womens Hospital kudostenhankintaryhmällä Program (Pittsburgh, PA). Kudokset jäädytettiin nopeasti leikkauksen jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Genomi-DNA eristettiin käyttäen Puregene veren Kit (Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita. DNA laatu arvioitiin käyttämällä SmartSpec Plus spektrofotometrillä (BioRad, Hercules, CA).

Kohdun limakalvon normaali näytteet

Tissue toimittivat näytteet osuuskunnan Human Tissue Network, jonka rahoittaa National Cancer Institute. Näytteet ovat vaihdevuosien jälkeisestä yksilöiden atrofinen endometrium ja saatiin rutiini kohdunpoisto tai lantion resektio ei-kohdun limakalvon syöpiä. DNA eristettiin seuraavan protokollan Trizol reagenssia (Invitrogen).

käyttö Ihmisen aihe materiaalia hyväksyttiin University of Pittsburgh ja Office of ihmiskoe NIH.

TCGA data

TCGA tiedot ladattu aikaan tämän analyysin tiedoista portaali (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). Tiedot samasta erästä sisälsi verraton serous kasvaimia ja normaali munanjohdin näytteitä. Normals: TCGA-01-0639-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0631-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0642-11A-02D-0383-05, TCGA-01-0628- 11A-01D-0383-05, TCGA-01-0637-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0633-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0630-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0636-11A-01D-0383-05.