Krooninen sairaus

tiivistelmä

Developmental geenit vaiennetaan alkion kantasoluja kaksiarvoisella histoni-pohjainen chromatin merkki. On ehdotettu, että tämä merkki antaa myös taipumus poikkeavasta DNA promoottorin hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille (APT) syövässä. Me raportoimme tässä, että hiljentäminen huomattava osa näistä APT ihmisalkion ja aikuisen kantasoluja liittyy promoottori DNA hypermetylaation. Tuloksemme osoittavat rooli DNA: n metylaation valvonnassa geenin ilmentymisen ihmisen kantasolujen ja ehdottaa, että geenit tukahdutettu promoottori hypermetylaation kantasoluja

in vivo

, poikkeava prosessi syöpää voitaisiin ymmärtää vika perustamisesta metyloimaton promoottori erilaistumisen aikana, pikemminkin kuin epänormaali prosessi

de novo

hypermetylaation.

Citation: Calvanese V, Horrillo A, Hmadcha A, Suarez-Álvarez B, Fernandez AF Lara E, et al. (2008) Cancer Genes hypermetyloitunut ihmisalkion kantasoluja. PLoS ONE 3 (9): e3294. doi: 10,1371 /journal.pone.0003294

Toimittaja: Maarten M. S. van Lohuizen, Alankomaat Cancer Institute, Alankomaat

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2008; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2008; Julkaistu: 29 syyskuu 2008

Copyright: © 2008 Calvanese et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli ensisijaisesti tukea Euroopan unionin (LSHG-CT-2006-018739, ESTOOLS). Monivuotisen rahoittaa Espanjan Ramon Cajal ohjelman ja Health Department of Espanjan hallituksen (PI061267). Syövän Epigenetiikka ryhmä klo CNIO tukee Health (FIS01-04) ja opetus- ja tiedeministeri (I + D + I MCYT08-03, FU2004-02073 /BMC ja Consolider MEC09-05) osastot Espanjan hallituksen, Euroopan Grant TRANSFOG LSHC-CT-2004-503438, ja Espanjan Association syöpää vastaan ​​(AECC). VC on vastaanottaja Fellowship FPU Espanjan tutkimusohjelman. KLL ja BSA tukee Health Department of Espanjan hallituksen (PI051707). BACM tukee Consejería de Salud de la Andalusian (0029 ja 0030/2006 PM) ja Espanjan terveysministeriön PM (FIS PI070026). CB tukee kansainvälisen Jose Carreras Foundation vastaan ​​leukemia (EDThomas-05) ja ISCIII (FIS 3 + 3 sopimus). Institute of korjaavaan neurobiologian saanut lisärahoitusta DFG ja Hertie Foundation. BS, ABH ja anh tukee Fundación Progreso y Salud ja Instituto de Salud Carlos III-Red Española de Terapia Celularille (RD06 /0010/0025). PWA, NH ja HDM tukee myös MRC.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vuoden alkion kehityksen solut ovat aluksi totipotentit, mutta muutaman rajapintoja, alkaa menettää tehoa ja muuttuvat pluripotenttien solujen, lopulta tulossa terminaalisesti erilaistuneita somaattisia soluja. Progressiivinen häviön erilaistumisen aikana on perustavanlaatuinen vaikutuksia sairaus, koska elpyminen pluripotenttisuuden kautta ydinvoiman uudelleenohjelmoinnin on yksi suurimmista haasteista regeneratiivisen lääketieteen [1], ja koska häiriöitä kehitysprosessiin, joka synnyttää lopullisesti erilaistuneita somaattisten solujen sen vastaava esisolujen voi johtaa pahanlaatuisiksi [2].

erilaistuminen ihmisen alkion kantasolut (hESCs) vaatii tukahduttaminen transkriptiotekijöiden mukana ylläpitää pluripotenttisuus ja aktivointi kehittävän geenejä. Molemmat prosessit ohjataan erityisillä epigeneettiset mekanismit. Eräs esimerkki ensimmäinen tyyppi on promoottori hypermetylaation riippuvainen tukahduttaminen pluripotenttisuuden-ylläpitää geenejä, kuten Nanog ja Oct4 kantasolut erilaistuvat [3]. Toistaiseksi aktivointi kehityshäiriöitä geenien aikana kantasolujen erilaistumista DNA: n metylaatio on vähemmän perusteellisesti tutkittu. Sen sijaan nämä kehitykselliset geenit on raportoitu olevan samassa tukahdutettu tilassa aikana varhaisessa kehitysvaiheessa vuoksi perustaa erityinen kuvio histonimodifikaation, kutsutaan ”kaksivalenssinen verkkotunnuksia”, joka koostuu suuria alueita H3 lysiinin 27 metylaatio kätkeminen pienempien alueiden H3 lysiinin 4 metylaatio [4]. Tämä chromatin-tukahduttavaa tila välittyy Polycomb- proteiinien ryhmä [5], [6] ja sen uskotaan altistavan poikkeava promoottori hypermetylaation syövässä [7] – [9]. Havainto, että hoito hESCs kanssa demetyloiva lääkkeen 5′-atsa-2′-deoksisytidiini aiheuttaa sydämen erilaistumisen ja geenin uudelleenaktivointi [10] sai meidät harkitsemaan promoottori-DNA: n metylaatio voisi edistää perustamiseen ja ylläpitoon erityisten-geenin sorron hESCs . Toteen ja oletetun suhteen poikkeava promoottori hypermetylaation syövän, vertasimme promoottori DNA metylaatio paneelin 800 syöpään liittyvien geenien välillä hESCs ja erityyppisten lopullisesti erilaistuneita aikuisen kudoksissa ja syövän solulinjoissa.

tulokset

Promoottori DNA: n metylaation profiloinnin hESCs, normaali eriytetty kudoksiin ja syöpänäytteissä

Käytimme Illumina goldenGate metylointi Array © verrata DNA metylaatiostatuksen 1505 sekvenssit (vuodesta 807 geeneistä) in kahdeksan erillistä eristettyä hESCs linjat, 21 normaalin ihmisen ensisijainen kudokset (NPTs), joka vastaa kuutta normaalia kudosta tyypit (NTTS) ja 21 ihmisen syövän solulinjoissa (CCLS) (katso menetelmät). Geenit sisältyvät metylointi paneelit valittiin sen perusteella, mikä merkitys niillä solujen käyttäytymistä ja erilaistumista ja mukana geenit aiemmin raportoitu olevan differentiaalisesti metyloitua, sekä kasvainten synnyssä, onkogeenien ja geenit koodaavat tekijöitä solukierron tarkastuspisteen [ ,,,0],11]. Ensin valitaan autosomaalisista geenit (766) pois taulukot, jotta suljetaan DNA metylaatio riippuvan X-kromosomissa inaktivoitu geenejä. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, ilman valvontaa ryhmittely näytteistä käyttämällä pelkästään metylointi signaalit autosomaalisista geenien (1421 sekvenssit) sisältämät paneelit mahdollisti oikea luokittelu kunkin näytteen sen vastaavaan ryhmään (hESC, NPT tai CCL) (kuvio 1A, ja katso kuva S1 online täydentäviä tietoja tämän artikkelin), mikä vahvistaa, että kunkin ryhmän näytteitä on tietty DNA: n metylaatio allekirjoitus [11]. Tämän jälkeen olemme yrittäneet luokitella geenien array suhteessa niiden metylaation asema kolmenlaisia ​​analysoidun näytteen (hESC, CCL, ja NPT) (kuvio 1A, ja taulukot 1 ja S1). Olemme havainneet, että 65,31% (928/1421), että sekvenssit eivät usein hypermetyloitunut hESCs (array signal≤0.7 in≥25% (2/8) näytteistä), ja että puolet (464/928) oli usein hypermetyloitunut in CCLS (array signaali 0,7 in≥25% (6/21) näytteistä). Suurin osa näistä sekvensseistä (99,78%, 463/464) oli metyloimaton ainakin yksi NTTS analysoidaan (array signaalin 0,3 in≥1 /6 NTTS). Tämä havainto on yhdenmukainen sen kanssa, että geenit poikkeuksellisesti hypermetyloitunut syöpä (eli ei hypermetyloitunut normaaleissa kudoksissa) ei hypermetyloitunut hESCs [8]. Soitimme tämä ryhmä geenejä klassisen luokan syöpää hypermetyloitunut geenit (taulukot 1 ja S1).

(A) metylointi profiilit Luokan AI (350), A-II (94), BI (20), ja B-II (107) geenejä hESCs (8), normaali (21), ja syöpä (21) näytteet saadaan Illumina paneelit. Metylaatiotasot vaihtelevat täysin metyloitu (punainen) kokonaan metyloimatonta (valkoinen). Oikeanpuoleinen sarake näyttävät metylaatiostatuksen histoni H3 ja Polycomb- täyttöasteen samat geenit on saatu aikaisemmin julkaistuihin tietoihin [5], [12], [16]. Sininen, metylaation K4 ja K27; oranssi, metylaation K4 yksin; vihreä, ei metylaation K4 tai K27; musta, läsnäolo Polycomb- proteiinin SUZ12. (B) rikastus Polycomb- proteiinin SUZ12, kahdenarvoisen chromatin allekirjoituksen (K4 /K27) tai puuttuessa molemmat merkit (ei mitään) luokan A ja luokan B geenit (yläpaneeli) ja luokan I ja luokan II geenit (alempi paneeli) .

Merkittävästi, huomasimme, että 34.69% (493/1421) on sekvenssit usein hypermetyloitunut hESCs (array signaali 0,7 in≥25% (2/8) näytteistä ). Useimmat näistä (79,72%, 393/493) on usein myös hypermetyloitunut CCLS (array signaali 0,7 in≥25% (6/21)) näytteistä). Jälleen monet heistä (32,32%, 127/393) oli metyloimaton ainakin yksi NTTS analysoidaan (array signaalin 0,3 in≥17% (1/6) NTTS) (kuvio 1, ja taulukot 1 ja S1). Toisin kuin luokan A syövän hypermetyloitunut geenejä, kuin tämä ryhmä myös usein hypermetyloitunut hESCs, niin ehdotetaan, että niitä voidaan pitää jäsenet eri luokan syövän metyloitu geenejä, jotka me olemme kutsutaan luokan B syövän hypermetyloitunut geenejä. Niistä 697 sekvenssit usein hypermetyloitunut syövän ja metyloitumaton ainakin yksi NTTS analysoitu, 444 (66,70%) ja 127 (18.22%) olivat vastaavasti luokiteltu luokan A ja B geenien (kuvio 1, ja taulukot 1 ja S1) , mikä osoittaa, vastoin odotuksia, että merkittävä osa (noin 20%) syövän metyloidut geenien myös usein hypermetyloitunut hESCs.

Kiehtovaa, eivät kaikki geenit usein hypermetyloitunut CCLS olivat täysin metyloitumattomia kaikissa NTTS analysoitiin (kuvio 1, ja taulukot 1 ja S1). Taajuus hypermetylaation normaaleissa kudoksissa on vain kohtalaisen tärkeä luokan klassisen syöpä metyloitu geenejä, koska useimmat niistä (78,83%; 350/444 sekvenssit) ovat metyloitumaton in NPTs. Toisaalta, ainoastaan ​​20-sekvenssit, jotka vastaavat luokan B geenit olivat metyloitumattomia kaikissa NTTS analysoitiin (taulukko 1). Kun geeni on metyloitu joissakin muttei kaikissa normaaleissa kudoksissa, metylointi on luultavasti mukana määrittely kudostyypille kehityksen aikana [12]. Kun geeni ei hypermetyloitunut hESCs, kudostyypin riippuva selektiivinen metylointi saa esiintyä. Sitä vastoin, kun geeni on usein hypermetyloitunut hESCs, se todennäköisesti tulee selektiivisesti demetyloidaan kun erilaistumisen perimästä mekanismi, joka pystyy edistämään kudoksen erittely. Toisaalta silloin, kun geeni on metyloitumaton kaikissa normaaleissa erilaistuneet solut ja hypermetyloitunut kantasoluja, menetys promoottorin metylaation että välttämättä tapahtuu eriyttäminen on todennäköisesti mukana alussa erilaistumisprosesseihin kuin kudosspesifikaatios- [12]. Näin ollen meidän on määritelty kaksi uutta alaluokkia sekä luokan A ja B syöpä metyloitu geenit: alaluokka I, sillä geenejä, jotka ovat aina metyloitumattomat normaaleissa kudoksissa, ja niissä II, geenejä, joita joskus metyloituja normaaleissa kudoksissa (kuvio 1, ja taulukot 1 ja S1). Prosenttiosuus luokan A-II ja B-II geenit on melko samanlainen (7,53% ja 6,61%) (taulukko 1). Kuitenkin prosenttiosuus geenien luokan A-I (24,63%) on paljon suurempi kuin luokan B-I (1,41%). Geenien nämä neljä ryhmää (A-I, A-II, B-I ja B-II), edustavat 58,2% kaikista sekvenssien läsnä metylaatio taulukot. Tarkastelemalla metylaatiostatuksen kolmen ryhmän näytteiden (hESCs, NPTs, ja CCLS) pystyimme klusterin suurin osa jäljellä olevista geenien array kahdeksaan lisäluokkia (taulukko 1), joka sisälsi muun muassa kahteen luokkaan geenit, jotka määrittelemme olevan konstitutiivisesti metyloituja (metyloitavaa hESCs, CCLS, ja kaikki NTTS; 11,19%) tai konstitutiivisesti metyloimatonta (metyloitumaton in hESCs, CCLS, ja kaikki NTTS; 28,43%) geenejä, tässä järjestyksessä. Siksi ehdotamme, että DNA: n metylaatio ei ole tärkeää geenien säätelystä näissä luokissa. Luokittelu geenit mukaan niiden metylaatio asema hESCs, CCLS, ja NTTS ja tulkinta biologisen roolin DNA: n metylaation geeneissä kussakin ryhmässä on esitetty taulukossa 1. Taulukko S1 luetellaan geenejä kussakin ryhmässä.

on tärkeää huomata tässä, että kaikki edellä kuvatut prosenttiosuudet viittaavat 807 geenit sisältyvät metylaatio paneelit, kun taas kokonaisosuuden geenien kussakin ryhmässä voi olla erilainen, jos koko genomin katsottiin. Luokittelun kynnys, että meidän käyttää identifioimaan geenejä, usein hypermetyloitunut hESCs (yli 70% promoottorin CpG: n metylaation yli 25% näytteistä), on se, joka on yleisesti käytetty määrittämään geenin on usein hypermetyloitunut syövän [13] . Sen arvioimiseksi, onko havaintomme päde supistava luokittelun kynnysarvot me tarkasteltiin uudelleen tietomme etsimään: i) sekvenssit hypermetyloitunut useimmissa hESCs analysoitu (array signaali 0,7 in≥75% (6/8) ja hESCs) ja, ii ) sekvenssit ”täysin metyloitu” joissakin hESCs analysoitiin (array signaalin 0,8) in≥25% (2/8) ja hESCs) (taulukko S2). Olemme havainneet, että 5 BI ja 84 B-II sekvenssit asennettu ensimmäisen kriteerin, ja 13 BI ja 86 B-II sekvenssit asennettu toiseen (taulukko S2), joka osoittaa, että johtopäätökset ovat edelleen voimassa, vaikka näillä tiukempien luokittelun kynnysarvot.

äskettäin on osoitettu, että pitkäaikainen

in vitro

kulttuuriin hESCs liittyy DNA: n metylaatio epävakauden [14], [15]. Sen arvioimiseksi, onko promoottori hypermetylaatiota meidän luokan B geenien liittyy

in vitro

kulttuuri prosessi, Vertasimme tietoja aiemmin julkaisemien Bibikova

et al.

[11]. Nämä kirjoittajat käyttivät GoldenGate metylaatio alustan vertailla metylaation tilan 1505 CpG sivustoja sisältämät taulukot kymmenen hESC linjat alhaisissa ja korkeissa kohtia. He havaitsivat, että vaikka metylaatiomuutokset ei esiintyä jakolukuun, tällaiset muutokset olivat pieniä verrattuna erot solutyyppien. He löysivät viisi geeniä (

ASCL2

,

GALR1

,

MEST

,

NPY,

ja

SLC5A8

) on johdonmukaisesti hypermetyloitunut kulun kanssa numero (kasvaa metylaatio tasolla 0,34 vähintään kahdella solulinjalla (20%)). Kolme näistä geeneistä (

ASCL2

,

NPY,

ja

SLC5A8

) kuuluvat luokan B-I, mutta kiinnostavaa, mikään ei ollut luokan B-II-geeni. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pitkäaikainen

in vitro

kulttuuri oli vastuussa vain promoottori hypermetylaatiota pieni osa (3/97, 3%) meidän luokan B geenejä, ja että vaikutus näytti olevan suurempi luokan BI geenejä.

Kuten edellä todettiin, se on ehdotettu, että kehitys- geenit vaiennetaan alkion kantasolujen Polycomb riippuvaisen kaksivalenssinen histoni-pohjainen chromatin mark [4], [5], jonka arvellaan altistavan poikkeavasta DNA promoottorin hypermetylaatiota APT syövässä [7] – [9]. Koska huomasimme, että osajoukko syövän metyloitu geenit voivat myös metyloitavaa hESCs halusimme tutkia suhdetta promoottorin hypermetylaation ja Polycomb- riippuva histonimodifikaation malli hESCs. Tätä varten Vertasimme metylaation tietoja luokan AI, A-II, BI, ja B-II: n geenien kanssa aiemmin raportoitu histonimodifikaation profiilin ja Polycomb- täyttöasteen saman geenien alkion kantasoluja [5], [12] , [16] (kuvio 1 ja taulukko S3). Yhdenmukainen aiemman raportin [9], huomasimme, että noin 35%: n sekvenssit usein hypermetyloitunut syövän ja metyloitumaton ainakin yksi NTTS analysoidaan sisälsi kromatiiniin tukahduttavaa tavaramerkkien niiden promoottorien (228-277 /697 kanna meK27, ja 236/697 sisälsi SUZ12). Kiinnostavaa, vertailemalla metylaatio tietoja kuin Mikkelsen

et al.

[16] havaitsimme, että suurin osa (96,4%) geenien kätkeminen meK27 sisälsi myös meK4 ja että vain noin 30%: n geenien usein hypermetyloitunut syövän esitteli kahdenarvoisen chromatin domain (meK4 /meK27) in hESCs (taulukko S3).

Kun vertasimme chromatin kuvioita ja Polycomb- käyttöaste luokan AI, A-II, BI, ja B-II-geenien löysimme kunkin ryhmän on oltava määrätty chromatin allekirjoituksen (p 0,00001). Luokan A geenit olivat rikastuneet Polycomb- ja kaksiarvoinen markkaa (47,5% ja 45,5-57,3% geenien, vastaavasti) kuin B-luokan geenejä (19,7% ja 21,4-32,7%, tässä järjestyksessä) (p 0,00001) (kuvio 1 B ja taulukossa S4 ). Rikastuminen kaksiarvoisen tavaramerkin luokan geenien johtuu pääasiassa alhaisesta tasosta tämän kromatiinin allekirjoituksen luokan B-II-geenit (taulukko S4). Todellakin, B-I geenit osoittavat samankaltaisia ​​tasoja meK4 /meK27 luokan A geenejä (taulukko S4) (p 0,00001). Mielenkiintoista, luokan II geenit olivat huomattavasti harvemmin käytössä Polycomb- proteiineja ja näytteille vähemmän kahdenarvoista markkaa (33,3% ja 26,5-38,8% geenien, vastaavasti) (p 0,00001) kuin luokan I geenit (45,7% ja 47,6-59,3 %, vastaavasti), (kuvio 1 B ja taulukko S4). Alempi taso kaksiarvoisen merkin luokkaan II geenit olivat pääasiassa vähäisen tasoa tämän kromatiinin allekirjoituksen luokan B-II-geenit (taulukko S4). Todellakin, luokka A-II-geenit olivat samalla tasolla meK4 /meK27 kuin I luokan geenien (taulukko S4) (p 0,00001).

APT tukahdutettu promoottori hypermetylaation vuonna hESCs

testata hypoteeseja muotoiltu perusteella saatujen tietojen Metylointilaitteistoon paneelit, olemme keskittäneet huomiomme neljään luokkaan B geenit (usein hypermetyloitunut syövän ja hESCs), jotka on aiemmin laajalti raportoitu olevan geenejä kasvain vaimennin ominaisuuksia ja jotka ovat usein hypermetyloitunut syövässä. Valitsimme kaksi (MGMT ja SLC5A8) [17], [18] päässä Class BI alaluokka (metyloitumaton kaikissa NTTS) ja kaksi (PYCARD ja RUNX3) [19], [20] luokasta B-II (metyloitumaton useissa of NTTS). Ensin palveluksessa bisulfiitti sekvensointi useiden kloonien määrätä täsmällisesti promoottori DNA metylaatiostatuksen näiden geenien hESCs ja normaaleissa kudoksissa (kuvio 2A, ja kuviot S2, S3, S4, S5). Kaikissa tapauksissa, bisulfiitti sekvensointi tiedot vahvistivat saadut tulokset taulukot ja osoitti, että hypermetylaation havaittu hESCs vaikuttaa suurin osa CpG: t ympäröivästä transkription alusta-site valitun geenejä. MGMT ja SLC5A8 (luokka BI) esitti tiheä promoottori hypermetylaation in hESCs mutta ei normaalissa eriytetty kudoksissa (kuvio 2A, ja kuviot S2, S3), kun taas luokan B-II-geenit usein hypermetyloitunut hESCs ja joskus normaaleissa kudoksissa (kuviot S4, S5 ). Ymmärtämään paremmin rooli promoottori hypermetylaatiota valitsemissamme APT vuonna hESCs ja NTTS, käytimme q-RT-PCR mitata niiden ilmentyminen molemmissa näytteessä ryhmissä (kuvio 2B, ja kuviot S2, S3, S4, S5). Huomasimme, että promoottori hypermetylaation oli aina liittyy geenin sorto, mutta sen puuttuminen somaattisten ensisijainen kudoksissa eivät välttämättä liity säätelyä geenin. Esimerkiksi, kun taas

SLC5A8

on hypometyloidut kaikissa normaaleissa kudoksissa analysoitiin (kuvio S3A, B), se oli vain yli-ilmentyy aivoissa, maksassa, ja paksusuolen (kuvio S3C).

(A ) bisulfiittimodifiointi genomista sekvensointia useista klooneja MGMT promoottorin hESCs (O3, H14), normaali ensisijainen kudokset (Pool lymfosyytit, normaali rinta) ja kaksi CCLS imukudosalkuperää ja rintojen alkuperää (U937 ja MDA-MB-231, tässä järjestyksessä). Musta, metyloitu CpG; valkoinen, metyloimattoman CpG; punainen, CpG ei ole läsnä. Vihreä palkki yläpuolella kaavio MGMT CpG-saarekkeen ilmaisee sijainnin käytetyn anturin Metylointilaitteistoon paneelit. (B) välinen suhde MGMT promoottorin hypermetylaation ja ilmaisun hESC, normaali, ja syöpä näytteitä. Ylempi paneeli esittää suhteellinen metylaatio signaali saadaan Metylointilaitteistoon paneelit ja alapaneeli ilmentymisen tasoja MGMT mRNA suhteessa GAPDH.

Menetys promoottorin hypermetylaation ja geeniaktivaatioon aikana

in vitro

erilaistumista hESCs

osoittavat lisäksi, että erilaistumista hESCs liittyy vähemmän DNA: n metylaatio on promoottorialueen tiettyjen geenien, me indusoi

in vitro

erilaistumista kantasoluja linjan Shef -1 kaksi solulinjoja (fibroblastin kaltaisia ​​soluja ja hermoston esiasteet) (kuvio 3A). Arvioimme sukujuuret spesifikaation avulla aiemmin julkaistu markkereita [21] (kuvio 3A, oikea paneelit) ja sitten käytetään metylaatio taulukot tunnistamaan geenejä, jotka tuli hypometyloidut erilaistumisen aikana. Huomasimme, että 12,98% (37/285) geenien hypermetyloitunut Shef-1 (joita ei metyloitavaa kaikkia NTTS analysoitiin) tulevat metyloimaton aikana

in vitro

erilaistumista. Näistä 12 geenit tulevat metyloimaton aikana hermosolun erilaistumista ja 25 aikana spontaanin erilaistumisen (taulukko S5). Kolme näistä geeneistä oli yhteinen molemmille ryhmille (kuvio 3B), ja kaksi niistä kuului B-II. On erityisen huomata, että vaikka 9/25 geenien metyloitumattomien aikana spontaanin erilaistumisen olivat luokan B-II, yksikään 12 geenien metyloitumattoman aikana hermosolun erilaistumista kuului tähän luokkaan.

(A) Vasemman- käytetyt kuvat, Shef-1 kantasolulinjaan (ylempi) ja sama solujen jälkeen hermo erilaistumisen (keskellä) ja spontaani erilaistumista fibroblastien kaltaisten solujen (alempi). Oikeanpuoleinen paneeli, joka näyttää suhteellisen mRNA-tasoja pluripotenttisuuden (Nanog, Oct4), neuroektodermaalinen (PAX6, NEUROD1), ja mesodermal (COL1A1, FN1) markkereita ennen ja jälkeen Shef-1 erilaistumista. (B) määrä sekvenssien hypometyloidut aikana Shef-1 hermo (punainen ympyrä) ja spontaani (sininen ympyrä) erilaistumista ja niiden päällekkäisyys luokan B-I ja luokan B-II-geenien (musta ympyrä). (C) bisulfiittimodifiointi genomisen sekvensoinnin useita klooneja DLC1 promoottorin Shef-1 kantasolulinjaan (ylempi) ja samoissa soluissa sen jälkeen, kun hermo erilaistumisen (keskellä) ja spontaani erilaistumista fibroblastin kaltaisia ​​soluja (alempi). Värikoodi on kuin kuvassa 2. (D) välinen suhde DLC1 promoottorin hypermetylaation ja ilmaisun aikana erilaistumisen Shef-1-soluissa. Ylempi paneeli esittää suhteellinen metylaatio signaali saadaan Metylointilaitteistoon paneelit ja alapaneeli ilmentymisen tasoja DLC1 mRNA suhteessa GAPDH.

Sen osoittamiseksi, että jotkut APT, jotka ovat usein hypermetyloitunut syövän ja hESCs voi menettää metylaatio erilaistumisen aikana, olemme keskittäneet huomiomme DLC1. Valitsimme tämän geenin, koska metylointi paneelit oli osoittanut, että se menetti promoottori metylaatio aikana spontaanin erilaistumisen Shef-1, ja koska sen tiedetään olevan TSG joka on usein hypermetyloitunut syöpä (kuva S6) [22], [23]. Bisulfiitti sekvensointi useista klooneista tukevat tulokset, jotka on saatu metylaation taulukot ja osoitti, että DLC1 promoottoria hypermetyloitunut Shef-1 ja tulee metyloitumaton aikana spontaanin, mutta ei hermo, erilaistumiseen (kuvio 3C). Q-RT-PCR kokeita DLC1 oli huonosti ilmaistu Shef-1-solulinjassa ja tuli yliekspressoitu aikana spontaani, mutta ei hermo, erilaistumiseen (kuvio 3D).

APT tukahdutettu promoottori hypermetylaation vuonna luuydinsiirtopotilailla esisolujen

on osoittanut, että jotkut syöpä geenit hypermetyloitunut ja tukahdutettu hESCs ja että he voivat menettää metylaatio aikana

in vitro

erilaistumiseen hESCs, tutkimme onko tämä ilmiö on rajoitettu alkionkehityksen tai päinvastoin , on epigeneettisestä mekanismi liittyy stemness asemaan riippumatta ontogenetic vaiheessa solun. Käytimme metylaatio taulukot geenien identifioimiseksi hypermetyloitunut CD34 + somaattisten kantasolujen esiasteita (kuvio S7) verrattuna perifeerisen veren lymfosyyttien ja neutrofiilien, kaksi aikuisten primäärisiä soluja, jotka ovat peräisin CD34 + hematopoieettisten esisolujen. Havaitsimme 362 merkittävästi hypermetyloitunut sekvenssit CD34 + soluja (array signaali 0,7) (taulukko S6). Suurin osa näistä sekvensseistä (92,27%, 334/362) on myös metyloitavaa hESCs ja useimmat olivat usein hypermetyloitunut CCLS (83,43%, 302/362) (kuvio 4A, ja taulukko S6). Nämä tulokset viittaavat siihen, että hypermetylaatiota syöpä geenit voivat esiintyä kantasoluja riippumatta ontogenetic vaiheen (alkio vs. aikuinen). Seuraavaksi me tunnistettu yhdeksän sekvenssit, joita on huomattavasti hypermetyloitunut CD34 + soluihin suhteessa perifeeristen valkosolujen, ja 16-sekvenssit, jotka hypermetyloitunut näissä progenitorisolujen suhteessa neutrofiilien (taulukko S7). Useimmat sekvenssit tunnistettu myös usein hypermetyloitunut hESCs (8/9 Lymfosyytti- ja 14/16 varten neutrofiilien) ja CCLS (6/9 Lymfosyytti- ja 13/16 varten neutrofiilien). Lisäksi ei ollut sekvenssit yhteisiä lymfosyyttien ja neutrofiilien ja suurin osa niistä joskus hypermetyloitunut NPTs. Mielenkiintoista, 28 näistä sekvensseistä aiemmin luokiteltu luokan B-II-geenit, kun taas yksikään niistä ei ollut luokasta BI (kuvio 4A).

(A) Vasemmanpuoleinen paneeli näyttää numerot-sekvenssit hypermetyloitunut somaattisten kantasolujen CD34 +, ja hypermetyloitunut hESCs ja CCLS. Huomaa, että useimmat sekvenssien hypermetyloitunut somaattisten kantasolujen myös hypermetyloitunut alkion kantasoluja. Oikeanpuoleinen paneeli esittää sekvenssien määrä hypermetyloitunut CD34 + soluissa (musta ympyrä) luokiteltu luokan B-II-geenien (punainen ympyrä). Sekvenssit, hypermetyloitunut CD34 + soluja koskaan luokiteltu luokan B-I geenit (sininen ympyrä). (B) bisulfiittimodifiointi genomisen sekvensoinnin useita klooneja AIM2 promoottorin Shef-1 ja I3 kantasolulinjoja (ylempi), CD34 + luuydinsiirtopotilailla progenitorit (keskellä), ja terminaalisesti erilaistuneita hematopoieettisia soluja (perifeeristen valkosolujen ja neutrofiilien). Värikoodi on kuin kuvassa 2. (C) välinen suhde

AIM2

ja

RUNX3

promoottori hypermetylaation ja ilmentymisen CD34 + somaattisten luuydinsiirtopotilailla esisolujen ja terminaalisesti erilaistuneita hematopoieettisia soluja (perifeeristen valkosolujen ja neutrofiilien ). Ylempi paneeli esittää suhteellinen metylaatio signaali saadaan Metylointilaitteistoon paneelit ja alapaneeli ilmentymisen tasot

AIM2

ja

RUNX3

mRNA: t suhteessa GAPDH.

Lopuksi, osoittaa, että jotkut syöpä metyloitu geenit myös usein metyloitavaa somaattisten progenitorisolujen kantasoluja ja että niiden metylaatio on tärkeää linjaa erittely, pidimme kaksi geeniä:

RUNX3

ja

AIM2

. Valitsimme

RUNX3

koska suostumuksella aiemmin julkaistu tietoja [24], meidän metylointi paneelit osoitti, suhteessa CD34 + soluihin,

RUNX3

oli hypometyloidut perifeerisissä lymfosyyteissä, mutta ei reuna-neutrofiilejä.

AIM2

valittiin, koska se oli aikaisemmin ajateltiin olevan TSG joka on usein hypermetyloitunut syöpä (kuva S8) [25] ja koska toisin kuin

RUNX3

, siitä tulee metyloitumattomia, erityisesti myelooisen sukuperää (kuvio 4B, C). Bisulfiitti sekvensointi tiedot vahvistivat saadut tulokset paneelit, jotka osoittavat, että CD34 + -solut ja reuna-lymfosyytit tiheään metyloitu promoottori

AIM2

geenin, kun taas reuna-neutrofiilit olivat lähes metyloimatonta (kuvio 4B). Voit selvittää rooli promoottorin hypermetylaatiota

AIM2

ja

RUNX3

hematopoieettisissa erilaistumiseen, käytimme q-RT-PCR analysoimaan ilmaisun ryhmissämme näytteiden (kuvio 4C). Huomasimme, että promoottori hypermetylaation oli aina liittynyt geenin sorrosta molemmat geenit ja että menetys promoottorin metylaation

AIM2

ja

RUNX3

reuna lymfosyyttien ja neutrofiilien vastaavasti liittyi niiden reexpression ( Kuva 4C).

keskustelu

Aberrant promoottori hypermetylaatiota APT ja erilaistumisen tekijöitä on keskeinen epigeneettiset muutos syöpää [26], [27]. Geenit saavien osalta muutoksia syöpä on raportoitu tukahdutettu vuonna hESCs perustamalla ”kahdenarvoisen kromatiinin verkkotunnuksia” koostuu aktivoimalla (H3 lysiinin 27 metylaatio) ja tukahduttaa (H3 lysiini 4 metylaatio) histonimerkkien joka pitää ne poised aktivointia mutta samaan aikaan, altistaa ne poikkeavan promoottorin hypermetylaatio aikuisten syövistä [7] – [9]. Tässä osoitamme, että toinen taso monimutkaisuus olemassa jolloin joidenkin geenien usein poikkeuksellisesti hypermetyloitunut syövän myös usein hypermetyloitunut hESCs. Tuloksemme viittaavat siihen, että, kuten aiemmin ehdotettiin hiiren solujen [28], promoottori DNA metylaatio voi olla tärkeä tekijä geenisäätelyn vuonna hESCs.

pohjalta metylaatiostatuksen vuonna hESCs me perustettiin kaksi luokkaa syöpä metyloitu geenit: A-luokan geenejä, jotka ovat usein metyloitumaton vuonna hESCs, ja luokan B geenejä, joita usein hypermetyloitunut hESCs. Kuten yllättäen havaittu, että huomattava osa geeneistä sisältyvät molemmissa ryhmissä olivat myös usein hypermetyloitunut normaaleissa eriytetty kudoksissa, loimme kaksi uutta alaluokkien syövän metyloitu geenien: alaluokan I, sillä geenejä, jotka ovat enimmäkseen metyloitumattomat normaaleissa kudoksissa, ja alaluokka II , geenejä, joita joskus hypermetyloitunut normaaleissa kudoksissa. Biologinen tulkinta poikkeavien metylaation A- ja B syöpää metyloitu geenejä ja niiden kahteen alaryhmään on täysin erilainen. Class A-I geenit usein hypermetyloitunut syöpä, mutta ei normaaleissa kudoksissa tai hESCs. Nämä geenit ole tarkoitus säädellä DNA: n metylaatio normaalin kehityksen ja siten hypermetylaation syövän tulisi aina tulkita poikkeava prosessi. Luokan A-II geenit usein metyloitavaa CCLS ja joskus normaaleissa kudoksissa, mutta harvoin hESCs. Metylointi nämä geenit voivat olla tärkeitä linjaa toiveiden ja tulisi harkita poikkeava syövän, kun se tapahtuu kasvaintyyppi jonka vastaavaan normaaliin kudokseen sitä ei hypermetyloitunut. Class BI geenit (pois lukien

ASCL2

,

NPY,

ja

SLC5A8

geenejä, joiden promoottori DNA hypermetylaation in hESC linjat voisi johtua

in vitro

kulttuuri prosessi [11]) ovat usein hypermetyloitunut hESCs ja syöpäsolujen linjat, mutta ei koskaan normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että menetys metylaation promoottorit näiden geenien voisi olla merkittävä vaikutus menetys pluripotenttisuuden kehityksen aikana. Heidän hypermetylaation syövän tulisi aina pidettävä täydellistä. Luokan B-II-geenit ovat usein hypermetyloitunut hESCs ja syöpäsoluja, mutta, koska ne ovat myös joskus metyloituja normaaleissa kudoksissa, niiden hypermetylaation syövässä voidaan harkita vain poikkeava kasvainten nimikkeet, joiden normaali kollegansa ne ovat täysin metyloitumaton. Tämän lisäksi se, että kaikki geenit usein hypermetyloitunut syövän olivat täysin metyloitumaton kaikissa normaaleissa kudoksissa analysoitiin on erittäin tärkeä havainto syövän epigenetiikka [26], koska promoottori hypermetylaatiota geenin tietyn kasvaimen tyyppi ei pitäisi olla