Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taustaa Tavoitteet

Nykyinen hoito tavoite kohti kehittyneitä kolorektaalisyövissä on keskittynyt pääasiassa kasvutekijän reseptorin (EGFR) signalointi, mutta sen additiivisten kemoterapiaan ovat vielä rajalliset. Disintegriini- ja metalloproteinaasi (ADAM) pilkkoo proheparin sitovan kasvutekijän kaltainen kasvutekijä (proHB-EGF). Ja liukoinen HB-EGF aktivoituu EGFR. Samanaikaisesti karboksiterminaalinen fragmentti proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translokoituu sisempään tumakalvoa, ja tämän jälkeen kohdistaa sääntelyä soluproliferaation sitoutumalla ydinaseiden promyelosyyttinen leukemia sinkkisormipolypeptidiin (PLZF) proteiini, transkription repressori , mikä aiheuttaa sen tumasta. Oletimme, että esto HB-EGF-CTF tumaansiirtymiseen voi olla uusi strategia estämisessä solujen lisääntymisen.

Methods

12

O-

tetradecanoylphorbor-13- asetaatti (TPA) käsiteltiin aktivoida ADAM. Yhdeksän tuhatta kemiallisia yhdisteitä seulottiin niiden tehoja estää sitoutumisen HB-EGF-CTF ja promyelosyyttinen leukemia sinkkisormipolypeptidiin (PLZF) kanssa Alphascreen järjestelmän. Saatu ehdokkaita käytettiin sitten estää sitoutumisen HB-EGF-CTF on PLZF paksusuolen syöpäsoluissa, HT29 ja HCT116. Solujen lisääntyminen tutkittiin kasvukäyrä määrityksessä. Solunsisäinen lokalisointi, ja yhdistyksen välillä HB-EGF-CTF ja PLZF, arvioitiin kanssa immunofluoresenssivärjäyksellä, ja immunosaostus ja Western blotting, vastaavasti. Vaikutukset saatu ehdokkaita EGFR fosforylaatioon ja tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF ja vienti PLZF aikana angiotensiini II type1 -reseptorin (AT1R) Knockdown tutkittiin myös.

Tulokset

Telmisartaani ja kandesartaani havaittiin olevan mahdollisia ehdokkaita. Telmisartaani esti TPA aiheuttamaa solujen lisääntymistä vahvempi kuin kandesartaani. Telmisartaani, mutta ei kandesartaani tukossa tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF, ja sitoutuminen HB-EGF-CTF on PLZF aikana TPA stimulaatiota. Sekä telmisartaanin ja kandesartaani eivät estäneet TPA aiheuttamaa EGFR fosforylaatiota, ja telmisartaani, mutta ei kandesartaani, esti TPA aiheuttamaa tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF jälkeen knockdovvn AT1R.

Johtopäätökset

esto HB-EGF-CTF tumaansiirtymiseen telmisartaanillla voi olla uusi strategia estämisessä solujen lisääntymisen.

Citation: Ozeki K, Tanida S, Morimoto C, Inoue Y, Mizoshita T, Tsukamoto H, et al . (2013) Telmisartaani Estää soluproliferaation esto Nuclear translokaatio ProHB-EGF C-terminaalista fragmenttia in koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (2): e56770. doi: 10,1371 /journal.pone.0056770

Editor: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kiina

vastaanotettu: 01 elokuu 2012; Hyväksytty: 15 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Ozeki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in tuki tieteelliseen tutkimukseen C (KAKENHI 22590704) päässä Japanin Society for Promotion of Science (JSPS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät ovat seuraavat Kilpaileminen kiinnostusta: Yoshimasa Inoue ja Eiji Nishiwaki työskentelee kaupallinen yhtiö Carna Biosciences Incorporation. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille. Kaikki tekijät ilmoittavat, että mitään taloudellista eturistiriitaa suhteessa artikkelin sisältöä.

Johdanto

peräsuolen syöpä on johtava kuolinsyy on maha-suolikanavan maligniteetti [1]. Tällä hetkellä hoidoista kohti kehittyneitä kolorektaalisyövissä ovat lähinnä suunnitteluun terapeuttisia aineita, jotka on suunnattu kasvutekijän reseptorin (EGFR), monoklonaalinen estävien vasta-aineiden kuten setuksimabin ja panitumumabipitoisuus [2], [3]. Lisäaine vaikutukset näiden terapeuttisten vasta-aineiden plus yhdistelmä kemoterapiaa korkealaatuisiin peräsuolen syövän saadaan, mutta rajoitettu, koska KRAS mutaatio poisti nämä vaikutukset [3], [4].

N-pään fragmentit EGFR ligandien kuten heparin- sitova epidermaalinen kasvutekijä kaltainen kasvutekijä (HB-EGF), joka pidetään mukana pääasiassa soluproliferaation koolonkarsinoomasoluissa sitoutuvat EGFR ja aiheuttaa sen fosforylaatio [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (GPCR) agonistit (esimerkiksi interleukiini-8) ja 12-

O

-tetradecanoylphorbol-13-asetaatti (TPA) indusoi EGFR transaktivaatiota kautta disintegriini- ja metalloproteinaasi (ADAM) – lohkaistaan ​​proHB-EGF [10], [11]. Karboksi- terminaalista fragmentit proHB-EGF (HB-EGF-CTF) tuottama ektodomeeni irtoaminen translokoituvat sisempään tumakalvoa myöhemmin uhata solujen jakautumisen sitoutumalla ydinaseiden promyelosyyttinen leukemia sinkkisormipolypeptidiin (PLZF) proteiini, transkription repressori , mikä aiheuttaa sen tumasta [12], [13]. Siksi esto tumaansiirtymiseen signalointia HB-EGF-CTF pidetään uuden strategian kehittymistä vastaan ​​peräsuolen syöpä. Ei ole kuitenkaan mitään todisteita terapeuttisia aineita, jotka nimenomaan estävät tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF ja sitoutumisen että PLZF.

Näin tavoitteet tässä tutkimuksessa olivat: i) näyttö voimakas kemiallinen yhdisteitä, jotka pystyvät inhiboimaan välistä vuorovaikutusta HB-EGF-CTF ja PLZF kautta GST-pull down määrityksessä, pintaplasmoniresonanssi (SPR) spektroskopiaa ja Alphascreen tekniikkaa, ii) vahvistaa estäviä vaikutuksia näiden voimakkaita yhdisteiden soluproliferaatioon, ja iii ) todistettava, että on tärkeää estämällä tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF paksusuolen syövän solujen lisääntymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

TPA ostettiin Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Anti-EGFR-polyklonaalista vasta-ainetta, anti-fosfotyrosiini monoklonaalinen vasta-aine (4G10) ja normaali IgG hankittiin Millipore (Bedford, MA, USA). EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori AG1478 ja anti-PLZF-vasta-aine hankittiin Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Candesartan saatiin Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Japani) ja telmisartaani oli eräänlainen lahjakas Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Saksa). Olmesartaanin ja losartaanin hankittiin Daiichi Sankyo Company Limited (Tokio, Japani) ja Merck Sharp Dohme (Whitehouse Station, NJ, USA), tässä järjestyksessä. Anti-HB-EGF-CTF polyklonaalista vasta-ainetta [12], ja metalloproteinaasi-inhibiittori, KB-R7785 [14], valmistettiin. Monoklonaalinen anti-FLAG M2-vasta-aineen ja peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori (PPAR) γ-antagonisti, GW9662 [15], [16], ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

plasmidivalmiste

plasmidi koodaa FLAG-merkitty PLZF muodostettiin subkloonaamalla FLAG-sekvenssin ja ihmisen PLZF cDNA pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmideja rekombinantti ilmentyminen FLAG-merkitty PLZF johdannaiset, GST-fuusioitu EGFR-ligandien-CTF, ja CFP (syaani fluoreseiini-proteiini) hännitetty PLZF valmistettiin [12]. Sinkkisormia (ZnF) 5-8, ja, EGFR-CTF kloonattiin pGEX6P-1 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Cell Culture

Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa, HT29 ja HCT116 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), viljeltiin McCoy’s5A (Sigma), Caco2 (American Type Culture Collection) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jossa on 20% naudan sikiön seerumia ( FBS). Ja SW480 (American Type Culture Collection) viljeltiin DMEM 10% FBS. HT1080 parit ja ihmisen keratinosyyttejä viljeltiin [12], [17].

GST Alasvetoköysi Pitoisuus

GST ja GST-fuusioitu proHB-EGF-CTF, GST transformoiva kasvutekijä α (TGF-α) -CTF, GST amfireguliini (AR) -CTF, ja GST epiregulin (EPR) -CTF valmistettiin [12]. Sitoutumisen jälkeen GST ja GST-EGFR-ligandien-CTF glutationia sefaroosihelmien, lysaatit sisältävät erilaisia ​​FLAG-leimatun PLZF johdannaiset inkuboitiin 20 ui helmiä 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen sitoutuneet proteiinit analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-FLAG-vasta.

pintaplasmoniresonanssilla (SPR) spektroskopia

BIA ydin S51 SPR System® (GE Terveydenhuolto) käytettiin laadullisesti ja määrällisesti analysoida vuorovaikutuksesta neljän immobilisoidun EGFR-ligandia CTFs (eli HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF, ja EPR-CTF) ja GST-Zn 5-8 PLZF, jotka olivat mitataan resonanssiyksikköinä (RU). Rekombinantti biotiini-EGFR- ligandia CTFs (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japani) on yksittäin immobilisoitiin (~1000 RU) kautta aminoryhmä kytkimen streptavidiini (SA) varmennettu pelimerkkejä. Eri pitoisuus GST-Zn5-8 lisättiin osaksi käynnissä HEPES-puskuria (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl: a, 0,005% Surfactant P20), virtausnopeudella 30 ul /min 2 minuutin ajan. Anturi hake dissosoitiin 30 s injektio 10 mM glysiini-HCI: ää, pH 1,5. Sensogrammien analysoitiin BIA arviointi ohjelmiston (versio 4.1; BIAcore). Tasapainodissosiaatiovakio vakiot ( ”sitova vakio” KD) kustakin reaktiosta laskettiin jakamalla dissosiationopeudet ( ”off rate” kd) yhdistyksen hinnat ( ”hyödyn määrää” ka) (eli Kd = kd /ka) .

kuvantaminen CFP-fuusioproteiinien ja kvantitointi Cellular fraktiot Nuclear Paikallinen CFP-PLZF

transfektoitiin HT1080-solujen, ja vakaa HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, HT1080 /AR, ja HT1080-/EPR-soluja viljeltiin 24 tunnin ajan ja sitten solut esikäsiteltiin 10 uM KB-R7785 seerumittomassa väliaineessa 30 min. Sitten soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa, jossa on 100 nM TPA 1 h. Solunosasijaintia kalastuspolitiikan fuusioproteiinia tutkitaan epifluoresenssimikroskoopilla (Eclipse TE3000, Nikon, Tokio, Japani) [12].

Alphascreen Analyysit

Alphascreen System® (PerkinElmer, Shelton, CT , USA) käytettiin kirjaston seulomiseen 9000 kemiallisia yhdisteitä (Carna Bioscience Inc., Kobe, Japan) cyclopaedically niiden tehokkuus estää vuorovaikutusta biotinyloidun-EGFR-ligandien-CTF ja GST-Zn5-8 on PLZF. 5 ui 1,25 ug /ml yhdistelmä-GST-ZnF5-8 inkuboitiin 2,5 ui 1,25 ug /ml biotiini-EGFR-ligandien-CTF 30 min, ja 2,5 ui anti-GST-vasta-ainetta (1,8 ug /ml), lisättiin yli 1 h. Sitten 5 ui streptavidiini-päällystetyt luovuttajan ja anti-GST-IgG konjugoitua akseptorin helmiä (01:01 seos) inkuboitiin 2 tunnin ajan pimeässä. Alphascreen signaalit (määrä sekunnissa) analysoitiin kanssa EnVision mikrolevynlukijalla (Perkin-Elmer). Määritykset tehtiin 23 ° C: ssa puskurissa, joka sisältää 25 mM HEPES, 1 mM MgCI

2, 20 mM NaCl, pH 7,4, 0,1% BSA: ta.

Cell Proliferation Assay (CCK-8 Kit Assay)

Cell Counting Kit8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) käytettiin määritettäessä solujen lisääntymisen. Lyhyesti, 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti viljeltiin 96-kuoppaisille viljelylevyille, jossa oli 10% FBS: ää 24 tunnin ajan. Sitten FBS korvattiin seerumittomalla väliaineella 72 h tai ilman 30 uM 12 ehdokkaan yhdisteitä ja telmisartaanin tai kandesartaani (0,3, 3 ja 30 uM), ja 30 uM GW9662 stimulaation aikana 100 nM TPA. 10 ui CCK-8 lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 2 tuntia. Optinen tiheys (OD) tutkittiin aallon pituus 450 nm.

Monitoring Single Cell kasvaimet

Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

2 solua per 10 cm lautasen päivänä 0 10% FBS normaaliin kasvualustaan. 24 h jälkeen (on day1), melko eristyksissä ja morfologisesti terveitä soluja merkitty faasikontrastimikroskopiaan. Väliaine korvattiin 5% FBS: ia (kontrolli) kanssa tai ilman 100 nM TPA, 10 uM KB-R7785, 100 nM AG1478, 30 uM telmisartaanin ja kandesartaani, ja 50 ng /ml yhdistelmä-DNA-HB-EGF ( Sigma). Väliaine vaihdettiin joka 48 h tuoreella kasvualustalla. Solujen morfologia ja laskee pisteytettiin 24 tunnin välein [18].

Immunofluoresenssimikroskopia

Solut, jotka muodostivat pesäkkeitä oli siirtynyt seerumittomassa elatusaineessa 48 h, ja sitten inkuboitiin 60 min 5 % FBS elatusaineessa tai ilman 10 uM KB-R7785, 100 nM AG1478, 50 ng /ml yhdistelmä-HB-EGF, 30 uM telmisartaanin, ja 30 uM kandesartaanin. Sen jälkeen soluja käsiteltiin 100 nM TPA: 90 min, ja sitten kiinteät etanolilla ja asetonilla. Sijainti solussa HB-EGF-CTF ja PLZF analysoitiin immunofluoresenssilla. Ensisijainen vasta-aineita HB-EGF-CTF tai PLZF käytettiin. Toissijainen vasta-aineet olivat Alexa Fluor 594 anti-kani-IgG: tä tai Alexa Fluor anti-hiiri-IgG (Invitrogen). Kuvat saatiin Eclipse 80i fluoresenssimikroskooppia (Nikon).

immunosaostus ja Western-blottaus

Solut on subkonfluenteista tilassa siirtyneiden seerumia 48 tuntia ja käsiteltiin TPA on ilmoitettu kertaa. Telmisartaania ja kandesartaani lisättiin soluihin 60 minuutin ajan, ennen ärsykkeisiin. Solut lyysattiin lyysipuskurilla, ja supernatantit kerättiin ja niitä inkuboitiin 1 ug ihmisen anti-EGFR tai anti-HB-EGF-CTF polyklonaalisia vasta-aineita 2 h 4 ° C: ssa end-over-end-kierto. Immunosaostaminen ja Western blotting suoritettiin [11]. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat 4G10 tai anti-PLZF, ja anti-HB-EGF-CTF. Toissijainen vasta-aineita käytettiin anti-hiiri-IgG HRP-kytketty tai anti-kani-lgG-HRP-kytketty vasta-aineita (Cell Signaling Technology). Membraanit kehitettiin ECL Western blotting tunnistusjärjestelmä (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Englanti).

vaimentaminen angiotensiini II tyypin 1 -reseptorin (AT1R) ja ADAM12

Solut transfektoitiin 30 uM of AT1R ja ryntäily siRNA (Santa Cruz, Delaware, CA, USA), ja 10 uM ADAM12 ja ryntäily siRNA (Invitrogen) käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen). 72 h kuluttua solut transfektoitiin, ilmaus AT1R ja ADAM12 (Santa Cruz Biotechnology) analysoitiin Western-blottauksella.

Tilastot

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Yksisuuntainen ANOVA ja Turkey-Kramerin monivertailu menettelyä testiä käytettiin määrittämään tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05).

Tulokset

Dual signalointireitit EGFR-fosforylaation ja HB-EGF C terminaalisia Fragment tumaansiirtymiseen aikana Cell Proliferation (Ote viitenro [19] ja Modified.) B

12-

O

-tetradecanoylphorbor-13-asetaatti (TPA) indusoi epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) transaktivaation kautta disintegriini- ja metalloproteinaasi (ADAM) – lohkaistiin proheparin sitova EGF: n kaltainen kasvutekijä (proHB-EGF) ja säätelee solujen lisääntymistä [10]. Samanaikaisesti karboksyyliterminaalisia fragmentteja (CTF) sekä proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translokoituvat sisempään tumakalvoa myöhemmin uhata solujen jakautumisen sitoutumalla ydinaseiden promyelosyyttinen leukemia sinkkisormipolypeptidiin (PLZF) proteiini, joka on transkription repressori, mikä aiheuttaa sen tumasta (kuvio. 1) [19].

Ote [19] ja muutettu. TPA indusoi ADAM -välitteisen pilkkomisen proHB-EGF, ja tuloksia ektodomeenia irtoaminen sen N-terminaalista fragmenttia ja sukupolven intrasellulaarisen C-terminaalista fragmenttia (CTF). Liukoinen HB-EGF sitoutuu EGFR ja sai aikaan nopean ohimenevä fosforylaatio EGFR. Tämä fosforylaatio johtaa transkription eri geenejä. Samaan aikaan HB-EGF-CTF kulkeutua tumaan, jossa se myöhemmin indusoi tumasta PLZF. Tämä johtaa siihen, että etenemistä solusyklin. Voimakkaan CYP estää tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF. P ilmaisee fosforylaation. Lyhenteet: EGFR; epidermaalisen kasvutekijän reseptori, TPA; 12-

O

-tetradecanoylphorbol-13-asetaatti, PKCδ; proteiinikinaasi Cδ, ADAM; disintegriini- ja metalloproteinaasi, HB-EGF; hepariinia sitovat EGF: n kaltainen kasvutekijä, CTF; C-terminaalista fragmenttia, MAPK; mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi, PLZF; promyelosyyttileukemian sinkki sormella.

Oletimme, että esto tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF saattaisi johtaa uusi strategia ehkäisyyn solujen lisääntymisen aikana paksusuolensyöpä kehitystä.

Kuitenkin tällä hetkellä ei ole näyttöä voimakkaiden ehdokkaiden että estettävä tumaansiirtymiseen signalointi HB-EGF-CTF.

CTF EGFR ligandien vuorovaikutuksessa erityisen osan PLZF (ZnF5-8) Käytimme HT1080 solu linjat koska HT1080-solut ilmentävät vähän endogeenista HB-EGF esiasteita, ja ne ovat hyödyllisiä analysoida sitoutumiskohtien välillä HB-EGF-CTF ja PLZF ja ydinvoiman vienti PLZF jälkeen yli-ilmentävät HB-EGF esiasteiden ja PLZF johdannaiset [12]. Ensin sertifioitu vuorovaikutusta sytoplasmadomeeneista EGFR-ligandien ja PLZF in HT1080-soluissa, jotka ilmentävät neljä proEGFR-ligandien ja PLZF ennen seulonta voimakas ehdokkaita. Ottaen huomioon, että PLZF coimmunoprecipitates vastaisella vasta-aineella CTF on proHB-EGF HT1080-solut yli-ilmentävät proHB-EGF: n ja FLAG-merkitty PLZF [12], joka on coimmunoprecipitation on PLZF suoritettiin vasta-aineita CTF neljän EGFR: n ligandien (HB-EGF , TGF-α, AR, EPR), in HT1080 soluissa. FLAG-merkitty täyspitkä PLZF-geeni transfektoitiin soluihin, jotka ilmensivät stabiilisti proHB-EGF, proTGF-α, proAR tai proEPR (Fig. 2A). PLZF ilmennettiin näissä soluissa (kuvio. 2B, kaista 1). Sen jälkeen, kun TPA stimulaatio 1 h, FLAG-merkitty PLZF-proteiinia, joka immunosaostettiin kukin vasta-aine tunnistettiin immunoblottauksella anti-FLAG-vasta-ainetta (kuvio 2B, kaista 2).

(A) Schema FLAG-merkittyä täyspitkä PLZF koostuu FLAG, BTB, Center ja yhdeksän ZnFs. (B) HT1080-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti pro-HB-EGF, pro-TGF-α, pro-AR ja pro-EPR transfektoitiin lyhytaikaisesti ilmentämisvektorilla, joka koodaa FLAG-merkitty PLZF. PLZF-proteiinin ilmentyminen solulysaateista (lane1), samoin kuin solut, joita käsiteltiin 100 nM TPA 1 h, ja tutkittiin anti-FLAG-vasta-aineita seuraavia immunosaostus anti-EGFR-ligandien-CTF-vasta-aineita (lane2) ja anti-kaniinin normaalilla IgG (lane3). (C) GST pull-down määrityksessä. Solulysaateista, joka sisältää FLAG-leimatun PLZF johdannaiset inkuboitiin GST (kaista 2), GST-HB-EGF-CTF (kaista 3), GST-TGF-α-CTF (lane4), GST-AR-CTF (kaista 5), ja GST-EPR-CTF (kaista 6) helmiä 2 tunnin ajan, ja sitoutuneet proteiinit havaittiin immunoblottauksella anti-FLAG-vasta-ainetta. (D) Schema FLAG-leimatun PLZF johdannaisia. Sitova ominaisuudet PLZF johdannaisia ​​GST-fused HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF ja EPR-CTF GST avattavassa määrityksessä, kuten yhteenvetona oikeaan kaistat kunkin rakenteen. Sitoutumisominaisuudet perustuvat arviointiin kaistan intensiteetin ovat suhteessa ohjauskaista ja merkitty ++ ( 50%), + (50-10%), ja – ( 10%).

Seuraavaksi määritettiin sitovat alueet PLZF jotta sytoplasmadomeeneista pro-EGFR ligandien HT1080 GST avattavassa määrityksessä. GST avattavasta testi osoitti vuorovaikutusta EGFR ligandia CTFs ja ZnF 5-8 PLZF. Kukin yhdistelmä-GST-fuusioitu CTF (GST-CTF) vedetään alas FLAG-leimatun PLZF yhtä solulysaateissa valmistettu HT1080 soluista, jotka ilmentävät FLAG-merkitty PLZF (Fig. 2C, paneeli 1). Tutkimme lisäksi sitoutuminen alueiden CTFs in PLZF. Erilaisia ​​FLAG-merkitty PLZF johdannaiset (Fig. 2D) valmistettiin ja inkuboitiin rekombinantti GST-EGFR ligandia CTFs. Koko sinkki sormi alue (ZnF1-9) ja ZnF5-8 purettiin yhtä GST-TGF-α-CTF, GST-AR-CTF ja GST-EPR-CTF sekä HB-EGF-CTF, mutta ei GST yksinään (Fig. 2C, levyt 3 ja 4). Yksikään neljästä GST-CTFs purettiin häviämämutantilla puuttuu sinkkisormipolypeptidiin alue (BTB + keskus) (Fig. 2C, paneeli 2). Sitten testataan onko deleetiomutanttien ZnF6-7 (PLZF: n /ΔZnF6-7) ja ZnF5-8 (PLZF /ΔZnF5-8) sitovat GST-CTFs. Poisto ZnF6-7 kumosi sitoutumisen PLZF GST-TGF-α-CTF ja GST-HB-EGF-CTF, mikä viittaa siihen, että TGF-α-CTF ja HB-EGF-CTF vuorovaikutuksessa PLZF kautta ZnF6-7. Sen sijaan, PLZF /ΔZF6-7 sitoutui heikosti GST-AR-CTF ja GST-EPR-CTF (Fig. 2C, paneeli 5). Lopuksi testasimme onko ZF5-8 on kriittinen alue vuorovaikutuksessa AR-CTF tai EPR-CTF. PLZF /ΔZnF5-8 sidottu yksikään GST-CTFs (Fig. 2C, paneeli 6). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ZnF5-8 alue on kriittinen välistä vuorovaikutusta PLZF ja CTFs.

Heikko sitoutumisaffiniteetin HB-EGF-CTF ja PLZF oli tärkeää Nuclear vienti PLZF

edelleen selventää, neljä CTFs suoraan vuorovaikutuksessa PLZF, olemme analysoineet välinen sitoutuminen CTFs ja rekombinantti GST-merkitty ZnF5-8 (GST-ZnF5-8) käyttäen SPR järjestelmää. GST-ZnF5-8 sidottu immobilisoituun biotiini-AR-CTF ja biotiini-EPR-CTF (Fig. 3A), jonka pitoisuus on 0,03-1,0 uM.

K

D vuorovaikutusta GST-ZnF5-8 ja biotiini-AR-CTF oli 76,5 nM, ja GST-ZnF5-8 ja biotiini-EPR-CTF oli 146 nM (taulukko 1 ). Sen sijaan,

K

D-arvo vuorovaikutusta GST-ZnF5-8 ja biotiini-HB-EGF-CTF ei laskettu, koska niiden nopean dissosiaation. Sitoutuminen signaali GST-ZnF5-8 immobilisoituun biotiini-TGF-α-CTF havaittiin, mutta se oli alempi kuin biotiini-AR-CTF tai biotiini-EPR-CTF. Näin ollen, dissosiaatiovakio ei voitu laskea, koska ei ole annoksesta riippuva sitoutuminen GST-ZF5-8 pitoisuutena ≤0.5 uM ja häiriöitä vapaan SH jäämiä seitsemän kysteiinin on TGF-α-CTF (kuvio . 3A).

(A) Suora vuorovaikutus EGFR-ligandi-CTF ja PLZF (GST-merkitty-ZnF5-8) kanssa SPR järjestelmään. Rekombinantti biotiini-EGFR- ligandia CTFs yksilöllisesti immobilisoitiin, SA anturi pelimerkkejä. GST-Zn5-8 kanssa pitoisuuksina 0,03-1,0 uM ruiskutettiin sitten juoksevalla puskurilla 25 ° C: ssa ja virtausnopeudella 30 ul /min 2 minuutin ajan. (B) Ekspressiovektori, joka koodaa CFP-PLZF oli kotransfektoitiin villityypin HT1080-solut ja HT1080-solujen, jotka ilmentävät pysyvästi joko proHB-EGF, proTGF-α, proAR tai proEPR. Soluja viljeltiin 24 tunnin ajan ja sitten esikäsitelty seerumittomassa väliaineessa KB-R7785. Sitten soluja käsiteltiin seerumivapaassa kasvualustassa, jossa TPA, ja solunosasijaintia YKP fuusioproteiinin havaittiin. Prosenttiosuuden määrittämiseksi soluja (keskiarvo ± SD), jotka osoittavat lokalisoituminen tumaan CFP-PLZF, solut laskettiin vähintään kaksi transfektioista, ja vähintään 200 soluja, jotka ilmentävät CFP-PLZF tutkittiin kussakin kokeessa. * P 0,05 vipuvaikutusta aikana TPA hoidon vs. mitään hoitoa, ja ** P 0,05 estävää vaikutusta aikana KB-R7785 hoito vs. TPA hoitoa. (C) kaaviomainen high-throughput Alphascreen järjestelmä. Kun viritys 680 nm, ambient happi muunnetaan singlettihappea (

1O

2) jonka valolle läsnä luovuttajan helmiä. Jos hyväksyjä helmet ovat lähellä ( 200 nm),

1O

2 siirtää energiansa thioxene johdannaisten läsnä akseptori helmiä johtaa päästöjen valoa 520-620 nm. Yksi alue koostuu streptavidiinipinnoitettuja luovuttajan helmiä ja biotinyloitua EGFR ligandien-CTF. Toinen koostuu anti-GST-vasta-konjugoitua akseptori helmiä ja GST-ZF5-8. Mikäli yhdistyksen välillä EGFR ligandi-CTF ja ZnF5-8 tapahtuu, helmet ovat riittävän lähellä, jotta havaitsemisen signaalin. Mikä tahansa inhibiittorit Tämän vuorovaikutuksen lisäisi välinen etäisyys helmiä, ja signaali olisi menetetty. (D) Alphascreen signaaleja GST tai GST-Zn5-8 inkuboitiin eri pitoisuuksien biotiini-HB-EGF-CTF. (E) Alphascreen signaalit biotiini-HB-EGF-CTF inkuboitiin eri konsentraatioita GST tai GST-Zn5-8. (E) Sitova kyvyt HB-EGF, TGF-α, amfireguliini (AR), ja epiregulin (EPR), jotta PLZF kanssa Alphascreen järjestelmään.

Seuraavaksi selventää tumasta of PLZF laukaisee TPA-indusoituvaa irtoaminen EGFR ligandien solunosasijaintia PLZF tutkittiin proteiinin aikana solunsisäisen translokaatiota neljän CTFs. Ekspressiovektori, joka koodaa CFP-PLZF transfektoitiin HT1080-soluihin ja transfektoitiin stabiilisti HT1080 soluja, jotka ilmentävät joko proHB-EGF, proTGF-α, proAR tai proEPR. On tunnettua, että villityypin HT1080-solut ekspressoivat konstitutiivisesti vähemmän HB-EGF ja siten tumaansiirtymiseen HB-EGF-CTF ei havaita [14]. CFP-PLZF oli pääasiallisesti tumassa on HT1080-solujen ja neljän transfektanteista. TPA hoito 1 h indusoi jakautuminen CFP-PLZF koko sytoplasmassa HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, ja HT1080 /EPR-soluissa. Kuitenkin, TPA ei muuttanut solunosasijaintia CFP-PLZF in HT1080 ja HT1080 /AR-soluissa. Suhteet CFP-PLZF paikallistamisen tumassa jälkeen TPA-indusoituva irtoaminen olivat merkittävästi alhainen HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α ja HT1080 /EPR-solut (Fig. 3B). Esikäsittely 10pM KB-R7785, joka on metalloproteinaasi-inhibiittori, tehokkaasti kumottu taajuus CFP-PLZF tumasta jälkeen TPA stimulaation HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α ja HT1080 /EPR-solut (Fig. 3B) . Kiehtovan, taajuus tumasta PLZF korreloi käänteisesti sen affiniteetti. Nämä tulokset osoittavat, että affiniteetti CTF-PLZF vuorovaikutus vaikuttaa solunsisäinen sijainti ja toiminta PLZF.

Suurikapasiteettinen seulonta -määrityssysteemiä varten estäjät, jotka estävät vuorovaikutus ZnF5-8 on PLZF ja AR- tai HB EGF-CTF Kaventuneet 12 Hakijat ja neljä ARB

high-throughput seulonta-analyysi kehitettiin koskevasta Alphascreen® seulomiseksi estäjä, joka estää vuorovaikutuksen ZnF5-8 ja CTFs. Alphascreen määritys suunnittelu perustuu siihen, että signaali voidaan havaita vain, kun streptavidiinipinnoitettuja luovuttajan ja anti-GST-vasta-aine-konjugoitua akseptori helmet ovat kiinni etäisyydellä 200 nm. Helmet tuodaan lähelle tätä reaktiota kautta erityisiä vuorovaikutuksia ZnF5-8 ja CTFs komplekseja niihin kytketty (Fig. 3C). Kasvavia pitoisuuksia biotiini-HB-EGF-CTF annosriippuvaisesti lisäsi Alphascreen signaali, kun inkuboidaan GST-ZnF5-8 (Fig. 3d). Kasvavia pitoisuuksia GST-ZnF5-8 myös annoksesta riippuen lisäsi signaalin, kun inkuboidaan biotiini-HB-EGF-CTF (Fig. 3E). Alphascreen signaalit vuorovaikutusta biotiini-AR-CTF, biotiini-EPR-CTF, biotiini-TGF-α-CTF, ja biotiini-HB-EGF-CTF GST-ZnF5-8 olivat verrattavissa sitomisaffiniteettien määritetään SPR järjestelmä (Fig. 3F).

analyysi biotiini-AR-CTF ja GST-Zn5-8 of PLZF voisi osoittavat selvästi estovaikutus saadaan hakijoiden vuorovaikutuksesta biotiini-AR-CTF GST-Zn5- 8 PLZF koska Alphascreen signaali biotiini-AR-CTF oli suurempi kuin biotiini-HB-EGF-CTF. Joka perustuu niiden tehoon estää sitoutumisen AR-CTF sekä HB-EGF-CTF ja Zn5-8 of PLZF, kaksitoista ehdokasta, mukaan lukien no.8016, 7701 ja 7804 saatiin seulomalla 9000 kemiallisia yhdisteitä (Fig. 4A ). Että% inhibitio 10 uM ei. 8016, 7701 ja 7804 välistä vuorovaikutusta biotiini-AR-CTF ja GST-Zn5-8 of PLZF olivat 30,4, 60,5 ja 49,9, vastaavasti. Estävää vaikutusta yhdisteen no.8016 vuorovaikutusta ei ollut korkein (taulukko 2). Kuitenkin No.8016 estivät solujen proliferaatiota vahvin kaksitoista ehdokasta soluproleferaatiomäärityksessä (Fig. 4B). Tulosten perusteella soluproliferaation, valitsimme ei. 8016 ehdokkaaksi. Puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) saatu yhdiste no. 8016 oli 29,9 uM (Fig. 4C).

(A) Kaksitoista ehdokkaan yhdisteen rakennekaava perustuu tehokkuudesta estämään sitoutumista HB-EGF-CTF tai AR-CTF on Zn5-8 of PLZF kanssa Alphascreen järjestelmään. (B) inhiboivat vaikutukset kahdentoista ehdokkaan yhdisteiden TPA-indusoidun soluproliferaation keratinosyyteissä, jossa on solujen lisääntymisen määrityksessä. 2 x 10

4-soluja käsiteltiin elatusaine tai ilman kahdentoista lääkeaihioihin aikana TPA stimulaation, ja absorbanssi 450 nm: ssä määritettiin 12 tunnin välein kunnes 60 tuntia. ** P 0,05 estovaikutus aikana 12 ehdokasta hoidon vs. TPA hoitoa. (C, D) inhiboiva vaikutus ehdokkaista, erityisesti yhdiste no.8016 ja telmisartaani, sitoutumiseen AR-CTF on PLZF. Tontit kanssa inhibitioprosentti vastaan ​​eri pitoisuuksia yhdistettä no.8016 ja telmisartaanin esitetään IC

50-arvot noudattavat Alphascreen järjestelmässä. (E) inhiboivat vaikutukset kolme ARB ehdokkaita sitoutumiseen AR-CTF on PLZF. Tontit kanssa inhibitioprosentti vastaan ​​erilaisia ​​pitoisuuksia kunkin estäjän ja esto esitetään IC

50-arvot.

sitten keskittynyt erityisten rakenteellisten kaava bifenyylin tetratsolia kandidaattiyhdistettä , ja edelleen seulotaan kemiallisia yhdisteitä, kuten ARBs (ts telmisartaania, kandesartaani, olmesartaanin ja losartaani). Perustuen tehoa estää sitoutumisen AR-CTF on PLZF, IC

50 Telmisartaanin kandesartaani, olmesartaanin ja losartaani oli 27,8, 21,9, 87,7 ja 28,4 uM, ja niiden kemiallinen rakennekaava on esitetty ( kuva 4D ja E). Nämä havainnot viittaavat siihen, että telmisartaani ja kandesartaani ovat tyydyttäviä ehdokkaita esto sekä HB-EGF-CTF ja AR-CTF päässä vuorovaikutuksessa PLZF.

No.8016 kahdentoista lääkeaihioihin ja telmisartaani Inhibioitu Cell Proliferation

keratinosyyttisoluja on paljon endogeenisen HB-EGF esiasteita, ja ne ovat hyödyllisiä analysoida solujen lisääntymisen kautta HB-EGF-CTF signalointi. Käytimme HT1080 solulinjoja, kun estäjät seulottiin [17]. Sen tutkimiseksi, onko ehdokkaiden yhdisteet, jotka estivät vuorovaikutusta CTFs ja PLZF esti myös solujen proliferaatiota, testasimme estäviä vaikutuksia näistä kahdestatoista ehdokkaiden ja neljä tyypin 1 angiotensiini II -reseptorin (AT1R) salpaajat (ARB: t) TPA-indusoidun solun proliferaation keratinosyyttien kanssa soluproleferaatiomäärityksessä. Soluja käsiteltiin elatusaineessa kanssa tai ilman 30 uM kahdentoista ehdokkaan yhdisteet ja 30 uM ARBs jopa 60 tuntia TPA: n läsnäollessa, ja absorbanssi mitattiin 12 tunnin välein. Yhdiste no.8016 ja telmisartaania havaittiin inhiboivan solujen lisääntymistä (Fig. 4B, 5B ja D). Lisäksi absorbanssiarvot vähitellen takaisin niille TPA-indusoidun tasoilla (eli ilman yhdiste no.8016 ja telmisartaani), kun solut pestiin 12 tunnin inkubaation jälkeen yhdisteen no.8016 ja telmisartaania (Fig. 5A ja C).

(AD) inhiboivat vaikutukset yhdistettä no.8016 (A) ja neljä ARB (B) TPA-indusoidun soluproliferaation keratinosyyteissä, jossa on solujen lisääntymisen määrityksessä. 2 x 10

4-soluja käsiteltiin elatusaineessa kanssa tai ilman no.8016 tai neljä ARBs aikana TPA stimulaation, ja absorbanssi 450 nm: ssä määritettiin 12 tunnin välein kunnes 60 tuntia.