Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sporadic peräsuolen syöpä (CRC) on yleinen maligniteetti ja myös yksi tärkeimmistä syistä syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Poikkeava ilmentyminen transkriptiotekijän Sox2 on äskettäin havaittu monissa syöpätyypeissä, mutta sen roolia CRC ei ole täysin selvitetty. Täällä tutkimme ilmentymistä Sox2 441 CRC potilailla immunohistokemiallisesti ja liittyvät lausekkeen kliinis ja molekyylitason muuttujat ja potilaan ennustetta. Sox2 ilmaistiin 11%: n kasvaimia ja merkittävästi liittyvät

BRAF

V600E

mutaatio, mutta ei

KRAS

mutaatioita (kodoni 12 ja 13). Sox2 positiivisuus korreloi huonon potilaan selviytymistä, erityisesti

BRAF

V600E

mutatoitunut tapauksissa.

In vitro

tutkimukset osoittivat, että solut, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen

BRAF

V600E

oli kasvanut Sox2 ilme, toteaminen ei löydy soluissa, jotka ilmentävät

KRAS

G12V

. Lisäksi estää loppupään BRAF signalointi käyttäen MEK-estäjää johti vähentynyt ilmentyminen Sox2. Koska Sox2 yli-ilmentyminen on korreloitu lisääntyneeseen muuttoliikkeen ja invaasio, tutkimme Sox2 ilmentymistä ihmisen CRC maksan etäpesäke ja totesi, että Sox2 positiivinen ensisijainen CRC oli myös Sox2 ilmentymistä vastaava maksametastaaseja. Lopuksi havaittiin, että solut yli-ilmentävät Sox2

in vitro

osoitti tehostettu ilmentyminen FGFR1, jonka on raportoitu korreloivan maksan etäpesäkkeitä CRC. Meidän uudet havainnot viittaavat siihen, että Sox2 ilmentymistä osittain säätelee BRAF signalointi, ja lisääntynyt Sox2 ilmentyminen voi edistää CRC etäpesäke ja välittää huono potilaan ennustetta.

Citation: Lundberg IV, Löfgren Burström A, Edin S, Eklöf V , Öberg Å, Stenling R, et ai. (2014) Sox2 Expression säännellään BRAF ja vaikeuttaa taas potilasennuste sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (7): e101957. doi: 10,1371 /journal.pone.0101957

Editor: Andreas-Claudius Hoffmann, Länsi-Saksan Cancer Center, Saksa

vastaanotettu: 31 tammikuu 2014; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 10. heinäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Lundberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Cancer Research Foundation Pohjois-Ruotsissa, OE ja Edla Johanssons säätiö, Petrus ja Augusta Hedlunds Foundation, Magneetin Bergvall Foundation, Ruotsin Cancer Society, Ruotsin tiedeneuvosto ja Uumajan yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sporadic peräsuolen syöpä (CRC) on yleinen maligniteetti läntisessä maailmassa ja yksi pääsyistä syöpäkuolemista. Korkea kuolleisuus johtuen piilevän tai kliinisesti todettu levittää tautia jo diagnoosin, korostaa suurempaa tietoa biologisista tapahtumista, jotka johtavat kohdunkaulan syöpä. Tämä tieto on tärkeää ennakoida potilaan ennustetta ja luoda uusia, tehokkaita hoitoja. Adenooma ja karsinooma-sekvenssin depicture geneettisen tapahtumia, joita tarvitaan normaalin paksusuolen epiteelissä muuntamiseksi pahanlaatuinen fenotyyppi useimmissa satunnaisia ​​CRC tapauksissa [1]. Koska metastaattisen prosessin CRC ei täysin ymmärretä, on vaikea valaista, miksi jotkut kasvaimet tullut aggressiivisempia ja etäispesäkkeitä helpommin kuin toiset. Tunnistaminen molekyylimarkkereiden ilmaistu invasiivisia kasvaimia, jotka voivat ennustaa huono potilaan ennuste on siis tärkeä tutkimusaihe.

SRY (sukupuoli määrittävä alue Y) -box 2 (Sox2) kuuluu suuri

SOX

geeniperheen, joka käsittää transkriptiotekijät tiedetään olevan tärkeitä sääntelyn kehitys- prosesseja ja solutyyppi erittely [2]. Avain jäsen Sox2 on olennaisia ​​rooleja ylläpitämiseksi solun pluripotenttisuus ja itseuudistumisen sekä alkion kantasoluja [3] ja aiheuttama pluripotenttien kantasolujen [4]. Viime aikoina on myös raportoitu, että itseuudistumisen syövän kantasoluja ylläpitää Sox2 [5], mikä viittaa ongogenic rooli Sox2. Yliekspressio Sox2 voidaan nähdä CRC [6] – [8] sekä useissa muissa syöpäsairauksista, kuten rinta-, haima- ja syöpien [9] – [11], mikä osoittaa sen osallistuminen syövän synnyn. Lisäksi Sox2 on ehdotettu olevan mukana CRC solumigraatioon, invaasiota ja etäpesäkkeiden, missä matriisin metalloproteinaasi 2 (MMP2) on ehdotettu mahdollisena välittäjänä varten Sox2 vaikutus [6], mutta tarkkaa mekanismia vielä löydetty .

Tässä tutkimuksessa arvioitiin Sox2 ilmaisun ensisijainen CRC, samoin kuin näytteitä vastaavien maksan etäpesäke, ja korreloi löydöksemme potilaan ennustetta ja molekyylitason kasvainten ominaisuuksiin. Tuloksemme viittaavat siihen, että Sox2 ilme on, ainakin osittain, säännelty BRAF, ja että ilmentyminen BRAF

V600E asteessa riippuvaisella tavalla korreloi huonon potilaan ennustetta.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Tässä tutkimuksessa, käsittely kudosnäytteiden ja potilastietojen hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Uumajan yliopistollisessa sairaalassa (Regional Ethical Review Board Uumajassa). Tähän sisältyy menettely, jolla potilaat suullisesti antoivat tietoisen suostumuksensa, joka dokumentoitiin kussakin potilastietoihin ja pidetään eettinen komitea riittäväksi. Kukin kudosnäyte rekisteröitiin numerolla ja vuosi tietokannassa käytetty analyysejä ja nimiä tai henkilötunnus ollut merkitty.

Kliiniset näytteet

CRC kudosnäytteitä tutkimuksessa mukana oli peräisin peräsuolen syövän Uumajan Study (CRUMS), joka koostuu potilaista, joita on kirurgisesti resektoitiin ensisijaisen CRC vuosina 1995 ja 2003 Uumajan yliopistollisessa sairaalassa, Ruotsi. Histopatologiset luokitukset kaikista tapauksista suoritettiin yksi patologi tarkistamalla rutiininomaisesti värjättyä tuumorisektioiden. Kliiniset tiedot saatiin tarkistamalla potilastietoja, ja selviytyminen kerättiin syksyllä 2012

13 potilaalla on arkistointia kudosta sekä ensisijainen peräsuolen adenokarsinooma ja vastaavat kaukainen maksa etäpesäke, joka oli diagnosoitu samalla aikavälillä kuin CRUMS olivat mukana esillä olevassa tutkimuksessa. Nämä tunnistettiin automatisoidussa potilaskertomusjärjestelmien tietokantaan Kliininen patologia, Umeå University Hospital, Ruotsi. Kasvaimet luokiteltiin ja diagnosoitiin patologit aikaan leikkauksen tai koepala.

immunohistokemia

CRC näytteet formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin mukaan rutiiniprotokollia klo Kliininen patologia, Umeå yliopiston sairaalan, Ruotsi. Ne leikattiin 4 um ja kuivataan sitten, parafiini ja nesteytyksestä. Anti-Sox2 polyklonaalista vasta [12] – [14] (Abcam, Cambridge, UK) käytettiin pitoisuutena 1:500 on puoliautomaattinen värjäysautomaatilla (Bench Mark Ultra, Ventana Inc) ja visualisoitu iView DAB Detection Kit (Ventana Inc)). Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä.

CRUMS, 449 tapausta immunohistokemiallisesti värjätty, mutta puutteen takia kasvaimen materiaalin (n = 7) tai toistuvasti kudoskatoa aikana antigeeni haku vaiheen (n = 1), kahdeksan niitä ei voitu analysoida Sox2 värjäystä. Kaikki 13 potilasta, joilla vastaaviin etäpesäkkeitä onnistuneesti värjätään, ja kaikki voitiin analysoida Sox2-positiivisia soluja. Näytteet tarkistetaan valomikroskoopilla, ja kukin näyte arvioitiin kaksi kertaa saman tarkkailijan ja tapauksissa, joissa discrepant pisteytys, kolmas loppuarvioinnin tehtiin. Tumavärjäystä arvioitiin negatiivinen tai positiivinen. Satunnainen sytoplasminen tai stroomakasvainten värjäys ei analysoitu.

Tilastolliset analyysit

Associations välillä Sox2 ilmaisun ja eri kliinispatologiset muuttujat analysoitiin käyttämällä Pearsonin χ

2 testiä. Arvioida syöpää erityisiä selviytymisen, Kaplan-Meier selviytymisen analyysiä käytettiin, ja vertailun ryhmien tehtiin käyttämällä log-rank-testi. Potilaat CRUMS kohortissa, joka kuoli kuukauden kuluessa leikkauksesta johtuen leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita (n = 37) jätettiin pois selviytymisen analyysit. Coxin suhteellisen vaaran malleja käytettiin monimuuttuja analyyseja. Cancer-tapahtumia määriteltiin kuolema tunnettujen levitetään tai uusiutuva sairaus, ja tapaukset sensuroitiin lopussa seurannan tai kuolinhetkellään muista syistä. SPSS /PASW tilastollinen ohjelmistoversio 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Geeniekspressiotasot verrattiin käyttämällä kahta pyrstö Opiskelijan

t

testiä. Kukin pylväs on keskimäärin kolmen erillisen kokeen ja virhepalkkien kuvaavat keskihajonta.

p

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa analyyseissä.

Solulinjat ja soluviljelmä

Tässä tutkimuksessa koolonisyöpäsolulinja Caco2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jossa oli Glutamax täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Life Technologies, Tukholma, Ruotsi), ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Sukupolven ekspressoivat stabiilit transfektantit Sox2 (Caco2-Sox2), mutantti BRAF (Caco2-BRAF

V600E) tai KRAS (Caco2-KRAS

G12V) suoritettiin transfektoimalla Caco2-solut pcDNA3.3-Sox2 ( Derrick Rossi, Childrens Hospital Boston, USA, kautta Addgene), pMCEF-BRAFV

600E (ystävällisesti professori R. Marais) tai pcDNA3-KRAS

G12V (ystävällinen lahjoitus tri N. Ignatenko) käyttäen Caco-2 Transfection Reagent (Altogen Biosystems, Las Vegas, NV, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Välillä 48 ja 72 tuntia altistuksen jälkeen DNA, transfektoidut solut valittiin 800 pg /ml G418: aa (Gibco, Life Technologies, Tukholma, Ruotsi). Medium sisältävä G418 vaihdettiin kahdesti viikossa.

Voit estää BRAF signalointi Caco2 ja Caco2-BRAF

V600E soluja, 20 uM MEK estäjä PD98059 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), tai DMSO kontrollina lisättiin soluihin inkuboinnin jälkeen 24 tai 48 h.

RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel, Duren , Saksa), ja cDNA syntetisoitiin SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Tukholma, Ruotsi) valmistajan protokollia. Alukkeita käytetään tutkimuksessa olivat DNA Technology A /S (Aarhus, Tanska) ja niiden sekvenssit olivat seuraavat: GAPDH eteenpäin: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ’, käänteinen: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’. Sox2 eteenpäin: 5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ’, käänteinen: 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3’. FGFR1 eteenpäin: 5′-AGGCTACAAGGTCCGTTATGC-3 ’, käänteinen: 5’TGCCGTACTCATTCTCCACAA-3’. FGFR2 eteenpäin: 5′-TTAAGCAGGAGCATCGCATTG-3 ’, käänteinen: 5’GGGACCACACTTTCCATAATGAG-3’. FGFR3 eteenpäin: 5′-CCTCGGGAGATGACGAAGAC-3 ’, käänteinen: 5′-CGGGCCGTGTCCAGTAAGG-3’. FGFR4 eteenpäin: 5′-TGCAGAATCTCACCTTGATTACA-3 ’, käänteinen: 5′-GGGGTAACTGTGCCTATTCG-3’. Jokainen PCR-reaktio sisälsi 25 ng cDNA: ta ja kukin näyte ajettiin kaksoiskappaleet. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Standardipoikkeamat laskettiin ja keskiarvoa kolmesta reaktioista. RT-PCR-reaktiot suoritettiin Taqman 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Tukholma, Ruotsi) ja seuraavat pyöräily parametrejä käytettiin: 50 ° C 2 min, ja sitten alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s. Geeniekspressioiden normalisoitiin GAPDH.

Western blot

analysoimiseksi Sox2 ilmentymisen stabiilissa Caco2-Sox2 transfektantti, solut hajotettiin hajotuspuskuriin (100 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, pH 8,0, 15 mM MgCl

2, proteiini-inhibiittorit), ennen kuin proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi). Blottia inkuboitiin ensisijaisen Sox2-vasta-aineen (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ja sekundäärinen vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Blotti kehitettiin ECL Select Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi).

Digital pisara PCR

Genominen DNA eristettiin soluista käyttämällä NucleoSpin Tissue Kit (Macherey- Nagel, Duren, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Digital pisara PCR (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) käytettiin tarkistaa Caco2 transfektantit ilmentävät mutantti

BRAF

V600E

(Caco2-BRAF

V600E) ja

KRAS

G12V

(Caco2-KRAS

G12V). DdPCR-menetelmä on esitetty perusteellisesti muualla [15], [16]. Lyhyesti, ddPCR sallii osoittamiseen ja määrittämiseen sekä mutaation ja villityypin samassa reaktiossa käyttäen fluoroforit FAM ja HEX konjugoitu sekvenssispesifisellä koettimia. Vuonna ddPCR-menetelmä, PCR näyte 20 ul jaetaan 20 000 nanoliter pisarat antavat noin 20 000 lukee.

Voit tarkistaa onnistunut transfektointi Caco2-BRAF

V600E, alukkeet ja koettimet olivat seuraavasti: eteenpäin: 5′-GCACAGGGCATGGATTACTTACA-3 ’, käänteinen: 5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′, villityypin koetin: 5′-56-FAM /TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT /3BHQ_1-3 ”, mutaatiokoetin: 5’-5HEX /TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT /3BHQ_1-3 ”(DNA Technology A /S, DNA Technology A /S) [17], [18]. PCR suoritettiin T100 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) käyttäen ohjelmaa: 95 ° C: ssa 10 min; 40x sykliä 95 ° C 15 s ja 56 ° C 1 min (muutosnopeus 2 ° C /s); ja 98 ° C: ssa 10 min. 900 nM alukkeita ja 250 nM vastaavien koetinta käytettiin.

havaitsemiseksi onnistuneen transfektion Caco2-KRAS

G12V, määrityksiä ddPCR käytettiin (PrimePCR ddPCR Mutation Assay: KRAS p.G12V määritys, Human; PrimePCR ddPCR Mutation Assay: KRAS tyyppi p.G12V määrityksessä, Human, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), jossa PCR-olosuhteet mukaan manuaalista yhtiön antaman: 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan; 40x sykliä 94 ° C 30 s ja 55 ° C 1 min (muutosnopeus 2 ° C /s); ja 98 ° C: ssa 10 min.

Jokainen PCR-reaktio sisälsi 50 ng DNA: ta ja pisarat valmistettiin mX100 pisaran generaattori (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Lopullinen PCR-tuote havaitaan QX200 pisaran lukija (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ja tulos analysoidaan QuantaSoft ohjelmiston, versio 1.4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) tila

Kasvaimen CIMP tila määritettiin MethyLightT menetelmällä pohja- ja koetinsekvenssit, jotka on aiemmin kuvattu [19], [20]. Kahdeksan geenien CIMP paneelissa (

CDKN2A

,

MLH1

,

CACNA1G

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

IGF2

ja

CRABP1

) [20] prosenttiosuus metyloitu viite (PMR) laskettiin, jossa PMR 10 pidettiin positiivisena [19]. Kasvaimet luokitellaan CIMP negatiivinen (ei-promoottorin hypermetylaatio), CIMP alhainen (yhdestä viisi geeniä metyloitu) tai CIMP korkea (kuudesta kahdeksaan geenien metyloitu) [20].

mikrosatelliitti epävakaus (MSI) seulonta tila

Mismatch korjaus proteiinit analysoitiin immunohistokemiallisesti kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, formaliinilla kiinnitetyt, ja parafiiniin CRC kudosta tutkittiin ekspressiota neljän yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän proteiineja (MLH1, MSH2, MSH6 ja PMS2). Näyte pidetään, jolla on positiivinen MSI seulonnan tila puuttui tumavärjäystä kasvainsoluissa ainakin yhden proteiineista, ja sitä kutsutaan MSI. Negatiivinen MSI seulonta tila oli ilmaus kaikkien neljän geenien ja kutsuttiin microsatellite vakaa (MSS).

BRAF

V600E mutaatiostatuksesta riippumatta

Taqman alleeliset syrjintä määrityksessä kuvataan yksityiskohtaisesti muualla [17], käytettiin havaitsemiseen

BRAF

V600E

mutaatio (reagenssit Applied Biosystems, Life Technologies, Tukholma, Ruotsi).

KRAS sekvensointi

mutaatioanalyysiin

KRAS

on selitetty muualla [21]. Sekvensointi suoritettiin käyttäen Big Dye v. 3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Tukholma, Ruotsi), ja käytetyt alukkeet olivat: eteenpäin: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 ’ja reverse: 5′-CAGGAAACAGCTATGACCTCTGTATCAAAGAATGGTCCT-3’.

tulokset

Sox2 ilmaisun CRC korreloi kasvaimen, TNM ja

BRAF

mutaatio

Nuclear Sox2 ilmentymistä kasvainsoluissa arvioitiin 441 CRC potilaan näytteitä immunohistokemia, jossa ilmentyminen arvioitiin joko positiivinen tai negatiivinen (Kuva 1). Positiivisessa tapauksessa Sox2 ilmentyminen ei koskaan nähty koko kasvain, mutta positiiviset ytimet löytyivät rajoitettu osissa. Satunnainen strooman tai sytoplasminen värjäys ei arvioitu. 47 (10,7%) ja CRC näytteiden näkyvät ilmentävien kasvainsolujen Sox2 ja ilmaisun suhteen eri kliinis ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Meidän potilaan kohortin Sox2 ilmentyminen havaittiin merkittävästi liittyy suuri kasvaimen (

p

= 0,004) ja TNM-luokitus (

p

= 0,034). Sox2 ilmentyminen myös korreloi

BRAF

mutaatio (

p

0,001), mutta yllättäen ei korrelaatiota

KRAS

mutaatioita voidaan nähdä (

p

= 0,928).

(A) Negatiivinen ydin- Sox2 värjäytymistä kohtalaisen eriytetty CRC. (B) Positiivinen ydin- Sox2 värjäytymistä huonosti eriytetty CRC.

Sox2 ilmentyminen korreloi huonon potilaan selviytymisen

Syöpä-erityisiä selviytymisen analyysit paljastivat, että potilailla, joilla on Sox2 positiivisia kasvaimia oli huonompi ennuste kuin potilailla, joilla on Sox2 syöpäkasvain (kuva 2a). Tämä yhdistys oli vielä voimakkaampi, kun vain

BRAF

mutatoitunut kasvaimet analysoitiin (kuvio 2b), kun taas mitään eroa Sox2 ilmaisun eloonjäämiseen nähtiin

BRAF

villityypin kasvaimia (kuvio 3c). Sox2 ilme ei ollut mitään vaikutusta potilaan ennusteeseen

KRAS

mutatoitunut kasvaimet (

p

= 0,676). Monimuuttuja Coxin suhteellisen riskin malliin kuten ikä, sukupuoli,

BRAF

mutaatio, ja Sox2 ilmaisu, huono ennuste potilaille, joilla on Sox2 ilme versus Sox2 ilme säilytetään tilastollista merkittävyyttä (riskisuhde (HR) = 1,64, 95 % CI 1,04-2,58,

p

= 0,032). Kun lisäksi Säätämisen vaiheessa Monimuuttuja-analyysissä ennustetyöväline vaikutusta Sox2 ilmentyminen oli kadonnut (HR = 1,04, 95% CI 0,65-1,67,

p

= 0,878), korostaen vaiheessa riippuvuus.

Näkyy ovat Kaplan-Meier tontit syöpää erityisiä selviytymisen (A) kaikki CRC potilaat, (B)

BRAF

V600E

mutatoitunut CRC potilaiden tai (C)

BRAF

villityypin CRC potilaille.

(A) Caco2 soluja, Caco2 solut jotka ilmentävät pysyvästi

BRAF

mutaatio (Caco2-BRAF

V600E) ja Caco2 solut ilmensivät stabiilisti

KRAS

mutaatio (Caco2-KRAS

G12V). Sox2 ilmentyminen Caco2 asetettiin 1. (B) Caco2 jälkeen viljelyn kanssa MEK-estäjää, 24 tai 48 tuntia, tai DMSO: ssa 48 tunnin kontrollina. Sox2 ilmaisun Caco2 käsitellään DMSO asetettiin 1. (C) Caco2-BRAF

V600E jälkeen viljelyn kanssa MEK-estäjää, 24 tai 48 tuntia, tai DMSO: ssa 48 tunnin kontrollina. Sox2 ilmentyminen Caco2-BRAF

V600E käsitellään DMSO asetettiin 1. PD: PD98059 (MEK-estäjä), *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001, ns: ei-merkitsevä

p

-arvo.

Sox2 ilmentymistä säätelee BRAF

vuonna vitro

Kuten Sox2 ilmaisu korreloi mutatoitunut

BRAF

meidän potilaan kohortin jatkoimme analysoida molekyyli- suhde

in vitro

. CRC solulinja Caco2, jossa endogeenisen BRAF ja KRAS villityypin, transfektoitiin joko BRAF

V600E tai KRAS

G12V luomiseksi solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti mutantti

BRAF

(Caco2-BRAF

V600E, kuva S1a) tai mutantti

KRAS

(Caco2-KRAS

G12V, kuva S1B). RT-PCR-analyysejä huomasimme, että Caco2-BRAF

V600E ilmaistuna noin kaksinkertaisia ​​Sox2-tasot verrattuna Caco2 (

p

= 0,013), ja se kasvoi joka ei nähty Caco2-KRAS

G12V (kuvio 3a). Nämä tulokset, yhdenmukaiset kanssa tietoja potilaan kohortin (taulukko 1) viittaavat siihen, että ilmaus Sox2 säätelee mutatoitu BRAF.

BRAF

V600E

mutaatio tekee BRAF on konstitutiivisesti aktiivinen tila, stimuloi MEK /ERK signalointi cascade puuttuessa solunulkoisen ärsykkeiden [22]. Todellakin, estämällä BRAF alavirran signalointia Caco2-BRAF

V600E soluihin käyttämällä MEK-estäjää PD98059, johti vähentynyt ilmentyminen Sox2 (kuvio 3c), mikä viittaa siihen, että se on lähinnä hyvin tunnettu MEK aktivoiva aktiivisuus BRAF joka säätelee Sox2 . Lisäksi alhainen endogeenisten tasojen Sox2 vuonna Caco2 solut pienentää myös MEK-estäjää (kuva 3b), mikä tarkoittaa, että BRAF vastaaminen endogeenisen aktivaatiosignaaleille myös säätelee Sox2 ilme. Yhdessä nämä tulokset tukevat roolia BRAF kuin ylävirran säätelijänä Sox2 ilmaisun.

Ensisijainen Sox2 positiivinen CRC on Sox2 positiivinen vastaava maksan etäpesäke

Koska se, että Sox2 ilmentyminen korreloi huonompi potilaalle ennuste, halusimme tutkia Sox2 ilmentymisen primaarikasvainten sekä vastaavat kaukainen etäpesäke. Tätä varten 13 potilaalla arkistonhoidolliset kudosta sekä ensisijainen peräsuolen adenokarsinooma ja etäinen maksa etäpesäke otettiin mukaan tutkimukseen ja ydinvoiman Sox2 ilmentyminen arvioitiin epiteelisoluissa. Kaksi 13 ensisijaisen kasvaimia Sox2 positiivisia, kun taas muut yksitoista kasvaimet olivat Sox2 negatiivisia. Mielenkiintoista, Sox2 positiivinen primaarikasvainten olivat myös Sox2 positiivisia vastaaviin maksan etäpesäke, kun taas Sox2 syöpäkasvain oli Sox2 negatiivinen maksan etäpesäke (taulukko 2). Huomionarvoista, nämä Sox2 positiivisia metastaasin olivat morfologisesti enemmän samankaltaisia ​​kasvaimen lokeroissa Sox2 positiivinen ytimet kuin muualla primaarikasvaimen (tuloksia ei ole esitetty).

Sox2 ilmentymisen tehostamiseksi FGFR1

vapauttaminen fibroblastikasvutekijä reseptorit (FGFR: ää) nähdään CRC sekä muissa syövissä [23], [24]. Koska on ehdotettu, että Sox2 säätelemään FGFR3 [7], halusimme tutkia jos Sox2 muuttanut ilmaus FGFR: ää meidän

in vitro

järjestelmässä.

solulinja yli-ilmentävät Sox2 perustettiin transfektoimalla CRC solulinja Caco2 kanssa Sox2 (Caco2-Sox2, kuva S2). Ilmentyminen FGFR1-4 analysoitiin RT-PCR: llä Caco2-soluissa ja Caco2-Sox2 soluja. FGFR1 ilmentyminen todettiin olevan kaksinkertaiset Caco2-Sox2 kuten Caco2 (

p

= 0,036), kun taas ei nähty merkittäviä eroja koskien FGFR2, FGFR3 tai FGFR4 (kuva 4).

Expression of FGFR1, FGFR2, FGFR3 ja FGFR4 RT-PCR-analyysi Caco2 soluissa ja Caco2 solujen vakaasti yli-ilmentävät Sox2 (Caco2-Sox2). Ilmaisu in Caco2 asetettiin 1. *

p

0,05, ns: ei-merkitsevä

p

-arvo.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa selvitettiin Sox2 ilmentyminen CRC korrelaatio useita kliinis ja molekyylitason muuttujien ja sen vaikutus potilaan ennusteeseen. 11%: n kasvaimia Sox2 positiivisia, ja ilmaisu korreloi kasvaimen, TNM ja

BRAF

mutaatio. Lisäksi olemme havainneet, että Sox2 ilmaisu ennusti huonompi potilaan ennusteeseen vaiheessa riippuvaisella tavalla, erityisesti

BRAF

mutatoitunut tapauksissa. Lopuksi esittelemme Sox2 mahdollisimman säätelijänä FGFR1 ilmaisun.

Koska väitetty osallistuminen Sox2 CRC kasvainten synnyssä [25] halusimme tutkia ilmentymistä Sox2 meidän potilaiden kohortissa CRUMS. Olemme havainneet, että 11%: n kasvaimia ilmaisivat Sox2 ja vertaamalla ilmaisun eri kliinis ominaisuudet voisimme nähdä, että Sox2 ilmentyminen korreloi huonosti eriytetty kasvaimet (korkea laatu). Tämä sopii tietäen, että Sox2 on tunnettu kantasolujen markkeri, ja on ehdotettu ilmaistaan ​​syövän kantasoluja [5], [26]. Kuten Sox2 usein ilmaistiin rajoitettuun osaan kasvain, me spekuloida, että nämä solut voidaan edustavat syöpä kantasolujen kapealla näissä erityisesti kasvaimia. Olemme lisäksi havainneet, että Sox2 ilmentyminen korreloi huonon potilaan ennusteeseen vaiheessa riippuvaisella tavalla, joka on sopusoinnussa joidenkin aiempien tutkimusten [6], [27], [28].

Sox2 on kuvannut muiden parantaa muuttavien ja invasiivisia vaikutus CRC solujen [6], [7] kuoppiin muun syöpäsolutyyppien [29] – [31], mikä tarkoittaa, että Sox2 ilmentäviä soluja voisi satama suuremman metastaattinen kapasiteetti. CRC on myös ehdotettu, että ilmaus Sox2 voi ennustaa kasvaimen etäpesäke [6]. Kuitenkaan mitään tutkimuksia on tänään Sox2 ilmaisun kasvainten etäpesäkkeitä. Tässä olemme osoittaneet, että vastaavat maksan metastaaseja Sox2 positiivinen primaaristen kasvainten myös satama Sox2 positiivisia kasvainsoluja. Vaikka nämä potilas kudosnäytteiden oli hyvin vähän, se osoittaa edelleen, että Sox2 positiiviset solut ovat todennäköisesti siirtää. Se olisi tietysti sekä mielenkiintoinen ja tarpeen tutkia tätä suuremmassa potilaalla materiaalia tarkastettavaksi. Se, että Sox2 positiivisten solujen tehty vain pienen osan koko kasvain, viittaa siihen, että nämä solut voivat näyttää invasiivisia fenotyyppi kuin ympäröivä syöpäsoluja. Toinen todiste entistä invasiivisia käyttäytyminen Sox2 positiivisia kasvainsoluja on, että etäpesäkkeiden olivat morfologisesti lähempänä osiin kasvaimen Sox2 positiivinen ytimiä. Vaikka morfologinen vertailu ensisijaisen kasvaimia ja etäpesäkkeitä voi vain tutkittu kahdessa tapauksessa pidämme todennäköisenä, että se voi heijastaa erityisiä soluja, jotka todella aiheuttavat kaukaisia ​​etäpesäkkeitä.

Sox2 ilmentyminen korreloi

BRAF

mutaatio meidän kudoksessa kohortissa, mutta mitään korrelaatiota näkyi välillä Sox2 ilmaisun ja

KRAS

mutaatioita. Meidän

in vitro

katsoessaan, että lisääntynyt Sox2 ilmentymistä havaittiin soluissa, jotka ilmentävät BRAF

V600E mutaatiota mutta ei KRAS

G12V mutaatio, vahvistaa tämän korrelaatio. RAS /RAF /MAP kinaasikaskadin on polku, joka on yhdistetty moniin tärkeisiin solun toimintoja, kuten solun kasvua, jakautumista ja erilaistumista [32], ja sen mukana proteiinit usein mutatoituneet CRC. Kaikista CRC, 30-40% on mutatoitunut

KRAS

geeni ja 5-15%

BRAF

geeni [21], [33]. Nämä kaksi mutaatiota uskotaan olevan toisensa poissulkevia CRC [21], [34], ja ne ovat molemmat liittyy huono potilaan ennusteeseen [21], [35] – [37]. Vaikka ne ovat mukana samaa reittiä, voimme nähdä, että

KRAS

ja

BRAF

mutatoitunut CRC on erilaiset morfologiset esiintymisiä. On mielenkiintoista spekuloida, että yhdistys

BRAF

mutaation Sox2 ilme saattaa selittää osan tästä morfologinen ero. Jatkoimme analysoida korrelaatio BRAF ja Sox2 ilmaisun meidän

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä. Todellakin, Sox2 ilmentyminen havaittiin voimistuvan soluissa, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen BRAF

V600E. Lisäksi estämällä BRAF alavirran signalointia, endogeeninen Sox2 sekä Sox2 ilmentyminen aiheuttama BRAF

V600E väheni, mikä osoittaa, että Sox2 ilmentyminen on ainakin osittain säätelee hyvin tunnettu BRAF /MEK-reitin. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa, että Sox2 ilmentymistä säätelee BRAF signalointi. Toinen mielenkiintoinen havainto oli, että negatiivinen ennustetekijöiden vaikutusta Sox2 ilmentyminen rajoittui

BRAF

muuntunut potilailla, mikä osoittaa, että se on Sox2 ilmaus yhdessä

BRAF

mutaatio, joka useimmiten edistää huono ennuste .

on hyvin tunnettua, että poikkeava ilmentyminen fibroblastikasvutekijän reseptoreihin (FGFR: ää) voidaan ajaa kasvaimen etenemistä [23], [24]. FGFR perhe koostuu neljästä geenistä, ja se on osoitettu, että ainakin

FGFR3

geeni säätelee Sox2 CRC [7]. Meidän solulinja yli-ilmentävät Sox2, Caco2-Sox2, oli kaksi kertaa niin suuri FGFR1 lauseketta Caco2 soluja, mikä tarkoittaa, että FGFR1 ilmaisua voidaan säädellä Sox2. Muut ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen FGFR1 löytyy CRC [38] ja että se korreloi maksan etäpesäkkeen [39]. Tuoreessa tutkimuksessa on myös, että kohonnut ilmentyminen sekä Sox2 ja FGFR1 korreloi huonon ennusteen pienisoluinen keuhkosyöpä [40]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että Sox2 osittain kautta ylösajon FGFR1 saattaisi vahvistaa kaukainen leviämistä kasvainsolujen maksaan, mikä aiheuttaa huonompi potilaan selviytymisen. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan paljastaa roolia ja mekanismi Sox2 ja FGFR1 CRC.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että Sox2 ilmentyminen korreloi huonon ennusteen CRC potilailla ja se tunnistaa ensimmäistä kertaa että Sox2 ilmaisu osittain säädellään BRAF. Nämä havainnot yhdessä havaittu korrelaatio Sox2 positiivisuus sekä primaarikasvaimen ja vastaavia etäpesäke, viittaavat siihen, että Sox2 positiivisia kasvainsoluja on parannettu kyky etäispesäkkeitä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Onnistunut transfektio pMCEF-BRAF

V600E tai pcDNA3-KRAS

G12V osaksi Caco2 koolonisyöpäsolulinja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0101957.s001

(PDF)

Kuva S2.

Caco2-Sox2 soluissa on lisääntynyt Sox2 ilmaus sekä mRNA ja proteiini tasolla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0101957.s002

(PDF) B

Kiitokset

kirjoittajat kiittää Kerstin Näslund, Department of Medical biotieteiden, patologia, Uumajan yliopisto, hänen taitava teknistä tukea ja Anna Dahlin johtamiseksi CIMP tilanneanalyyseistä.