Krooninen sairaus

tiivistelmä

seroosit epiteelin munasarjasyöpä (EOC) potilailla on usein periksi aggressiivisia etäpesäkkeitä, mutta vähän tiedetään käyttäytyminen ja genetiikka munasarjasyövän etäpesäke. Täällä pyrimme ymmärtämään, miten omental etäpesäkkeitä eroavat ensisijainen kasvaimia ja miten nämä erot voivat vaikuttaa kemoterapiaa. Analysoimme miRNA ilmaisun profiilit ensisijaisen EOC kasvainten ja niiden omental etäpesäkkeiden 9 käyttävillä potilailla miRNA Taqman qPCR taulukot. Löydämme 17 miRNA kanssa ero ilmaisua omental vaurioita verrattuna ensisijainen kasvaimia. miR-21, miR-150, ja miR-146a on alhainen ilmentyminen useimmissa primaarikasvainten on huomattavasti lisätty ilmaisun omental vaurioita, joilla on samanaikaisia ​​vähentynyt ilmentyminen ennustettu mRNA, jotka perustuvat mRNA ilmaisun. Huomaamme, että miR-150 ja miR-146a välittäjänä pallomainen kokoa. Sekä miR-146A ja miR-150 suurempi määrä jäljellä eloonjääneiden solujen 2-4 kertaiseksi, kun altistettiin tappavan sisplatiinin pitoisuuksilla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ainakin kaksi miRNA, miR-146A ja miR-150, säädellään ylöspäin omental vaurioita, stimuloivat selviytymistä ja lisätä lääkkeiden sietokykyyn. Meidän havainnot viittaavat siihen, että syöpäsolut omental kasvaimissa ilmaista avain miRNA eri tavalla kuin ensisijainen kasvaimia, ja että ainakin osa näistä MikroRNA voi olla kriittinen sääntelyviranomaisten syntyminen lääkkeille vastustuskykyiset tauti.

Citation: Vang S, Wu HT , Fischer A, Miller DH, MacLaughlan S, Douglass E, et ai. (2013) tunnistaminen munasarjasyövän Metastasoitunut miRNA. PLoS ONE 8 (3): e58226. doi: 10,1371 /journal.pone.0058226

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 syyskuu 2012; Hyväksytty: 31 tammikuu 2013; Julkaistu: 12 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Vang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Brown University center for Computational Molecular Biology, Seed palkinnon Brown University National center of Excellence in Naisten terveys, ja National Institutes of Health /National center for Research Resources myöntää 5P41RR001395. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

seroosit epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on aggressiivinen sairaus, jolle on olemassa muutamia tehokkaita biomarkkereiden ja hoitoja. EOC diagnosoidaan usein sen jälkeen, kun tuumorisolut ovat levitettäviä vatsaonteloon [1]. Huolimatta siitä, että etäpesäkkeitä muodostavat suurimman sairauteen liittyvien kuolemien, munasarjasyöpä etäpesäkkeitä jää huonosti [1].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ominaisuuksia, jotka voivat olla tärkeitä luoda etäpesäkkeitä ja määrittää miten nämä tekijät voivat vaikuttaa kemoterapian vastauksia. Advanced etäpesäkkeitä edelleen pelottava haaste hoitoon, useimmiten johtaa toistuviin, lääkkeille vastustuskykyiset kasvaimet. Etäpesäkkeitä voidaan rikastaa selvä mutaatioanalyysiä spektrin verrattuna primaarikasvainten [2], [3], [4]. Vertaamalla ensisijainen ja etäpesäkkeitä on tuottanut tärkeitä oivalluksia taudin etenemistä kummassakin eläinmalleissa [5] ja potilailla [2]. Parantaakseen Etäpesäkkeisen tauti, on tärkeää ymmärtää geenien ja reitit syntymässä etäpesäkkeitä, että ei voi olla läsnä ensisijainen kasvaimia. Vaikka metastaattinen potentiaali voidaan ennustaa perustuen primaarikasvaimen [6], [7], tämä havainto ei ole toisiaan poissulkevia sitä mahdollisuutta, että tärkeimmät ominaisuudet esiin etäpesäkkeitä, joita ei ole havaittu ensisijainen kasvaimia. Esimerkiksi uusi microenvironment voi aiheuttaa merkittäviä fenotyyppisiä muutoksia syöpäsolujen, mukaan lukien muutokset aineenvaihdunnan aktiivisuutta omentum [8], ja lisääntynyt lääkeresistenssin [9].

Aiemmat mRNA ilmaisu Tutkimuksissa Hyväksytty munasarjojen ensisijainen ja etäpesäkkeitä samasta potilaasta, tukea ensisijainen kasvain alttius ”malli [6], [10], [11], [12]. mRNA ilmaisu dataa aikaisin sukupolven mikrosiruja ehdottaa olemassa muutamia merkittäviä ilmaus eroja omental vaurioita ja primaarikasvainten [13], [14], [15], mutta useat tutkimukset ovat kuvanneet ero ilmaus keskeisten sääntelyn tekijöiden välillä ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, kuten E-kadheriinin [16], MMP [17], [18] ja integriinit [19]. Ongelman ilmeinen ristiriita ja saada uusia oivalluksia valtion syöpäsolujen etäpesäkkeitä, olemme profiloitu miRNA ilmaisun pareittain ensiarvoisen vakavien munasarjan epiteelin (EOC) kasvaimet ja omental vaurioita. miRNA ilmaisun profilointi tunnistaa miR-150 ja miR-146a olevan säädellään ylöspäin omental etäpesäkkeitä. Huomaamme, että miR-150 ja miR-146a edistää sferoidiviljelmiä muodostumista ja lisätä osa jäljellä eloonjääneiden solujen sisplatiinin jälkeen altistuksen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että korkeampi ilmentyminen miR-146A ja miR-150 omental vauriot voivat johtaa kovenevaan, solunsalpaajaresistentti tauti.

Tulokset

Havaitsimme 9 Stage III C serous epiteelin munasarjasyöpä potilaille, joilla on paria ensisijainen ja omental etäpesäkekasvainten yksilöitä (kuva S1, taulukko S1). Kaikki potilaat olivat postmenopausaalisten ( 55 vuotias ajankohtana diagnoosi) ja oli etäpesäkkeitä on omentum. Mittasimme miRNA ilmaisua käyttäen Taqman qPCR array kortteja 9 paria kasvaimia. Jokainen kasvain oli 70% syöpäsoluja, ja hyvä RNA laatu (Agilent Bioanalyzer RIN 5). Meidän painopiste on ymmärtää muutoksia ilmentää aikana sairauden etenemistä, ja siksi olemme keskittyneet vertaamalla etäpesäkkeitä ensisijaiseen kasvaimia ja ei pitänyt normaaleja munasarjaepiteelisoluilla.

tunnistaminen miRNA differentiaalisesti ilmaisi välillä ensisijainen ja etäpesäkkeitä

mitattiin 377 miRNA ABI Taqman qPCR paneelit, spesifinen kypsä miRNA [20], 9 sovitettu ensisijainen ja metastaattinen ihmisen kasvaimissa. 180 miRNA ilmaistaan, ainakin kaksi kasvaimet, joilla ei ole globaali ylä- tai alas-säätely näistä miRNA välillä ensisijainen ja etäpesäkkeitä. Kuva 1A yhteenveto miRNA suuret toistuva ilmaisun eroja tunnistetaan pariksi t-testiä (kuva S2). Testasimme ilmentyminen miR-146A ja miR-150 määrityksissä kohdistaminen juuri nämä miRNA kahdessa paria potilasta vahvistamaan, että Taqman ovat ominaisia ​​näille miRNA ilman ylikuulumista muista 376 määrityksissä (kuvio S3).

. miRNA ilmentymisen profilointi Taqman qPCR paneelit tunnistaa 17 miRNA ilmentyvät eri välillä 9 paria primaarikasvainten ja omental vaurioita. miRNA kanssa p 0,05 (pariksi t-testi) valittiin. Ilmaisu taso esitetään keskiarvona +/- keskiarvon keskivirhe (s.e.m.) taitteen muutoksen avulla ACk

t menetelmä suhteessa U6 snRNA. Punainen, alempi ilmaisun etäpesäkkeitä, sininen, korkeampi ilmaisun etäpesäkkeitä. B. Vasen, ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi taitteen muutoksia analysoitiin potilaista. Oikea, yhdistys juoni analyysi miRNA ilmaisun tunnistaa miRNA klustereita merkitty punaisella. Klusterointi suoritettiin Gene-E] 50].

Hierarkkinen ryhmittely kertaluokkamuutos välillä ensisijainen ja etäpesäkkeitä varten 17 miRNA näkyy kolme erillistä ryhmää (kuvio 1 B). Potilaat ryhmittyneet samankaltaisten kertaiseksi muutoksia miRNA ilmaisu (kuvio 1 B, vasen paneeli). Erillisiä miRNA ryhmät helpommin visualisoida kun miRNA ovat ryhmittyneet riippumattomia potilaiden (kuvio 1 B, oikea paneeli). Koska miR-146a, miR-21 ja miR-150 edustavat kolme suurta sääteli klustereita, päätimme keskittää pyrkimyksiä ymmärtää niiden mahdolliset toiminnot munasarjasyöpä. Huomasimme, että ilmentyminen miR-21, miR-146a, miR-150 korreloi negatiivisesti niiden ennustettu mRNA tavoitteensa (kuva S4), mikä viittaa siihen, että nämä miRNA aktiivisesti tukahduttamalla mRNA ilmaisun etäpesäkkeitä verrattuna ensisijainen kasvaimia. Päätimme keskittyä miR-146A ja miR-150, koska nämä kaksi miRNA ei ole aikaisemmin tutkittu munasarjasyöpää tietomme.

Voit selvittää ilmaisu muuttuu peräisin syöpäsolujen tai strooman, käyttäen ortogonaalista määritys, suoritimme

in situ

-hybridisaatio (ISH). miR-21 ilmentyy sekä syövän ja strooman soluja, ja säädellään ylöspäin omental vaurioita, sopusoinnussa Taqman qPCR näyttö (kuvio 2A). By ISH, huomaamme, että absoluuttiset ilmentymistasot ovat vaihtelevia, mutta kaikki 8 omental leesiot testattu osoittavat kasvanut miR-21 syöpäsolujen ilmentymisen verrattuna vastaavaan primaarikasvaimen (kuvio 2 ja kuvio S5). Meidän käsissämme, ISH herkkyys on huono ja riippuu laadusta anturin, ja emme voineet saada luotettavia signaalin muille miRNA jälkeenkin on tutkittu perusteellisesti avainmuuttujia lukien hybridisaation lämpötila, proteinaasi K keskittyminen, ja koetinkonsentraatiossa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-21 on peräisin sekä syövän ja strooman soluja, ja että miR-21 ilmentyminen lisääntyy omental etäpesäkkeitä syöpäsoluissa.

.

In situ

-hybridisaatio miR-21. Syöpäsolut värjätään punainen Nuclear Punainen. Korkeampi ilmentyminen omental etäpesäkkeitä havaitaan kussakin tapauksessa jopa sekä suhteellisen korkea ja matala miR-21 ilmentyminen primaarikasvaimen. Nuolet osoittavat alueet miR-21 ilmentyminen yhteistyössä paikallistamisen Nuclear Punainen värjäystä. B. Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä (LCM) kahdessa tapauksessa paljastaa miRNA todennäköisesti ilmaistu syöpäsoluja. Lämpö Kartassa kertainen muutos 17 miRNA yksilöity irtotavarana kasvain näyttö. Samanlaiset differentiaalikaavojen havainnoidaan miRNA ilmaistu syöpäsoluissa havaittuna irtotavarana kasvain. Musta osoittaa, että miRNA ei ollut havaittavissa LCM eristetty syöpäsoluja.

Jotta harjoittaa yleisluontoisempi analyysi, me rikastetaan syöpäsolujen Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä (LCM) H 0,01, *, p 0,05 Studentin t-testiä.

Pallot malli monisoluisten aggregaatteja että askites munasarjasyövän potilailla, joilla luodaan etäpesäkkeitä [22]. Pallot ovat tarkempi esitys kasvaimia ja yhä näyttöä siitä, että lääke vastaukset ovat parempia mallinnettu sferoideja kuin yksikerrosviljelmässä [23], [24], [25], [26]. Sferoidiviljelmiä muodostuminen vaatii tyypillisesti vähintään määrä soluja, mitä seuraa spontaani aggregaatiota, eloonjääminen alle ankkurointi riippumaton olosuhteissa, ja tiivistyminen vahvistaa selviytymisen aggregaatin [27]. Arvioidaan miRNA toiminnon palloset, muodostamme yhtenäinen pallosia ymppäämällä solut agaroosi micromolds [28]. Mielenkiintoista, kaikki ilmaistu miRNA ovat säädellään ylöspäin 3D pallosia verrattuna yksikerroksista käyttäen Taqman array kortti (kuva S4). Testasimme miR-146A ja miR-21 ilmentyminen Taqman qPCR, käyttäen alukkeita kohdistamista vain nämä kaksi miRNA, ja toistettavasti tarkkailla ylössäätöä näiden kahden miRNA in pallosia (kuvio 4A). Sen testaamiseksi, säätely ylöspäin miR-146a on tärkeää pallomainen muodostumista, olemme esti miR-146a kanssa Locked Nucleic Acid (LNA) estäjä. miR-146a esto aiheuttaa amorfinen, väljemmin muodostuu rakeita sekä SKOV-3 ja OVCAR-8-solujen kahden päivän kuluttua (kuva 4B), verrattuna kompaktimpi sferoidit muodostunut negatiivisessa kontrollissa. Vaikutus on dramaattisempi SKOV-3 kuin Ovcar-8. Koska amorfinen luonne varhain muodostavien päivä 2 palloset, emme voineet luotettavasti määrittää niiden kokoa. Tämä havainto viittaa siihen, että varhainen sferoidiviljelmiä muodostuminen vaikuttaa vähentäminen miR-146a toimintaa. 4 päivän jälkeen kun ohjaus pallosia on täydellisemmin muodostunut kun niitä tiivistymisen, esto miR-146a kanssa LNA estäjän pienentää pallomainen kokoa, verrattuna negatiiviseen kontrolliin LNA, in SKOV-3, mutta vain vaatimattomasti OVCAR-8 (kuvio 4C ). 45 sferoidit mitattiin kussakin rinnakkaisnäytteessä, ja kolme riippumatonta rinnakkaista tehtiin. Koko kunkin sferoidiviljelmiä määritettiin ImageJ ja kokojakauma pallosia on edustettuna rasiakuvaajien (kuvio 4C ja 4D). Sferoidiviljelmiä muodostuminen voi olla haastavaa, koska pieniä eroja solujen määrä käytetään siemeniin kukin pallomainen. Agaroosilla muotit, arvioimme useita pallosia voittaa huolet virheitä solujen määrä käyttää siemeniä pallojen kussakin kuopassa mahdollistaa erillisten miRNA riippuvaisia ​​eroja, joita on noudatettava.

24 tuntia transfektion jälkeen anti- miR LNA estäjiä tai pre-miR jäljittelee kuten, 700 /ul SKOV-3 tai 600 /ul OVCAR-8-soluja siirrostettiin 35 hyvin agaroosi micromolds yksi pallomainen muodostavat kussakin kuopassa. A. miR-21 ja miR-146a ovat säädellään ylöspäin 4 päivää SKOV-3 ja OVCAR-8 pallosia havaita käyttäen Taqman qPCR array kortteja kaksi rinnakkaista. Virhe palkit ovat s.e.m. B. estäminen miR-146a 10 nM LNA viiveitä sferoidiviljelmiä muodostumista ja johtaa entistä amorfinen ja löysemmin muodostunut rakeita SKOV-3 ja OVCAR-8 2 päivän kuluttua. Punainen palkki on 400 um. C. Laatikko ja hiuksenhienosti juoni osoittaa, että esto miR-146a kanssa LNA vähentää merkittävästi sferoidiviljelmiä koko kuluttua 4 päivää SKOV-3, ja vaatimattomasti OVCAR-8. Edustavia ilmaisun kuvassa neljän toiston. D. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-150 ja miR-146a parantaa merkittävästi sferoidiviljelmiä muodostumista 4 päivän jälkeen. SKOV-3 ja OVCAR-8-solut transfektoitiin 50 nM esi-miR miR-150 ja miR-146a ennalta MIRS ennen pallomainen muodostumista. SKOV-3 tai OVCAR-8-soluja transfektoitiin, kuten on ilmoitettu. Edustavia pallosia näytetään. Punainen palkki on 400 um. Laatikko ja hiuksenhienosti käyrät kokojakauman 45 pallosia edustavasta kokeesta. Kokeilu toistettiin kolme kertaa. P-arvot määritettiin Studentin t-testiä.

Yhdenmukainen lisääntyneen ilmentymisen miRNA vuonna pallosia olla kriittisiä pallomainen muodostumista, korkeamman miR-150 ja miR-146a ilmentyminen edistää suurempia rakeita SKOV-3 ja OVCAR-8 (kuvio 4D). Esittely miR-150 ja miR-146a esittävät parhaiten yhteen ja suurin vaikutus pallosia verrattuna negatiiviseen kontrolliin ja muut pre-Mirs testattu. Mir-146a, huomaamme pienempiä pallosia, kun miR-146a on estetty (kuvio 4C), ja suurempi pallosia, kun ektooppinen ilmentyminen (kuvio 4D) jälkeen 4 päivää pallomaisten muodostumista. Yhdessä nämä havainnot tukevat miR-146a edistävät sferoidiviljelmiä muodostumista.

miR-150 ja miR-146a kasvu sisplatiinin toleranssi

Kun etäpesäkkeitä on perustettu, munasarjasyöpä on hyvin vaikea hoitaa toistuvia resistenttejä kasvaimet usein uudelleen esiin kuluttua ensimmäisestä kemoterapiaa. Muutokset miRNA ilmaisu voi osoittaa eri fysiologinen tila varten syöpäsolujen etäpesäkkeiden vaikuttaa siihen, miten nämä muutokset vastaisivat kemoterapiaa. Testasimme lisääntyneen ekspression vaikutusta neljän miRNA, säädellään ylöspäin omental vaurioita, sisplatiinilla herkkyys. Annoksesta riippuvainen, joissa käytettiin WST-1-määrityksissä osoittavat, että suurempi ekspressio miR-150 vaatimattomasti lisää sisplatiinin IC

50 SKOV-3, mutta ei OVCAR-8 ja IGROV-1 (kuvio 5A). Muut miRNA, kuten miR-146a, vaikuttaa joko SKOV-3 tai IGROV-1, mutta ei niin tilastollisesti merkittävällä tavalla.

. Solujen käsittely ennen miR-150 matkivat hieman lisää sisplatiinin IC50 SKOV-3 ja IGROV-1, mutta ei OVCAR-8-soluista. WST-1-määritykset suoritettiin 48 tuntia sisplatiinin jälkeen hoidon. Kuvaaja osoittaa keskimäärin 3 biologisten rinnakkaista. Virhe pylväät edustavat s.e.m. B. Kaavio sisplatiinin -eloonjäämiskoe. Solut käsiteltiin kahdesti korkea sisplatiinin johtaa selviytymisen noin 1% soluista. C. miR-150 ja miR-146a ovat säädellään ylöspäin eloonjääneiden solujen 6 päivän jälkeen 50 uM sisplatiinin SKOV-3 ja 7 päivää 30 uM sisplatiinin OVCAR-8 solua verrattuna hoitamattomiin, jakautuvat solut. Tiedot ovat kahtena kappaleena ja virhepalkkeja ovat s.e.m. Taitteen muutos miR-150 on erittäin suuri, koska miR-150 ei ollut havaittavissa jakautuvat solut. C

t asetettiin mahdollisimman vaihtelukoe, 40, arvioida kertaluokkamuutos. D. esto miR-146a 10 nM LNA estäjä vähentää merkittävästi jäljellä solujen SKOV-3 ja vaatimattomasti vähentää eloonjääneiden solujen OVCAR-8 6 päivän jälkeen 50 uM sisplatiinin SKOV-3 ja 7 päivää 30 uM sisplatiinin OVCAR-8 solua. Elossa elinkykyiset solut määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Biologiset rinnakkaisessa kokeessa on esitetty. Virhe palkit ovat s.e.m. E. transfektio 50 nM esi-miR-146A ja pre-miR-150 parantaminen pitkällä aikavälillä selviytymisen 6 päivän jälkeen 50 uM sisplatiinin SKOV-3 ja 7 päivää 30 uM sisplatiinin OVCAR-8-soluista.

huolellinen tarkastelu solujen yksikerrosviljelmässä aikana sisplatiinihoitoon ehdotti, että terveellisempiä solut selvisivät korkeamman ilme miR-146A ja miR-150 suurina sisplatiinia pitoisuuksina. Dynamiikka jäljellä olevia soluja on alle määritysrajan ja WST-1 määrityksessä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet palautuvia lääkkeen suvaitsevainen lepotilassa olevat solut, jotka selviävät tappavan lääkeaineiden pitoisuuksia [29]. Siten tarkastelu eloonjääneiden solujen edustaa vaihtoehtoista mallia selvittämään, miten syöpäsolujen hengissä kemoterapiaa. Testata, jos Metastasoituneessa miRNA edistää selviytymistä tappavien annosten sisplatiinin, tarkastelimme miRNA ilmentymistä elossa jäljellä soluissa yksikerrosviljelmässä alttiina tappavan annoksen sisplatiini 6-7 päivän ajan. Huomaamme, että miR-150 ja miR-146a ovat huomattavasti ajan säännelty eloonjääneiden solujen verrattuna lisääntyvä populaatio (kuvio 5C). miR-150 on huomaamaton OVCAR-8 solua ja alapuolella ABI suositellut kynnysarvoa SKOV-3-soluissa (C

t~36 sykliä) lisääntyvissä soluissa, mutta muuttuu merkittävästi ilmaistu jäljellä eloonjääneiden solujen molemmissa solulinjoissa, mikä viittaa mahdollinen rooli elossa sisplatiinia. Sen testaamiseksi, miR-146a vaikuttaa kykyyn munasarjasyöpäsoluja hengissä pitkän aikavälin sisplatiinihoitoon esto miR-146a kanssa LNA määrä vähenee elinkelpoisten eloonjääneiden jäljellä soluja vaatimattomasti OVCAR-8, ja lisää merkittävästi Skov-3-solut (Kuva 5D). Sopusoinnussa niiden kohonneen ekspression elossa soluissa, huomaamme, että korkeampi ilmentyminen miR-150 tai miR-146a lisää huomattavasti eloonjääneiden elinkelpoisten solujen trypaanisinieksluusiolla kokeessa kuusi (SKOV-3) tai seitsemän (OVCAR-8) päivää lisäyksen jälkeen tappavan sisplatiinin (kuvio 5E). Trypaanisinistä on osoitus elävien solujen lukumäärä ja heijastaa lisääntynyt määrä eloonjääneiden solujen havaitsimme visuaalisesti. Kaikkia ektooppisesti ilmaisi miRNA parantaa selviytymistä viittaa siihen, että vaikutukset miR-150 ja miR-146a ovat erityisiä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että lisääntynyt ilmentyminen miR-150 ja miR-146a edistää selviytymistä, tai ainakin viivästyttää sisplatiinin aiheuttamaa solukuolemaa, vuonna munasarjasyöpäsoluja.

Keskustelu

keskeiset havainnot osoittavat, että etäpesäkkeitä säätää ylös erityisiä miRNA verrattuna niiden ensisijainen kasvaimia ja että näistä miRNA, miR-146A ja miR-150 edistää 3D sferoidiviljelmiä muodostumista ja lisätä suvaitsevaisuutta sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja, mikä viittaa rooli näiden miRNA hengissä tietyillä olosuhteissa. Huomaamme merkittäviä yhteisiä toistuminen ero sääntelyn 17 miRNA, mikä viittaa siihen, että vaatimukset sopeutua omentum ovat hyvin samanlaisia ​​useimmissa EOC potilaista. Yhdessä nämä tiedot tukevat ajatusta, että omental vauriot rikastetaan piirteitä aggressiivinen tauti, joka myös välittää potilaan vaste kemoterapialle. Jotkin näistä ominaisuuksista, kuten miR-146A ja miR-150 ilmentyminen voi olla ainutlaatuinen etäpesäkkeitä, koska ne ovat hyvin nöyrä ilmaistaan ​​eniten primaarikasvaimille meidän aineisto ja TCGA [21]. Alhainen ilmentyminen näiden miRNA vuonna primaarikasvainten liittyy huono yleistä elossaololuku [21]. Koska nämä miRNA ovat usein säädelty vahvistavasti omental vaurioita ja korreloi voimakkaasti ilmaisua primaarikasvainten (Pearson = 0,7 miR-150 ja 0,78 miR-146a), me ennustaa, että korkeampi ilmaisun etäpesäkkeitä liitetään lyhyempi kokonaiselinaikaa ja taudin etenemiseen.

yhtenä tavoitteena oli selvittää ymmärtää, miten samanlaisia ​​tai erilaisia ​​primääri munasarjojen kasvaimia ovat omental etäpesäkkeitä. Edellisiä verrataan nämä kasvaimet ovat hakeneet microarray teknologian tutkia mRNA ekspressiotasoja. Tiukkojen kynnysarvot, suhteellisen pienet erot ensisijaisen ja etäpesäkkeitä raportoitu [15]. Kuitenkin useat tutkimukset raportoivat merkittäviä eroja muilla menetelmillä, mukaan lukien immunohistokemia E-kadheriinin [19], MMP [17] ja että viimeisten tietojen adiposyyttien signalointi vaikuttaa syöpäsolujen omentum [8]. miRNA ovat nousseet keskeisiksi säätelijöinä solun kohtalon ja lukuisat miRNA profilointi tutkimusten mukaan miRNA voi olla suurempi dynaaminen alue niiden ilmaisun eroja kudosten tunnistamisen mahdollistavat erillisten kudosten ja kasvain erityinen ilmentymä allekirjoituksia.

Koska stroomasoluilla eroavat kahden kasvainten, joidenkin suurten miRNA ilmaisu erot voivat olla peräisin näistä soluista. Mitkä, jos mitään, miRNA ilmaisu erot ovat peräisin syöpäsoluista, suoritimme kahden kokeen. Pystyimme havaitsemaan miR-21 ISH, joka osoittaa lisääntynyt miR-21 ilmentyminen H & E-värjättyjä syöpäsolujen (kuvio 2A ja kuvio S5). Nämä tiedot osoittavat myös, että jotkut lisääntynyt miR-21 ilmentyminen joillakin potilailla peräisin stroomasoluilla. Voit suorittaa kattavamman analyysin, yhdistimme Taqman qPCR paneelit, LCM tutkia rikastettua syöpäsolun väestöstä. Nämä tiedot osoittavat, että jotkut miRNA tunnistettu suurin näytöllä (miR-370, miR-124, miR-508, miR-509) ei todennäköisesti ilmaistu syöpäsoluissa, koska ne eivät ole helposti havaittavissa LCM rikastettu väestöstä. Toisaalta, 11/17 ja miRNA, kuten miR-146A ja miR-150, jonka tunnuksena irtotavarana kasvain ilmaistaan ​​ja ylläpitää vastaava ilmaisu eroja LCM rikastunut syöpäsoluja.

Expression profilointi sekä irtotavarana kasvain ja LCM rikastettu syöpäsolujen populaatiot sekä ISH tiedot viittaavat siihen merkittävä säätely ylöspäin miR-21 etäpesäkkeitä verrattuna ensisijainen kasvaimia. miR-21 on hyvin tiedetään olevan antiapoptoottisena, pro-eloonjääminen miRNA monissa syövissä, kuten munasarjojen [30], ja alustavien havaintojen tukevat myös miR-21: n rooli sferoidiviljelmiä muodostumiseen (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot tukevat käsitystä, että omental etäpesäkkeitä voidaan valita olevan resistenttejä kemoterapialle jääneet eloon paeta primaarikasvaimen.

miRNA usein alas-säädellä ilmentymistä sitomalla 3’UTR mRNA. Vaikutus mRNA: n stabiilisuuteen ja kokonais-RNA tasolla on usein vaatimaton [31], [32], arvio mRNA: n ekspression muutoksia voi olla vaikea havaita. Jotta saadaan käsitys siitä, miten säädellään ylöspäin metastasoitunut miRNA ovat välittävien lisääntymistä ja sisplatiini vastaus, arvioimme niiden ennustettu tavoitteita. Huomaamme, että miR-21, miR-146A ja miR-150 mRNA tavoitteet ovat huomattavasti alassäädetty verrattuna satunnaisesti valittuun vastaavasti kokoinen geenin sarjaa (kuva S4), sopusoinnussa näiden miRNA aktiivisesti tukahduttaa mRNA etäpesäkkeitä.

miR-150 on parhaiten tunnettu sen säätelijänä B-solujen erilaistumista ja ajoitus ilmaus on kriittinen sen moitteettoman rooli B-solujen kehitystä [33], [34]. Viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että miR-150 voivat joko edistää tai estää kasvainten [35], [36], [37], [38], jossa korostetaan yhteisiä teema yhteydessä funktioiden miRNA [39], [40]. Emme noudata käänteinen korrelaatio ilmaus aiemmin tunnistettu miR-150 tavoitteet P2RX7 [41] tai EGR2 [35] meidän ensisijainen /etäpesäkekasvainkudoksen data.

miR-146a on tunnistettu tuumorisuppressorina kautta alas-säätely NFKB aktivaattorit IRAK1 ja TRAF6 [42], [43]. Kuitenkin olemme huomanneet, että IRAK1 ja TRAF6 eivät ilmenny SKOV-3 tai OVCAR-8 qPCR (tuloksia ei ole esitetty). Joissakin yhteyksissä, miR-146a on onkogeenisen, tukahduttamalla BRCA1 [44] tai FAS [45]. Emme havainneet merkittävä väheneminen BRCA1, BRCA2, tai FAS ilmaisu, kun miR-146a ektooppinen ilmentyminen (dataa ei esitetty). Suppressio BRCA1 ei olisi järkeä lisääntynyt säilymiseen, kuten vähentynyt BRCA1- /BRCA2 välittämä DNA korjaukseen toimintoja liittyy korkeampaan sisplatiinin herkkyys [46]. Siten miR-146a näyttää toimivan läpi uudella mekanismilla munasarjasyöpäsoluja lisätä selviytymisen.

Oletimme, että muutokset miRNA ilmaisun etäpesäkkeitä verrattuna primaarikasvaimia voi osoittaa toimintoja metastaattinen ympäristössä, jotka poikkeavat primaarikasvaimen ympäristö. Aluksi mallintamaan miten nämä miRNA voi tukea kestävää kasvua ja selviytymistä etäpesäkkeitä, ryhdyimme joukon toiminnallisia kokeita käyttäen vakiintuneita munasarjasyövän solulinjoissa. Käytimme voitto ja tappio toiminta tutkimusten sisplatiinin solujen elinkelpoisuuden määritykset löytää mitään merkittäviä vaikutuksia miR-146A ja miR-150 huumeiden herkkyys tai kasvun munasarjasyöpäsoluja. Alustavat tutkimukset migraation testaamiseksi eivät paljastaneet merkittäviä miRNA riippuvia vaikutuksia (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin huomaamme, että miR-146A ja miR-150 välittäjänä muodostumisen ja koon pallosia. Koska syöpäsolut paeta primaarikasvaimen ja anna vatsaonteloon, ne muodostavat usein aggregaatteja 50-750 um. Sferoidit muistuttavat nämä aggregaatit eristetään potilaista [47], ja muistuttavat ksenograftikasvaimissa parempi yksikerrosviljelmään [48]. Osa muutoksista kuten lisääntynyt ilmentyminen integriinien nähdään perustettu etäpesäkkeitä myös havaittu tässä pallosia (tuloksia ei ole esitetty), mikä saattaa yhteisön vaikutus muistuttaa enemmän ihmisen sairauden [19], [47], [49]. Meidän havainnot että miR-146a on säädelty ihmisen omental etäpesäkkeitä, joiden samanaikainen väheneminen ennustaa mRNA tavoitteita, ja rakeita yhdessä voitto ja lakkaa toimimasta määritysten kaikki viittaavat tärkeä rooli miR-146a muodostumiseen ja ylläpitoon etäpesäkkeitä . Nämä tiedot tukevat myös rooli miR-150, tosin ilman lakkaa toimimasta tietojen perusteella tehdyt johtopäätökset toiminnalliset kokeet eivät ole yhtä vahvoja. Yhdessä sisplatiinin toleranssi määritys, nämä tiedot tukevat mahdollisuutta, että miR-146A ja miR-150 ovat tuettava selviytymistä vaikeissa olosuhteissa, kuten pallomainen kasvu, korkeat pitoisuudet sisplatiinihoitoon, ja sopeutuminen uuteen ympäristöön testin aikana levitystä potilailla.

varoitus tämän tutkimuksen on, että nämä solulinjat eivät välttämättä kerrata keskeisiä piirteitä syöpäsoluja kasvaimissa, kuten ilmaus miR-150 nähdään munasarjojen kasvaimia. Meidän kyvyttömyys kunnolla mallintamaan munasarjasyöpään

in vitro

tai

in vivo

voidaan peittää lisätoimintoja näiden miRNA säädellään ylöspäin omental etäpesäkkeitä. Lyhytaikainen viljelmiä vasta solulinjat tai tutkimista miRNA toiminto eläinmalleissa saattaa olla tarpeen tunnistaa lisätoimintojen näiden miRNA in etäpesäkkeitä. Nämä tiedot korostavat kuinka jotkut miRNA voivat olla tärkeitä selviytymisen tietyissä olosuhteissa ja ovat siten valitut kohonneen ekspression etäpesäkkeitä. Jatkotutkimuksissa tutkitaan miR-146A ja miR-150 käyttämällä

in vivo

malleissa ja yhdessä viljelemisen järjestelmät voivat auttaa tarjoamaan käsityksen toimintoja näiden miRNA.

Yksi suurimmista haasteista hoidossa kehittyneitä