Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet

in vitro

tuumorin vastaisen toimintoja synteettistä Kalkonin johdannainen 4,3 ’, 4’, 5’tetramethoxychalcone (TMOC) munasarjojen syöpäsoluja. Huomasimme, että TMOC inhiboivat ja pesäkkeiden muodostumista sisplatiinin herkkien A2780 ja kestävä A2780 /CDDP sekä munasarjasyövän solulinja SKOV3 on ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla. Hoito A2780 solujen TMOC johti G

0 /G

1 solusyklin pidätyksen kautta alas-säätely sykliini D1 ja CDK4: n ja ylössäätöä p16, p21 ja p27-proteiineja. Olemme osoittaneet, että TMOC saattavat aiheuttaa solujen apoptoosia estävä Bcl-2 ja Bcl-x L, mutta parantaa ilmentymistä Bax ja katkaisun PARP-1. Hoito TMOC myös vähensi hyökkäyksen ja kulkeutumista A2780 soluissa. Lopuksi todettiin, että TMOC esti konstitutiivisen aktivaation STAT3 signalointireitin ja indusoi ilmentymistä tuumorisuppressorigeenin PTEN riippumatta p53: solulinjoissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että TMOC voidaan kehittää mahdollisena kemoterapeuttisen aineen tehokkaaseen hoitoon tiettyjen syöpien, mukaan lukien munasarjasyöpä.

Citation: Qi Z, Liu M, Liu Y, Zhang M, Yang G (2014) Tetramethoxychalcone, joka on kalkonisyntaasia Johdannaissopimukset, hillitsee, Blocks solusyklin etenemistä, ja indusoi apoptoosia ihmisen munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 9 (9): e106206. doi: 10,1371 /journal.pone.0106206

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 03 elokuu 2014; Julkaistu: 02 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Qi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81071839 M. Liu, ja nro. 91129721 ja 81372797 G. Yang ), Kiina Postdoctoral Science Foundation (nro 2013M531126) M. Liu, jonka Shanghai Pujiang Program (11PJ1402200) Shanghain kaupunginhallitus Kiinan G. Yang, ja jonka Jatko Fund opetusministeriön Kiinassa (20120071110079 ) G. Yang. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy peräisin gynecologic naisten kasvaimista. Puutteen herkkien ja erityisiä menetelmiä varhaisen havaitsemisen, lähes 60-70% munasarjasyöpää sairastavilla potilailla diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa [1], [2]. Edistysaskelista huolimatta munasarjasyövän hoitoon, pääasiassa mukana sytoreduktiivisen leikkausta seuraa platinapohjaisen kemoterapian, eloonjäämisaste munasarjasyöpä potilaiden edelleen hyvin alhainen [3]. Kliiniset ongelmia, mukaan lukien hankittu resistenssi perinteisille kemoterapiaan, sekä metastaattisen ja invasiivisia valmiudet taudin ovat vakavasti heikentynyt hoidon onnistumisen [4], [5]. Siksi jatkuva kehittäminen uusia terapeuttisia aineita munasarjasyöpä, erityisesti platinaa resistenttien solujen, on edelleen kiireellinen.

Luonnollinen tuotteita eri kasveista ovat aina tärkeitä löytämään uusia terapeuttisia aineita [6], [7]. Esimerkiksi kalkoni johdannaiset (molekyyleistä, joissa 1,3-difenyyli-2-3propen-1-yksi ryhmistä), yksi tärkeimmistä luokista luonnontuotteita laajaa jakelu mausteita, teetä, olutta, hedelmiä ja vihanneksia, näyttää lukuisia mielenkiintoisia biologisia aktiviteetteja, kuten tulehdusta, mikrobilääkkeiden, antioksidantti, ja syövän vastaisia ​​ominaisuuksia [8] – [10]. Erityisesti, kuten rakenne jäljittelee combretastatiini A-4 (CA-4), 3 ’, 4′, 5’-trimethoxychalcone on raportoitu olevan antimitoottisia ominaisuuksia aiheuttama esto tubuliinin polymerisaatiota [11] – [14].

meidän pyrkimyksiä löytää sytostaattien vastaan ​​munasarjasyöpäsoluja, sarjan CA-4 liittyvät yhdisteet syntetisoitiin ja arvioitiin niiden antiproliferatiivinen toiminta ihmisen epiteelin munasarjasyövän A2780

in vitro

(tuloksia ei ole esitetty). Näiden yhdisteiden joukossa, 4,3 ’, 4′, 5’-tetramethoxychalcone (TMOC, Fig. 1A) hallussaan korkein estävä vaikutus vastaan ​​A2780-soluja. Kuitenkin myöhemmät

in vitro

määrityksissä osoittivat, että TMOC ei keskeyttänyt tubuliinin polymerisaatiota (Fig. 1 B), mikä osoittaa, että syövän mekanismi TMOC vielä selvittämättä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

TMOC syntetisoitiin edellisen raportin ja määritettiin spektrien lukien

1H-NMR,

13C-NMR, ja korkean resoluution massaspektri (HRMS), jotka suuri kanssa sovittiin kirjallisuuden [14], [15]. Puhtaus TMOC oli yli 98%, joka analysoitiin HPLC: llä.

RPMI-1640-elatusaineessa ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Thermo Scientific (South Logan, UT, USA). MTT, propidium- indide (PI), 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI), ja vasta-aine p-Actin ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Gentian violetti ostettiin Solarbio (Beijing, Kiina). Anneksiini V-FICT /PI apoptoosin havaitseminen pakki, invaasio kammiot, matrigeeliä, ja vasta-aineen p21 hankittiin BD Biosciences (Franklin Lakes, NY, USA). Soluhajotuspuskurin ja BCA proteiini iinianalyysikitissä ostettiin Beyotime (Shanghai, Kiina). PVDF kalvo ja kemiluminesenssi reagenssit olivat Milliporesta (Billerica, MA, USA). Vasta-aineet sykliini D1, CDK4: n, p16, p21, Bcl-x L, Bax, STAT3, p53, PTEN, c-myc olivat Santa Cruz Biotechnology. Vasta-aineita fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-STAT3 (Tyr705) ja lohkaistaan-PARP-1 hankittiin Cell Signaling Technology.

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen munasarjan epiteelin syöpäsolun linjat A2780 ja SKOV3 ostettiin ATCC. Sisplatiini kestävä munasarjasyövän A2780 /CDDP luovutti ystävällisesti professori Ling-Ya, Pan [16]. Kuolemattomiksi mutta pre-neoplastisia ihmisen munasarjaepiteelisoluilla T29 oli peräisin munasarjojen pinnan epiteelisolujen solulinjoja menettää tavallisesti-29, kuten aiemmin on kuvattu [17]. -Soluja viljeltiin rutiininomaisesti RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Transfektioon tutkimuksia, solut transfektoitiin ohimenevästi STAT3-CA (konstitutiivinen jatkuvasti aktiivisen mutantin, A661C ja N663C) [18], [19], STAT3-DN (dominantti negatiivinen mutantti, Y705F) [20], tai kontrollivektorilla käyttäen Fugene HD ( Promega). STAT3 konstruktit olivat lahja tri Hesham M. Amin (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA).

In vitro

vastaisen lisääntymisen määrityksessä

in vitro

anti-proliferatiivista aktiivisuutta TMOC mitattiin MTT-reagenssilla, kuten kirjallisuudessa on kuvattu [21]. Lyhyesti, 5 x 10

3 solua 100 ui alustaa kaivoa kohti maljattiin 96-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen, kun niitä inkuboitiin 24 tuntia, soluja käsiteltiin eri pitoisuus TMOC tai DMSO: ta (negatiivisena kontrollina), 24 h, 48 h tai 72 h. Sitten väliaine yhdistettä tai DMSO korvattiin 200 ui tuoretta alustaa, joka sisälsi 10% MTT: tä (5 mg /ml PBS: ssä) kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tuntia. Lopuksi MTT sisältävä väliaine heitettiin pois ja 150 ui DMSO: ta kuoppaa kohti lisättiin liuottamaan formatsaanikiteet äskettäin muodostettu. Kunkin kuopan absorbanssi määritettiin mikrolevylukijalla (Synergy H4, Bio-Tek) noin 590 nm: n aallonpituudella. Esto hinnat proliferaation laskettiin seuraavan yhtälön avulla:

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

5 x 10

2 solua kuoppaa kohti ympättiin kuudella-kuoppalevyille yhden solun tiheyteen. 48 tuntia myöhemmin solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla TMOC tai DMSO: ta (negatiivisena kontrollina), 48 tuntia. Sitten väliaine korvattiin tuoreella kasvualustalla, jotta solukasvun yhden viikon ajan. Solut kiinnitettiin metyylialkoholia 15 min ja värjätään gentian violetti 30 minuuttia. Koloniat, jotka koostuivat yli 50 solusta, laskettiin.

Solusyklianalyysiä

Cell cycle tilan havaittiin virtaussytometrialla mukaisesti aiemmin julkaistu menetelmä, [22], ja analysoitiin Multicycle AV ( ikkunoihin, versio 320) ohjelmisto. Lyhyesti, soluja käsiteltiin ensin eri pitoisuuksilla TMOC tai DMSO: ssa 24 tuntia, ja sitten talteen, pestiin kaksi kertaa 1 x PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan 1 x PBS: ää. Solut kiinnitettiin 4 ml: ssa jääkylmää 75% etanolia -20 ° C: ssa yön yli ja värjättiin 500 ul: PI (50 ug /ml, Sigma), joka sisälsi 0,1% RNaasi (1 mg /ml, Sigma) 15 min tumma ehto huoneenlämmössä. Tämän jälkeen solut analysoitiin virtaussytometrillä (Cytomics FC 500 MPL, Beckman Coulter). Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina kolmesta itsenäisestä määrityksen.

Cell apoptoosin analyysi

apoptoosin havaitsemiseen, soluja inkuboitiin eri pitoisuuksia TMOC tai DMSO: ta (negatiivisena kontrollina) 24 tunnin . Solut otettiin talteen, pestiin kahdesti kylmällä 1 x PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 200 ui sitomispuskuria tiheydellä 1 x 10

5 solua /ml. Sitten solut värjättiin 5 ui anneksiini-V: n ja PI, 15 min pimeässä kunnossa huoneenlämpötilassa ja alistettiin analyysi virtaussytometrialla. Varhaisen apoptoosin arvioitiin perustuu solujen prosenttiosuus anneksiini V + /PI, kun myöhään apoptoosin oli solujen anneksiini V + /PI +. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina kolmesta itsenäisestä määrityksen.

DAPI ja PI-värjäyksellä

Nuclear morfologiset ja kalvo kiinteä muutoksia apoptoosin määritettiin DAPI ja PI-värjäyksellä vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu [23 ], [24]. 3 x 10

5-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin 48 tunnin ajan, minkä jälkeen seuraa käsittely laimentimen tai haluttu pitoisuus on TMOC 24 tuntia. Sillä DAPI-värjäyksellä, solut pestiin PBS: llä kolme kertaa, kiinnitettiin mentolia, ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100, jota seurasi värjäys DAPI (1:2000 laimennuksen, 1 x PBS: ssä) 37 ° C: ssa 15 min tumma. PI-värjäys, solut pestiin PBS: lla kolme kertaa, ja sitä värjättiin PI 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan pimeässä. Värjäyksen jälkeen solut pestiin PBS: llä sitoutumattoman värin pois- (PI) ja havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskopialla (Olympus). Fluoresoivia kuvia rekisteröitiin käyttäen jäähdytettyä CCD-kameraa.

Haavan paranemista määrityksessä

havaitsemiseksi solun liikkuvuus, solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja kasvatettiin 90% konfluenssiin. Yksi naarmu haava luotiin yksikerrossoluissa käyttämällä steriiliä mikropipetin kärki. Tämän jälkeen väliaine solujäte poistettiin, ja tuoretta seerumitonta elatusainetta (ilman FBS: ää täydentämistä), joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia TMOC tai DMSO: ssa. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja kuvat haavoittuneen yksikerroksisen otettiin 0, 36 ja 72 h.

Transwell invaasiomääritys

Cell hyökkäystä määritettiin käyttäen kammioihin etukäteen päällystetty matrigeeliä [ ,,,0],25]. Lyhyesti, 5 x 10

4 solut 300 ui seerumittomassa RPM-1640 ympättiin saliin. Kammio laitettiin 24-kuoppalevylle ja alempi sisälsivät RPM-1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää ja eri pitoisuuksia TMOC tai DMSO: ta (negatiivisena kontrollina). 24 tunnin inkubaation jälkeen solut yläpinnalla kammion huolellisesti pyyhittiin pumpulipuikolla. Solut vaeltaneet kammion läpi kiinnitettiin metanolilla, värjättiin kristallivioletilla ja myöhemmin lasketaan 5 eri alueita kustakin kuopasta alle käännettyä mikroskooppia. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin.

Western blot-analyysi

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TMOC tai DMSO: ta (negatiivisena kontrollina) 24 tunnin ajan, ja sitten otettiin talteen, pestiin kylmä 1 x PBS: ää kahdesti, hajotettiin solujen hajotuspuskuria 30 minuutin ajan jäillä ja sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pitoisuus kokonaisproteiinia määritettiin BCA-proteiinimäärityksellä kit. Yhtä suuret määrät (30 ug per kuorma) proteiinia näytteet altistettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin edelleen polyvinylideenifluoridia (PVDF), joka blokattiin sitten 10% rasvatonta maitoa, ja saatetaan reagoimaan primaaristen vasta-aineiden. Inkuboinnin jälkeen toissijaisen vasta konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP), proteiini bändit kehitettiin kanssa kemiluminesenssi reagenssien.

Tilastollinen

Tiedot laskettiin Graph Pad Prism ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE Arvot IC

50 sovitettiin käyttäen epälineaarista regressiomallia kanssa sigmoidal annosvaste. Väliset vertailut kontrolli- ja testiryhmään määritettiin pariksi

t

testiä tai yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukeyn useita vertailutestejä. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkitsevä

p

0,05 tasolla.

Tulokset

TMOC tukahduttaa solujen kasvua

määrittivät ensin antiproliferatiivisia vaikutuksia ja TMOC ihmisen munasarjakarsinooma- solut, mukaan lukien A2780 (p53 villityypin), A2780 /CDDP (sisplatiini resistentti alalinja A2780, p53-mutantti) ja SKOV3 (p53-tyhjä) soluja, sekä pre-neoplastisia munasarjojen epiteelin T29-soluissa. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (vaihtelee 0,3125-40 uM) TMOC 24, 48, ja 72 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, hoito A2780 solujen TMOC johti vähentää vastaavasti solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuuden annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Samanlaisia ​​vaikutuksia saatiin hoitoon A2780 /CDDP ja SKOV3- soluja (kuvio 2A). Sen sijaan, herkkyyttä T29-solujen TMOC oli paljon alhainen, koska pitoisuus TMOC tehokas T29-soluissa havaittiin 40 uM 72 tuntia. IC

50-arvot laskettiin ja luetellaan taulukossa 1. Näin ollen, nämä tiedot viittaavat siihen, että TMOC ei ole sytotoksinen vaikutus munasarjojen kasvainsoluja riippumatta p53 status, mutta käsittelee vähemmän sytotoksisuus pre-neoplastisia munasarjaepiteelisoluilla. Lisäksi testattiin myös anti-proliferatiivista toimintaa Kalkonin (1,3-difenyyli-2-propen-1-oni), joka on äidin yhdisteen TMOC (taulukko 1). Verrattuna TMOC, kalkoni näytteillä paljon heikko vaikutus esto sekä neoplastisia ja preneoplastisen solujen kasvua, ja esitteli huono vesiliukoisuus, mikä saattaa tarkoittaa, että neljä metyylioksi ryhmää ovat välttämättömiä syövän toimintaa ja fysikokemialliset ominaisuudet.

(A) TMOC esti solujen lisääntymiseen ja ajasta riippuvaisella tavalla. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksissä. (B) edustavat kuvat solupesäkkeet hoidon jälkeen eri pitoisuuksia TMOC 24 tuntia. (C) Pesäkkeenmuodostusta nopeudella hoidon jälkeen TMOC 24 h.

Seuraavissa kokeissa olemme määritti TMOC on pesäkemuodostuksen kyky munasarjasyövän solulinjoissa. Pesäkemuodostusta on

in vitro

solujen eloonjäämistä määritys perustuu kykyyn yhden solun lisääntyä rajattomasti, mikä säilyttää sen lisääntymis- kyky muodostaa pesäkkeitä, joka koostuu vähintään 50-soluissa. Pesäkkeenmuodostus määritys on valittu menetelmä määrittää solun lisääntymis- ja syöttämällä sen jälkeen, kun hoidon sytotoksisten aineiden kanssa, ja nyt käytetään laajasti määrittämään sytotoksisuus indusoitiin eri kemoterapeuttisten aineiden [26]. Tässä tutkimuksessa, kuten on esitetty kuviossa. 2B, hoito A2780, A2780 /CDDP ja SKOV3 solujen TMOC pitoisuuksina 0,3125, 0,625, 1,25 ja 2,5 uM 48 tuntia annosriippuvaisesti esti pesäkkeiden muodostumisen, verrattuna hoidon laimentimen (DMSO). Numerot muodostuneiden pesäkkeiden solut käsiteltiin TMOC tai laimennusaineen oli koottu kuvioon 2C, jotka vahvistivat estetty vaikutus TMOC kasvuun munasarjasyöpäsoluja.

TMOC indusoi G

0 /G

1 vaihe solukierron pysähtymisen

Chemical syöpälääkkeitä voivat estää solujen lisääntymisen kautta solusyklin pidätyksen. Näin ollen ymmärtää, miten solujen kasvu estyi TMOC, solusyklin etenemisen analysoitiin kvantitoimalla DNA-pitoisuus virtaussytometriaa käyttämällä. Käsittelimme A2780 solut TMOC 24 tuntia ja tutki DNA-pitoisuus propidiumjodidilla (PI) värjäys (Fig. 3A). Kuten kuviossa. 3B, kun kontrollisoluja käsiteltiin laimentimen, kun A2780-soluja käsiteltiin suuria pitoisuuksia TMOC 5, 10 ja 20 uM, prosentuaalinen solujen G

0 /G

1 faasi kohonnut 42,3 % 64,1%, ja prosenttiosuus solujen S ja G

2 /M faasi väheni samanaikaisesti. Koska solusyklin etenemistä säätelee sykliini /sykliini-riippuvaisen kinaasin (CDK) komplekseja, hallitsematon ilmaisuja Sykliinien ja /tai CDK voi johtaa solukierron säätelyhäiriötä ja kasvaimen kehittymisen [27]. Siksi me tutki TMOC vaikuttaa Sykliineiksi tai CDK ilmaisuja. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, solujen käsittely TMOC alassäädetty ilmaisuja sykliini D1 ja CDK4, mutta säädelty ilmaisuja p16, p21

CIP1 ja p27

Kip annoksesta riippuvaisella tavalla. Yhdessä muuttuneen ilmaisuja solun Sykliinien ja CDK-inhibiittorit saattavat liittyä solukierron pysähtymisen aiheuttamia TMOC.

(A) Cell cycle jakautuminen hoidon jälkeen eri pitoisuuksia TMOC 24 tuntia. (B) kvantitatiivinen analyysi TMOC käsiteltyjä soluja. (C) asetus solusyklin liittyvien proteiinien A2780 soluissa. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja edustava koe esitetään. *

p

0,05, **

p

0,01 verrattuna kontrolliin.

TMOC indusoi solujen apoptoosia

DAPI ytimiä värjäystä käytettiin visualisoida indusoiman apoptoosin TMOC. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, ydin- apoptoosin TMOC käsiteltyjen A2780 solut tyypillistä tiivistettyä ja hajanaiset kromatiinin värjättiin vahva sinisen fluoresoivan pisteitä, kun taas kontrolli solut värjättiin yhtenäinen sininen [24]. Lisäksi apoptoosi osoitti myös värjäämällä PI, kalvo vajaatoiminta ydin- väriaine, kuten on esitetty kuviossa. 4B. Nämä tulokset osoittivat, että TMOC voivat aiheuttaa solujen apoptoosin. Edelleen määrittää, kuinka monta ja vaihe apoptoottisten solujen, anneksiini-V /PI kaksoisvärjäystä levitettiin määrällisesti apoptoottisten solujen määrässä käsiteltiin TMOC [22]. Kuten kuviossa. 4C ja 4D, yhteensä osuudet värjättyjen solujen anneksiini V + /PI

– (oikealla alempaan neljännekseen edustaa varhaisen apoptoosin) ja anneksiini V

+ /PI

+ (oikealla ylempi Quadrant edustavat myöhään apoptoosin ja kuolio) soluja kasvoi 1,2%: sta 35,5% sen jälkeen, kun hoidon A2780 solujen TMOC 5, 10 ja 20 uM 24 tuntia. Nämä tiedot vahvistivat lisäksi, että TMOC voisi voimakkaasti indusoivien solujen apoptoosin munasarjasyövän solujen annoksesta riippuvalla tavalla.

(A) DAPI ydinten värjäystä on käytetty havainnollistamaan indusoiman apoptoosin TMOC. Nuolet edustavat apoptoottisten solujen. Asteikko bar = 10 um. (B) PI oton analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Mittakaava = 50 pm. (C) edustaja virtaussytometrialla profiilit apoptoosin ja (D) kvantitatiivisia tuloksia saadaan käyttämällä anneksiini V /PI-värjäyksen. (E) Western-blotit apoptoottisten liittyviä proteiineja. Määritys toistettiin kolme kertaa, ja edustava tulos esitetään. *

p

0,05, **

p

0,01 verrattuna kontrolliin.

Seuraavaksi tutkimme signalointireitille mukana TMOC aiheuttama apoptoosin Western blot-analyysi. Osoitimme, että (Fig. 4E), TMOC sääteli ilmentymisen proapoptoottisten proteiini Bax, mutta alassäädetty ilmaisuja anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L on ei riippuvaisella tavalla. Lisäksi, verrattuna kontrollisoluihin, altistuminen TMOC indusoi lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1), markkeri-solujen apoptoosin [28]. Nämä tulokset viittaavat siihen, TMOC saattavat aiheuttaa solujen apoptoosin kautta näitä proteiineja.

TMOC tukahduttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota

Metastasoitunut leviäminen, yksi ominaisuuksia munasarjasyöpäsoluja, on tärkeä tekijä alhainen eloonjäämisaste potilaista [29], kun taas syöpälääkkeitä voi vain estää syöpäsolujen kasvua, mutta se voi myös pysäyttää solujen etäpesäkkeitä. Tässä tutkimuksessa onko TMOC tukahduttaa hyökkäyksen ja muuttoliike munasarjasyöpäsoluja, suoritimme haavan paranemista ja siirtokuoppaan invaasio määrityksissä. Haavan paranemista määrityksessä, kun yksi haava oli naarmuuntunut yksisolukerroksen A2780-soluja, väliaine vaihdettiin seerumittomalla alustalla, joka sisälsi TMOC tai laimennusaineen (kontrollina), jotta vältetään vaikutus soluproliferaation. Kuten on esitetty kuviossa. 5A ja 5B, solujen kulkeutumista väheni merkittävästi TMOC. Tukahduttaminen muuttoliikettä ei johtunut apoptoosin tai kasvun pidätys keskittyminen TMOC 0,5 uM tai 1 uM vain indusoi suhteellisen alhainen myrkyllisyys A2780 soluissa. Saadut tulokset Transvvell- määrityksessä, osoittivat, että TMOC esti hyökkäyksen ja kulkeutumista A2780 soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5C ja 5D).

(A) TMOC inhiboi solumigraation. Edustaja valokuvia soluista otettiin ajankohtana 0, 36 tai 72 tuntia. (B) kvantifiointi haavan paranemista. Kokeet toistettiin kolme kertaa. (C) edustaja valokuvia invasiivisen solujen siirtokuoppaan invasiivisia määrityksissä. Mittakaava = 20 um. (C) kvantifiointi invasiivisia A2780 soluissa. Kokeet toistettiin kolme kertaa. *

p

0,05, **

p

0,01 verrattuna kontrolliin.

signalointireiteissä mukana TMOC välittämää syöpälääkkeen vaikutuksia

Signal anturin ja aktivaattori transkription-3 (STAT3), onkogeeninen transkriptiotekijä, on usein konstitutiivisesti aktiivinen ihmisen syöpäsoluja [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivointi STAT3 on keskeinen rooli selviytymisen, hyper-leviämisen, ja metastasointiin munasarjasyöpä [30], [31]. Kun se on aktivoitu, fosforyloitu STAT3 voi säätää ylös geenien ilmentymistä, kuten apoptoosin estäjät (Bcl-xl, Bcl-2), solusyklin säätölaitteet (sykliini D1) ja onkogeenisten transkriptiotekijöiden (c-myc) tuumorigeneesiin [32], [33]. Siksi käytimme western blot testata onko tukahduttaminen STAT3 signalointireitin oli mukana TMOC välittämää syöpälääkkeen vaikutuksia. Itse asiassa, kuten on esitetty kuviossa. 6A, jossa kasvua TMOC pitoisuuden, fosforylaatiota STAT3 sekä ilmentymisen c-myc, tunnettu alavirran kohde STAT3 [33], [34], on annosriippuvaisesti tukahdutetaan A2780, A2780 /CDDP ja SKOV3 solut, kun taas mitään vaikutusta ekspressiotasot yhteensä STST3 havaittiin.

(A) TMOC hoito esti STAT3 fosforylaatiota ja alassäädetty taso c-myc annoksesta riippuvaisella tavalla. (B) A2780 ja A2780 /CDDP-solut transfektoitiin STAT3 konstitutiivisesti aktiivinen (S3-CA) plasmidin, STAT3 dominantti negatiivinen (S3 DN) plasmidi- tai kontrollivektorilla. (C) otetaan käyttöön S3-CA merkittävästi estänyt anti-proliferatiivista aktiivisuutta TMOC. Sen sijaan otetaan käyttöön S3-DN herkistyneet syöpäsolujen TMOC hoitoon. (D) TMOC esti c-Src fosforylaatiota ja säädelty kasvain surpressor PTEN kaikissa kolmessa solulinjoista, mutta vain säädelty p53 A2780 soluissa. β-aktiini käytettiin yhtä latauskontrollina. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja edustavasta kokeesta on esitetty. *

p

0,05, **

p

0,01 verrattuna kontrolliin.

edelleen varmistamiseksi roolia STAT3 in TMOC aiheuttama sytotoksisuuden, transfektoimme A2780 ja A2780 /CDDP-solujen STAT3 konstitutiivisesti aktiivinen (S3-CA) plasmidin, STAT3 dominantti negatiivinen (S3-DN) plasmidi- tai kontrollivektorilla, vastaavasti, ja sitten määritettiin anti-proliferatiivista vaikutusta TMOC transfektoiduissa soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, käyttöönotto S3-CA merkittävästi resecued anti-proliferatiivista vaikutusta TMOC. Sen sijaan otetaan käyttöön S3-DN herkistyneet syöpäsolujen TMOC hoitoon. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että TMOC voivat saada aikaan sen syövän vastaista aktiivisuutta estämällä STAT3: n signalointireitin.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että konstitutiivinen aktivaatio STAT3 usein liipaisu ei-reseptori-tyrosiinikinaasin c-Src ja negatiivisesti säätelemä tuumorisuppressorien p53 ja PTEN [35], [36]. Näin meillä tutkittiin myös TMOC hillitsevän aktivointi c-Src-kinaasia, ja moduloivat p53 ja PTEN kolmen munasarjasyövän solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 6D, huomasimme, että TMOC annosriippuvaisesti esti fosforylaatiota c-src-kinaasia, kun taas kokonaistaso c-src pysyi ennallaan. Samaan aikaan, TMOC sääteli ekspressiotasot PTENin kaikissa kolmessa solulinjoista, mutta vain säädelty p53 A2780 soluissa.

Keskustelu

Yrittäessään kehittää uusia solunsalpaajiin vähemmän haitallisia sivuvaikutuksia syövän hoitoon, luonnontuotteet ja niiden synteettiset analogit ovat saaneet paljon huomiota [37]. Esimerkiksi, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että useat kalkoni yhdisteitä, sekä luonnosta peräisin ja synteettiset versiot, sytotoksisia ja tuumorinvastaisia ​​vaikutuksia [38]. Tässä tutkimuksessa halusimme tutkia syövän vastaista aktiivisuutta ja taustalla mekanismi TMOC, synteettistä kalkoni yhdiste, munasarjasyövän solulinjoissa. Olemme osoittaneet, että TMOC merkittävästi inhiboivat ja pesäkkeiden muodostuminen A2780, A2780 /CDDP ja SKOV3-solut (Fig. 2), joka viittaa siihen, että TMOC voi olla tehokas kemoterapeuttinen aine vastaan ​​sekä sisplatiini herkkiä ja resistenttejä munasarjasyöpäsoluja. Tärkeää on, olemme huomanneet, että TMOC esillä vähemmän toksisuutta ennalta neoplastisten ihmisen munasarjaepiteelisoluilla kuin neoplastiset solut saman pitoisuuden.

Huomasimme, että TMOC indusoi G

0 /G

1 solusyklin pidätyksen kautta alas-säätely sykliini D1 ja CDK4: n ja ylössäätöä p16, p21 ja p27-proteiineja (Fig. 3C). Sykliini D1 /CDK4 kompleksi on vastuussa solusyklin etenemisen varhaisessa G

1 vaihe ja on usein yli-ilmentyy erilaisissa ihmisen karsinoomia kuten munasarjasyöpä [39] – [41]. P16-proteiini on erityinen estäjä CDK-sykliini D kompleksi, estää fosforylaatiota Rb ja solukierron paluu G

0 /G

1 vaihe [39]. p21 ja p27, jotka kuuluvat CIP /Kip perhe, säädellä negatiivisesti solusyklin etenemistä estämällä CDK-sykliinikompleksien [42].

Apoptoosi on yleensä tasapainoisen tiukasti säännelty antiapoptoottinen ja pro- apoptoottisten efektorit, mukaan lukien proteiinit ja Bcl-2-perheen. Anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L edistävät solun eloonjäämistä ottaa huomioon, että pro-apoptoottinen proteiini Bax indusoi ohjelmoidun solukuoleman. Suhde Bax /Bcl-2 on kriittinen apoptoosin ja määrittää, onko solut käyvät läpi apoptoosin [43]. Esillä olevassa tutkimuksessa, TMOC hoito johti lisääntymiseen Bax, mutta johti laskuun Bcl-2 ja Bcl-x L (Fig. 4E). Kasvu Bax /Bcl-2 suhde +0,07-+1,90 voi olla vastuussa samanaikaista apoptoosin vuoksi Mitokondrioiden kalvon potentiaalia ja inaktivaatioon keskeisten solun proteiinien kuten PARP-1.

Kertyvät tutkimukset antaa vahvaa näyttöä siitä, että STAT3 aktivointi on yhdistetty erilaisia ​​kasvaimia kuten multippelimyeloomaa munasarjasyöpä, rintasyöpä, eturauhassyöpä, ja niin edelleen [44]. Siten tukahduttaminen STAT3 signalointireitin on tullut tehokas tapa syövän hoidossa. Meidän Tässä tutkimuksessa tulokset Western blotit osoittivat, että fosforylaatiota STAT3 ja sen alkupään proteiinityrosiinikinaaseja c-Src (Fig. 6A ja 6D) estyi TMOC, jota tukee myös alas-sääntelyn säädellään transkriptionaalisesti tavoitteet, kuten sykliini D1, Bcl-xL: n ja c-myc [33]. Lisäksi olemme havainneet, että TMOC voisi ajan säätelemään PTEN kaikissa kolmessa solulinjojen kuitenkin vain säädelty ekspressio p53 A2780-soluissa. Vaikka p53 raportoidaan säädellä negatiivisesti fosforylaatiota ja DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT3 helpottamalla tuumorisuppressorigeenin PTEN [36], [45], meidän tietojen mukaan TMOC herättivät anti-leviämisen toiminto ja esti fosforylaatiota STAT3 riippumatta p53 tila, joka voi osoittaa, että syövän vastainen vaikutus on TMOC on p53-riippumatonta.

Yhteenvetona voimme tarjota vahvaa näyttöä siitä, että TMOC estää solujen kasvua ja liikkuvuus, ja indusoi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin ihmisen munasarjasyövän soluihin tukahduttaa STAT3 ja c-Src aktivointi. Kuitenkin lisätutkimuksia voidaan tarvita vahvistaa potentiaalinen sovellus TMOC syövän hoidossa.