Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Perimän häviämä tuumorisuppressoriproteiinia loci on yleinen geneettinen poikkeavuus ihmisen syövissä. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia ehdokas tuumorisuppressorigeeneille kromosomissa 4q25-q28.2 ja hahmotella uusia prognostisia biomarkkerit liittyy peräsuolen syöpä (CRC).

Methods

poistaminen kartoitus kromosomiin 4q25-q28 0,2 suoritettiin 114 satunnaista CRC menetys heterotsygotian tutkimuksessa 11 mikrosatelliittimarkkerin. Romaani ehdokas tuumorisuppressorigeeniä eli

NDST4

, tunnistettiin 4q26. Geeniekspression

NDST4

tutkittiin 52 paria ensisijainen CRC kudosten kvantitatiivisen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio. Allelic menetys

NDST4

geeni määritellään lisäksi 174 peräsuolen karsinoomat menetys Heterotsygotian analyysin, ja sitten arvioitiin kliinistä merkitystä.

Tulokset

Yksi minimaalinen poisto alue oli rajattuja välillä D4S2297 ja D4S2303 loci klo 4q26, jossa

NDST4

oli ainoa geeni, joka oli selvästi jo vaimentua CRC kasvaimia. Laserilla kaapata mikrodissektion,

NDST4

RNA ilmentyminen osoitettiin paksusuolen epiteelisoluissa, mutta oli havaittavissa kasvainsoluissa. Kaikkiaan 30 (57,7%) on 52 peräsuolen karsinoomien osoitti dramaattinen väheneminen

NDST4

geenin ilmentymisen verrattuna vastaaviin normaaleihin limakalvoja. Geneettinen menetys

NDST4

oli merkitsevästi yhteydessä kehittynyt patologinen vaiheessa (

P =

0,039) ja köyhien eloonjäämisaste potilaiden (

P =

0,036).

Johtopäätökset

NDST4

geeni on uusi ehdokas tuumorisuppressorigeeniä ihmisen syövässä, ja menetys sen toiminta saattaisi olla mukana CRC etenemistä. Lisäksi Heterotsygotian menetys määrityksen, joka perustettiin määrittää alleelinen menetys

NDST4

geeni, voisi olla kustannustehokas keino tarjota hyödyllisen biomarkkereiden haitallisten ennusteen CRC.

Citation: Tzeng ST, Tsai MH, Chen CL, Lee JX, Jao TM, Yu SL, et al. (2013)

NDST4

on uusi Candidate tuumorisuppressorigeeniä kromosomissa 4q26 ja sen Geneettiset Loss haitalliseen ennusteen peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (6): e67040. doi: 10,1371 /journal.pone.0067040

Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 tammikuu 2013; Hyväksytty: 13. toukokuuta 2013. Julkaistu: 25 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Tzeng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustusta National Science Council, Executive Yuan (NSC99-2320-B-002-020-MY3), kardinaali Tien sairaalan (CTH-93-1-2A01), ja National Health Research Institutes (NHRI-ex101 -10136BI), Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syistä syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti ja useimmat kasvaimet syntyvät satunnaisesti yhdistämällä erillisten mutaatioiden ja kromosomaalisten muutosten [1] – [3]. Huolimatta aggressiivinen toiminta täydentää erilaisilla adjuvanttia hoitojen ja lisääntynyt ymmärrys geneettisiä mekanismeja taustalla häiriö, ei ole juurikaan parannusta selviytymisen potilaalla on invasiivisia CRC [4], [5]. Vaikka histopatologisia ominaisuuksia ja lavastus aikaan esityksen edelleen tärkein ennustetekijöiden indikaattoreita, monet potilaat, joilla on samanlaiset patologisia piirteitä näyttää huomattavasti eri kliinisiin tuloksiin [6]. Siksi soveltaminen herkkien geneettinen analyysi voi olla käyttökelpoinen tunnistamaan korkean riskin potilaita ja sitten osituksesta suunnittelussa adjuvanttihoito. Lisäksi parannettu ymmärtäminen molekyylitason mekanismeja peräsuolen kasvaimien syntyyn voi tarjota uusia biomarkkereita, että mahdollisia kohteita terapeuttisen intervention sekä varoituksia indikaattorit kirurgisten toimenpiteiden [7].

kromosomaalinen epävakaus on yleisin geneettinen poikkeavuus satunnaista CRC [8], [9]. Huomattavia tutkimukset ovat osoittaneet, että alleeliset tappiot useita alueita kromosomin 4 liittyy vaiheessa etenemiseen, kasvaimen etäpesäkkeitä, ja lyhyempi selviytyminen monissa ihmisen syövissä, että niissä on yhden tai useamman tuumorisuppressorigeenin (APT) loci [10] – [15 ]. Kuitenkin vain harvat APT kromosomissa 4 mukana CRC synnyssä on tunnistettu. Olemme äskettäin suoritettu poisto kartoitus kromosomissa 4 Heterotsygotian menetys (LOH) tutkimus, ja tunnistanut D4S402 lokusta 4q27 että esillä korkeimman alleelinen menetys taajuus 32,5% vuonna 106 satunnaista CRC (meidän julkaisematon data). Esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan CRC-liittyvä APT viereisessä alueella D4S402. Kaksi lähestymistapaa tehtiin: (1) sakon poisto kartoitus kromosomissa 4q25-q28.2 rajata alueen kätkeminen APT, ja (2) analyysit muutokset (geenien ilmentyminen ja alleelisia poistetaan) ehdokas APT perusterveydenhuollossa CRC kasvaimia. Lisäksi geneettinen menetys ehdokkaan TSG arvioitiin varten kliinistä merkitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäytteiden

Kaikkiaan 174 potilasta, joilla satunnaista CRC, joka leikattiin Cardinal Tien sairaalan Taiwan, rekrytoitiin elo 1997 joulukuuta 2008 (taulukko 1). Seurannat tehtiin vasta huhtikuussa 2010. Kaikki 174 potilasta toiminut histologisesti varmistettu peräsuolen adenokarsinooma ilman leikkausta edeltävän kemoterapiaa ja /tai sädehoitoa. Sekä pariksi kasvain ja viereisen normaalin limakalvon kerättiin kunkin potilaan leikkauksen aikana. Lisäksi adenomatoottisen polyyppi kudokset kerättiin 57 potilasta, joille tehtiin colonoscopic polypectomy. Kaikki kudosnäytteet jäädytettiin välittömästi sen jälkeen, kun resektion ja varastoitiin nestemäisessä typessä, kunnes nukleiinihapon uuttamista. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, ja tutkimus toteutettiin noudattaen Helsingin julistuksen ja hyväksynyt Institutional Review Board of Cardinal Tien sairaalan, Taiwan.

LOH Analysis

DNA uutettiin jäädytetyistä kudoksista käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Hienoksi poisto kartoituksen kromosomin 4q25-q28.2 (12,9 cM), LOH tutkimus, jossa paneeli 11 mikrosatelliitteihin suoritettiin 114 paria CRC kudoksen DNA (kuvio 1A ja taulukko 2). Edelleen määrittää alleelinen menetys

NDST4

geenin, LOH tutkimuksessa kaksi mikrosatelliittimarkkerin, MS5850 (UniSTS: 536617) ja D4S1580, tehtiin 174 CRC tapauksissa (kuvio 1A ja taulukko 2). Kussakin alukeparia, eteenpäin aluke syntetisoitiin 6-FAM, VIC tai NED fluoresoivan leiman riippuen amplikonin koko. PCR-monistus tehtiin lopullisessa tilavuudessa 6 ui käyttämällä 20 ng DNA: ta, 500 nM kutakin vastaavien alukkeiden, 200 uM kutakin dNTP: tä ja 0,3 yksikköä AmpliTaq-Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems). PCR suoritettiin seuraavissa sykliolosuhteita: pre-PCR inkubointivaihe 95 ° C: ssa 15 min; jota seurasi 35 sykliä 95 ° C 15 s, 55 ° C: ssa 45 s, ja 72 ° C 30 s; ja lopullinen laajennus 72 ° C: ssa 10 min. Monistetut fragmentit erotettiin 6%: denaturoivissa polyakryyliamidigeeleillä ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), kuten on kuvattu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Normaali ja kasvainten DNA paria verrattiin muutosten määrän alleelin huippuja ja piikin korkeus kunkin merkin avulla GeneScan Analysis ohjelmisto (Applied Biosystems). LOH indeksi jokaisen normaalin ja kasvaimen DNA pari laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, suhde alleelin piikkien korkeuksien lasketaan kunkin kasvaimen näytteen jaettiin alleelin piikin korkeus suhde normaalin vastaavia ohjaus. LOH indeksi ≤0.67 tai ≥1.5, jotka edustavat vähintään 33% laskua kasvaimen alleelin, oli osoitus alleeliset menetys.

. Mikrosatelliittimarkkerin käytetään Heterotsygotian menetys tutkimus. Kolme geenit sijaitsevat minimaalinen deleetioalueella rajaamalla D4S2297 ja D4S2303. Mustat palkit osoittavat

UGT8

ja

NDST4

geenejä.

miR-577

(

MIR577

) sijaitsee intronin

UGT8

. B. Analyysi

UGT8

ja

NDST4

mRNA kasvaimissa (T) ja vastaaviin normaaleihin limakalvojen (N) CRC kudosten RT-PCR.

β-ACTIN

käytettiin sisäisenä RNA valvontaa. C. Analyysi

miR-577

ilmentymistä CRC kudoksissa qRT-PCR. Ilmentymistasojen kasvainten normalisoitiin kuin vastaavassa normaalissa limakalvojen. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD.

RNA uuttaminen

Kokonais-RNA uutettiin jäädytetty kudosten ja 10 CRC-solulinjat (Colo205, HCC2998, HCT116, HCT15, HT29 , KM12 ja SW620 Yhdysvaltain National Cancer Institute, LoVo, SW48, ja SW480 päässä Bioresource Collection ja Research Center, Taiwan) käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Pitoisuus ja puhtaus RNA määritettiin Nanodrop ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific), ja RNA: n eheys varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.

käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)

Kymmenen satunnaisesti valittua CRC tapauksissa käytettiin esitutkimuksessa geenin ilmentymisen. Täydentävä DNA (cDNA) oli käänteistranskriptoituneet kokonais-RNA (2 ug /20 ui reaktiota) käyttämällä High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Käänteistranskriptio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 25 ° C: ssa 10 minuuttia, 37 ° C: ssa 2 tuntia, ja 85 ° C: ssa 5 min. Saatu cDNA laimennettiin 5-kertaisesti dietyylipyrokarbonaatti (DEPC) hoidetun H

2O. Gene-spesifinen aluke, jotka on suunniteltu ulottuu eksonien olivat seuraavat:

NDST4

eteenpäin 5′-TCTGGGAGTTACACCTCG-3 ’ja reverse 5′-TCTTGAGAGGCTTAGTTCTTG-3’;

UGT8

eteenpäin 5′-TTATATTATTCGTCACAATGG-3 ’ja reverse 5′-AAAACTAAGGTCTGACACAGT-3’;

β-ACTIN

eteenpäin 5′- ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3 ’ja reverse 5’-TCATCTTCTCGCGGTTGG -3 ”. PCR-monistus suoritettiin lopputilavuudessa 25 ui käyttäen 2,5 ui laimennettua cDNA: ta, 1 uM kutakin vastaavien alukkeiden, 250 uM kutakin dNTP: tä, ja 1 yksikön Super-Therm Gold DNA Polymerase (Bertec Enterprise). PCR suoritettiin seuraavissa sykliolosuhteita: pre-PCR inkubointivaihe 95 ° C: ssa 10 min; 36 (

NDST4

ja

UGT8

) tai 28 (

β-ACTIN

) sykliä 95 ° C 15 s, 55 ° C: ssa 45 s, ja 72 ° C 45 s; seurasi lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 3 min. Monistetut fragmentit analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla.

Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

kvantifiointia

NDST4

RNA ilmentymisen 52 paria ensisijainen CRC kudokset ja 57 polyypit, TaqMan Gene Expression Assay (Hs00224024_m1, Applied Biosystems) käytettiin viittauksella geenin

TBP

(TATA-sitovan proteiinin, Hs00920497_m1) kontrollina RNA laadun ja määrän. CDNA syntetisoitiin kuten edellä RT-PCR-osassa. Kvantitatiivinen PCR tietoja vangiksi ABI PRISM 7000 Sequence Detection System ja analysoitiin ABI PRISM 7000 SDS Software (Applied Biosystems). Reaktioseos sisältyi 5 ui laimennettua cDNA, 1 ui hydrolyysikoettimella seosta, 10 ui TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), johon on lisätty DEPC-käsiteltyä H

2O lopulliseen tilavuuteen 20 ui . Reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena seuraavissa sykliolosuhteita: inkubaatiovaiheen 50 ° C: ssa 2 min; ja entsyymin aktivointi vaiheessa 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Ilmentymistasojen

NDST4

kasvaimia, tavanomaisen limakalvon ja polyypit normalisoitiin yksittäisen viite-geenin,

TBP

. Kasvain-to-sovitetun normaalin limakalvon suhde

NDST4

RNA ekspressio laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmää, 2

-ΔΔCt [17]. Suhteellinen ekspressiotasot

NDST4

CRC solulinjoissa verrattiin tarkoittaa ilmaus 52 normaalin limakalvojen, joka säädettiin 1.

microRNA 577 Expression Analysis

kvantifiointiin

microRNA 577

(

miR-577

) ilmentyminen 10 paria satunnaisesti valittua ensisijaista CRC kudoksia, pieni RNA uutettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA malleja valmistettiin kokonais-RNA käyttäen TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), joka käyttää varsi-silmukka-alukkeilla taaksepäin. Lyhyesti, 10 ng kokonais-RNA: ta sekoitettiin 0,8 ui varsi-silmukka-RT-alukkeita, 0,15 ui 100 mM dNTP: tä, 1,5 ui 10 x RT-puskuria, 0,2 ui RNaasi-inhibiittoria (20 U /ul), ja 1,0 ui MultiScribe käänteistranskriptaasin (50 U /ul). Seos (lopullinen tilavuus 15 ui) inkuboitiin 16 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 85 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun RT cDNA tuotteita, lisäksi TaqMan-alukkeita ja koettimia, sekoitettiin muiden PCR-reagenssien PCR Universal Master Mix Kit (Applied Biosystems), ja qPCR tehtiin kolmena kappaleena ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. PCR-olosuhteet sisältyvät alkuperäiseen inkubointi 50 ° C: ssa 2 minuutin ajan ja denaturointi 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Käytetyt alukkeet

miR-577

(tuotenumero 4408995) ja

RNU6B

(RNA, U6 pieni ydin- 2, 4373381) ostettiin Applied Biosystems. Koska endogeeninen kontrolli,

RNU6B

monistettiin rinnakkain, ja Ct-arvo

miR-577

normalisoitiin kuin

RNU6B

. Ilmentymistasojen kasvainten verrattiin vastaaviin normaaleihin limakalvoja, jotka säädettiin 1.

Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä

Vahvista

NDST4

RNA ekspressiota spesifisissä solutyypeissä ensisijainen CRC kudokset, peräsuolen syöpä ja epiteelisolut sovitetun normaalin limakalvon kerättiin kaksi CRC tapauksissa, sekä limakalvojen liittyvä lymfoidisoluja kerättiin kolmannesta normaalin kudoksen osassa. Jäädytetyt leikkeet kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen HistoGene LCM Frozen jakson Värjäys Kit (Arcturus Engineering). Solut eristettiin suorittamalla laser kaapata mikrodissektion kanssa AutoPix Automated Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä System (Arcturus Engineering). Kun mikrodissektion solut kaapattu korkki inkuboitiin välittömästi uutto- puskuria, ja kokonais-RNA eristettiin käyttäen PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Engineering) mukaan valmistajan ohjeiden.

Tilastollinen analyysi

välinen yhteys alleeliset menetys

NDST4

geeni ja kliinis muuttujat analysoitiin Studentin

t

-testi (ikä), lineaarinen-by-lineaarinen yhdistys chi-neliö testi ( Dukes ’vaiheita) tai Pearson chi-square test (muille kategorinen muuttujat). Kaksipuolinen

P

arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Elinaika pidettiin väli leikkaus ja viimeisestä seurantaa tai kuolema taudin (kokonaiselinaika, OS), tai viimeisimmän seurannan tai toistumisen (tautivapaan elinajan, DFS). Survival käyrät, arvioitiin Kaplan-Meier menetelmä, vertailtiin log-rank-testi. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin IBM SPSS® ohjelmiston versio 17.0.

Tulokset

NDST4 Gene on Candidate tuumorisuppressorigeeniä kromosomissa 4q26

yhteensä 114 paria ensisijainen CRC kudoksia käytettiin määrittämään minimaalinen poistetaan alueella kromosomissa 4q25-q28.2 käyttämällä LOH-analyysi. Viisikymmentä (43,9%) ja 114 kasvaimia esillä LOH yhden tai useamman mikrosatelliittimarkkerin. Usein Loh, määritellään esiintyy yli 30% informatiivinen kasvainten havaittiin neljässä loci, kuten D4S2297, D4S2303, D4S402 ja D4S2394. Vastaavasti yksi minimaalinen poistetaan alueelta, jonka geneettinen pituus on 1,4 Mb sitten rajattuja välillä D4S2297 ja D4S2303, joka oli mukana 80,0% (40/50) ja kasvainten LOH. Tulokset osoittavat tiheä kromosomin 4q26 menetys peräsuolen karsinoomat, ja paljastaa yksi otaksuttu TSG lokuksen mukana CRC kehittämiseen.

Etsimällä National Center for Biotechnology Information (NCBI) tietokantaan, vain kaksi proteiinia koodaavan geenit,

UGT8

ja

NDST4

, sekä yksi microRNA,

miR-577

, osoitettiin sijaita määritelty minimaalinen deleetioalueella. Ilmaus

UGT8

,

NDST4

, ja

miR-577

seulottiin 10 paria satunnaisesti valittua ensisijainen CRC kudoksissa RT-PCR: llä tai qRT-PCR: llä (kuvio 1B ja 1C). Ilmaisu tasot

UGT8

ja

miR-577

testatussa kasvaimet olivat sopusoinnussa niiden vieressä normaali limakalvoja. Tulokset osoittivat, että

NDST4

geenin ilmentyminen ilmeisesti vähentynyt kuudessa 10 kasvaimia. Tulokset viittaavat siihen, että

NDST4

saattaa olla uusi TSG sijaitsee alueella 4q26, joka usein poistetaan CRC.

NDST4 ilmennetään Normaali Colonic limakalvoja ja polyypit, mutta on vaimentua kolorektaalisyövän karsinoomat

peräsuolen syöpä on peräisin paksusuolen limakalvon läpi kertymistä geneettisiä muutoksia. Ehdokkaaksi CRC-liittyvän TSG,

NDST4

on ilmaistava paksusuolen epiteelissä. Näin ollen, laser talteenotto mikrodissektion on tarkoitus eristää erilaisia ​​solutyyppejä kudosleikkeissä, mukaan lukien epiteeli- ja imusoluja normaalin limakalvon, samoin kuin kasvainsoluja CRC, ja sitten

NDST4

ilmentyminen määritettiin qRT -PCR (kuvio 2). Tulokset osoittivat, että

NDST4

mRNA oli havaittavissa epiteelisolujen molemmissa tapauksissa normaalin limakalvojen, mutta ei niiden pariksi kasvainsoluissa eikä lymfoidisoluissa, vaikka 45 syklin PCR-monistus. Selvittämiseksi downregulation

NDST4

ilmaisun CRC, me analysoitiin edelleen 52 paria ensisijainen kudoksiin. Mukaan Knudson kahden osui hypoteesi, yksi funktionaalinen kopio TSG saattaa edistää osittaisten geenien ilmentyminen [18]. Näin ollen, 0,25-kertainen pieneneminen määriteltiin kynnyksen merkittävän downregulation. Kaikkiaan 30 kasvaimet (57,7%) osoitti selvää laskua

NDST4

ilmentymisen, verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin limakalvojen (kuvio 3A). Lisäksi,

NDST4

geenin ilmentyminen määritettiin myös 57 adenomatoottisia polyyppejä. Toisin CRC kasvaimia, jossa

NDST4

ilmentyminen vähentyneet huomattavasti, adenoomia oli samanlainen ekspressiotaso normaalisti limakalvoille (kuvio 3B). Lisäksi kaikki 10 CRC solulinjat tutkituissa ilmaistuna erittäin alhainen tai havaitsemattomia tasoja

NDST4

mRNA: ta (kuvio 3C). Dramaattinen vähentäminen

NDST4

ilmaisua CRC ylläpitää että

NDST4

on uusi ehdokas APT, ja että menetys sen toiminta saattaisi olla merkitystä peräsuolen kasvaimien syntyyn.

A. Laser capture mikrodissektion eri solutyyppejä CRC kasvain ja vastaaviin normaaleihin limakalvon osissa. Edustavat kuvat HistoGene-värjättyä dioja ennen ja jälkeen laser kaapata mikrodissektion näkyvät. B. ja C. qRT-PCR-analyysi

NDST4

ja

TBP

ilmentymistä vangitut soluissa.

TBP

käytettiin sisäisenä RNA valvontaa. Rn, normalisoitu toimittaja signaali.

. Vertailu

NDST4

ilmaisun välillä kasvain ja vastaaviin normaaleihin limakalvo 52 paria CRC kudoksissa qRT-PCR. Suhteellinen ekspressio (kasvain /Normaali) kulloinkin on merkitty sarakkeessa. B. alassäätely

NDST4

ilmentyminen CRC kasvaimissa mutta ei adenomatoottisten polyypit.

NDST4

ilmaisun suhteessa sisäinen kontrolli,

TBP

, havainnollistetaan kautta rasiakuvaaja analyysi. Viikset tarkoittavat väli 5

th ja 95

th persentiilit. Merkittävä ero ryhmien testattiin Studentin

t

-testi (Paired, kasvain

vs.

Limakalvojen Parittomia, limakalvo

vs.

Polyyppi). N. S., ei ole merkittävä. C. alassäätely

NDST4

ilmentymistä kaikissa 10 ihmisen CRC testatuilla solulinjoilla. Suhteellinen ekspressiotasot CRC-soluja verrattiin keskimääräinen ilmentyminen 52 on normaalia koolonin limakalvoja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD.

Allelic Loss of NDST4 Gene liittyy merkittävästi Advanced patologinen Stage and Poor Survival CRC

tarkasti määrittää geneettisen poistamisen

NDST4

CRC The WebSat, web-ohjelmisto microsatellite markkeri kehittämiseen, käytettiin tunnistamaan lyhyen peräkkäistoistot sisällä

NDST4

geeni [19]. Uusi merkki, MS5850, joka oli suunniteltu tässä tutkimuksessa, ja D4S1580 käytettiin LOH analyysiä 174 paria ensisijaisen CRC kudosten (kuvio 1A). Väliset korrelaatiot geneettinen muutos ja kliinis ominaisuudet on lueteltu taulukossa 1. Kaikkiaan 53 (30,5%), 174 kasvaimet olivat positiivisia alleelinen menetys

NDST4

geenin. Geneettinen poikkeavuus nostettiin huomattavasti kasvaimissa korkeamman patologinen vaiheet (T3 ja T4) (

P =

0,039). Lisäksi, vaikka ei ollut tilastollisesti merkitsevä, kasvava trendi havaittiin etenemistä etäpesäkkeiden ja Dukes vaiheessa (

P =

0,075 ja 0,083, tässä järjestyksessä). Kuitenkin geneettinen menetys ei liittynyt muita kliinis.

korrelaatio alleeliset menetys

NDST4

geenin elossaololuku arvioitiin edelleen. OS analyysi suoritettiin 174 potilaalla, joista OS oli 67,8% (n = 118), jonka keskimääräinen selviytymisen 94 kuukautta. Soveltamalla Kaplan-Meierin selviytyminen käyräanalyysi, alleelinen menetys

NDST4

geeni ennusti huonompi OS (

P

= 0,036) (kuvio 4). Viisikymmentäkolme potilailla, joilla on geneettinen poikkeavuus oli OS 60,4% ja keskimääräinen eloonjääminen 74 kuukautta, kun taas toinen 121 potilaalla oli OS 71,1% ja keskimääräinen eloonjääminen 100 kuukautta. Lisäksi DFS analyysi suoritettiin 118 potilaalla on Dukes vaiheissa B ja C, joista DFS oli 73,7% (n = 87) ja keskiarvo DFS 104 kuukautta. Kuitenkin geneettinen ominaisuus ei tunnistettu merkittäväksi ennustaja DFS potilaalle ryhmän Dukes vaiheissa B ja C.

Kaplan-Meier analyysi suoritettiin vertaamaan potilaille, joilla on alleelinen menetys

NDST4

geeni muille (ei alleeliset tappio). Geneettinen menetys

NDST4

osoittaa merkittävää yhteyttä huonompi selviytyminen (log-rank-testi).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistimme

NDST4

geeni uutena ehdokkaana TSG kromosomissa 4q26, joka on yhteinen deleetio alueella CRC. Toisin kuin normaalissa paksusuolen limakalvon

NDST4

ilmaisu, enemmistö CRC kasvaimia ja solulinjat osoittivat dramaattinen väheneminen geenin ilmentymisen. Lisäksi olemme kehittäneet LOH määrityksessä kahdella mikrosatelliittimarkkerin, ja paljasti, että geneettinen menetys

NDST4

oli merkitsevästi yhteydessä kehittynyt patologinen vaiheessa ja huono selviytyminen, tukemalla tuumorisuppressori funktio NDST4 CRC.

huolimatta tiettyjen molekyyli väyliä taustalla selvitetty peräsuolen kasvainten synnyssä, erilaiset geneettiset muutokset voivat johtaa tiettyyn fenotyyppiin, joka korreloi eri kasvaimen käyttäytymisen ja hoitotuloksia [20]. Siksi tunnistaminen romaani molekyylimarkkereita on tarpeen parantaa strategioiden kohdennettuja hoitomuotojen ja räätälöity potilaan hoidossa. Tutkimuksessa me selvitetty minimaalinen deleetioalueella 1,4 Mb kromosomissa 4q26 satunnaisissa CRC, sopusoinnussa edellisen raportin, että tiheys alleelinen häviämä 4q26 nostettiin peräsuolen karsinoomat verrattuna adenoomia [11]. Vaikka useat aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, ehdokas TSG loci kromosomissa 4 [14], [15], tässä tunnistimme, ensimmäistä kertaa,

NDST4

geeni uutena ehdokkaana TSG klo 4q26. Lisäksi, koska LOH at Monimuotoinen loci mahdollistaa expressivity menettämisen-of-function deleetion APT, tämä geneettinen tutkimus on potentiaalia ja ennustavia merkitystä [21]. LOH määritys perustettu tutkimuksessa voisi olla kustannustehokas keino tarjota hyödyllisen biomarkkereiden haitallisten ennusteen CRC.

NDST4 on yksi jäsen N-deasetylaasi /N-sulfotransferaasien (heparan glukoosiaminyyliryhmä) (NDST ) perhe, joka on vastuussa heparaanisulfaatti (HS) biosynteesi on ydinproteiinin muodostamiseksi heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs) [22], [23]. HSPGs kaikkialle sijaitsevat solun pinnalla, solun sisällä, ja soluväliaineen [24]. HS ketjut HSPGs vuorovaikutuksessa monenlaisia ​​proteiiniligandien kuten kasvutekijä perheisiin sekä siten, edistää kudosten rakenteen ja toiminnan kehittämisen aikana ja aikuisten homeostaasin [25], [26]. Tärkeää on, että sisältö ja jakelu HSPGs muutetaan aikana tuumorigeneesiprosessin jotka ovat sekaantuneet positiivinen tai negatiivinen näkökohtia syövän etenemisen. Esimerkiksi HSPGs toimivat yhteistyössä kasvutekijöiden reseptoreita ja niiden reseptorityrosiinikinaasien vakauttamiseksi signalointikompleksejaan aikana kasvaimen leviämisen ja invaasion [27]. Sen sijaan, HSPGs edistää solu-solu- ja solu-soluväliaine vuorovaikutusta ja rakentaa estävä esteitä tuumori-invaasio. Siksi alentuneesta HSPGs korreloi kasvaimen etenemistä [28], [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa, geneettinen menetys

NDST4

oli merkitsevästi yhteydessä kehittynyt patologinen vaiheessa, jossa viitataan paikalliseen kasvain syvyys hyökkäyksen CRC, mikä viittaa siihen, että lakkaa toimimasta

NDST4

geeni voi heikentää muuttaminen HS ketjujen tietyn HSPGs, mikä lisää invasiivisia kasvainsolujen kautta remodeling vuorovaikutuksen soluadheesion reseptorien ja ligandien.

neljä eri isoformien NDSTs tunnistetaan selkärankaisissa. Toisin kuin yleinen geenin ilmentymistä

NDST1

ja

NDST2

,

NDST3

ja

NDST4

selostukset pääasiallisesti ilmaistaan ​​alkionkehityksen aikana [30], [31 ]. Ilmaisulla kuviot

NDSTs

ei ole koskaan kuvattu ihmisen paksusuolessa. Käyttämällä RT-PCR: llä havaittiin, että selostukset neljän

NDSTs

olivat helposti havaittavissa normaalissa paksusuolen limakalvossa, kun taas vain

NDST4

ilmentyminen säädeltiin vähentävästi useimmissa testattu CRC kasvaimia (tietoja ei ole esitetty ). Mukaan ennustettu rakenne sulfotransferaasien domeenin NDSTs, neljän eri isoformeja voi esiintyä vaihtelevia alustan spesifisyydet [30]. Sheng

et al.

Viime aikoina osoittaneet, että NDST1 suoritetaan muutos on erittäin määräsi tavalla ohjaamaan N-sulfatointi domeenien HS, viittaa siihen, että aloitetaan ja sen jälkeen N-sulfatointi voidaan suorittaa käyttäen eri NDSTs [32]. Kun suhteellisen huono deasetylaation aktiivisuus NDST4 on muunneltua HS ketjuja, NDST4 ehkä mieluummin ne, joiden alkuperäinen muutokseen, jonka muut isoformit [30]. Lisäksi NDSTs on keskeinen rooli HS biosynteesissä koska NDSTs ovat ensimmäiset osallistujat peräkkäinen muokkaaminen prosessi [33]. Mielenkiintoista, koska NDST4 on ainoa isoformi, joka oli merkittävästi vaimentua testatussa CRC kasvaimet (meidän julkaisematon data), muut kolme NDST isoformia eivät näytä kompensoimaan NDST4 puute kaksoispistein erityisolosuhteet. HS ketjut HSPGs paksusuolen limakalvon voisi olla ainutlaatuinen modifikaatiomalleja välittämän ainakin osittain NDST4 aktiivisuutta. Altered HSPGs johtuvat lakkaa toimimasta NDST4 saattavat vaihdella solujen ja kudosten järjestely, ja sitten edistää CRC synnyssä. Kuitenkin muutokset ilmaus HS biosynteettisten entsyymien saattaa olla suhteellisen erilainen syöpää tyyppikohtaista tavalla [34]. Fernandez-Vega

et al.

Raportoitu melko äskettäin, että

NDST4

transkriptio kasvoi 50% 23 soluttautua ductal adenokarsinoomat tutkittu, kun se oli poissa normaaleissa rintakudosten [35]. Yhdessä lisätutkimuksia perusteltua saada oivalluksia rooliin NDST4 kasvaimen kehittymistä ja etenemistä ihmisen syöpien.

tekemisestä rajaamista minimaalinen deleetioalueella kromosomissa 4q26, tämä tutkimus on ensimmäinen tunnistaa

NDST4

geeni uutena ehdokkaana TSG CRC. Lisäksi geneettinen menetys

NDST4

voisi toimia biomarkkeri haitallisten ennusteen potilaille, joilla on CRC. LOH määritys tarkoitus määrittää alleelinen menetys

NDST4

geenin tutkimuksessa voidaan käyttää molekyyli- diagnostinen väline riskin kerrostuneisuus yksittäisten hoitotoimenpiteiden.