Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

LIM ja SH3-proteiinia 1 (LASP-1) on tietyn polttovälin Adhesion Protein mukana useissa pahanlaatuisia kasvaimia. Kuitenkin sen rooli suullinen levyepiteelisyöpä (OSCC) ei tunneta. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia luonnehtia rooliin ja molekyylitason tila /mekanismi LASP-1 in OSCC.

Methods

arvioitiin

LASP-1

mRNA ja proteiini ilmauksia in OSCC solulinjat ja ensisijainen OSCCs. Käyttämällä shRNA järjestelmä, olemme analysoineet vaikutus LASP-1 biologian ja toiminta OSCC solulinjojen, HSC-3 ja Ca9-22. Solut myös injektoidaan subkutaani- arvioida kasvaimen kasvua

in vivo

. Tiedot analysoitiin Fisherin testiä tai U-testi. Bonferroni korjausta käytettiin useiden testaus.

Tulokset

Merkittävät säätely ylöspäin LASP-1 havaittiin OSCC solulinjat (n = 7,

P

0,007) ja ensisijaisen OSCCs (n = 50,

P

0,001) verrattuna normaaleihin kontrolleihin. LASP-1 Knockdown solujen merkitsevästi esti solujen lisääntymistä verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa (

P

0,025) pidättämällä solusyklin etenemisen G2 vaiheessa. Havaitsimme dramaattinen väheneminen kasvua shLASP-1 OSCC ksenografteissa verrattuna shMock ksenografteja

in vivo

.

Johtopäätös

tulokset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen LASP-1 on linkitetty tiiviisti suun tumourigenicity ja edelleen aikaan uusia todisteita siitä, että LASP-1 on keskeinen rooli kasvaimen solujen kasvua välittämällä G2 /M siirtyminen.

Citation: Shimizu F, Shiiba M, Ogawara K, Kimura R, Minakawa Y Baba T, et ai. (2013) yli-ilmentyminen LIM ja SH3 Protein 1 Johtavat Nopeutettu G2 /M-vaiheen siirtyminen Auttaa Enhanced tuumorigeneesiä in Oral Cancer. PLoS ONE 8 (12): e83187. doi: 10,1371 /journal.pone.0083187

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 21 elokuu 2013; Hyväksytty: 11 marraskuu 2013; Julkaistu: 26 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Shimizu et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

huomattavaa näyttöä on siitä, että äkillinen nousu solujen lisääntymistä johtua häiriöitä solusyklin ohjausmekanismi. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet korrelaation solusyklin sääntelyn ja kehittäminen suun okasolusyöpää (OSCCs) [1], [2], [3]. Huolimatta kertyvät tiedot, tarkkaa mekanismia kliinistä hyötyä solusyklin sääntelyn OSCCs ei ole selvitetty.

Syöpä solujen lisääntymistä tapahtuu seurauksena häiriöitä solun syklin valvontamekanismit ja jatkuvaa signalointia varten mitoosin. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että säätelyhäiriötä G2 /M siirtyminen edistää solujen lisääntymistä monissa kasvaintyypeissä [4], [5], [6]. Niistä geenit korreloi G2 /M vaiheessa nukle- LIM ja SH3-proteiinia (LASP-1) on G2 /M vaiheessa pidetään olennaisena onkogeeniselle aktiivisuutta potilailla, joilla on rintasyöpä [7]. LASP-1 identifioitiin alun perin cDNA-kirjastosta metastaattisen rintasyövän etäpesäkkeitä [8]. Se on sijaittava useita sivustoja dynaamisten F-aktiini kokoonpano kuten paikallisissa kontakteissa [9] ja se osallistuu solun tukirangan arkkitehtuuri [10]. Ihmisen syöpää peräisin olevia soluja, kun taas hiljentäminen of LASP-1 johti vahva estää solun kasvun [11], yliekspressio LASP-1 edistänyt merkittävästi kasvaimen kasvua

in vivo

[12]. Lisäksi yli-ilmentyminen LASP-1 on havaittu erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, kuten metastaattisen rintasyövän [11], munasarjasyöpä [13], virtsarakon syöpä [14], medulloblastooman [15], ja hepatosellulaarista karsinoomaa [16].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, LASP-1 yhdessä toisen fokaalisen adheesion proteiini on tärkeä rooli G2 /M-siirtymävaiheen estämällä cdc2 [17], [18], mikä viittaa sen mahdollista suhteessa solusyklin syövän. Näiden havaintojen perusteella olemme arveltu, että LASP-1 liittyy läheisesti suullinen kasvaimien syntyyn nopeutetusti G2 /M siirtyminen.

Nykyisessä tutkimuksessa löydettiin poikkeava ilmentyminen LASP-1 ja arvioitiin korrelaatio sen ilmaisun ja kliinis ominaisuudet OSCCs. Olemme myös suorittaa toiminnallista analyysiä määrittämään biologisia vaikutuksia LASP-1.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi eettinen komitea Graduate School lääketieteen, Chiba University (Hyväksymisnumeroa, 236) ja suoritettiin mukaisesti eettisten normien vahvistetut Helsingin julistuksen mukaisesti. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Kaikki koe-eläimet hoidettiin ja hoidetaan mukaisesti ohjeiden Chiba University. Koe-eläimet tapettiin saattamalla niska sijoiltaan. Teimme kaikkemme lievittää kipua koe-eläimillä. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Chiba University (Hyväksymisnumeroa, 25-221).

Cell Culture and Tissue Näytteitä

Ihmisen OSCC solulinjoja (HSC -3, KON, ja HO-1-N-1) hankittiin Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japani. RIKEN BRC (Tsukuba, Japani) edellyttäen Sa3, HO-1-u-1, HSC-4, ja Ca9-22 kautta National Bio-Resource projekti opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology Japanissa. Cellular identiteetti varmistettiin lyhyellä peräkkäisen toiston profilointia. Ensisijainen viljellyissä ihmisen normaalia suun keratinosyyttejä (HNOKs) saatiin kolme terveiltä luovuttajilta ja toimi tavanomaista valvontaa [19], [20], [21]. Kaikki solut viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Sigma, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Sigma) ja 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä (Sigma) kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% hiilidioksidia /ilmaa 37 ° C: ssa.

Viisikymmentä paria ensisijaisen OSCC näytteiden ja vastaavassa normaalissa suun epiteelikudosten saatiin leikkauksen at Chiba University Hospital. Institutionaalinen Review Board of Chiba University hyväksyi tutkimuksen. Tietoinen suostumus saatiin kaikki potilaat. Resektoitua kudokset jaettiin varten RNA: n eristys ja immunohistokemia (IHC); entinen jäädytettiin välittömästi ja varastoitiin -80 ° C: ssa, jälkimmäinen on vahvistettu 20% puskuroidussa formaldehydiliuosta. Kukin kudos oli diagnosoitu histopatologisesti mukaan Maailman terveysjärjestön kriteerien Department of Pathology, Chiba University Hospital. Kliinis lavastus määritettiin mukaan kasvain-solmu-etäpesäkkeet luokittelu International Union syöpää vastaan. Kaikki OSCC näytteet varmistettiin histologisesti että kasvain oli läsnä yli 90% näytteistä.

mRNA Expression Analysis

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA tuotettiin 5 ug kokonais-RNA käyttäen Ready-To-Go You-Prime First-Strand helmiä (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ja oligo (dT) alukkeen (Hokkaido System Science, Sapporo, Japani). Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen LightCycler® 480 PCR -järjestelmää (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa) arvioimaan ilmentymistason

LASP-1

mRNA OSCC -johdannainen solulinjat ja HNOKs. Aluke sekvenssejä käytetään qRT-PCR olivat:

LASP-1

, eteenpäin, 5′-CAGCCCCAGTCTCCATACAG-3 ’; käänteinen, 5’-ATACTGATGTCGCGGCGG-3 ’; ja Universal anturi # 77. Alukkeiden ja koettimien suunniteltiin käyttäen ProbeFinder qPCR Pitoisuus Design Software, saatavilla osoitteessa www.universalprobelibrary.com. QRT-PCR-monistukset suoritettiin seuraavasti: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuuttia, 45 monistussykliä 95 ° C: ssa 10 sekunnin denaturaatio 55 ° C: ssa 30 sekuntia, pariutuminen /laajennus ja jäähdytys 40 ° C: ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Otteen määrä

LASP-1

laskettiin kunkin standardin käyriä ja normalisoitiin

glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin

(

GAPDH

) (eteenpäin 5 ’ -CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’cell, käänteinen 5’- GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ’, ja Universal koetin # 60) transkriptin määrä määritetään vastaava näytteistä.

Immunoblottausmääritys Analysis

solut hajotettiin puskurissa ( 7 M ureaa, 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, 10 mM Tris [pH 7,4]) kanssa proteinaasinestäjä cocktail (Roche) ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus arvioitiin käyttäen Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteiini uutteet erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 10% geelillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ennen inkubaatiota yön yli ensisijainen vasta-aineet LASP-1 (Applied Biological Materials, Richmond, BC, Kanada), sykliini A, sykliini B, tai fosfo- -cdc2 (Tyr15) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 4 ° C: ssa. Membraani pestiin 0,1% Tween-20: Tris-puskuroitu suolaliuos, inkuboidaan sekundaarisen vasta-aineiden, piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-tai anti-hiiri-IgG: tä (Promega, Madison, WI, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. SuperSignal kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo, Waltham, MA, USA) käytettiin proteiinin havaitsemiseksi. Immunoreaktiivinen bändit tehtiin näkyviksi jäähdytetty CCD-kamerajärjestelmä (ATTO, Tokio, Japani), ja CS Analyzer ohjelmistoversio 3.0 (ATTO) käytettiin signaalin voimakkuuden kvantitoimiseksi.

IHC

IHC suoritettiin parafiiniin upotetut näytteet leikattiin 4 um: n osia käytetään kanin anti-LASP-1 polyklonaalinen vasta-aine (Applied Biological Materials). Endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus estettiin 30 minuutin inkuboinnin 0,3%: ista vetyperoksidiliuosta 100% metanolia. Leikkeitä inkuboitiin 1,5% esto seerumia (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ennen kuin saatetaan reagoimaan yön yli anti-LASP-1-vasta-aine (1: 1000 laimennos) 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Ennen inkuboinnin primaarisen vasta-aineen, levyt pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja käsiteltiin Histofine Simplestain Max-PO (G) (Nichirei, Tokio, Japani). 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAKO, Carpinteria, CA, USA) käytettiin kromogeenin, ja kudosleikkeet vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä, dehydroitiin etanolia, puhdistetaan ksyleenillä ja asennettu Marinol (Muto Pure Chemicals, Tokyo , Japani). Jotta vältettäisiin ei-spesifinen vasta-aineen sitomiseksi ja muita proteiineja kuin antigeeni, immunisoivaa peptidi estää koe suoritettiin. Kolme rinnakkaista osat immunovärjättiin reagoimatta primaarinen vasta-aine kuin negatiivinen kontrolli vahvistaa värjäys spesifisyyden.

määrittämiseksi LASP-1 ekspressiotasot, objektilasit arvioitiin käyttäen IHC pisteytysjärjestelmiä aiemmin on kuvattu [22], [23]. Värjäytyminen intensiteetit pisteytettiin 1, heikko; 2, kohtalainen; ja 3, vahva. IHC pisteet laskettiin kertomalla prosentteina positiivisia kasvainsoluja ja värjäytymisen intensiteettiä. Tapaukset, joiden pistemäärä on yli 113,0 (+3 keskihajonta [SD] sijoituksen normaalia kudosta) määriteltiin LASP-1-positiivisia. Poikkesi ± 3 SD sulku, joka tilastollisesti on vain 0,2% mittauksen ja sen odotetaan laskevan tämän alueen ulkopuolella, käytettiin koska se tuskin vaikuttaa satunnainen kokeellinen virhe tuotettu näytteen manipulointi [24]. Kaksi itsenäistä patologia, joilla ei ollut tietoa potilaiden kliininen tila teki näistä tuomioista.

Transfektio shRNA Plasmid

OSCC solulinjat, HSC-3 ja Ca9-22, korkeammat LASP- 1-proteiinin ekspressio oli stabiilisti transfektoitu LASP-1 shRNA (shLASP-1) tai kontrolli shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) käyttäen Lipofectamine LTX ja Plus Reagenssit (Invitrogen). Transfektoidut solut valittiin väliaineessa, joka sisälsi 1 ug /ml puromysiinille (Invitrogen).

Cellular lisääntymismääritykset

vaikutuksen määrittämiseksi LASP-1 pudotus on soluproliferaatioon shLASP-1- ja shMock- transfektoidut solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille 1 x 10

4 solua /kuoppa, trypsinoitiin ja laskettiin kolmena kappaleena joka päivä 7 päivää hemosytometrillä.

Cell-syklin analyysi

Seitsemän päivää perustamisen jälkeen LASP-1 pudotus soluja, solusyklin jakautuminen tarkistettiin. Synkronoida solut G2 /M-siirtymävaiheessa, solut käsiteltiin 200 ng /ml nokodatsoli (Sigma) 20 tuntia [25]. Solut pelletoitiin, huuhdeltiin PBS: llä, ja tutkittiin CycleTEST Plus DNA reagenssipakkauksen (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Kun oli sentrifugoitu 400 x g 5 minuuttia, 250 ui liuosta A (trypsiini-puskuria) lisättiin, ja seosta inkuboitiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kaksisataa mikrolitraa liuosta B (trypsiini-inhibiittori, ja RNaasi-puskuriin), sitten lisättiin ja seosta inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Lopuksi, 200 mikrolitraa liuosta C (propidiumjodidin tahra liuosta) lisättiin, ja seosta inkuboitiin pimeässä 10 minuutin ajan jäissä. Virtaussytometrinen määritys DNA-pitoisuus analysoitiin käyttämällä Accuri C6 -virtaussytometrillä (Becton-Dickinson). Solusyklin jakaumat kvantitoitiin käyttämällä FCS Express 4 (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

In vivo

tuumorikasvun Pitoisuus

arvioimiseksi syövän kasvua

in vivo

, 2 x 10

7 shLASP-1- ja shMock-transfektoidut solut itsenäisesti ihonalaisesti selkään naisten nude-hiirten BALB /c-nu, ostettu Oriental Yeast Co. (Tokio, Japani). Kaikki koe-eläimet käsiteltiin ja hoidetaan mukaisesti institutionaalisten ohjeiden. Kasvaimet mitattiin käyttäen jarrusatulat välein 3-4 päivää sen jälkeen, kun ne saavuttivat tilavuus 100 mm

3. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa 4π /3 x (leveys /2)

2 x (pituus /2). Hiiret tapettiin 28 päivää. Kasvaimen kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla ja parafiinileikkeillä (4 pm) valmistettiin immunohistokemialla LASP-1 ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 pidettiin merkittävänä. Bonferroni korjausta käytettiin useita testejä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

Tulokset

arviointi LASP-1 Ekspressio OSCC solulinjat

analysoimiseksi ilmaisu asema

LASP-1

, suoritimme qRT-PCR: llä ja immunoblot -analyysejä seitsemällä OSCC solulinjat (HSC-3, HSC-4, KON, HO-1-u-1, HO- 1-N-1, Ca9-22, ja Sa3) ja HNOKs.

LASP-1

mRNA oli merkittävästi (

P

0,007) säädellään ylöspäin kaikissa OSCC solulinjoissa verrattuna että HNOKs (kuvio 1A). Kuvio 1B esittää edustavia tuloksia immunoblottauksella analyysejä. Merkittävä lisäys LASP-1-proteiinin ilmentyminen nähtiin kaikissa OSCC solulinjat verrattuna HNOKs. Expression analyysi osoitti, että sekä transkription ja translaation tuotteet LASP-1 olivat erittäin ilmaistaan ​​OSCC solulinjat.

(A) kvantifiointi

LASP-1

mRNA: n ekspression OSCC peräisin oleva solu riviä qRT-PCR-analyysillä. mRNA: n ilmentymisen tasot normalisoidaan GAPDH. Merkittävät säätely ylöspäin

LASP-1

mRNA nähdään seitsemän OSCC solulinjat verrattuna että HNOKs. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM kolminkertaisten tuloksia (*

P

0,007; U-testi, jossa Bonferroni korjaus). (B) Immunoblottaus analyysi LASP-1-proteiinin OSCC solulinjat ja HNOKs. LASP-1-proteiinin ilmentymistä ajan säännelty OSCC solulinjat verrattuna että HNOKs. Densitometrinen LASP-1-proteiinin Aineisto on normalisoitu GAPDH-proteiinin tasoja. Arvot ilmaistaan ​​prosentteina HNOKs.

Evaluation of LASP-1 ilmentäminen Ensisijainen OSCCs

Selvittää ilmaisun tilan LASP-1 in ensisijainen OSCCs ja sen suhteet on kliinis ominaisuuksia, tutkimme LASP-1-proteiinin ilmentymisen ensisijainen OSCCs ja pariksi normaali suun kudoksia 50 käyttävän potilaan IHC pisteytysjärjestelmä. Vahva LASP-1 immunoreaktiivisuus havaittiin sytoplasmassa OSCCs, kun taas normaalit kudokset oli negatiivinen immunovärjäyksellä (kuvio 2B, C). LASP-1 IHC tulokset vaihtelivat 43-265 vuonna OSCCs (mediaani, 178) ja 2,5-97 normaaleissa suun kudoksissa (mediaani, 35). IHC arvosanat ensisijainen OSCCs olivat merkitsevästi (

P

0,05) korkeammat kuin normaalissa suun kudoksiin (kuvio 2A).

(A) asema LASP-1-proteiinin ilmentymisen ensisijainen OSCCs (n = 50) ja normaalista kollegansa perustuu IHC pisteytysjärjestelmä. IHC tulokset lasketaan seuraavasti: IHC pisteet = 1 × (lukumäärä heikosti värjäytyneiden solujen alalla) + 2 x (lukumäärä kohtalaisen värjäytyneiden solujen alalla) + 3 × (lukumäärä voimakkaasti värjätään solujen alalla). LASP-1 IHC tulokset normaalin suun kudoksia ja OSCCs vaihtelevat 2,5-97 (mediaani, 35) ja 43-265 (mediaani, 178), tässä järjestyksessä. LASP-1-proteiinin ilmentymisen tasot OSCCs ovat merkittävästi korkeampia kuin normaaleissa suun kudoksiin (*

P

0,001; Mann-Whitneyn U-testi). (B, C) edustaja IHC tulokset LASP-1 normaalissa suun kudoksissa ja ensisijainen OSCCs. Alkuperäinen suurennus, × 100. Mittaviivat 5 pm. LASP-1 on erittäin yli-ilmennetään OSCCs verrattuna normaaliin suun kudoksiin.

Taulukko 1 esittää korrelaatiot kliinis ominaisuudet potilaiden OSCC ja asema LASP-1-proteiinin ilmentymisen käyttäen IHC pisteytys järjestelmään. Niistä kliiniset luokittelut, The LASP-1 positiivisia OSCCs korreloivat merkitsevästi (

P =

0,02) kasvaimen koon. Lisäksi merkittävä (

P =

0,04) ero havaittiin LASP-1 ilmentymisen tasojen T1 /T2 ryhmässä ja T3 /T4 ryhmä, joka osoittaa LASP-1 ekspressiotasot ovat korkeampia pitkälle edennyt verrattuna jossa alkuvaiheessa. Mitään merkittäviä suhteita löytyivät iän, sukupuolen, N-alueellinen imusolmuke, histopatologiset tyyppi, ja kasvainpaikkaa.

perustaminen LASP-1 Knockdown Cells

selvää mahdollisista toiminto of LASP-1 OSCCs, The OSCC solulinjat, HSC-3 ja Ca9-22, transfektoitiin LASP-1 shRNA ja ohjaus shRNA (shMock). Ilmentymistasojen

LASP-1

mRNA: ta ja proteiinia shLASP-1-transfektoiduissa soluissa osoitti merkittävää (

P

0,025) laskevan verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A, B ).

(A) ilmentyminen

LASP-1

mRNA shMock- ja shLASP-1-transfektoiduissa soluissa (HSC-3- ja Ca9-22 johdetut transfektantit; 2 klooneja kukin) .

LASP-1

mRNA ilmaisun shLASP-1 on merkittävästi (*

P

0,025; U-testi, jossa Bonferroni korjaus) alhaisempi kuin vuonna shMock-transfektoitujen solujen . (B) Immunoblottaus analyysi LASP-1-proteiinin shMock- ja shLASP-1-transfektoiduissa soluissa (HSC-3- ja Ca9-22 johdetut transfektantit, 2 kloonit, kukin). LASP-1 proteiinin shLASP-1 transfektoitujen solujen köyhdytetyn merkittävästi verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa.

Alennettu Cellular kasvu LASP-1 Knockdown Cells

Tutkia vaikutus LASP-1 solujen lisääntymishäiriöiden kyky, tarkkailtiin solujen kasvua shLASP-1-transfektoituja soluja seitsemän peräkkäisen päivän ajan. Sekä HSC-3 ja Ca9-22 shLASP-1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävä (

P

0,025), vähennys solujen kasvua verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 4).

määrittämiseksi vaikutuksen shLASP-1 soluproliferaation, shLASP-1- ja shMock-transfektoidut solut ympättiin kuudella-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua /kuoppa. ShLASP-1 transfektoitujen HSC-3 ja Ca9-22 solut on merkittävä (*

P

0,025; U-testi, jossa Bonferroni korjaus) lasku solujen kasvua verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa.

knockdovvn LASP-1 indusoi G2 Phase arvosanojen

tutkimiseksi mekanismi, jonka alassäädetty LASP-1 liittyy solusyklin etenemisen, me sitten tutkineet solu- sykli jakaumia shLASP-1-transfektoitujen solujen fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Osuus solujen G2-vaiheen shLASP-1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi (

P

0,025) korkeampi kuin shMock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 5A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa (kuvio S1, S2), mikä viittaa siihen, että down-regulation LASP-1 esti solujen lisääntymisen, joka indusoi G2 pidätys.

(A) virtaussytometrinen määritys DNA-pitoisuuden analysoitiin käyttämällä Accuri C6 -virtaussytometrillä. shLASP-1-transfektoitujen HSC-3 ja Ca9-22 soluilla merkittävää (*

P

0,025; U-testi, jossa Bonferroni korjaus) G2 vaiheen kertyminen vastakohtana shMock-transfektoiduissa soluissa. (B) Immunoblottaus analyysi osoittaa alas-säätely sykliini A ja sykliini B ja säätely ylöspäin fosfo-cdc2 on knockdown soluissa.

tunnistaa mekanismia, jolla alassäädetty LASP-1 lohkot G2 /M siirtyminen, arvioimme ekspressiotaso sykliini A, sykliini B tai fosfo-cdc2 (Tyr15). Proteiini ilmauksia sykliini A ja sykliini B oli alassäädetty taas fosfo-cdc2 (Tyr 15) oli säädelty (kuvio 5B), mikä osoittaa pidätys G2 /M vaihe shLASP-1 transfektoiduissa soluissa.

LASP-1 mainosvideosuositukset tuumorikasvun

in vivo

Jos haluat määrittää vaikutuksen LASP-1 syövän kasvuun

in vivo

, shLASP-1- ja shMock- transfektoidut solut HSC-3 ja Ca9-22 solulinjoja ihonalaisesti selkään naisten nude-hiirten, vastaavasti (3 hiirtä kussakin ryhmässä). Vastaa meidän

in vitro

havaintojen keskimääräinen kasvaimen tilavuus shLASP-1-soluissa oli merkitsevästi (

P

0,05) pienemmät verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa. H 0,05, Mann-Whitney U-testi) inhiboi verrattuna shMock-hiiriin on injektoitu. Immunohistokemia osoitti selvästi, laski immuunivärjäykseen LASP-1 shLASP-1-johdettu kasvainten kuin shMock injektoidaan hiiriin. H & E-värjäys vahvisti, että tuumorisolujen läsnäolo. Alkuperäinen suurennos, × 200.

Keskustelu

Nykyisessä tutkimuksessa, löysimme korkea esiintyvyys lisääntyi LASP-1 ilmentymisen potilailla, joilla OSCC ja merkittävä korrelaatio primaarikasvaimen koko (taulukko 1). Lisäksi knockdovvn LASP-1 in OSCC solulinjat johti dramaattisia vaikutuksia kasvun estäminen

in vitro

ja

in vivo

kautta pidätyksen G2 /M vaiheessa. Nykyiset tiedot saadaan aikaan uusi käsitys rooli poikkeavan LASP-1: n toimintaa, kuten onkogeeninen prosessi tämän sairauden.

merkittävä säätely ylöspäin LASP-1 havaittiin kaikissa OSCC peräisin olevia soluja tutkittiin proteiinin tasot (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että LASP-1 ekspressio on tarpeen suun karsinogeneesiin. Toisaalta, mRNA: n ilmentymistä todetaan riippui soluja (kuvio 1A). Mahdollinen selitys tälle ero on, että LASP-1 proteiineja eri vaikuttaa translaation jälkeisten ubikinaation ja proteolyysi kussakin tuumorisolulinjoissa. Tässä yhteydessä, välillä on eroja

LASP-1

mRNA-ekspression tasoa ja proteiinin tasot on raportoitu virtsarakon syövän solulinjoissa [14].

FACS-analyysi osoitti, että LASP-1 on erityisesti aktiivinen G2 /M-vaiheen OSCC soluissa (kuvio 5A). G2 /M tarkastuspiste on välttämätön solun korjata DNA-vaurioita ennen mitoottisiin merkintä. Kun DNA on vaurioitunut, cdc2 tärkeä säätelijä solun etenemisen, inaktivoidaan lisäämällä fosforylaation jäämiä Tyr 15, joka aiheuttaa solujen pidättämään G2 vaiheessa [26]. Sykliini A ja sykliini B myös muita keskeisiä säätelijöitä solusyklin etenemisen. Sykliini assosioituu cdk2 ja cdc2 ja vaaditaan aloitettaessa S-vaiheeseen ja G2 /M siirtyminen [27], [28]. Samaan aikaan, sykliini B kumppaniaan cdc2 ja säätelee mitoosi saapumisen ja poistumisen [29]. Ekspressiotasot sykliini A ja sykliini B ovat usein säädelty erilaisissa kasvaimissa [30], [31]. Ehtyminen sykliini A ja sykliini B johtaa solusyklin pidätyksen G2 [32], [33]. Aikana G2 vaiheessa sykliini B /cdc2 kompleksi inaktivoi fosforylaatio Try15 ja Thr14 of cdc2 jonka Wee 1 ja MYT 1 kinaasien [34], [35]. Alkaessa mitoosia, cdc25C fosfataasi aktivoi cdc2 poistamalla fosfaattien klo Thr 14 ja kokeile 15 [36], [37] ja estää sykliini B1 /cdc2 kompleksin olemasta inaktivoitu uudelleen [38].

Perustuen näiden havaintojen me seuraavaksi määritellään ilmaus tilan liittyvien geenien aiemmin mainittiin. Kuten odotettua, kun taas sykliini A ja B olivat merkitsevästi alassäädetty, havaitsimme säätely ylöspäin phoshpo-cdc2 on LASP-1 knockdown soluissa. Tämä oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten että hiljaista LASP-1 on vastuussa solujen lisääntymisen takia solusyklin pidätyksen G2 vaiheessa potilailla, joilla on rinta- ja munasarjasyövän syöpiä [11], [13].

Yhteenvetona meidän data osoitti, että LASP-1 voi liittyä syövän etenemisen edistämällä solusyklin etenemisen G2 vaiheessa. On huomionarvoista, että

in vivo

tiedot osoittivat dramaattisen tuumorin kasvua LASP-1 hiljentäminen, viittaa siihen, että tämä molekyyli voi olla hyödyllinen biomarkkereiden leviämisen ja mahdollinen terapeuttinen kohde kehittää syöpälääkkeiden ihmisen OSCCs koska suurin osa potilaista, joiden OSCC on yli-ilmentynyt LASP-1-proteiinia (taulukko 1).

tukeminen Information

Kuva S1.

FACS-analyysi shMock- ja shLASP-1-transfektoitujen HSC-3-soluja. Prosenttiosuus G2 /M-vaiheen shLASP-1-transfektoitujen HSC-3-soluissa oli korkeampi kuin shMock-transfektoiduissa soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0083187.s001

(TIF)

Kuva S2.

FACS-analyysi shMock- ja shLASP-1-transfektoitujen Ca9-22 soluissa. Prosenttiosuus G2 /M-vaiheen shLASP-1-transfektoitujen Ca9-22 solut oli suurempi kuin shMock-transfektoiduissa soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0083187.s002

(TIF)

Kiitokset

Kiitämme Ms Lynda C. Johtosääntö muokkaa tätä käsikirjoituksen.