Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Bacillus Calmette-Guerin (BCG) on tehokkain hoito non-lihas invasiivisia virtsarakon syöpään. Kuitenkin vika ensimmäisen vastauksen tai uusiutuminen viiden ensimmäisen hoitovuoden on havaittu 20%: lla potilaista. Olemme aiemmin havaittu, että

in vivo

estäjää typpioksidin parantunut vaste BCG virtsarakon kasvaimen kantavien hiirten. Se oli kuvattu, että tämä vaikutus johtui korvaava kasvainkudoksen kollageenin toimipistettä. Tavoitteena Tämän työn oli selvittää mekanismi mukana tässä prosessissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

osoittaneet, että BCG indusoi NIH-3T3 fibroblastien proliferaatiota aktivoimalla MAPK ja PI3K signalointireitteihin ja myös eriyttäminen määritetty alfa-sileän lihaksen aktiini (alfa-SMA) ilmaisua.

In vivo

, kasvaimeen rokotus BCG myös lisääntynyt alfa-SMA ja kollageenin ilme. Suun kautta anto L-NAME tehosti profibroottinen vaikutus BCG. Peritoneaalimakrofageille saatu MB49 tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin

in vivo

kanssa yhdistelmähoito BCG L-NAME myös parannettu fibroblastien proliferaatiota. Havaitsimme, että FGF-2 on yksi niistä tekijöistä, vapauttaa BCG-aktivoitujen makrofagien, joka pystyy aiheuttamaan fibroblastien proliferaatiota. Osallistuminen FGF-2 todistettiin käyttämällä anti-FGF2 vasta-aine. Samalla tämä rofagipopulaatio parani haavan paranevuus normaaleilla hiirillä ja FGF-2 ekspressio lisääntyi myös näistä haavoista.

Johtopäätökset /merkitys

havainnot viittaavat siihen, että fibroblastit on kohdistettu BCG sekä suoraan aktivoitu makrofagit immunoterapian yhteydessä virtsarakon hiirimallissa. Meillä on myös kuvattu, ensimmäisen kerran, että FGF-2 on mukana välinen dialogi fibroblastit ja makrofagit indusoi jälkeen BCG hoidon. Se tosiasia, että L-NAME anto parantaa BCG vaikutusta fibroblasteissa, NO inhibitio voisi edustaa uutta lähestymistapaa lisätä tavanomaisen BCG-hoidon.

Citation: Lodillinsky C, LANGLE Y, Guionet A, Góngora A, Baldi A, Sandes EO, et ai. (2010) Bacillus Calmette Guerin indusoi Fibroblastin aktivointi sekä suoraan makrofagien Hiiri virtsarakon syövän Model. PLoS ONE 5 (10): e13571. doi: 10,1371 /journal.pone.0013571

Editor: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, Ranska

vastaanotettu: 05 toukokuu 2010; Hyväksytty: 04 lokakuu 2010; Julkaistu 22 lokakuuta 2010

Copyright: © 2010 Lodillinsky et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CL, YL, AB, AME), ja avustukset Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas-PIP, ja Universidad de Buenos Aires -UBACYT M017 (www.conicet.gov.ar . www.uba.ar). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tällä hetkellä diagnoosi, 60-80% virtsarakon kasvaimet ovat non-lihas invasiivisia ja rajoittuu uroteelin ja /tai lamina propria. Näitä ovat papillaarisen kasvaimet tai karsinooma in situ. Molemmat kasvaimia esiintyy yleisesti samanaikaisesti. Vuonna 1976 Morales et al. [1] ilmoiteta, ensimmäistä kertaa, onnistunut intravesikaalisen käyttö

Bacillus Calmette Guerin (BCG) B adjuvanttina hoito ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä seuraavat höyläysleikkaus. Nyt on yleisesti hyväksytty, että rakkoon BCG on voimakkaampi hoito estämään kasvaimen uusiutumisen kuin mikään rakkoon kemoterapiaa [2]. Kuitenkin noin 20% potilaista joko eivät reagoi aluksi tai uusiutuminen viiden ensimmäisen hoitovuoden [3].

On tunnettua, että BCG generoi paikallisen immunologisen reaktion aktivoitumisen immuunisolujen sekä eritystä sytokiinien, joihin liittyy Th1-solun sytotoksisuuden [4]. Merkittävä kasvu polymorfonukleaarisista ja mononukleaaristen solujen että tunkeutumaan sisään rakkokasvaimista jälkeen BCG-hoidon on havaittu [5]. Koska makrofagit (ilmastointijärjestelmät) ovat fagosyyttisiä ja antigeeniä esitteleviä soluja ja on kyky erittää sytokiineja ja kasvutekijöitä, niitä pidetään paras varustettu solujen mukana BCG immunoterapiassa. Riippuen microenvironment, luonne ja voimakkuus jossa MAC: erilaistuminen tapahtuu, nämä solut kykenevät aktivoimaan eri reittejä ja antanut aihetta erityisiin profiileihin [6]. Vastauksissa ilmastointijärjestelmien vamman tai infektion ovat esimerkkejä monista eri ärsykkeitä, jotka laukaisevat ilmastointijärjestelmät aktivoinnin kudoksissa, näytetään suuri plastisuus. BCG, kun sitä käytetään immunoterapiaa virtsarakon kasvaimia, prosessoidaan ilmastointijärjestelmät ja urothelial soluja, jolloin alussa tulehdussytokiinien, joista osa voi olla vastuussa tiettyjä haitallisia vaikutuksia potilailla [7], [8]. Yksi välittäjäaineiden tämän tulehduksellinen prosessi on typpioksidin (NO), tuotetaan perheen NO-syntaasin (Noss). Tulehduksellisten sytokiinien ja /tai bakteeri-tuotteilla on yleensä aktivoida ilmentymistä indusoituvan NOS (iNOS) isoformi, joka tuottaa suuria määriä NO. iNOS ei ilmenny normaaleissa virtsarakon epiteelissä, mutta on havaittu varhaisessa virtsarakon kasvaimen uusiutumista [9], ja on raportoitu, että iNOS ilmentyminen kasvainsoluissa voisi liittyä reagoimattomuus BCG [10]. Olemme aiemmin raportoitu, että in vivo anto BCG MB49 kasvaimen hiirille väheni kasvaimen kasvua, ja että yhdistetty hoito BCG kanssa NOS-inhibiittorin L-NAME merkittävästi parantaa kasvaimen regression korvaamalla tuumorikudoksen kollageeni-asemien, jotka muistuttavat haavan paranemista [11] . Nykyinen tulokset viittaavat siihen, että valvonta virtsarakon kasvaimen uusiutumista BCG hoito liittyy strooman uudelleenjärjestely ja että NO estäminen voisi parantaa kudoksen uudelleen. Haavan paranemista on esimerkki kudoksesta uudelleenjärjestelyn, koska sen jälkeen, kun haava sukupolvi, kasvutekijöitä vapautuu solunulkoiseen matriisiin indusoi tulehduksellinen prosessi, joka mahdollistaa solujen vaeltamiseen [12]. Muun muassa ilmastointijärjestelmät ja fibroblasti ovat tärkeitä solujen mukana tässä prosessissa. Fibroblastien vaeltavat kohti vahingoittunut vyöhyke, erilaistuvat myofibroblasteja ja syntetisoida soluväliaineen proteiineja, jotka mahdollistavat supistuminen ja lopulta haavan lähellä. Kun haavan paranemisen yhteydessä, kasvutekijät tällainen fibloblast kasvutekijä-2 (FGF-2) ja transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-beeta) erittämä MAC, stimuloivat fibroblasteja, jotka ovat vastuussa synteesi, kerrostuminen ja remodeling soluväliaineen [13]. FGF-2 tunnistettiin alun perin perus kasvutekijä, joka stimuloi NIH-3T3-fibroblasteja. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet roolin FGF-2: kudosfibroosi, jossa tämä tekijä on lisääntynyt akuuttien haavojen hoidossa, ja sillä on rooli granulaatiokudoksen muodostumista, reepithelization ja kudoksen uudelleen [12], [14].

Tietääksemme ei ole tietoa rooli kudoksen uudelleen BCG käytettynä virtsarakon syövän hoidossa. Siksi tavoitteena työmme oli arvioida vaikutusta BCG fibroblastien aktivoitumisen mitattuna MAPK ja PI3K signalointireitteihin ja kollageeni I, ja alfa-sileän lihaksen aktiini (alfa-SMA) ilmaisua. Koska Macit ovat mukana sekä BCG vasteen ja kudosten yritysjärjestelykokonaisuuteen havaittu prosessi haavan paranemisen [6], [15] me arvioitiin myös roolia MAC: alle BCG hoito ja NO esto hoito, vuonna fibroblastien aktivoitumista haavan paranemista malli . Tulosten perusteella näyttää, että osana mekanismien virtsarakon syövän valvontaa, BCG indusoi aktivointi fibroblastien joko suoraan tai MAC:, että vapauttamalla liukenevia tuotteita, voivat Yksistään aktivoida fibroblasteissa. Osallistumista NO negatiivisena säätelijänä tätä prosessia myös osoitettu.

Tulokset

BCG indusoi NIH-3T3 leviämisen

On kuvattu, että BCG pystyy aiheuttamaan solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin virtsarakon kasvainsolulinjoissa [15], [16]. Kuitenkin yksi jäljellä kysymys voisi olla mikä olisi vaikutus BCG sidekudosmuodostussoluilla? Tähän kysymykseen NIH-3T3-soluja viljeltiin eri pitoisuuksia BCG. Kuten on esitetty kuviossa. 1A ja 1B, BCG indusoi leviämisen NIH-3T3-solut, arvioidaan sekä laskemalla solujen lukumäärä ja MTS-määrityksellä. Induktio fibroblastien proliferaatiota havaittiin BCG pitoisuudet 1,5 x 10

6 CFU /ml enintään 3 x 10

6 CFU /ml, vähentyneet suurempina pitoisuuksina 6 × 10

6 CFU /ml. Tuloksemme osoittavat poikkeamia, kun määritetään leviämisen tehtiin joko laskemalla solujen lukumäärä tai MTS (kuvio 1 A ja vastaavasti B) konsentraatio on yhtä suuri tai suurempi kuin 6 x 10

6 CFU /ml. Mielestämme tämä ero liittyi parantaa mitokondrioiden toiminnan aiheuttama suuria määriä BCG. Näin ollen seuraavat kokeet suoritettiin 3 x 10

6 CFU /ml BCG, joista on sopimus kahden muotojen kvantifiointiin. Sen arvioimiseksi, PI3K ja MAPK reitit ovat mukana BCG aiheuttama fibroblastien proliferaatiota, olemme analysoineet vaikutuksia LY 294002 ja PD 98059, inhibiittorit PI3K ja MAPK polkuja vastaavasti, fibroblastien proliferaatiota aiheuttama BCG. Olemme myös arvioineet fosforylaatiota ERK ja AKT, kaksi aktivoitua molekyylejä, jotka ovat avain näiden reittien. Havaitsimme, että LY (20 uM) kykeni inhiboimaan indusoimaa BCG 24 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 1 C), ja että PD (50 uM) esti lisääntymisen aiheuttama BCG 48 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 1 D ). Kuten on esitetty kuviossa. 1E ja 1F, BCG indusoi nopean fosforylaation ERK ja AKT 5 min. Western blot analyysit paljastivat, että fosforylaatiota AKT stimuloitiin 5-10 min, pienenee 20 min (Kuva. 1 E). BCG indusoi myös ERK1 ja ERK2 fosforylaation jälkeen 5 min, jonka jälkeen vähentynyt 30 minuutin kuluttua (Fig. 1 F). Tämä vuorovaikutus BCG ja fibroblastien liittyy sekä lisääntymiseen ja selviytymisen kautta. Nämä tiedot viittaavat siihen, että BCG tavoitteita ei vain kasvainsoluja ja MAC, mutta myös fibroblasteissa.

(A) NIH-3T3-fibroblastien käsiteltiin eri pitoisuus BCG: ssa 24 tuntia. Solut laskettiin tai (B) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin ei-radioaktiivinen solujen hihittää menetelmä (MTS), vs kontrolli: p 0,05. (C) vaikutus LY 294002 ja (D) PD 98059 arvioinut MTS fibroblastien stimuloidaan BCG (3 x 10

6 CFU /ml) 24 ja 48 tuntia vastaavasti a: p 0,05 kontrolliryhmään, b: vs BCG. Fibroblasti stimuloitiin BCG (3 x 10

6 CFU /ml) ja p-AKT (E) ja p-ERK (F) määritettiin Western blot. Suhteellinen fosforylaatio tasot normalisoituivat kokonaisproteiinin ja suhteutettuna kertamuutos Valvonnassa: p 0,05.

Leviämisen NHI-3T3-soluja tehostettiin L-NAME 0,5-4 mM (p 0,05) pitoisuutena riippumattomalla tavalla (tuloksia ei ole esitetty). Kun fibroblasteja käsiteltiin yhdistetty protokollan, korkein leviämisen aktiivisuutta havaittiin BCG 3 x 10

6 CFU /ml plus L-NAME 2 mM (kuvio 2). Tämä vaikutus estyi LY 294002 ja PD 98059, mikä osoittaa, että L-NAME pystyy parantamaan BCG-indusoitua proliferaatiota NIH-3T3-soluissa välitteisen MAPK ja PI3K signalointireittejä.

NIH-3T3-fibroblastien käsiteltiin BCG (3 x 10

6 CFU /ml), L-NAME (2 mM) tai BCG ja L-NAME läsnäollessa LY 294002 ja PD 98059 24 ja 48 tuntia vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS. a: p 0,01 vs valvonta; b: p 0,05 vs BCG tai L-NAME yksin; c: p 0,01 vs niiden valvonta.

BCG indusoi NIH-3T3 erilaistuminen

aktivointi fibroblastien myofibroblasteja, ratkaiseva vaihe haavan paranemisen, on ominaista kehittäminen intracytoplasmic rasitukseen liittyviä säikeitä, jotka antavat näiden solujen kyky kehittää jännitteitä, ja lisääntynyt synteesi soluväliaineen komponenttien, kuten kollageenin tyypin I [17], [18]. Tärkein markkeri fibroblasti /myofibroblastin fenotyypin siirtymä on novo Expresión alfa-sileän lihaksen aktiini [19]. Joten, olemme analysoineet a-SMA ja kollageeni I indikaattoreina fibrogenic aktiivisuus ja arvioitiin näiden molekyylien ilmentyminen NIH-3T3-solut, joita käsiteltiin BCG.

määrittää paras annos BCG, immunofluoresenssi molemmat proteiinit oli suoritetaan fibroblasteissa käsiteltiin eri pitoisuuksilla BCG: ssa 24 tuntia (dataa ei esitetty). Vahvin ilmentyminen sekä alfa-SMA ja kollageeni I havaittiin 3 x 10

6 CFU /ml BCG (Fig. 3A), joten tämä konsentraatio valittiin suorittaa Western blot-analyysit. Kuvio 3B esittää, että 3 x 10

6 CFU /ml BCG kykeni indusoimaan kollageenia I ilmentymisen jälkeen 6 h hoidon, joka ilmaisu 2,5-kertaa suurempi kuin kontrolleilla sen jälkeen, kun 12 tuntia hoidon jälkeen. Merkittävä induktio alfa-SMA kuluttua 12 h BCG hoito havaittiin, loput lisääntyi 48 tunnin kuluttua hoidon. Yhdessä tiedot osoittivat asti, voisimme hypoteesin, että fibroblasti aktivointi voi tapahtua myös in vivo.

(A) Immunofluoresce värjäys NIH-3T3 käsitelty BCG (3 x 10

6 CFU /ml) 24 tunnin ajan osoitti, anti-kollageeni I ja anti-alfa-SMA-vasta-ainetta. Asteikko: bar = 100 um. (B) Western Blot fibroblasti- homogenaateista käsiteltiin BCG (3 x 10

6 CFU /ml) eri aikoina kartoitettiin kollageeni I ja alfa-SMA induktio. (C) Densitomet- yksikköä kollageenin I tai (D) a-SMA määritettiin käyttäen analyysin ohjelmisto, suhteellistavat beta-aktiini ja suhteutettuna kertamuutos määräysvallan a: p 0,05, b: p 0,01.

BCG indusoi fibroblastien aktivoitumisen kautta makrofagien

in vitro

ja indusoi kollageenin ja alfa-SMA ilmentyminen MB49 kasvaimissa

in vivo

Koska suoraan hoidon BCG indusoi fibroblastien lisääntymistä ja ilmastointijärjestelmät eivät joitakin tärkeimpiä solut BCG vastauksia, me arveltu, että on olemassa dialogi välillä fibroblasteja ja ilmastointijärjestelmät alle BCG hoito. Jotta testata tätä, me tutkimme, ilmastointijärjestelmät käsitelty BCG voi vaikuttaa lisääntymistä ja erilaistumista fibroblasteissa. Ensin arvioidaan NO tuotantoa ilmastointijärjestelmät käsitelty BCG. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, vatsakalvon MAC päässä on kasvain käsiteltiin in vivo BCG tuotettu suurempia määriä NO kuin ei-käsitellyn niistä. In vitro, hoidossa MAC: RAW 264.7 BCG lisääntynyt NO tuotantoa. Arvioidaan roolia liukoisen poistettujen tuotteiden ilmastointijärjestelmien, saimme medium (CM) peräisin vatsakalvon Macien tuumoreita kantavaa hiirtä joko käsitelty in vivo tai BCG +/- L-NAME. Havaitsimme, että CM peritoneaalisista MAC: kasvain-hiirille (MAC-T) eri ryhmien indusoi fibroblastien proliferaatiota. Erityisesti CM Macien tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin in vivo BCG (ilmastointijärjestelmät-T-BCG) plus L-NAME aiheuttama korkein fibroblastien leviämisen nopeus in vitro. CM käsittelemättömästä RAW 264.7 ei muuttanut fibroblastien proliferaatiota. Kuitenkin in vitro hoidossa RAW 264.7 BCG joko yhdistettynä tai ei L-NAME, samalla tavalla vatsakalvon ilmastointijärjestelmät, indusoi myös NIH-3T3 leviämisen (Fig. 4B).

(A) EI tuotanto määritettiin supernatanteissa sekä vatsakalvon Macien MB49 kasvain hiirille (ilmastointijärjestelmät-T) ja RAW 264.7 soluja käsitellään in vivo BCG (6 x 10

6 CFU /ml) tai in vitro (3 x 10

6 CFU /ml) vastaavasti, arvioitiin supernatantissa Griessin reagenssia. a: p 0,0001 kontrolliryhmään verrattuna. RAW 264.7-soluja käsiteltiin BCG (3 x 10

6 CFU /ml) 24 tuntia, ja sitten solut pestiin perusteellisesti PBS: llä. Seerumitonta alustaa lisättiin ja inkubointia jatkettiin 24 tuntia, jolloin saatiin CM. (B) fibroblasti hoidettiin 48 tuntia kanssa CM peräisin vatsakalvon tai RAW 264.7 soluja oli aiemmin käsitelty BCG (3 x 10

6 CFU /ml) plus L-NAME (2 mM). Fibroblasti elinkelpoisuus arvioitiin MTS ja suhteutettuna prosentteina kontrollista (RAW 264.7 tai NIH-3T3 käsittelemätöntä solulinjoja), a: p 0,05 ja b: p 0,01 kontrolliryhmään verrattuna, c: p 0,05 vs ilmastointijärjestelmät-T ohjaus. (C) Western Blot määrittää kollageeni I ja alfa-SMA päässä fibroblastien homogenaateista käsiteltiin 24 h CM RAW 264.7 aiemmin käsiteltiin 24 tunnin ajan BCG plus L-NAME. Suhteellinen ilmentymistason normalisoitiin beeta-aktiini ja suhteutettuna kertamuutos Valvonnassa: p 0,05, b: p 0,01. (D) Masson trichome (yläpaneeli) ja immunohistokemiallisella värjäyksellä (alapaneeli), määrittää kollageenisäikeiden ja alfa-SMA vastaavasti, suoritettiin MB49 kasvaimia kasvaa ihonalaisesti hiirissä, joita käsiteltiin BCG, L-NAME tai BCG + L-NAME. Valkoiset nuolet osoittavat sinistymisen- kollageenin kuituja. Keltaiset nuolet osoittavat ruskea positiivista värjäytymistä alfa-SMA. Asteikko: bar = 100 um.

CM saatu RAW 264.7 aiheuttama kollageeni I ilmaisun fibroblasteissa. Ilmaisu oli suurempi, kun CM oli ilmastointijärjestelmien käsitelty BCG, ja tämä vaikutus oli edelleen korkealla alle L-NAME lisäksi. CM saadut RAW 264.7 käsitelty BCG plus L-NAME indusoi myös alfa-SMA ilmentymisen (Fig. 4C). Nämä tulokset näyttävät osoittavan, että on olemassa joitakin liukoisia tekijöitä erittyy ilmastointijärjestelmien aktivoidaan BCG jotka voivat indusoida fibroblastien proliferaatiota ja aktivointi. Kun tavoitteena arvioida tätä vaikutusta in vivo analysoitiin kollageenin kerrostumista ja alfa-SMA ilmentymisen MB49 on kasvain alle BCG ja L-NAME hoitoa. Tulokset osoittavat, että sekä BCG ja L-NAME, ja niiden yhdistelmä indusoi laskeuman kollageenisyistä näiden kasvainten. BCG ja L-NAME myös indusoima alfa-SMA verrattuna kontrolliryhmään. Kuitenkin voimakkaampi värjäys alfa-SMA havaittiin käsitellyt kasvaimet BCG plus L-NAME. Nämä tulokset viittaavat siihen, että BCG voi aktivoituvat fibroblastien in vivo, ja että tämä vaikutus on parannettu NO: n estäminen tuotannon.

Typpioksidi esto parantaa

in vivo

haavan paranemista aiheuttama vatsakalvon ilmastointijärjestelmät mistä on kasvain hoidettiin BCG

määrittämiseksi toimintakykyä ilmastointijärjestelmien alle BCG hoito ja sen sääntelyä NO, in vivo kokeessa haavan paranemisen suoritettiin. Vatsakalvon ilmastointijärjestelmät-T joko käsitelty tai ei BCG in vivo pantiin selkä ihon haavan normaalien hiirten. NO-inhibiittorit L-NAME ja 1400W lisättiin haavoihin joko yksin tai yhdistettynä ilmastointijärjestelmät. Pinta Haava merkittävästi vähentynyt, kun MAC: normaalista (tuloksia ei ole esitetty) tai MAC:-T lisättiin haavan verrattuna valvontaa, jossa vain PBS-glyserolia lisättiin. On tärkeää huomata, että lisäksi NO-inhibiittorit L-NAME tai 1400W yksin pystyivät merkittävästi vähentää pinnan haavan. Kun vatsakalvon Macien on kasvain, joka oli saanut BCG tuumorinsisäisesti (ilmastointijärjestelmät-T-BCG) lisättiin haavan, prosenttiosuus haavan oli vähentynyt verrattuna haavat MAC:-T. Kuitenkin, kun nämä ilmastointijärjestelmät-T-BCG lisättiin 1400 W, haavan paranemista korko lisääntyi merkittävästi (Kuva. 5A).

(A) Peritoneaalisille Macien kasvain hiirille joko käsitelty tai ei BCG ( ilmastointijärjestelmät-T-BCG ja ilmastointijärjestelmät-T vastaavasti), sijoitettiin selkäpuolen iholle haavan normaalien hiirten. L-NAME (2 mM) tai 1400 W (1 uM) lisättiin päälle haava. Haava sulkeminen laskettiin prosenttiosuutena alkuperäisen haava-alueen (päivä nolla), joka on: p 0,01, b: p 0,001 vs PBS-gli, c: p 0,05 vs ilmastointijärjestelmät-T-BCG ohjaus. (B) Peritoneaalisille ilmastointijärjestelmät-T-BCG sijoitettiin selkäpuolen iholle haavan hiirien annettiin suun kautta L-NAME (0,2 g /kg hiiri), joka on: p 0,0001 vs PBS-gli, b: p 0,01 vs MAC-T -BCG ohjaus.

Kun selän ihon haavan tuotettiin hiirissä juominen NO inhibiittorin L-NAME, pinta haava vähentynyt verrattuna kontrolliryhmään. Ilmastointijärjestelmät-T-BCG lisäksi myös aiheuttama kiihtyvyys haavan. Sitä paitsi, ilmastointijärjestelmät-T-BCG lisäksi paransi haavan, kun hiiret saivat L-NAME suullisesti (Fig. 5B).

FGF-2 välittää stimuloiva vaikutus BCG-aktivoitua makrofagien sidekudosmuodostussoluilla

on osoitettu, että FGF-2 on yksi tärkeimmistä kasvutekijöiden mukana fibroblastien proliferaatiota [20]. Lisäksi on osoitettu, että FGF-2 kykenee inhiboimaan apoptoosia NIH-3T3-solut, joita käsiteltiin kemoterapialääkkeillä [21]. Näin ollen olemme arveltu, että FGF-2 voi olla yksi liukoisen erittämät tekijät aktivoitu MAC kykenee stimuloimaan fibroblastien. Vahvista tämä ajatus, ensin analysoidaan onko FGF-2 moduloidaan ilmastointijärjestelmät RAW 264.7 soluja BCG hoito. Kuviossa 6A on esitetty, jonka immunofluoresenssi, että FGF-2 on lisääntynyt MAC RAW 264.7 käsiteltiin BCG käsittelemättömiin soluihin verrattuna. Tämä havaittiin myös Western blot määrityksessä (kuvio 6B), jossa se voidaan nähdä yhden kaistan 17,2 kDa yhteensopivasti sekretoriseen FGF-2. Bändejä korkeamman molekyylipainon ovat ei-sekretorisen FGF-2. Sitten suoritetaan proliferaatiomääritys CM peräisin RAW 264.7 aktivoitu BCG, köyhdytettyä tai FGF-2. CM RAW 264.7 käsitelty BCG lisääntynyt fibroblastien proliferaatiota, kun taas ehtyminen FGF-2 vähensi merkittävästi fibroblastien stimulaatiota, mikä viittaa siihen, että BCG-aktivoitu ilmastointijärjestelmät voisi aiheuttaa fibroblastien proliferaatiota, ainakin osittain, FGF-2 eritystä. Fibroblasteja kulkeutumaan haavaan, jossa ne lisääntyvät ja tuottavat suuria määriä soluväliaineen. Jotkut fibroblasteja differentiante osaksi myofibroblasteja, jotka ovat vastuussa haavan supistuminen ja laskeuman lisäksi matriisin [22]. Sen selvittämiseksi, Macien kasvain hiirille hoidettiin BCG pystyvät aiheuttamaan FGF-2 in vivo ilmentyminen FGF-2 arvioitiin joko haavan paranemista määrityksissä. Rinnalla, olemme myös arvioineet FGF-2: n ilmentymisen in MB49 kasvaimia. Histologinen analyysit haavoihin osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä FGF-2 in haavat ilmastointijärjestelmät-T-BCG. Kun nämä ilmastointijärjestelmät asetettiin yhdessä NO estäjien haavoissa, FGF-2: n ilmentymisen säilyi korkeana (Fig. 6D). Korkea taso FGF-2 oli yhdenmukainen lisääntynyt paranemista korko, joka osoitti kuvassa. 5. Lisäksi, samanlaiset tulokset havaittiin MB49 kasvaimissa, joissa ilmentyminen FGF-2 oli korkeampi kasvaimia käsiteltyjen hiirien joko BCG: n tai L-NAME kuin kontrolleilla. Kasvaimet peräisin hiiristä sai kombinaatio osoitti enemmän paikallisia ja intensiivinen FGF-2 värjäys (Kuva. 6E). Tässä mallissa, tuloksemme osoittavat, että FGF-2 on liittynyt vaikutusmekanismi BCG immunoterapian.

(A) immunofluoresenssi anti-FGF-2-vasta-aineen RAW 264.7 MAC käsiteltiin BCG (3 x 10

6 CFU /ml) 24 tuntia. (B) Western blot lysaateista RAW 264.7 käsiteltiin BCG (3 x 10

6 CFU /ml), 8 ja 24 tuntia. 20 ng puhdistettua hiiren FGF-2: ta käytettiin positiivisena kontrollina. Suhteellinen ilmentymistason normalisoitiin GAPDH ja suhteutettuna kertamuutos Valvonnassa: p 0,05 (C) fibroblasteja käsiteltiin CM RAW 264.7 soluja oli aiemmin käsitelty BCG (3 x 10

6 CFU /ml), L-NAME tai BCG plus L-NAME: ssa 24 tuntia. Ohjaus suoritettiin loppuun elatusaineet (CM 3T3, samasta NIH-3T3-solut). 0,5 ng /ml FGF-2: CM 3T3 käytettiin positiivisena kontrollina. NIH-3T3 leviämisen seurattiin

3 (H) tymidiinin. CM esi-inkuboitiin 1 h 10 ug /ml estää monoklonaalisen anti-FGF-2-vasta-aineen (DB3), tai normaali IgG kontrollina, a: p 0,001 vs CM NIH-3T3, b: p 0,001 vs IgG. (D) immunohistokemiallinen värjäys on määrätty FGF-2: n ilmentymisen suoritettiin ihon haavat. Haavat käsiteltiin vatsakalvon MAC kasvaimen kantavien hiirten käsitellyn tai BCG (MAC-T ja MAC-T-BCG respectivesly) yksinään tai paikallisesti yhdessä NO-inhibiittorit (E). Immunohistokemiallinen värjäys FGF-2 suoritettiin s.c. MB49 kasvaimia hiirille on BCG, L-NAME tai BCG plus L-NAME. Asteikko: bar = 100 um.

Keskustelu

Virtsarakonsisäinen hoidon BCG on merkittävä rooli hoidossa ja ennaltaehkäisyssä uusiutuvien ei-lihas- invasiivinen virtsarakon syöpä [23].

Shelley et al. [24] ovat äskettäin kuvattu meta-analyysit tutkimus, BCG käytetty adjuvanttina jälkeen höyläysleikkaus vähensi uusiutumisen riskiä 67% 12 kk verrattuna höyläysleikkaus yksin; kuitenkin joitakin sivuvaikutuksia kuten virtsarakon, kuume ja hematuria, liittyivät BCG annon. Tarkka mekanismi antituumorivaikutuksen BCG ei täysin tunneta, mutta näyttää siltä, ​​että BCG sisältää sekä suorat vaikutukset kasvainsoluihin [16] ja epäsuorat vaikutukset välittyvät immuunijärjestelmän solut [7].

Olemme aiemmin raportoitu että BCG wass pystyy aiheuttamaan kasvun inhibition MB49 virtsarakon kasvainsolujen joko in vitro tai siirrostettiin vivo hiirissä tuottama NO MB49 syöpäsolujen käsiteltiin BCG indusoi MAC ja pernasoluja kuoleman, mikä viittaa siihen in vivo immunosuppressiivisen funktiona NO. Kokeemme osoittivat myös suurempi tuumorin kasvua hiirissä, joita käsiteltiin BCG yhdistettynä L-NAME verrattuna pelkästään BCG: llä. Ensimmäisessä tapauksessa harvoista kasvainsoluja täysin ympäröi kollageenisäikeiden [11].

Tässä työssä, tutkimme joitakin mekanismeja, joilla BCG ja L-NAME tuottaa arpi me kuvattu aiemmin. MAPK ja PI3K signalointireitteihin on tutkittu laajasti eri malleja. Nämä aktivoituvat eri ärsykkeiden, kuten kasvutekijöiden ja sytokiinien [25], [26]. Nykyinen havainnot osoittavat, että BCG kykenee suoraan indusoimaan NIH-3T3 fibroblastien leviämisen kautta MAPK ja PI3K signalointireitteihin, kollageenin ilmentyminen ja fibroblastien erilaistumista määritettynä alfa-SMA ilme. Lisäksi immunohistokemia kasvainten BCG käsitellyistä hiiristä osoittivat lisääntyneen ekspression kollageenikuiduista ja alfa-SMA, viittaa siihen, että fibroblasti aktivointi voi tapahtua myös.

Uskomme, että BCG voi toimia strooman ympäröivän kasvainsoluja, jotka voivat jäävät jälkeen kasvaimen resektiota tai uusi nouseva kasvain. Siten yhteistä toimintaa fibroblastien ja immuunisolujen aktivoidaan BCG ja suorat toimet kasvainsoluihin vähentäisi uusiutumisen riskiä. Pitoisuus BCG käytettiin kuhunkin tiputtamisen potilailla, on noin 10

7 CFU /ml (kokonaistilavuus 50 ml). Emme tiedä tarkkaa dosis jotka saavat strooman kuitenkin meidän kokeita käytämme 3 x 10

6 CFU /ml, mikä on paras dosis joka indusoi fibroblastien proliferaton in vitro, että yksi alemman tason kuin käytetty in tiputtamisen potilaalle. Niinpä spekuloida, että määrät BCG käytämme in vitro ovat lähes fysiologisia.

Tiedetään, että bakteeri ärsykkeet kykenevät indusoimaan NO tuotantoa ilmastointijärjestelmät [27]. Tässä osoitimme, että kun BCG hoito, RAW 264.7 ja ilmastointijärjestelmät-T pystyivät lisäämään NO tasoja in vitro ja in vivo vastaavasti ja CM RAW 264.7 käsitellä in vitro BCG aiheuttama fibroblastien proliferaatio ja lisääntynyt kollageenin I ilme. Koska osallistuminen NO eri osa fysiologisia ja patologisia prosesseja, NOS-inhibiittorit ovat saaneet näkyvyyttä liittyviä mekanismeja haavan paranemista, angiogeneesiä ja tulehdusreaktiota sytokiinien [28], [29], [30]. Koska CM ilmastointijärjestelmien-T-BCG-L-NAME aiheuttama korkein fibroblastien leviämisen nopeus, voisimme spekuloida, että tässä solupopulaation, NO: n estäminen aiheuttaa vapauttamaan joitakin liukoisen tekijät, lisäsi fibroblastien lisääntymistä ja aktivoitumista. Sitä paitsi, emme voi hävitä että NO esto voi myös muuttaa eritystä mallia näistä liukoisen tekijöistä. Tietääksemme ei ole olemassa raportteja, joissa vuorovaikutus MAC: ja fibroblastien virtsarakon syöpään. Kuitenkin yhdenmukaiset tuloksemme käyttäen keuhkotuberkuloosi malli, se on kuvattu parannettu leviäminen keuhkojen fibroblastien CM keuhkorakkuloiden makrofagien stimuloidaan BCG [31]. Samanaikaisesti, havaitsimme välistä yhdenmukaisuutta vaikutus in vivo hoitoon virtsarakon tumos ja in vitro. Huomattava ilmaus kollageenin kuituja ja alfa-SMA havaittiin käsitellyt kasvaimet BCG, L-NAME ja BCG plus L-NAME, olisi vaikutus suurempi, kombinaatio.

Rooli NO ihoaltistumisessa fibroblastien leviämisen on aiemmin kuvanneet Chen et al [32], joka ehdotti, että esto ihon fibroblastien leviämisen UV-valolla, saattavat liittyä ylös-säätely iNOS-geenin ilmentymisen ja siten NO liiallinen eritys In hyväksy näitä tuloksia voimme olettaa, että NO-tuotanto on negatiivinen säätelijä fibroblastien lisääntymistä ja aktivoitumista, kun BCG käytetään virtsarakon syövän hoidossa.

kasvaimet ja haavat jakaa joitakin komponentteja, kuten tulehdusreaktio, yhteydessä [22]. Vaikka haavoissa tulehdus on ohimenevä, kasvaimissa tämä prosessi on säilytetty ajan, joten tämä reversion, pomppivaan kasvaimen kasvua valvontaa. Vuonna 1986, Dvorak oletetun käsite ”kasvaimia ovat haavoja, jotka eivät parane”, ja arveltu, että koostumus kasvaimen strooman muistuttaa granulaatiokudoksen parantavan ihon haavan, joka viittaa siihen, että kasvaimia muodostumisen edistämiseksi niiden strooman aktivoimalla haavan parantavaa vastaus vastaanottavan [22], [33]. Perustuen tämän hypoteesin, me tuotti selkäpuolen iholle haavan määrityksessä, arvioida roolia makrofagien eri hoitoja mallia, jossa fibroblastit on keskeinen toiminto. Arvioimme kapasiteetin MAC:-T-BCG auttaa haavan paranemista. Havaitsimme, että eksogeenista ilmastointijärjestelmät-T kiihtyi paranemista, vaan päinvastoin MAC:-T-BCG laski paranevuus verrattuna ilmastointijärjestelmät-T. Kuitenkin, kun läsnä on NO-inhibiittorin, haavan sulkeminen on kiihtynyt, mikä viittaa siihen, että NO vapautuu MAC-T-BCG viivästyttää paranemista. Arvioida roolia endogeenisen NO isäntä, L-NAME annettiin suun kautta haavan kantavien hiirten, haavan sulkeminen on huomattavasti nopeampi, kun MAC-T-BCG pantiin haavoihin. Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että sen lisäksi NO vapautuu päälle haava MACSilla-T-BCG, muut solut tuottavat NO haavan kantavien hiirten olla negatiivinen rooli paranemista. Tiedot liittyvät NO toimintaa haavan on kiistanalainen. Jotkut kirjoittajat ovat osoittaneet, että NO indusoi angiogeenisen prosessin tarpeen hyvän paranemisen [29], [34], kun taas toiset ovat osoittaneet, että indusoiman apoptoosin NO kykenee inhiboimaan haavan paranemista [30]. Perusteella tuloksemme, voimme spekuloida, että NO tuottamat MAC-T-BCG: n tai jonka jäljellä olevat syöpäsolut voivat viivästyttää kudoksen uudelleenjärjestelyn aikana BCG immunoterapiassa.

Erilaiset toiminnot kasvutekijöiden, kuten FGF-2: n tai TGF-beeta, haavan paranemista ja syöpä on myös raportoitu.