Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka metastaattinen paksusuolen syöpä on johtava syy syövän kuolema maailmanlaajuisesti molekyylimekanismeja jotka mahdollistavat paksusuolen syöpäsolujen etäispesäkkeitä jää epäselväksi. Kehittyvät todisteet osoittavat, että metastaattinen solut kehittyä usurping transkription verkkoja alkion kantasoluja (ES-soluja) helpottamaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), invaasio, ja metastasointiin. Aiemmat tutkimukset tunnistettu HMGA1 keskeiseksi transkriptiotekijä rikastunut ES-soluissa, paksusuolen syöpä, ja muita aggressiivisia kasvaimia, vaikka sen rooli nämä asetukset ymmärretään huonosti.

Methods /Principal Havainnot

Määritä miten HMGA1 toiminnot metastaattisessa paksusuolen syövän, me manipuloitu

HMGA1

ilmentymistä transgeenisissä hiirissä ja koolonkarsinoomasoluissa. Huomasimme, että HMGA1 ajaa proliferatiivisia muutoksia, poikkeava krypta muodostumista, ja suoliston polypoosin siirtogeenisissä hiirissä. Vuonna koolonsyöpäsolulinjaa huonosti eriytetty, etäpesäkkeitä, knock-alas HMGA1 lohkojen kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun, siirtolaisuuden, invaasio, ksenografti- kasvaimen kehittymisen ja kolmiulotteinen colonosphere muodostumista. Inhiboiva

HMGA1

ilmaisu lohkojen tumorigeneesin rajoittamaan laimentumiset sopusoinnussa ehtyminen kasvaimeen initiaattorin solujen knock-down soluissa. Knock-down of HMGA1 myös estää metastasointiin maksaan

in vivo

. Metastaattisessa paksusuolen syöpäsoluja, HMGA1 indusoi ilmentymisen

Twist1

, liittyvän geenin alkionkehityksen, EMT, ja kasvaimen etenemisen, kun taas HMGA1 tukahduttaa

E-kadheriinin

, geeni, joka säätyy alas aikana EMT ja metastasointiin. Lisäksi

HMGA1

on yksi rikastunut geenien paksusuolensyöpä verrattuna normaaliin limakalvolle.

Johtopäätökset

havainnot osoittavat ensimmäistä kertaa, että HMGA1 ajaa proliferatiivisia muutoksia ja polyyppi muodostumista suolistossa siirtogeenisiä hiiriä ja indusoi metastasointiin ja varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia koolonkarsinoomasoluissa. Nämä havainnot osoittavat, että HMGA1 on keskeinen säädin, sekä metastasointiin ja ylläpidossa varsi kaltainen tila. Tuloksemme osoittavat myös, että HMGA1 tai loppupään polkuja voisi olla järkevä terapeuttisia kohteita metastaattisessa, huonosti eriytetty paksusuolen syöpä.

Citation: Belton A, Gabrovsky A, Bae YK, Reeves R, Iacobuzio-Donahue C, Huso DL, et ai. (2012) HMGA1 Aiheuttaa Suoliston polypoosin siirtogeenisissä hiirissä ja Drives kasvaimen etenemiseen ja Stem Cell asuntoja koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 7 (1): e30034. doi: 10,1371 /journal.pone.0030034

Toimittaja: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 12 joulukuu 2011; Julkaistu: 20 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Belton et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus tuli The National Institutes of Health (NIH) RO1CA092339 ja R21CA2149550 L. Resar, NIH T32HL007525 A. Belton, ja Marylandin Stem Cell Research Fund L. Resar ja A. Beltonin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta viimeaikaisesta edistyksestä peräsuolen syövän seulonnassa ja hoidossa, metastaattisen kolorektaalisyövän edelleen johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1] – [2]. Molekyylimekanismeja jotka mahdollistavat syöpäsolujen etäispesäkkeitä tunnetaan huonosti, vaikka kehittyvillä todisteet osoittavat, että transkription edellyttämä verkkojen kantasolujen ominaisuuksia alkionkehityksen aikana ovat lisäjäsentä aikana metastasointiin [3] – [4]. Viimeaikaiset tutkimukset tunnistettu HMGA1 keskeiseksi transkriptiotekijä rikastettu ihmisen alkion kantasoluja (ES-solut) [3], hematopoieettiset kantasolut [5] – [8], tulenkestävät leukemia [6] – [7], [9] ja korkealaatuisesta /huonosti eriytetty syöpiä rinnasta, aivot, ja virtsarakon [3]. Lisäksi kasvaimet yli-ilmentävät

HMGA1

ja kahdeksan muuta ES transkriptiotekijä geenit oli vähentynyt selviytymisen, mikä korostaa näiden geenien syövän etenemistä [3]. Viime aikoina olemme huomanneet, että HMGA1 proteiini tasot korreloivat huono erilaistumista asema ja laski hengissä haimasyövän, edelleen syytetään HMGA1 erilaistumattomassa, varsi-kaltainen tila ja syövän etenemistä [10].

HMGA1

geeni koodaa HMGA1a ja HMGA1b kromatiinin remodeling proteiineja, joiden tehtävänä on moduloida geenin ilmentymisen muuttamalla kromatiinin rakennetta ja kokoonpanoa transkriptiotekijä komplekseja promoottorit [11] – [18]. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että HMGA1 indusoi onkogeenisiä ominaisuuksia viljellyissä soluissa [19] – [27] ja aiheuttaa aggressiivisia kasvaimia transgeenisissä hiirissä [9], [28] – [32]. Tarkka molekyylitason reitit säätelevät HMGA1 transformointikokeissa ovat kuitenkin vain muotoutumassa ja tutkimuksia selvittämiseksi HMGA1 transkription verkot ovat todennäköisesti paljastaa perustavanlaatuinen reittejä mukana kasvaimen etenemiseen ja kehitykseen.

Täällä raportoimme ensimmäistä aika, että HMGA1 ajaa proliferatiivisia muutoksia ja polyyppien muodostumista suolistossa siirtogeenisiä hiiriä ja ohjaa molekyylien reittejä tärkeää kasvaimen etenemistä ja kantasolujen ominaisuuksia ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että

HMGA1

edistää syövän etenemisen paksusuolensyöpä kohdentamalla paksusuolen epiteelin varsi kaltainen tila.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollan mukaan hyväksymän Johns Hopkins University animal Care ja Käytä komitea (protokolla # MO08M263). Kaikki hiiret pidettiin steriilissä ympäristössä, jossa he saivat vapaasti ruokaa ja vettä esitettyä meidän hoitokäytännön.

Quantitative käänteistranskriptio-PCR (qRT-PCR) analyysi.

RNA valmistettiin kuten on kuvattu [9], [27]. Alukkeet

HMGA1

[28],

Twist

,

vimentiinista

,

E-kadheriinin

,

FOXC2

,

Snail1

,

Slug

,

TCF-3

,

Twist1

,

Twist2

,

SFH1B

) aiemmin raportoitiin [4].

GAPDH

alukkeet ovat kaupallisesti saatavilla (Applied Biosystems). qRT-PCR-reaktiot tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kerran.

Western-analyysillä.

Western-analyysit suoritettiin kuten on kuvattu [9], [19] – [20], [33 ] käyttäen kaupallista HMGA1 vasta-ainetta (Abcam, luettelo # AB4078) laimennettuna 1:1000 ja β-aktiini (Cell Signaling, luettelo # 4967) laimennettuna 1:1000 kuin endogeeninen kontrolli.

Solulinjat.

HCT116 (CCL-247; American Type Culture Collection) ja SW480 (CCL-228; American Type Culture Collection) viljeltiin suositusten. Transfektoidut solut valittiin puromysiiniä (3 ug /ml).

kasvukäyrät.

Cellular kasvu määritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19] – [20], [26] – [ ,,,0],29], [33].

Anchorage riippumaton solujen kasvua pehmeässä agarissa, muuttoliike, ja invaasio määritykset.

Nämä määritykset suoritettiin kuten on kuvattu [19] – [20], [ ,,,0],26] – [28], paitsi että migraatiokokeessa tehtiin 60000 solua /kuoppa ja invaasio määritykset tehtiin 20 ul: kasvutekijän vähentää matrigeeliä.

Colonosphere määrityksessä.

Colonosphere määrityksissä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34].

In vivo

etäpesäkkeiden määrityksessä.

Tämä määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35], jossa on soluja (10

5 ) pistetään hiirtä kohti (NOD /ALUEITTAIN

SCID Twitter /IL-2Ry: n kanssa

null, Jackson Laboratory).

Vieraslajisiirteen kasvainten muodostumiseen.

Nämä tutkimukset tehtiin nude (nu – /-) hiirillä kuten kuvataan [19] – [20].

Vektorit.

lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) häiriöt plasmidin

HMGA1

on on kuvattu [36]. Tyhjän shRNA vektoria käytettiin kontrollina.

immunohistokemiallinen analyysi.

Kudosleikkeet (4 pm paksu) on pienten ja suurten suolet siirtogeenisten ja verrokkihiiret syntyy ja parafiini ksyleenissä ja sitten sammutettua porrastetusti alkoholin sarjassa. Heat-epitooppisup- haku suoritettiin autoklaavissa 10 minuutin natriumsitraatissa (pH 6,0). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus inaktivoitiin inkuboimalla osiot 4% H

2O

2 5 minuuttia. Huuhtelun jälkeen fosfaatti-puskuroitu suolaliuos, leikkeitä inkuboitiin kanin monoklonaalista anti-Ki-67-vasta-ainetta (klooni 30-9, Ventana, Tucson, AZ, luettelo # 790-4286) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Positiivinen värjäytyminen visualisoitiin DAKO EnVision Plus-HRP havaitseminen pakki (DAKO, Carpinteria, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ki-67 positiiviset solut laskettiin 5 satunnaisesti valitun kentät samankaltaisilla alueilla pienten ja paksusuolen siirtogeenisistä ja ohjaus hiirillä 20-kertainen suurennus. Yhteensä 100 kryptien kunkin hiiren laskettiin päässä värjätyt leikkeet siirtogeenisistä hiiristä ja kontrollihiiristä (2 hiirtä /ryhmä).

Solun morfologia ja koko määrityksen.

Solut maljattiin ja annettiin kasvaa 80% konfluenssiin. Valokuvia varten morfologiset arviointi ja halkaisijan mittaukset saatiin käyttämällä Zeiss Inverted M-laajuus Olympus DP72 Kameran ja ohjelmiston (JHMI konfokaali Facility). Ainakin viisi satunnaista kentät kuvattiin kunkin solulinjan kanssa tai ilman HMGA1 knock-down. Suurin halkaisija (um) mitattiin 700-1000 soluja kustakin ryhmästä. Suurin halkaisijat olivat edustettuina keskiarvo ± keskihajonta; merkittävyys määritettiin käyttäen opiskelijan t-testissä.

Tulokset

HMGA1a

transgeeniset kehittää polyyppien ja laajentumista kantasolujen

Jos haluat määrittää rooli of HMGA1 kasvainten synnyssä, me suunniteltu siirtogeenisiä hiiriä hiiren

hmga1a

siirtogeenin ohjaa H2K promoottori ja immunoglobuliini mu tehostajana [9], [27] – [29]. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, kaikki hiiret periksi aggressiivinen imukudoksen pahanlaatuisen [9] ja naaraat kehittää kohdun sarkoomaa [28] – [29]. Sen määrittämiseksi, HMGA1 edistää neoplastisen muutoksen suoliepiteeliin, tutkimme suoliston näiden hiirten. Siirtogeeni ilmaistaan ​​pienten ja suurten suolet 4 7-kertaisesti yli joka löytyy valvonta (Fig. S1). Ruumiinavauksessa sisäelimet ovat hypereemisen paksennetulla limakalvon ja painonnousu kontrolleihin verrattuna (Kuva. 1 A-D). Histologisesti, sekä suuret että pienet suolet näytteille merkitty proliferatiivisia muutoksia, kohdunulkoinen krypta muodostumista, ja polyyppi muodostumista (Kuva. 1 C-D). Oli merkittävä kasvu Ki-67 sekä pieniä ja paksusuoli, markkeri leviämisen (Fig. 2A-B). Kasvu kryptassa määrä viittaa siihen, että näillä hiirillä voisi olla laajeneminen suolen kantasolujen [37].

(A)

HMGA1

siirtogeenisiä suolisto hypereemisen lisääntynyt paino verrattuna kontrolleihin ( n = 7 kussakin ryhmässä; p = 0,000000138 Studentin t-testi.) (B) polyyppi numero siirtogeeniset ja hallintalaitteet (n = 7 kussakin ryhmässä; p = 0,000426 Studentin t-testi). Suoliston levitteet (oikea paneeli) värjätään 1,5% metyleenisiniä lisääkin polyypit laskemiseksi. (C) hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset pieniä ja paksusuoli osoittaa merkitty proliferatiivisia muutoksia siirtogeeniset (bar = 50 pm). (D) laajentaminen proliferatiivisen vyöhykkeen tuloksena on diffuusisti hyperplastic ulkonäön limakalvon ja cystically laajentuneet kryptissa sisään siirtogeeniset. Korkeampi voima näkymä ohutsuolen limakalvon osoittaa muodostumista kohdunulkoisen crypt pesäkkeitä (nuolet).

(A) Ki-67 värjäys pienten ja suurten suolisto

HMGA1

transgeeniset ( alapaneeleita) ja valvonta hiiret (top paneelit) osoittavat merkittävää kasvua Ki-67 immunoreaktiivisuus

HMGA1

transgeeniset (20-kertainen suurennus). (B) Ki-67 positiivisten solujen

HMGA1

siirtogeenisiä ja ohjaus hiiriä lueteltu kryptissa pienten ja paksusuolen 20-kertainen suurennus. Keskiarvo ± keskihajontojen Ki-67-positiivisia soluja kohti krypta 100 crypts kunkin parin hiiriä kussakin paikassa näytetään. Erittäin merkittäviä eroja osoitettiin välillä transgeeniset ja valvontaa sekä pienten ja suurten suolet (p 0,00001, opiskelijan t-testi) (C)

HMGA1

ilmentyminen arvioitiin qRT-PCR ja kasvoi ensisijainen, korkea asteen (luokka 3-4) paksusuolen adenokarsinooman verrattuna viereiseen, normaali koolonkudoksessa.

β-aktiini

käytettiin ohjaamaan lastaus ja normaali kudos arbritrarily annetaan arvo 1,0. (D) Western blot analyysi HMGA1 ja ohjaus proteiini (GAPDH) suoritettiin 3 kasvaimiin riittävän näytteen ja osoittivat yhä HMGA1 proteiinia vähenee erilaistumista ja lisäämällä invasiivisuuden tai Frank etäpesäke. Luokka, erilaistuminen tila, invasiivisuus, ja läsnäolo etäpesäkkeitä on merkitty.

HMGA1

on rikastettu ihmisen paksusuolikarsinoomat

Korkea HMGA1 proteiinin tai mRNA raportoitu koolonsyöpäsolulinjoissa tai primaarisia kasvaimia pieni pilottitutkimuksessa [38]. Sen määrittämiseksi, onko

HMGA1

yliekspressoituu suurempi tutkimuksissa ensisijainen paksusuolen syövät, me kysellä geeniekspressioprofiili analyysi ensisijaisen paksusuolen syövät kuudesta riippumattomia tutkimuksia läpi Oncomine ™ julkisen tietokannan (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Olemme havainneet, että

HMGA1

on hyvin rikastettu koolonadenokarsinooma verrattuna normaaliin kudokseen 5/5 aikaisempien tutkimusten. Kaikissa näissä tutkimuksissa HMGA1 oli kärjessä 10% rikastettua geenien ja 4 tutkimuksissa, se oli joukossa 1-3% rikastettua geenejä. Pilottitutkimuksessa 10 ensisijainen, korkea-asteen (luokka III-IV) paksusuolen syöpiin (antelias lahja Bert Vogelstein), huomasimme, että HMGA1 ekspressio lisääntyi eniten paksusuolensyöpä näytettä (8/11) verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen saman potilaan. Lisäksi keskimääräinen HMGA1 lausekkeen kaikista kasvaimista korotettiin 3-kertainen verrattuna viereiseen kontrollikudoksen (Fig. 2C). Olemme myös arvioitiin proteiinin ilmentymistä osajoukko ensisijainen paksusuolen kasvaimista on käytettävissään riittävät tiedot ja löysi korkeimmat HMGA1 proteiinin korkea laatu, etäpesäkkeitä kanssa havaittavissa tasoilla viereiseen normaaliin kudokseen (Fig. 2D).

HMGA1 vaaditaan ankkurista riippumaton solujen kasvua, muuttoliike, invaasio, ja tuumorigeneesiä koolonkarsinoomasoluissa

tutkimiseksi toiminnallista roolia HMGA1 paksusuolen syövän, me esti

HMGA1

ilmentymistä kahdessa paksusuolessa syöpä johdetut solulinjat huonosti eriytetty (luokka 4), metastaattinen paksusuolen syövät (HCT116 ja SW480) käyttäen shRNA lähestymistapaa. Solujen transfektiota, jossa on

HMGA1

shRNA vektori johti merkittävään, vakaa lasku HMGA1 proteiinia (Fig. 3A) että shRNA soluissa verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla. Huomasimme, että knock-alas HMGA1 estetty kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun tai pesäkkeitä muodostumisen pehmeässä agarissa, muuttoliike, ja invaasio sekä HCT116 ja SW480-soluissa (kuvio. 3B-C). Lisäksi ei havaittu kasvaimia muodostettu nude-hiirissä sen jälkeen, kun injektion HCT116-solujen HMGA1 knock-down (10

5 tai 10

4-solut), kun taas kasvaimet muodostuu transfektoitujen solujen kontrollivektoreihin (Fig. 3d). Ei ollut merkittävää eroa kasvulukuihin solulinjoissa tai ilman HMGA1 knock-down

in vitro

(Fig. S2), mikä osoittaa, että

HMGA1

shRNA ollut myrkyllinen paksusuoleen syöpäsoluja. Nämä tulokset osoittavat, että HMGA1 ajaa solujen ominaisuuksia vaaditaan sekä kasvaimen aloittamisen (ankkurista riippumaton solujen kasvua, kasvaimen kehittymisen) ja syövän etenemiseen (maahanmuutto, invaasio).

(A) transfektion shRNA Knockdown vektori

HMGA1

erittäin aggressiivinen, huonosti eriytetty ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa (HCT116 ja SW480) johtaa merkittävään väheneminen HMGA1 proteiinia. (B) Maahanmuutto ja invaasio arvioitiin kontrolli (tumma palkit) ja HMGA1 knock-down (avoimet pylväät) paksusuolen syöpäsoluissa (HCT116 ja SW480). Kuvaaja osoittaa, keskiarvo ± keskihajonta 2 kokeet tehdään kolmena kappaleena. (P-arvot määritettiin Studentin t-testit on esitetty). (C) Anchorage-riippumaton solujen kasvua pehmeässä agarissa ohjaus (tumma palkit) ja HMGA1 knock-down (avoimet pylväät) paksusuolen syöpäsoluissa (HCT116 ja SW480). Kaikki pesäkkeitä 50 pm laskettiin. Pylväsdiagrammi näyttää keskiarvo ± keskihajonta kahdesta kokeita tehdään kolmena kappaleena. (P-arvot määritettiin Studentin t-testit on esitetty). (D) Taulukosta näkyy, että knock-alas HMGA1 lohkojen kasvaimen muodostumisen rajoittamiseksi laimennuksen. Kuvassa edustaja karvattomia hiiriä 4 viikkoa injektion jälkeen ohjaus tai HMGA1 knock-down in HCT116-soluissa (10

5 /injektio). Ei kasvaimia muodostunut HMGA1 knock-down soluissa.

HMGA1 riippuvia kantasolujen ominaisuuksia koolonkarsinoomasoluissa

Koska

HMGA1

rikastuu kantasoluja [ ,,,0],5] – [8] ja aiheuttaa muutoksia hiiren suolessa, joka voisi olla sopusoinnussa laajeneminen suolen kantasolujen, etsimme onko

HMGA1

osallistuu kantasolujen ominaisuuksia koolonkarsinoomasoluissa. Tätä varten meidän arvioida kolmiulotteinen colonosphere muodostumista koolonsyöpäsolulinjoissa kanssa tai ilman knock-alas HMGA1. Havaitsimme merkittävä lasku määrän colonospheres sekä HCT116 ja SW460-solujen HMGA1 knock-down kontrolleihin verrattuna (Fig. 4A). Nämä havainnot osoittavat, että HMGA1 on välttämätöntä, että tämä kantasolujen fenotyyppiä (kolmiulotteinen kasvu) paksusuolen syöpäsoluissa. Rajoittamalla laimennusta tuumorigeenisyyden kokeissa knock-alas HMGA1 estetty kasvaimen muodostumisen, kun 104 tai 105 solua injektoitiin, kun taas kasvaimissa, jotka on muodostettu valvonta-soluissa. Kasvaimet muodostettu molempiin ohjaus ja knock-down ryhmät jos 106 solua injektoitiin (Fig.3D). Nämä tulokset osoittavat, että knock-alas HMGA1 kuluttaa kasvaimeen alullepanija soluihin.

(A) Kolmiulotteinen colonosphere muodostuminen ohjaus (tumma palkit) ja HMGA1 knock-down (avoimet pylväät) paksusuolen syöpäsoluissa (HCT116 ja SW480). Spheres laskettiin 10 päivän jälkeen. Kuvaaja osoittaa, keskiarvo ± keskihajonta 3 kokeet tehdään kolmena kappaleena. (P-arvot määritettiin Studentin t-testit on esitetty). (B) metastaasipesäkkeiden maksassa laskettiin 5 viikon kuluttua injektion ohjaus (tumma palkit) tai HMGA1 knock-down (avoimet pylväät) HCT116-solut (1 x 10

5) otetaan pernat nude-hiirten. Pylväsdiagrammi näyttää keskiarvo ± keskihajonta metastaasipesäkkeiden kahdesta kokeet tehdään kolmena kappaleena. Hiiret injektoitiin kontrolli-soluja (mustat bar) verrattiin hiiriin injektoitiin HMGA1 knock-down-solut (avoimet pylväät, p-arvot määritettiin Studentin t-testit on esitetty). (C) Gross valokuvat metastaasipesäkkeiden maksan injektion jälkeen HCT116 solujen pernat jude hiirillä. Vasemmassa maksa otetaan edustava hiiri injektoitiin kontrolli solut; oikea maksa otetaan edustava hiiri injektoitiin HMGA1 knock-down soluissa. Valokuvia kuvaavat edustaja maksa hiiristä sai ohjaus tai

HMGA1

knock-down soluissa. (D) histologisen tutkimisen maksojen vahvisti, että metastaasipesäkkeiden ovat huomattavasti pernoista ruiskutettiin säätökennoja verrattuna HMGA1 knock-down-solut (Bar = 100 um).

HMGA1 tarvitaan metastaattinen etenemistä paksusuolensyöpä

Voit selvittää HMGA1 vaaditaan syövän etenemiseen, käytimme prekliinisissä mallina metastasointiin paksusuolen syöpä [35]. HCT116 paksusuolen syövän solut injektoidaan suoraan pernat immuunivajaissa hiiriä ja metastaaseja arvioitiin sen jälkeen, kun 5 viikkoa. Silmiinpistävän, löysimme vähentyneen merkittävästi metastaasipesäkkeiden että maksat injektoitujen hiirien HMGA1 knock-down-solut (Fig. 4B-C). Nämä tulokset korostavat kriittinen rooli HMGA1 metastaattisessa etenemisen tässä mallissa.

HMGA1 indusoi ilmentymistä EMT geenien

Twist1

ja

vimentiinista

Koska viimeaikaiset tutkimukset viittaavat EMT epiteeli- kantasolujen ominaisuuksia [3] – [4], etsimme onko HMGA1 säätelee EMT geenien paksusuolensyöpä. Tämän vuoksi arvioimme ekspressiotasot 11 geenien aiemmin osoitettu olevan tärkeä rooli EMT ja syövän alullepanija solujen [4]. Vuonna HCT116-soluissa, huomasimme, että molemmat

Twist1

ja

vimentiinista

merkittävästi tukahdutettu solujen HMGA1 knock-down (Fig. 5A), mikä osoittaa, että HMGA1 indusoi niiden ilmaisua. Vuonna SW480-soluissa,

E-kadheriinin

on ajan säännelty knock-down soluissa, mikä viittaa siihen, että HMGA1 yleensä tukahduttaa sen ilme (Fig. 5B).

Twist1

merkittävästi myös tukahdutettiin vuonna SW480 knock-down soluissa, vaikkakin vähemmän kuin mitä me havaittu HCT116-soluissa. Yhdessä meidän tutkimusten mukaan HMGA1 edistää syövän etenemisen kautta transkription verkostoja, jotka helpottavat metastasointiin ja varsi kaltaiseen tilaan, ainakin osittain, indusoimalla

Twist1

ja

vimentiinista

, kun taas tukahduttaa

E-kadheriinin

. Huomattavaa on, että ei tapahtunut muutoksia solujen morfologian tai koon knock-down-solut (Fig. S3), mikä viittaa siihen, että alas-säätely HMGA1 näissä soluissa ei ole riittävä aiheuttamaan morfologisia muutoksia sopusoinnussa paluuta enemmän epiteelin tila kun kasvanut yksikerroksinen. Kuten aikaisemmin oli merkittäviä muutoksia kasvuominaisuudet kun kasvatettu kiinnittymisestä riippumaton muoti tai istutuksen jälkeen hiiriin. Vaihtelu EMT geenien moduloidaan HMGA1 näissä kahdessa eri solulinjoista todennäköisesti heijastaa erilaisia ​​miljöö ja uudelleenohjelmointi potentiaalia syöpäsolujen perustuvat arvopapereihin geneettisiä ja epigeneettiset muutokset.

(A) In HCT116-soluissa,

Twist1

, ja

vimentiinista

mRNA: n ilmentymisen oli tukahdutettu qRT-PCR: llä HMGA1 knock-down solujen verrattuna hallita soluihin.

E-kadheriinin

ja muut EMT geenit eivät vaikuttaneet näissä soluissa. (P-arvot määritetään opiskelijan t-testit ovat osoittaneet). (B) In SW480-soluissa,

vimentiinista

on tukahdutettu ja

E-kadheriinin

indusoituu solujen HMGA1 knock-down. (P-arvot määritetään opiskelijan t-testit ovat osoittaneet).

Keskustelu

Metastaattinen paksusuolen syöpä on erittäin tappava ja esiintyvyys kasvaa, varsinkin nuoremmat [1] – [2]. Nykyiset hoidot rajoittavat syntymistä metastaattisen syövän solut, jotka ovat resistenttejä hoidolle. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että nämä tulenkestävä solut kehittää, koska ne yhteistyössä valitsevat olinpaikassasi mukana alkion kehitykseen saa valmiuksia metastasizing ja kiertämästä terapia [3] – [4].

HMGA1

onkogeeni tunnistettiin äskettäin keskeiseksi transkriptiotekijä rikastunut ES-soluissa ja korkean asteen kasvaimet huono tulokset [3], vaikka sen tehtävä nämä asetukset on pysynyt vaikeasti. Tämä geeni on jäsenenä

HMGA

geeniperheen, joka sisältää myös

HMGA1

[11] – [18] ja

HMGA2

[31], [39] – [40]. Kaikki HMGA proteiinit ovat pieniä, pienen molekyylipainon (näin suuren liikkuvuuden ryhmä proteiineja), jossa on AT-hook DNA: ta sitovan domeenin, joka välittää sitoutumisen AT-rikkaita alueita pienessä urassa kromatiinin. HMGA1 ja muut AT-hook-proteiinien uskotaan toimivan moduloimalla kromatiinin rakennetta ja geeniekspressiota [15] – [18], [41] – [42]. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että

HMGA1

aiheuttaa proliferatiivisia muutoksia ja polyyppien muodostumista suolistossa siirtogeenisiä hiiriä. Lisäksi

HMGA1

tarvitaan rajoittavan laimennuksen tuumorigeneesin

in vivo

yhdessä 3-ulotteinen colonosphere muodostumisen

in vitro

, jotka molemmat ovat fenotyypit ominaista epiteelin kantasolujen. Lisäksi estämällä

HMGA1

ilmaisua lohkojen paitsi transformaatio ominaisuuksia mukana kasvaimen aloittamisesta (ankkurista riippumaton solujen kasvua, tuumorigeenisyyteen), mutta myös solun ominaisuuksia, jotka edistävät metastasointiin (invaasio ja muuttoliike). Olemme myös havainneet, että

HMGA1

vaaditaan metastasointiin maksaan

in vivo

. Erityisesti useat viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että

HMGA1

rikastuu normaaleissa kantasoluja, kuten alkion ja Veren kantasolut [3] – [8], lisäksi huonosti eriytetty tai tulenkestävä varsi kaltainen syöpiä [ ,,,0],8] – [32], mikä viittaa siihen, että HMGA1 auttaa ajaa varsi kaltaiseen tilaan, sekä normaalia kehitystä ja syöpä.

HMGA1

on myös erittäin ilmaistaan ​​alkionkehityksen aikana, joilla on alhainen tai havaita ilmentymistä useimmissa eriytetty, aikuisen kudoksissa [43].

Voit selvittää miten HMGA1 orchestrates kasvainprogression ja kantasolujen fenotyyppiä, tutkimme ilme geenien, jotka on aiemmin osoitettu olevan tärkeitä EMT, kehittämiseen, ja kasvaimen alullepanija soluihin [4]. Vuonna HCT116-soluissa, havaitsimme, että HMGA1 ajan säätelee geenien molempien

Twist1

ja

vimentiinista

. Vuonna SW480-soluissa, HMGA1 myös ylös-säätelee

Twist1

, kun se tukahduttaa

E-kadheriinin

.

E-kadheriinin

eivät muutu HCT116 koolonkarsinoomasoluissa epäsuoria alas

HMGA1

, joka voisi heijastaa vakaata vaiennettu

E-kadheriinin

näissä mesenkymaaliset, erittäin metastaattinen koolonsyöpäsolulinjoissa. Transkription verkostot säätelevät HMGA1 todennäköisesti riippuu solujen miljöö ja taustalla geneettiset ja epigeneettiset ominaisuuksiin.

Yhteenvetona tutkimuksemme ovat ensimmäiset todisteet yhdistävät HMGA1 solujen ominaisuuksia ja transkription verkkojen tärkeä kantasoluja, EMT, ja metastasointiin paksusuolen syövän. Vaikka työtä on jatkettava, nämä tulokset korostavat roolia HMGA1 keskeisenä säätelijänä kasvainprogression ja varren kaltainen tila paksusuolen syövän ja ehdottaa, että kohdistaminen HMGA1 reitit voisi olla hyödyllistä terapiassa paksusuolensyöpä. Koska

HMGA1

rikastuu alkion kantasoluja, kudosspesifisiä kantasoluja, ja lähes kaikki aggressiivisia kasvaimia tutkittu tähän mennessä, meidän tulokset ovat todennäköisesti koskemaan paitsi ihmisen erilaisiin syöpiin, mutta myös normaaliin kehitykseen.

tukeminen Information

Kuva S1.

HMGA1

ilmentymistä kaikkialla ohut- ja paksusuolen transgeenisissä (TG) hiirissä verrattuna villityypin (WT) valvontaa. qRT-PCR

HMGA1

ja ohjaus geeni,

GAPDH

, suoritettiin kudoksesta saatu koko ohutsuoli (pohjukaissuoli, ja sykkyräsuoli) ja paksusuoleen (nouseva paksusuoli, merkitään A paksusuoli, ja laskeva paksusuoli, nimetty D paksusuoli) pois TG ja WT hiirillä.

HMGA1

ilmentymistä TG suolistossa kasvaa 4-8-kertaisesti yli, että havaittu WT-hiirissä, joka on mielivaltaisesti annettu arvo 1. Kaikki qRT-PCR-reaktiot tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kerran.

doi: 10,1371 /journal.pone.0030034.s001

(TIF) B Kuva S2.

Proliferaationopeudet HCT116 tai SW480 paksusuolen syövän soluja HMGA1 knock-down tai valvontaa vektori. (A) kasvuvauhteja HCT116-soluja oli transfektoitu

HMGA1

shRNA vektorin knock-down HMGA1 (punaiset neliöt) tai kontrollivektorille (sininen ympyrä) osoittavat samanlaisen leviämisen nopeudella. Standardipoikkeamat ovat ≤10% ja siksi ole näkyvissä. (B) kasvuvauhteja SW480 transfektoitu kontrollivektorilla (sininen ympyrä) tai

HMGA1

shRNA vektori (punaiset neliöt) osoittavat samanlaisen leviämisen nopeudella. Standardipoikkeamat ovat ≤10% ja siksi ole näkyvissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0030034.s002

(TIF) B Kuva S3.

HMGA1 knock-down johtaa muutoksiin EMT geenien ilman muutoksia solujen morfologiassa. (A) Knock-down of HMGA1 vuonna HCT116-soluissa ei aiheuttanut muutoksia solun morfologiassa tai halkaisija kontrolleihin verrattuna. (B) Knock-down of HMGA1 vuonna SW480-soluissa ei aiheuttanut muutoksia solun morfologiassa tai halkaisija kontrolleihin verrattuna. Otettiin valokuvia elävien solujen käyttäen 10 × tavoite; mittakaavajana, 100 pm.

doi: 10,1371 /journal.pone.0030034.s003

(PPTX) B