Krooninen sairaus

tiivistelmä

Käyttämällä expressed sequence tag bioinformatiikan algoritmi, tunnistimme, että

Lin28 homologi B

(

Lin28B

) voi olla onkofetaalinen ekspressiokuviota jotka voivat helpottaa havaita syöpäsoluja aikuisilla. On myös raportoitu olevan mahdollinen markkeri syövän kantasoluja. Siksi me pyrki tarkistamaan onkofetaalinen-stemness merkkiä

Lin28B

ja testaa sen mahdollisuuksia kiertävä syövän kantasolun kaltaisia ​​markkeri aikuisilla HCC potilailla.

Lin28B

mRNA tutkittiin paneeli sikiön kudosten, aikuisen kudosten ja kasvaimia.

Lin28B

oli yli-ilmentynyt tai pudotti HepG2-soluissa arvioida mahdollisuutensa kantasolun kaltainen merkki. RT-qPCR varten

Lin28B

suoritettiin perifeerisen veren mononukleaaristen solujen potilaista, joilla oli HCC vastaanottamiseksi leikkauksen (n = 96) ja ei-HCC kontrolleihin (n = 60) ja analysoitiin sen kliinistä merkitystä.

Lin28B

osoitti onkofetaalinen ilme kuvio. Sen yli-ilmentyminen voi säädellä lisäävästi stemness markkereita (Oct4, Nanog ja Sox2) ja parantaa tumorsphere muodostumista

in vitro

.

Lin28B

Knockdown oli päinvastainen vaikutus. Verenkierrossa

Lin28B

havaittiin perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa 3 tapauksissa (5%) ei-HCC valvontaa ja 32 tapauksessa (33,3%) HCC-potilaat. HCC potilailla, kiertävä

Lin28B

liittyi korkea kasvaimen (P = 0,046), suuri koko (P = 0,005), korkea AJCC vaiheessa (P = 0,044) ja BCLC vaihe (P = 0,017). Kiertävä

Lin28B

oli merkitsevästi yhteydessä vähentynyt uusiutumista vapaan elinajan (P 0,001). Kiertävä

Lin28B

erotetaan aikaisessa vaiheessa HCC osaksi 2 uusiutumista ilman taudin käyrät (P = 0,003). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, kiertävä

Lin28B

oli itsenäinen muuttuja liittyy varhainen uusiutuminen (P = 0,045) ja toistuminen alkuvaiheen HCC (P = 0,006). Lopuksi onkofetaalinen geeni

Lin28B

on potentiaalinen onkofetaalinen syöpää kantasolujen kaltaisia ​​kiertävien tuumorisolujen markkeri, joka korreloi HCC uusiutumisen jälkeen hepatektomian. Kiertävä

Lin28B

voisi hioa varhaisessa AJCC vaiheissa. Meidän havainto tukee mahdollista käyttöä TNMC (C verenkierrossa olevia kasvainsoluja) pysähdyspaikan järjestelmä HCC.

Citation: Cheng S-W, Tsai H-W, Lin Y-J, Cheng P-N, Chang Y-C, Yen C-J, et al. (2013)

Lin28B

Onko onkofetaalinen Kiertävä Cancer Stem Cell-Like Marker Liittyy uusiutuminen maksasyövän. PLoS ONE 8 (11): e80053. doi: 10,1371 /journal.pone.0080053

Editor: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 30 syyskuu 2013; Julkaistu: 14 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä oli tukee apurahan DOH101-TD-C-111-003 päässä Department of Health, Taiwan, myöntää NSC 97-2320-B-006 -027 -MY3 ja myöntää NSC-99-2628-B-006-034-My2 päässä National Science Council, Taiwan, ja NCKUH Research Grant (95) nro 67 National Cheng Kung yliopistollisen sairaalan, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on suurin syy syövän kuolemaan Taiwanissa ja yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti [1]. Siksi on välttämätöntä tunnistaa biomarkkereiden ennustettaessa kehittämisessä HCC ja kliinisen tuloksen. Alfafetoproteiinin (AFP) ja glypikaani-3 ovat nykyiset kasvain merkkiaineita HCC. Molemmat kuuluvat onkofetaalinen geenejä, jotka on määritelty geenit ilmaistaan ​​alkiot ja sikiöt, estetty tai tukahdutettu aikuisilla kudoksessa, mutta uudelleen ilmaistaan ​​kasvainsoluissa [2,3]. Onkofetaalinen geenien /proteiinien yleensä hyvä kasvainmerkkiaineet alhaisen tausta ilmentymistä aikuisilla. Aikaisemmassa tutkimuksessa käytimme yhdistetty bioinformatiikka ja kokeellinen lähestymistapa etsiä uusia onkofetaalinen geenien [4]. Olemme luokiteltu 6118 expressed sequence tag (EST) kirjastot 3 ryhmään: epäkypsä (n = 483), kypsä (n = 1724), ja kasvaimen (n = 3911). Käyttämällä laskettua taajuudet AFP-geenin kunkin ryhmän viittauksina asettaa kynnysarvot bioinformatiikan analyysi, me onnistuneesti tunnistettu 44 tuntemattoman geenin mahdollisten onkofetaalinen ilme kuvioita. Yksi geeneistä, LRRC16B tutkittiin edelleen [4]. Tulos tukee että tämä bioinformatiikan algoritmi voi tuoda esiin onkofetaalinen geenejä tärkeitä tehtäviä. Myös läsnä meidän geenissä luettelo oli geeni

Lin28 homologi B

(

Lin28B

), joka oli tuntematon tuohon aikaan. Laskennallinen taajuudet

Lin28B

geenin kirjastoissa kehittymätön, kypsä, ja kasvaimen ryhmät olivat 22, 5 ja 28, vastaavasti, jossa suhde kasvaimen ja kypsä ryhmiä (kasvain /kypsä) arviolta 5,6 (taulukko S1 ).

nisäkkään homologeja lin-28,

Lin28

ja

Lin28B

ovat microRNA sitovia proteiineja. Ne säätelevät kirjeet

7

sitoutumalla terminaalin silmukan

let-7

perheen miRNA esiasteiden ja estää sen jalostamista kypsä miRNA, jolloin derepressiota

let-7

tavoitteita, kuten

K-ras

ja

c-Myc

[5,6].

Lin 28

ilmentyy vahvasti alkioiden ja alkion kantasolujen [7]. Se voi ohjelmoida ihmisen somaattisten fibroblasteja pluripotenssia kun koekspressoidaan

Oct4

,

Nanog

ja

Sox2

[8]. Siten

Lin28

voi käsittää, että alkion kehityksen ja ylläpidon alkion kantasoluja. Mitä

Lin28B

, se pystyy edistämään solujen lisääntymistä ja transformaatio, mutta sen toiminta alkion kehitykseen on edelleen epäselvä [9-11].

Lin28B

usein ilmaistaan ​​HCC ja liittyy huono prognoosi potilaalle, verrattuna

Lin28

[9-13]. Koska

Lin28

tiedetään olevan markkeri kantasoluja, me ennustettu

Lin28B

liittyy myös solujen stemness ja on mahdollisesti markkeri syövän kantasoluja. Tällainen käsite tukivat viime julkaisuista, joissa

Lin28B

osoitettiin liittyvän stemness eturauhas- ja paksusuolen syöpä solulinjoja [14,15].

Käänteinen transkriptio kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (RT-qPCR) Ficoll-erotetut solut tai buffy coat on käytetty havaitsemaan kasvainsolujen transkriptin korvikkeena havaitsemiseksi verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) [16-20] . Jos haluat vähentää taustan tasoa ja lisätä erilaistumista voima, erinomainen markkereita tulisi olla alhainen todennäköisyys ilmaistaan ​​valkosolujen tai endoteelisolujen. Olisi vieläkin parempi, jos niitä ei ole ilmaistu mitään aikuisen kudoksessa ollenkaan. Siksi teoriassa onkofetaalinen geenit olisi hyvä kasvainmarkkereiden ääreisveren näytteistä. Koska

Lin28B

on ehdokkaana onkofetaalinen geenin, joka on mahdollisesti liittyvän kantasolujen fenotyyppejä, se on potentiaalinen korvike tuumorimarkkeri havaita verenkierrossa syövän kantasoluja, joiden on osoitettu olevan erittäin ennustearvoa syövän uusiutuminen ja etäpesäke [ ,,,0],21,22].

Siksi tämän tutkimuksen tarkoituksena oli todentaa dual onkofetaalinen ja syöpää kantasoluja ominaisuudet

Lin28B

ja arvioimaan sen kliinistä merkitystä, kun havaitaan verenkierrossa olevien solujen HCC potilailla. Hypoteesi testattu oli, että kiertävä

Lin28B

havaita perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa on onkofetaalinen syöpään kantasolujen kaltaisia ​​markkeri liittyy uusiutumisen tai elinajan HCC.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvainsolulinjat

käytetyt solulinjat tässä tutkimuksessa olivat ihmisen maksan (Huh-7, HepG2 ja PLC /PRF /5), munasarjojen (PA-1, TOV-21G, SK-OV -3, BG-1, NIH: OVCAR-3, ja ES-2), munuaisten (786-O ja ACHN), virtsarakon (T24 ja TSGH-8301), rinta (MCF-7), keuhkojen (A549), ja paksusuoli (SW480) syöpäsolun linjat. Huh-7 saatiin JCRB. HepG2, PLC /PRF /5, PA-1, TOV-21G, NIH: OVCAR-3, ES-2, MCF-7, SW480, T24 ja TSGH-8301 saatiin BCRC. A549 saatiin ATCC: ltä. SK-OV-3 ja BG-1 olivat ystävällinen lahja professori Tzu-Hao Wang [23]. 786-O ja ACHN olivat ystävällinen lahja professori Yeong-Shiau Pu [24]. A549, NIH: OVCAR-3, SK-OV-3, ja BG-1 ylläpidettiin DMEM /F12. T24, TSGH-8301, Huh-7, HepG2, MCF-7 ja SW480 pidettiin DMEM. 786-O ja ACHN pidettiin RPMI1640. PLC /PRF /5 ja PA-1 pidettiin MEM. ES-2 säilyi McCoyn 5a. TOV-21G säilyi MCDB105 ja M199 (1: 1). Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Gibco, Grand Island, NY, USA) alle 5% CO2, 37 ° C: ssa.

cDNA-kirjastot ja pariksi kasvain ja ei-kasvain kudosnäytteitä

sikiön cDNA-kirjastot hankittiin BioChain (Hayward, CA, USA) verrattiin ihmisen normaaleja aikuisen cDNA-kirjastoista hankittiin Clontech (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ). Pariksi kasvain ja ei-kasvainkudoksen eri elimistä kerättiin tuotujen potilaiden leikkausta National Cheng Kung yliopistollisen sairaalan, Tainan, Taiwan.

Magneettinen solulaji rikastuttaa EpCAM + solujen

EpCAM-positiivinen PLC /PRF /5, Huh-7 ja HepG2-solut eristettiin magneettinen solun lajittelu (MCS) käyttäen monodispersseistä magnetoitavissa hiukkaset mukaan valmistajan ohjeiden (CELLection

TM Pan hiiri-lgG kit) käyttäen anti-EPCAM-vasta-aine (Epitomics, Burlingame, CA). EpCAM

+ ja EpCAM

– PLC /PRF /5, Huh-7 ja HepG2 solut hajotettiin varten Western blot määrityksiä.

Retrovirusinfektio

Käytimme retrovial järjestelmää yli-ilmentävät

Lin28B

vuonna HCC solulinjoissa. pMSCVpuro (BD Clontech), pMSCV-LIN28B ja pSUPERretro vektorit transfektoida GP2-293T paketti solut VSV-G-plasmideja käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää 48 tuntia. HepG2 solu ympättiin 1 x 10

6 solua kuoppaa kohti 6-cm malja ja inkuboitiin yön yli 5% CO

2 37 ° C: ssa. Retrovirussupernatanttia lisättiin 8 ng /ml polybreeniä (Sigma, St Louis, MO, USA), ja käytettiin infektoimaan HepG2-solu. Yhdistettiin HepG2 solupopulaatiot ilmentävät joko pMSCVpuro tai pMSCV-LIN28B oli valittu 0,7gg /ml puromysiiniä (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).

shRNA lentivirus tuotannon

Käytimme lentivirus shRNA järjestelmä kaataa

Lin28B

vuonna HCC solulinjoissa. pLKO.1 ilmentävien plasmidien pieni hiusneula-RNA (shRNA) hankittiin National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwan). Lentivirus partikkelit saatiin RNAi Core, tutkimuskeskuksen Kliininen National Cheng Kung yliopistollisessa sairaalassa. Kaataa Lin28B ilmaisu, shRNA on

Lin28B

(TRCN0000219860, kohdesekvenssin: 5′- CATAACAGGTCTTCTTCATAT-3 ’) hyväksyttiin. Plasmidi pLKO_TRC005 käytettiin negatiivisena kontrollina.

Western blotting

Kerätyt solut liuotettiin lyysipuskuria (Complete Lysis M, EDTA free, Roche) jäillä ja sentrifugoitiin sitten 10000 x g, 4 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Sitten 100 ug proteiinia ladattiin ja erotettiin 12% SDS-PAGE, ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (Millipore, Billerica, MA, USA). Pienemmän määrän proteiinia (40 ug) ladattiin magneettinen solun lajittelu määrityksessä alentuneet solujen kokonaismäärä kerätään. Primaaristen vasta-aineiden mukana kanin anti-Lin28B (Cell Signaling Technology), hiiren anti-Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin anti-Nanog (Epitomics, Burlingame, CA), kanin anti-Sox2 (Epitomics, Burlingame, CA ), kanin anti-EpCAM (Epitomics, Burlingame, CA) ja hiiren anti-β-aktiini (Millipore).

Sphere muodostumista määrityksessä

Sphere muodostumisen määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, HepG2-solut ympättiin päällystämättömän 6-viljelylevyille (BD Labware, Bedford, MA) DMEM /F-12 seerumia (caisson) sisälsi 1% MEM NEAA: ta, 1 x N2, 20 ng /ml EGF: ää, 10 ng /ml bFGF: ää, 100 ug /ml penisilliini G ja 100 U /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Grand Island, NY). Kun 9 vuorokauden viljelmästä, kuopat tutkitaan käännettyä mikroskooppia at x20 suurennus, ja määrä aloilla 50 um laskettiin valomikroskoopilla.

Potilaat, näytteet ja kliiniset tiedot

sata ja yhdeksäntoista potilaat, joilla oli ensisijainen HCC koki hepatektomiaa National Cheng Kung yliopistollisen sairaalan tammikuusta 2006 ja joulukuun 2011 olivat mukana. Pre-leikkaus koko verinäytteitä lähetettiin perifeerisen veren mononukleaaristen solujen keräämistä. Potilaat, joilla on aiemmin todettu syövän, kaukainen etäpesäke ennen hepatektomiaa, positiivinen kirurginen marginaalit, diagnoosi yhdistetyn hepatocellur-kolangiokarsinooma (CHC), tai huono näyte RNA laatu suljettiin pois. Kymmenen potilasta suljettiin pois johtuen positiivisen kirurgiset marginaali tai diagnosoitu CHC ja 13 potilasta jätettiin pois heikon näytteen RNA laatu. Loput 96 potilasta otettiin mukaan lisätutkimuksia (kuva S1). Seuranta-aika oli keskimäärin 3 kuukauden välein. Toistuminen HCC dokumentoitiin kun tyypillisiä havainnot tietokonetomografian tai magneettikuvauksen kanssa tai ilman kohonnut seerumin AFP tasolla tai patologista vahvistusta. Toistuminen-elinaika (RFS) määriteltiin aika leikkauksesta ensimmäinen esiintyminen joko paikallisesti tai etäpesäkkeenä. Tautikohtaiset eloonjäämisen (DSS) määriteltiin aika leikkauksesta HCC liittyvä kuolema. Koehenkilöille sensuroitiin viimeisessä seurannassa tapaaminen tai kuollessa ilman toistumisen. Potilas profiilit 96 HCC potilailla on esitetty taulukossa S2. Mediaani seuranta-aika oli 19,7 kuukautta (alue, +0,1-41,5kuukausi). Neljäkymmentä potilasta (41,7%) oli toistuvia HCC (mediaani asti toistuminen, 7 kuukautta, alue, 1,5-31,6 kuukautta), mukaan lukien paikalliset uusiutumisen 32 potilaalla, etäpesäke 5 potilaalla, ja sekä paikallisia uusiutumisen ja etäpesäke 3 potilaalla. Kymmenen potilasta (10,4%) kuoli HCC (mediaanielinajassa, 13,8 kuukautta alue, +1,6-+21,9kuukautta). Vertailun vuoksi 60 henkilöä ilman HCC (non-HCC ryhmä) otettiin myös: 31 terveillä henkilöillä ilman maksasairaus ja 29 potilaalla on viruksen aiheuttama maksatulehdus, mukaan lukien 8 maksakirroosipotilaista (16 HBV ja 13 HCV). Keski-ikä terveiden yksilöiden ilman maksasairaus oli 44,1 vuotta (vaihteluväli 20-75 vuotta, 10 miestä ja 21 naista), ja potilailla, joilla on hepatiitti oli 49,4 vuotta (vaihteluväli 24-67 vuotta, 20 miestä ja 9 naista ).

Tietoon perustuva suostumus kirjallisesti saatiin kunkin potilaan ja tutkimussuunnitelman sopeutui eettiset ohjeet vuoden 1975 Helsingin julistuksen mikä näkyy ennalta hyväksyntä Human Experiment ja eettisen komitean National Cheng Kung yliopisto Hospital Tainan, Taiwan.

ääreisverinäytteestä valmistelu

Kokoveri kerättiin 10-ml pyrogeenitonta putkiin, jotka sisälsivät 0,12 ml K

3EDTA 15% (BD Vacutainer K

3EDTA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ja kerrostettiin sitten yhtä suuret tilavuudet Ficoll-Hypaque-tiheysgradientti (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa). Perifeerisen veren mononukleaariset solut talteen interphase. Solupelletit pestiin ja kerättiin myöhempää RNA.

RNA

Kokonais-RNA ensisijaisen kudoksen ja solulinjoja eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA verinäytteiden uutettiin käyttäen kittiä (QIAamp RNA Veren Mini Kit; Qiagen) valmistajan mukaan protokollia.

RT-PCR (RT-PCR) ja käänteistranskription kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n ( RT-qPCR) B

2 ug RNA: ta käänteisesti transkriptoitiin käyttäen SuperScript II (Invitrogen, Grand Island, NY). Semikvantitatiivinen RT-PCR-alukesekvenssit on esitetty taulukossa S3.

β-aktiini

käytettiin sisäisen valvonnan geenin RT-PCR: llä. CDNA: t tehtiin RT-qPCR käyttäen LightCycler-järjestelmä (Roche, Mannheim, Saksa). RT-qPCR eri sikiön ja normaalin aikuisen elinten ja verinäytteet, tasot

Lin28B

normalisoitiin

GAPDH

jota on käytetty referenssinä geenin havaitsemiseksi verenkierrossa olevia kasvainsoluja [19 , 26]. Maksan ja HCC kudosnäytteitä, tasot

Lin28B

normalisoitiin

tyrosiini 3-mono-oksigenaasin /tryptofaani 5-mono-oksygenaasi aktivointi proteiini, zeta-polypeptidi

(

PLA

) sen sijaan, ja

GAPDH

, koska ei ollut monenlaisia ​​vaihtelu ekspressiotasot

GAPDH

joukossa maksan ja HCC kudosnäytteistä.

PLA

oli keskipitkän ekspressiotaso maksakudoksessa [27] ja sen ekspressiotasot olivat vakaammat joukossa HCC kudosnäytteitä. Sekä RT-qPCR alukkeita ja koettimia ostettiin (Applied Biosystems; sekvenssejä ei esitetty) tai syntetisoitiin, kuten on suunnitellut LightCycler Probe Design Software 2,0. Sekä fluoresoiva TaqMan-koettimet ja suunniteltu amplifikaatioalukkeen sekvenssit on lueteltu taulukossa S4. Kukin standardikäyrä laskettiin sarjalaimennoksissa (10

0-10

6 kopiota) plasmidin malleja. Kynnys (Ct) näytteiden muutettiin kopioluvun mRNA käyttäen standardeja käyrät on johdettu sarjalaimennoksia konstruktien

Lin28B

ja

GAPDH

, vastaavasti. Nukleiinihappo uutetaan HepG2-soluissa käytettiin positiivisena kontrollina. Negatiivinen kontrolli, jossa templaatti kokonais-RNA korvattiin steriilillä vedellä oli mukana. Dynamiikka RT-qPCR varten

Lin28B

oli 10-10

6 kopiota plasmidia malleja (kuva S2). CT-arvo on alle 38 ja suurempi kuin nolla osoittaa positiivinen ilmaus

Lin28B

geeniä, kun taas Ct-arvo on yhtä suuri tai suurempi kuin 38 tai ei Ct-arvo osoittaa negatiivinen ilmaus

Lin28B

geeni.

Tilastollinen

Ero tumorsphere muodostuminen

Lin28B

ilmentävää ja -knockdown solulinjat testattiin merkitystä käyttäen opiskelijan

t

-testi.

Lin28B

mRNA ilmaisun ääreisverenkierrossa verrattiin ryhmien välillä käyttämällä Wilcoxonin summa testi ja korreloi kliinis indikaattorien avulla chi-neliö -testi tai Fisherin testiä. Survival käyrät ja todennäköisyyksiä arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä, ja log-rank-testiä käytettiin merkityksen arvioimiseksi ero ryhmien välillä. Jätettävää yksi-out cross validointi käytettiin määrittämään raja-arvo liittyy selviytymisen. Yhden ja usean Coxin suhteellista riskiregressioanalyysiä mallia käytettiin määrittämään merkitystä eri ennustavat tekijät. Monimuuttujakalibrointi analyysit säädettiin samanaikaisesti ikä, sukupuoli, laji virusinfektio, maksakirroosi, kasvaimen, tila multifokaalinen kasvaimia, satelliitti kyhmyjä, verisuonten invaasio, kasvaimen koon,

American

yhteinen

komitea

on

Cancer

(AJCC 7. painos) vaihe , Barcelona-Clinic Maksasyöpä (BCLC) vaihe ja seerumin AFP. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin

P

0,05. Analyysi perifeerisen verinäytettä 96 potilasta on 80% teholla havaitsemaan riskisuhde 2,2 välillä

Lin28B

(+) ja

Lin28B

(-) HCC potilaille. Suhteellinen vaarat oletukset tarkastettava martingaali ja poikkeavuudeksi diagnostisia tontteja eikä merkittävää poikkeama oletukset suhteellinen vaara regressiomallin olemassa.

Tulokset

Euroopan onkofetaalinen ominaisuudet Lin28B

sen testaamiseksi,

Lin28B

on onkofetaalinen geeni, sen ekspressiota tutkittiin paneeli ihmisen kokonais-RNA: ta (Master Panel II, BD Clontech) käyttäen RT-PCR: llä (kuvio 1A).

Lin28B

ilmentyi sikiön aivojen, sikiön maksassa, normaalin aikuisen istukka, kives, aivot ja selkäydin. Sitä ei ilmaista muissa aikuisen kudoksissa. Muutos ilmaisun fetaalimaksoista aikuisen kudoksiin kvantitoitiin RT-qPCR käyttäen kokonais-RNA valittu ihmisen sikiön Normaali Tissue (BioChain) ja Master Panel II (BD Clontech) kudoksen paneelit (kuvio 1 B).

Lin28B

ilmentyi sikiön elinten, mutta merkittävästi alassäädetty niiden aikuisten kollegansa, paitsi aivoihin.

A, RT-PCR osoitti, että

Lin28B

ilmentyi sikiön aivoissa ja maksassa ja aikuisen kiveksessä, aivot, selkäydin ja istukan. Se ei havaittu muissa aikuisen kudoksissa. B, RT-qPCR osoitti, että

Lin28B

oli merkittävästi vaimentua sikiön (suljettu bar) aikuisille (avoin baari) kudoksiin paitsi aivoihin. C, RT-qPCR suoritettiin käyttäen pareja HCC (suljettu bar) ja ei-kasvain (avoin baari) maksan kudoksissa. Yliekspressio

Lin28B

( 100 ×) havaittiin 8 HCC näytettä (53,3%). NC, negatiivinen kontrolli; PC, positiivisena kontrollina.

seulomiseksi mahdollista

Lin28B

ilmentymistä eri kasvaintyypeissä, RT-PCR suoritettiin ihmisen eri syöpäsolulinjoissa.

Lin28B

voitiin havaita munasarja-, maksan, paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjoissa (kuvio S3). Tutkia sen ilmentymistä kasvaimissa, RT-PCR suoritettiin viisi tapausta pariksi kasvain ja ei-tuumorikudoksia 5 tyyppisiä yhteisiä syöpiä (kuva S4).

Lin28B

oli yli-ilmentynyt joissakin kasvainten rinta (1/5), kohtu (1/5), keuhkojen (4/5), maksassa (1/5), ja munasarjojen (1/5) , mutta ilmentyi hyvin pieniä määriä ei-kasvainkudoksessa. RT-qPCR varten

Lin28B

ilmentyminen edelleen suoritettiin 15 HCC kasvain ja ei-kasvainkudoksessa pareja (kuvio 1 C). Yli-ilmentyminen

Lin28B

( 100 ×) havaittiin 8 kasvain kudosnäytteistä (53,3%). Nämä tulokset vahvistivat onkofetaalinen luonne

Lin28B

. Kaksi ei-kasvain maksan kudosnäytteistä (13%) osoitti alhaista

Lin28B

ilmaisua. Mikroskooppisen, yksi näistä kahdesta näytteestä osoitti kirroosin polttoväli suuri solu muutos ja muut osoittivat krooninen hepatiitti miedolla käyttöliittymän toimintaa. Histologinen havainnot eivät osoittaneet selvää eroa kuin 13 ei-kasvain maksan kudosnäytteistä ilman

Lin28B

ilmaisua, jossa seitsemän tapausta osoitti kirroosi ja 6 tapaukset osoittavat, krooninen hepatiitti kanssa käyttöliittymän toimintaa. Neljä tapausta osoitti suurta cell muutos ja yksi tapaus osoitti pienisoluinen muutos.

Kohonnut ekspressio Lin28B in EpCAM rikastettu kantasolun kaltainen väestön

EpCAM on pintamerkkiaine joka oli raportoitu pystyvän rikastuttaa maksan kantasolun kaltainen väestöstä [28]. Siksi tutkia

Lin28B

ilmentyy syövän kantasoluja, suoritimme magneettinen solun lajittelu (MCS) erottamiseksi HCC solulinjojen osaksi EpCAM

+ ja EpCAM

– populaatiot. Proteiini taso Lin28B suureni EpCAM

+ PLC /PRF /5-soluissa ja Huh-7-soluissa (kuvio 2A, ylempi paneeli), sekä kohonneeseen kantasolujen merkkiaineita, Sox2, Nanog ja Oct4 PLC /PRF /5 soluja ja Sox2 ja Oct4 in Huh-7-soluissa (kuvio 2A, alempi paneeli). Sen sijaan EpCAM-capture ei rikastuttaa kantasolun kaltainen väestön HepG2-soluissa, koska ei ollut eroa Sox2, Nanog tai Oct4 ilmaisun välillä EpCAM

+ ja EpCAM

– HepG2-soluissa (kuvio 2A, alempi paneeli). Lin28B myös osoittanut mitään eroa näiden kahden populaation (kuva 2A, ylempi paneeli). Yhdessä havaintomme tukevat käsitystä, että Lin28B ilmentyy syövän kantasolujen kaltaisia ​​alapopulaatiot.

Western blot-analyysit osoittivat, että Lin28B yliekspressoitiin jää EpCAM

+ PLC /PRF /5-soluissa ja Huh- 7-soluissa mutta ei EpCAM

+ HepG2 solut (A, ylempi paneeli). EpCAM

+ PLC /PRF /5-soluissa osoitti kohonneet Sox2, Nanog ja Oct4; EpCAM

+ Huh-7-soluissa, Sox2 ja Oct4; mutta EpCAM

+ HepG2-soluissa, ei mitään (A, alempi paneeli). Lin28B-pMSCV HepG2cells osoitti kohonneeseen Oct4, Nanog, Sox2 ja EpCAM Länsi blot (B) ja muodostunut enemmän palloja kuin vektorisäädön solujen (P = 0,032) (C). sh-Lin28B HepG2 solut osoittivat alentuneesta Oct4, Nanog, Sox2 ja EpCAM Länsi blot (D) ja taipumus muodostaa vähemmän palloja kuin vektorisäädön solujen (P = 0,059) (E). sh-Lin28B PLC /PRF /5-soluissa ja Huh-7-solut vähentävät myös ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita (F). Pienemmän määrän proteiinia (40 ug) ladattiin MCS määrityksessä kuin että (100 ug) ladattiin

Lin28B

-overexpression määritys johtui solujen kokonaismäärä kerätään MCS määrityksessä. Eri virus järjestelmiä käytettiin kokeissa: retrovirus in

Lin28B

yli-ilmentyminen määritys ja lentivirukselle in

Lin28B

knock-down määrityksessä. Solujen kasvu oli hitaampaa, kun tartunnan lentiviruksen. MCS, magneettinen solun lajittelua. Asteikkoviiva C ja E, 50 pm.

Lisääntynyt in vitro stemness kanssa Lin28B yliekspressio

Koska EpCAM voinut rikastuttaa

Lin28B

ilmentävää varsi solu- kuten väestön HepG2-soluissa, olemme perustaneet

Lin28B

-overexpression HepG2 vakaa poolista retrovirusinfektiosta tutkia vaikutusta Lin28B on kantasolun kaltainen fenotyyppejä. Edustavia kantasolujen merkkiaineita analysoitiin Western blottauksella. Verrattuna vektorisäätö, Lin28B yli-ilmentyminen upregulated kantasolujen merkkiaineita: Sox2, Nanog, ja EpCAM. Lievä nousu Oct4 havaittiin myös (kuvio 2B).

vaikutuksen määrittämiseksi

Lin28B

kasvaimen pallo muodostumista, sekä

Lin28B

ilmentävää ja ohjaus solujen viljeltiin suspensiossa tuottamaan palloja indikaattorina syöpä varren kaltainen ominaisuus

in vitro

[25,29,30]. Kuten kuviossa 2C,

Lin28B

ilmentävillä HepG2 solut osoittivat lisääntynyttä tumorsphere muodostava kyky verrattuna vektorisäätö solujen (P = 0,032).

Päinvastoin kaatamalla

Lin28B

HepG2 solulinjassa vaimentua ilmentymistä Oct4, Nanog, Sox2 ja EpCAM (kuvio 2D) ja pyrkivät vähentämään tumorsphere muodostumista (P = 0,059) (kuvio 2E). Lisäksi kaatamalla

Lin28B

PLC /PRF /5-soluissa ja Huh-7-soluissa myös vaimentua ilmaus kantasolujen merkkiaineita (kuvio 2F).

havaitseminen Lin28B mRNA reuna verisolujen HCC potilaiden

RT-qPCR levitettiin ekspression tutkimiseksi

Lin28B

perifeerisessä verisolujen. Reaktio oli lineaarinen 10-10

6 kopiota puhdistettua plasmidi malleja (kuva S2). Ilmaus

Lin28B

voitiin havaita, kun yksi HepG2 solujen yhdistettiin 10

7 leukosyyttien noin 3 ml kokoverta (kuvio S5). Tämän pohja,

Lin28B

mRNA havaittiin 3 tapausta (5%) ei-HCC valvonta (1 terveillä ryhmässä ja 2 hepatiitti ryhmässä) ja 32 tapauksessa (33,3%) HCC ryhmässä (kuva 3A). Valikoima Ct oli 30,57-37,94 positiivisen näytteen.

Lin28B

ilmaistiin 3 tapausta (5%) ei-HCC valvonta (1 terveillä ryhmässä ja 2 hepatiitti ryhmä) ja 32 tapauksessa (33,3%) on HCC ryhmässä. (Bar: keskimääräinen; Musta piste: huomaamaton) (A). Potilaat, joilla on uusiutuva HCC oli merkittävästi korkeammat ekspressiotasot

Lin28B

kuin potilailla, joilla ei toistuvia HCC. (P 0,001). (Bar: keskimääräinen; Musta piste: huomaamaton) (B). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että

Lin28B

oli merkitsevästi yhteydessä vähentynyt uusiutumista vapaan elinajan (P 0,001) (C). Suhde

Lin28B Twitter /

GAPDH

mRNA yli 10

-3 yleensä liittää tiettyyn tautiin eloonjäämisen (P = 0,094) (D).

Lin28B

oli merkitsevästi yhteydessä vähentynyt uusiutumista elinaika AJCC vaiheen I-II potilaat (P = 0,003) (E), mutta ei AJCC vaiheessa IIIA-IVA potilailla (P = 0,419) (F).

Lin28B

oli merkitsevästi yhteydessä vähentynyt uusiutumista elinaika AJCC vaiheessa I (P = 0,030) (G) ja vaiheen II (P = 0,030) potilailla (H).

Potilaat, joilla on uusiutuva HCC oli merkittävästi korkeammat ekspressiotasot

Lin28B

kuin ilman toistumisen (P 0,001) (kuvio 3B). Ilmaisu on

Lin28B

kiertävien solujen merkitsevästi liittyvät ei-kirroottiset maksan (P = 0,021), korkea kasvaimen (P = 0,046), suuri kasvain koon (P = 0,005), korkea AJCC vaiheessa (P = 0,044) ja BCLC vaihe (P = 0,017) (taulukko 1). Pitoisuudet verenkierrossa Lin28B ollut merkittävää yhteyttä korkea BCLC (vaihe B C tauteja vastaan ​​A1-A4 sairaudet) (P = 0,022) (kuvio S6A) ja oli rajatapaus merkitys liittyy korkea AJCC (vaihe IIIC IVA tauteja vastaan ​​I IIIB sairaudet) (P = 0,066) (kuvio S6b). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että liikkeessä

Lin28B

merkitsevästi liittyy pienentynyt RFS (P 0,001) (kuvio 3C). Ilmaisu on

Lin28B

verenkierrossa soluissa ei merkittävästi liittynyt vähentynyt DSS (P = 0,140). Käyttämällä jätettävää one-out cross validointimenetelmän, suhde

Lin28B /GAPDH

mRNA yli 10

-3 (n = 15) oli taipumus liittyä pienentynyt DSS (P = 0,094) ( Kuva 3D).

tekijät

Ryhmä

Lin28B

(-) (%) B

Lin28B

(+) (%) B

P

-arvon

Age 60 vuotta old35 (70) 15 (30) 0.470≥60 vuotta old29 (63) 17 (37) SexMale46 (67) 23 (33) 1.000Female18 (67) 9 (33) Virus infectionNone10 (83) 2 (17) 0.551HBV34 (61) 22 (39) HCV16 (67) 8 (33) HBV + HCV4 (100) 0 (0) CirrhosisAbsent28 (56) 22 (44) 0,021

* Present36 ( 78) 10 (22) Kasvaimen grade1-255 (71) 22 (29) 0,046

* 39 (47) 10 (53) multifokaalinen tumorsAbsent53 (65) 28 (35) 0.551Present11 (73) 4 (27) Satellite noduleAbsent51 (67) 25 (33) 0.859Present13 (65) 7 (35) Tuumorikoko 5 cm45 (78) 13 (22) 0,005

* ≥ 5 cm19 (50) 19 (50) Vascular invasionAbsent35 (71) 14 (29) 0.312Present29 (62) 18 (38) AJCC stageI, II, III A, IIIB62 (70) 27 (30) 0,044

* IIIC, IVA2 (29) 5 (71) BCLC stageA1-A441 (77) 12 (23) 0,017

* B-C23 (53) 20 (47) seerumi AFP tasot 50 ng /ml44 (73) 16 (27) 0.074≥ 50 ng /ML20 (56) 16 (44) Taulukko 1. Korrelaatio kiertävän

Lin28B

testitulokset kliinis indikaattorit maksasolusyövän.

* P 0,05. Kasvaimen by Edmondson ja Steiner pisteytysjärjestelmä. AJCC, American sekakomitean Cancer 2010; BCLC, Barcelona-Clinic Maksasyöpä; AFP, Alfafetoproteiini. CSV Lataa CSV

Univariate analyysi paljasti, että kasvaimen (P = 0,047), verisuonten invaasio (P = 0,038), AJCC vaihe (P 0,001), BCLC vaihe (P = 0,030) ja kiertävän

Lin28B

(P = 0,001) liittyivät merkittävästi vähentynyt RFS (taulukko 2). Monimuuttujakalibrointiin mallissa, kirroosi (P = 0,043), AJCC vaihe (P = 0,001) ja kiertävän

Lin28B

(P = 0,047) olivat riippumattomia muuttujia liittyy pienentynyt RFS (taulukko 2). Kasvaimen (P = 0,035), AJCC vaihe (P 0,001), seerumin AFP (p = 0,014) ja kierrätetään

Lin28B

(P = 0,001) olivat merkitsevästi yhteydessä varhainen uusiutuminen alle yhden vuoden yhden muuttujan malli (taulukko 3). AJCC vaiheessa (P = 0,004) ja kiertävän

Lin28B

(P = 0,045) olivat merkitsevästi yhteydessä varhainen uusiutuminen alle vuoden monimuuttujakalibrointiin malli (taulukko 3). Kuten DSS, satelliitti kyhmy (P = 0,047) ja AJCC vaihe (P = 0,046) olivat riippumattomia muuttujia monimuuttujamenetelmin (taulukko S5). Kuitenkin

Lin28B /GAPDH

mRNA yli 10

-3 ollut itsenäinen parametri DSS.

RFS univariate

RFS monimuuttuja

Factor

Ryhmä

HR

95% CI

P

HR

95% CI

*Tumor stage 0.001

*0.001

*I/II~IIIB3.421(1.396-8.385)4.929(1.293-18.785)I/IIIC~IVA36.35(3.731-353.236)50.281(4.202-601.720)BCLC stage0.030

*0.085A1/A2-A42.986(1.209-7.374)3.632(1.073-12.288)A1/B-C2.361(1.124-4.961)3.320(0.730-15.110)Serum ng/ml1.642(0.876-3.076)0.1220.778(0.323-1.873)0.575Lin28B-/+2.918(1.559-5.463)0.001

*2.248(1.012-4.995)0.047

*Table 0,05. years0.616(0.293-1.295)0.2010.479(0.189-1.215)0.121SexMale/female0.570(0.233-1.396)0.2190.742(0.276-2.000)0.556Viral /Both1.152(0.104-12.724)2.777(0.156-49.508)Cirrhosis-/+0.576(0.104-12.724)0.1470.437(0.153-1.250)0.123Tumor stage 0.001

*0.004

*I/II~IIIB3.782(1.521-9.405)4.040(0.948-17.221)I/IIIC~IVA37.631(3.860-366.894)47.592(3.692-613.500) stage0.0630.304A1/A2-A42.015(0.639-6.351)2.532(0.606-10.582)A1/B-C2.856(1.190-6.850)2.787(0.536-14.502)Serum ng/ml2.457(1.198-5.038)0.014

*0.964(0.344-2.698)0.944Lin28B-/+3.637(1.749-7.563)0.001

*2.649(1.022-6.862)0.045

*Table 0,05. β-aktiini oli sisäisen valvonnan.