Krooninen sairaus

tiivistelmä

Polycomb- Sortavat Complex 2 (PRC2) on epigeneettisestä säädin aiheutettiin moniin syöpiin. Uskotaan ajaa kasvaimien syntyyn mukaan tukahduta jako, stemness, ja /tai kehitykseen sääntelyviranomaisten. Syövät kiertää immuuni havaitsemiseen, ja monipuolinen immuuni sääntelyviranomaiset levoton eri kasvaimissa. On epäselvää, miten tällainen soluspesifisestä vaikutuksia koordinoidaan. Tässä osoitamme syvällinen ja syöpää selektiivinen rooli PRC2 vuonna tukahduttaa useita sytokiinien reittejä. Huomaamme, että PRC2 tukahduttaa satoja IFNy stimuloidaan geenien (ISGs), sytokiinien ja sytokiinin reseptoreihin. Tämä tavoite ohjelmisto on merkittävästi laajennettu syövän vs ei-syöpäsoluja, ja on selvästi eri syöpätyyppejä. PRC2 on siis korkeamman asteen säätelijä immuunijärjestelmää syöpäsoluissa. Estämällä PRC2 joko RNAi tai EZH2 inhibiittorit aktivoi sytokiinien /-sytokiinireseptorin promoottorit merkitty kaksiarvoisella H3K27me3 /H3K4me3 chromatin ja täydentää vastata erilaisiin immuuni signaaleja. PRC2 esto pelastaa immuuni-geenin induktion, vaikka ilman SWI /SNF, tuumorisuppressori puutteellinen ~ 20% ihmisen syövissä. Tämä uusi PRC2 toiminto kasvainsoluissa voi olla vakavat vaikuttaa vaikutusmekanismi ja tehoa EZH2 estäjien syövän hoidossa.

Citation: Abou El Hassan M, Huang K, Eswara MBK, Zhao M, Song L, Yu T , et ai. (2015) Cancer Cells kaappaus PRC2 muokata useita Sytokiinimääritys Pathways. PLoS ONE 10 (6): e0126466. doi: 10,1371 /journal.pone.0126466

Academic Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 29 joulukuu 2014; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2015; Julkaistu: 01 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Abou El Hassan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla GEO tietokannasta, tulonumerolla GSE67766. Tämä on superseries numero, ja kyseisen aineisto on olemassa yksittäisiä tiedostoja kaikille microarray, Chip-siru, ja RNAseq tiedot.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat RB: 703079 Kanadan Cancer Society (http: //www.cancer.ca/research), RB: MOP 74570 Canadian Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html), RB: KF12-02 Krembil Foundation (http : //www.krembilfoundation.ca/), JJ: R01GM103893 National Institutes of Health (US) NIH (https://www.nih.gov/).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Syöpäsolut käyttää erilaisia ​​strategioita kiertää immuunijärjestelmää, kuten sääntely sytokiinien tai muiden erittyvien tekijät /reseptoreita, jotka ohjaavat immuunivaste [1]. Huomattavaa on, että tyyppi, sijainti, ja aste immuuni infiltraatiota on kasvain (jäljempänä ”Immunoscore”) ennustaa lopputulos parempi kuin lukuisat perinteisesti käytetty kasvaimeen keskeinen patologia parametreja, kuten kasvaimen [2]. Tekijöitä, jotka ohjaavat immuunivalvonnan vaihdella asiayhteyden ja yksityiskohdat ovat monimutkaisia, koska aineet, jotka edistävät immuuni välys yhdessä tilanteessa edistää immuunisuppressiota toisessa (tarkistetaan [3]). Houkutteleva ajatus on, että kasvaimia voisi käyttää yhteinen mekanismi manipuloida ilmaisua immuuni sääntelyviranomaisten, ja että kukin kasvain räätälöi tätä strategiaa omien tarpeidesi ympäristössä. Häiritsevät tällaista korkeamman tason sääntely voisivat tarjota yleistä strategiaa kasvattaa immuuni havaitsemiseen ja puhdistumaan moniin syöpiin. Kuitenkin mekanismit, jotka ohjaavat lukemattomia immuunijärjestelmän geenit, jotka vaikuttavat valvonta ei ymmärretä hyvin.

Polycomb- Sortavat Complex 2 (PRC2) on epigeneettiset säädin että talletukset tukahduttava histoni H3 lysiinin 27 (H3K27me3) jälkiä chromatin. Kaksi sen pääkomponenttien sisällyttää katalyyttinen alayksikkö EZH2, ja SUZ12, teline proteiini tarvitaan monimutkaisten vakauden [4]. PRC2 on osa Polycomb- perheen sääntelyviranomaisten että toiset myönteiset transkription vaikutukset Trithorax perheenjäsenten kehityksen aikana, kuten SWI /SNF chromatin remodeling monimutkainen [5]. PRC2, joka on usein yli-ilmentynyt syövän, ajatellaan edistää kasvaimien syntyyn säätelemällä solukierron, DNA: n kahdentuminen, selviytyminen, vanhenemista ja /tai stemness [5-7]. Onko ja missä laajuudessa PRC2 saattavat vaikuttaa immuunijärjestelmää kasvaimissa on epäselvä.

Aiemmin me ja muut osoittivat, että BRG1, ATPaasi moottorina SWI /SNF, tarvitaan reagointikykyä IFNy stimuloidaan geenien (ISGs ) [8-11]. Tällä

CIITA

lokuksen, huomasimme, että BRG1 koordinoi toimintaa monien distaalisen parantajia. Kuitenkin vaikka se on välttämätön tällä endogeeniseen lokukseen ja suuri 190 kb toimittaja, BRG1 on tarpeeton IFNy induktioon lyhyt

CIITA

toimittajille, mikä johtaa ajatukseen, että se voi lieventää vaikutuksia kauko repressori. Viime työtä rinnakkain nykyisen tutkimuksen, osoitimme, että PRC2 ja H3K27me3 koristella

CIITA

locus, sekä promoottorin ja välillä kauko parantajia [12]. Irrottaminen PRC2 lievittää vaatimus BRG1, ja valmis kauko -50 kb tehostajana, aivan kuten nähdään BRG1. Mietimme, tämä antagonismia BRG1 ja PRC2 saattavat ulottua muiden IFNy tavoitteisiin. IFNy on tärkeä rooli immuunivalvonnan [13-20]. 20% ihmisen syövissä puuttuu toiminnallinen SWI /SNF [21], ja tämä vika tai säätely ylöspäin PRC2 voisi olla yleinen mekanismi immuuni paeta syövän. Lisäksi kohdentamista PRC2 erillisiin loci voisi auttaa sculpt erityiset immuunijärjestelmää tarvitaan eri syövissä.

Tässä osoitamme, että PRC2 on laaja rooli tukahduttaa ISGs, ja yllättäen, että se on myös dramaattinen ja syöpä selektiivinen säätelijänä monissa muissa sytokiini polkuja. Estämällä PRC2 kanssa RNAi tai pienimolekyylisiä EZH2 estäjät uudelleen ISG reagointikykyä, vaikka SWI /SNF-vajaiden syöpäsoluja. Lisäksi laaja RNAseq analyysi paljasti, että häiritseviä PRC2 aktivoi useita sytokiinien ja sytokiinin reseptoria polkuja. Tämä toiminto on laajentunut huomattavasti syövän

vs

. ei-syöpäsoluja, ja voitaisiin estää kautta lääkealan keinoin. PRC2 on siis korkeamman asteen säätelijä immuuni reittejä syövän, kohdistaminen sytokiineja, niiden reseptorit, ja loppupään tavoitteet, ja se räätälöidään tämän ohjelman mukaan syöpätyypin. Sytokiinit ovat pleiotrooppinen vaikutuksia kasvainten synnyssä [3,22], ja sillä voi olla suuri vaikutus tehoon EZH2 estäjien ihmisen syövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja adenovirukset

Soluja kasvatettiin, kuten on kuvattu [9] ja käsiteltiin ihmisen IFNy (Invitrogen), jonka pitoisuus on 0,1 mg /ml. SW-13-soluja transdusoitiin adenovirus ilmentävät GFP (Ad-GFP) tai GFP-BRG1 fuusioproteiini (Ad-BRG1) kuvattu [9]. AdBRG1 virus titrattiin siten, että BRG1 ilmaisu sovitettu, että HeLa-soluissa [9].

Sirna (siRNA) B

siSUZ12, siEZH2 ja siCtrl saatiin Qiagen, ja siBRM Thermo Scientific . SW-13-solujen 2×10

6 per 10 cm: n maljaa transfektoitiin 50 nM siCtrl, siSUZ12 tai siEZH2 yksin tai 75 nM siBRM 3-4 päivää käyttäen DharmaFECT-1 (Thermo Scientific). Soluja Saharan viljeltiin 2×10

6 per 10 cm malja ja suoritetaan toinen transfektio sykli, varmistamalla parempi H3K27me3 ehtyminen. Sen jälkeen soluja käsiteltiin 0,1 mg: lla /ml ihmisen IFNy: ssa 6 tuntia.

Lännenelokuvat

Lännenelokuvat suoritettiin, kuten on kuvattu [23]. Vasta-aineiden katso S4 Taulukko.

RT-PCR: llä ja Expression Arrays

RNA käänteistranskriboitiin ja analysoitiin kvantitatiivisella PCR: llä. Arvot normalisoitiin p-aktiini [9]. Primerit ovat S4 taulukossa. Sillä ilme paneelit, RNA laatu tarkastettiin käyttämällä Bioanalyzer (Agilent Inc.), muunnetaan cDNA, jota seurasi 2

nd juosteen synteesin ja cRNA valmistelu käyttäen Ambion Kit (Applied Biosystems). cRNA oli sarake-puhdistettu laatu tarkastetaan käyttäen Agilent Bioanalyzer. 1,5 ug hybridisoitiin Illumina koko genomin ekspression taulukot. AdGFP /BRG1 ja siCtrl /siSUZ12 näytteet hybridisoitiin ihmisen-WG6 Expression BeadChips and Human-HT-12 Expression BeadChips, vastaavasti (Illumina, Inc.). Differentiaalisen ekspression analyysi suoritettiin käyttäen keskimääräistä normalisoinnin mukaan BeadStudio ohjelmisto (Illumina Inc). Kolme biologinen rinnakkaista sisällytettiin kussakin testiryhmässä.

ChIP qPCR, siru siru, ja siru-seq

chip qPCR DNA tehtiin kuten [10,24]. Vasta-aineet ja alukkeet ovat S3 S4, vastaavasti. Vasta-aineet oli aiemmin validoitu [25] ja olemme edelleen todentaa H3K27me3 ja H3K79me3 vasta avulla pisteblotit. Sillä Chip-siru, immu- DNA monistettiin, merkitty, ja hybridisoitiin ihmisen 1M promoottori laatoitus paneelit (Agilent). TileMap käytettiin määrittämään alueita, joilla on täydennettävä H3K27me3 [26], ja intensiteetit normalisoitiin sisäisiin standardeihin. Piikit paremmuusjärjestykseen testisuureen arvo (maksimaalinen TileMap-MA tilastotieto: maxM /P [26]). Menetelmät asettaa maxM /P sulku kuvataan S1 Teksti (Täydentävä Methods). Lisätietoja analyysiin siru-kohdat tulokset, katso S1 Teksti (Täydentävä Methods).

RNA-Sequencing

RNA laatu testattiin Bioanalyzer (Agilent). Oligo-dT-helmiä käytettiin eristämään poly (A)

+ mRNA, ja sen jälkeen, kun satunnainen pirstoutuminen ~ 300 emäsparin RNA-fragmentteja käytettiin valmistamaan multipleksoidun cDNA-kirjastojen avulla Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit. High-throughput sekvensointi kirjastot tehtiin käyttämällä Illumina HiSeq 2000 LTRI. Sekvensointi lukee kunkin näytteen fastq muodossa arvioitiin kanssa FASTQC, ja per emässekvenssi laatu ja sarjaa kohti GC-pitoisuus ilmoitetaan tietojen korkea laatu. Tiedot kartoitettiin päälle ihmisen genomin (hg19) käyttäen Tophat 1.4.1, joka mahdollistaa jopa kaksi epäsuhta [27]. Ei ainutlaatuinen lukee erotettiin suodattamalla. Lukuoperaatioista count (tai kokoonpanoa) kunkin geenin laskettiin käyttämällä mukautettua R-pohjainen putki ((https://www.r-project.org). Lisätietoja siitä, miten tietojen laatua ja differentiaalisesti ilmentyvien geenien arvioitiin katso S1 Teksti (Täydentävät menetelmät ja tulokset).

Gene Set rikastus Analysis

uutetaan geenejä log

2Fold muutos 0 ja ero todennäköisyyksiä 0,5 ja sijoittui SUZ12 tukahdutti geenejä vähentämällä ero todennäköisyys arvot. Käytimme GSEA Preranked toiminnon analysoida rikastusta sijoittui geenien C2-geenin sarjaa viedään Kegg koulutusjakson versiosta 3.1 kanssa geenien geenin sarjaa tunnistaa HUGO geeni symboli. Valitsimme rikastettua väyliä korkea Enrichment Pisteet (ES), jonka sulku nimellisestä P-arvo (NOM p-val) 0,01 ja FDR q-val 0,05. Sillä ”sytokiini–sytokiinireseptorin vuorovaikutus” (CCRI) reitin, me edelleen soveltavaa GSEA eturivin analyysi poimia polku jäsenille, jotka selittävät rikastamista. Me ryhmittyneet geenit heidän DE todennäköisyydellä yli kuusi syöpäsolulinjoilla yhteisiin ja eri vaikuttaa geenien eri syöpäsoluja saman reitin. Käytimme Kegg reitin kartta CCRI koulutusjakson (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html, kartta 04060) tuottaa kaavioita. Klusterointi analysointi ja visualisointi tehtiin kanssa MeV (https://www.tm4.org/mev.html).

Sytokiini Detection

Suz12 Knockdown, A549 soluja käsiteltiin kahden syklin kohti yllä. Huumeiden inhibitioon Ezh2, soluja käsiteltiin kaksi neljän päivän jaksoissa 2 uM GSK343 ​​tai UNC1999. Lopussa kunkin käsittelyn, solut siirrostettiin @ 3×10

4 /kuoppa 96 ruokia. Solujen annettiin laskeutua 4 tunnin ajan ja sitten konsentraatiot eri ärsykkeiden (LPS, IFNy, IL1B ja TNFa) lisättiin. Culture supernatantit kerättiin 24 tunnin kuluttua ja pakastettiin käyttöön asti. ELISA suoritettiin kahtena käyttämällä IL6-, IL8- ja CXCL10-ELISA Max Deluxe tuotesarjoja Biolegend. Multiplex analyysi sytokiinien viljelmäsupernatanteissa suoritettiin käyttäen Human Primary Sytokiini Array /Kemokiini Array 41-Plex määritys Eve Technologies Corporation, Kanada. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Western blot -analyysi suoritettiin varmistamaan Suz12 kaataa ja alas säätely H3K27me3 jokaisen kokeen.

Tulokset

genominlaajuisten antagonismia BRG1 ja PRC2 at IFNy tavoitteet

SWI /SNF säätelee ISGs [8-11,28-30], mutta toiminnallinen suhde PRC2 ei tunneta. Vertaamaan tavoitteet genomin laajuinen, BRG1 puutteesta SW-13-soluja transdusoitiin adenovirusvektoreiden ilmentävät BRG1 (Ad-BRG1) tai GFP (Ad-GFP), tai transfektoitu siCtrl tai siSUZ12, jätetään hoitamatta tai IFNy stimuloimaa 6 tuntia ja microarray arvioinnissa käytetään mRNA-tasoja. SUZ12 on keskeinen alayksikkö PRC2 ja sen menetys johtaa hajoamiseen entsymaattisen alayksikön, EZH2 [4]. Keskityimme geenejä, jossa AdBRG1 tai siSUZ12 indusoima ≥ 2-kertainen (Kattavan tiedon yhteenveto, katso piirakkakuvioita kuvassa 1). Tarkempia tietoja tietojen ja geeniluokkaa annetaan S1 teksti (katso ensimmäinen osa Täydentävät tulokset); jälkimmäinen tarjoaa paljon tietoa siitä, missä määrin BRG1 ja PRC2 säätelevät pohjapinta ja IFNy aiheuttama geenien ilmentymisen. Silmiinpistävän, BRG1 saattamisen tai siSUZ12 hoito tehostetun induktion 87% (95/109) ja ISGs, mutta vaikutti perusilmennystä vain ~ 2% kaikista geeneistä (kuvio 1). Lisäksi on 2% kaikista geeneistä, joiden perusekspression vaikuttivat, 14% (48/342) oli yhdessä säädellään SWI /SNF ja PRC2, kun taas 34% (32/95) ja ISGs oli co-säännelty. Vaikutus SWI /SNF ja PRC2 yhteistyöstä geenien oli antagonistinen. Reaaliaikainen PCR-analyysi 52 ISGs vahvisti vallitseva BRG1 riippuvuus tässä geenissä luokka (kuvio A S1 File), ja siSUZ12 pelastettiin vasteaikaa 5/7 BRG1 riippuva ISGs, kun taas BRG1 riippumaton ISGs tai ohjaus geenit eivät muuttuneet (kuvio B, paneeli B S1 File). Toinen SUZ12 siRNA pelasti myös BRG1 riippuvaisen ISGs (kuvio C S1 File). PRC2 ehtyminen marginaalisesti indusoi BRG1 liittyvä proteiini BRM (kuvio B, paneeli A S1 File). Sen arvioimiseksi, onko tämä vähäinen induktio saattaa selittää induktio joidenkin ISGs me pudotettiin BRM. Tämä ylimääräinen vaihe ei ollut lainkaan tai vain vähäinen vaikutus pelastaminen BRG1 riippuvaisten ISGs by siSUZ12 (kuviot B, D S1 File). Rescue ISG-vaste oli myös ei induktion vuoksi endogeenisen IFN, koska RNAi hoito ei vaikuttanut STAT1 fosforylaatioon tai IRF1 proteiinin tasot, joko SW13 soluissa [12], tai useita muita solulinjoja (katso jäljempänä).

mikrosirut suoritettiin RNA: SW-13 solujen vaikutuksen arvioimiseksi BRG1-saattamisen tai SUZ12 knockdown perustason ilmentymistä kaikkien geenien (A, 465 vaikuttavat geenit) tai IFNy reagointikykyä (B, 109 ISGs). Hoidot on merkitty punaisella ja sinisellä päällekkäin heatmap, geeniluokkaa osoitetaan värillinen palkit vasemmalle kunkin heatmap, ja pie kaavioita yhteenveto% geenien kussakin luokassa (In (A) harmaa = ennallaan geenejä). Lisäksi kaavion oikealla puolella heatmap (A) luokittelee geenejä perustuen: 1. IFNy reagointikykyä (ISGs = 12), tai GO termejä: 2. Development (n = 118); 3. Soluviestintä (n = 64); 4. Cell muuttoliike (n = 24). Gene Class Lyhenteet: Expn: Expression; Br: Brg1, Z: Suz12; S: lisättävä; R: tukahduttaa; I: interferoni-γ; G: Gene.

Jos PRC2 suoraan säätelee ISGs tavoitteiden tulisi esiintyä H3K27me3. Ensin käsiteltiin tätä kysymystä käyttäen chip qPCR perustamisesta cutoffs myöhemmin genominlaajuisia analyysi. Tutkimme 30 promoottorit: 10 ISGs pelastettiin siSUZ12 tai BRG1, 6 ISGs pelasti siSUZ12 vain, 6 ISGs pelasti BRG1 vain, 3 ISGs vaikuta siSUZ12 tai BRG1, ja 5 positiiviset säätimet H3K27me3. IRF1, vaikuta joko PRC2 tai BRG1, puuttui H3K27me3 ja toimi lähtötilanteessa (Kuva E S1 File). H3K27me3 havaittiin 15/16 on siSUZ12 säänneltyjen ISG promoottorit, mutta vain 4/9 on ISGs vaikuta siSUZ12 (kuvio E, paneeli A S1 File) (p 0,05, Fisherin eksakti testi), ja H3K27me3 oli merkitsevästi korkeampi entinen (kuvio E, paneeli B S1 File).

Genominlaajuiset chip chip paljasti ~ 1/5

th promoottorien oli joitakin H3K27me3 (vähintään yksi 100 emäsparin bin 1,5x edellä kontrolli). Keskimääräinen H3K27me3 intensiteetti oli huipussaan +/- 1 kb ympäri TSS kaikkien geenien (kuvio F paneelit A, B S1 File), ja H3K27me3 tasot anti-korreloi perusekspression (kuvio F, Paneelit C, D S1 File), johdonmukaista muiden solutyyppien (tarkistetaan [6]). Keskittyminen geenien joka BRG1 ja /tai siSUZ12 stimuloidaan ilmaisua, joilla on korkein H3K27me3 tasot tukahdutettu PRC2 (BRS /ZRG ZRG, Kuva G, ruudut A-E S1 File). Keskimääräinen taso H3K27me3 at ISGs oli samankaltainen kuin lainkaan hiljainen geenit (vrt kuvio 2A ja 2F, paneeli A S1 File). ~ 40% ISGs oli joitakin H3K27me3 (kuvio 2B), joka on ~ 2x enemmän kuin kaikki geenit (vrt kuvio F, paneeli B S1 File). Kuten kaikissa geenit, taso ja taajuus H3K27me3 korreloi perusekspression (kuvio 2C ja 2D). Lisäksi on basaalisesti hiljaa ISGs taso ja taajuus H3K27me3 oli huomattavasti suurempi loci jossa siSUZ12 parannettu IFNy reagointikykyä (kuvio 2E-2I, ZR-ISGs, BRS /ZR-ISGs).

Genominlaajuiset ChIP siru tietoja käytettiin arvioitaessa H3K27me3 tasolle ISG promoottorit. (A) chip chip signaalin intensiteettiä per 100 emäsparin astiat on +/- 5 kb TSS kaikkien 109 ISGs määritelty kuvassa 1B. (B) Prosenttia H3K27me3 positiivisia ja negatiivisia ISG promoottorit. (C) chip chip signaalin intensiteettiä kuin (A), mutta ryhmitelty ISG perusekspression. (D) Histogrammi prosenttiosuuden H3K27me3 positiiviset ja negatiiviset ISGs suhteessa perusinsuliininsa geeniekspressiota. (E) Color koodi basaalisesti hiljainen ISGs analysoitu (F) – (H). (F) Heatmap osoittaa pohjapinta H3K27me3 chip chip signaali on +/- 1 kb TSS osoitettujen basaalisesti hiljainen ISG luokissa. (G) chip chip signaalin intensiteettiä per 100 emäsparin astiat kuluessa +/- 1kb n TSS on basaalisesti hiljainen ISGs. (H) Viulu juoni näyttää tason keskimääräinen pala-chip signaali. Asteriskit osoittavat merkittävää eroa (P 0,05, Mann Whitney-testi) välillä osoitti ryhmiä. (I) Histogrammi näyttää prosentteina H3K27me3 positiivinen promoottorien kussakin merkitty ISG luokassa. *: Merkitsevästi suurempi% of H3K27me3 positiivista ISGs eroksi ryhmien (P 0,05, Fisherin eksakti testi). Gene Class Lyhenteet: Br: Brg1, Z: Suz12; S: lisättävä; R: tukahduttaa; I: interferoni-γ; G: Gene.

Yhdessä edellä ilmaisun ja chromatin sitovia data paljastaa laaja, vihamielinen roolia SWI /SNF ja PRC2 IFNy reagointikykyä.

PRC2 tukahduttaa Useita Immune reittejä syöpäsolut

arvioimaan yleisen merkitystä havaintomme, suoritimme RNAseq analyysin jälkeen PRC2 heikkeni 8 syövän ja 3 syöpäsolujen solulinjat (Cancer: A549, keuhkoadenokarsinooma; Panc.04.03 AsPC1 haiman adenokarsinoomat, PC3, eturauhasen syöpä, MCF-7 MDA-MB-231, rintasyöpiä, HeLa, kohdunkaulan syöpä, ja SW-13, lisämunuaiskuoren syöpä, ei-syöpä: 184-A1, rinta-, BPH-1 eturauhasen ja Beas-2B keuhko). Westerns paljasti, että SUZ12, EZH2 ja /tai H3K27me3 tasot olivat tyypillisesti koholla syöpälinjojen verrattuna ei-syöpälinjojen (kuvio H S1 File). BRG1 /BRM tasot vaihtelivat syöpä ja ei-syöpä radoilla alhaisin A549, AsPC1, Panc.04.03 ja 184A1 (kuvio H S1 File). EZH2 ja SUZ12 tasot korreloivat keskenään, mutta eivät irtotavaran H3K27me3, ja PRC2 ja BRG1 tai BRM tasot olivat korreloimattomia (Kuva H, paneeli B S1 File). Nämä muuttuja havainnot korostavat toiminnallisten tutkimusten päätellä vaikutus PRC2 geenien ilmentymisen koska yksinkertaisesti pitoisuuksien arvioinnissa kompleksin tai merkki paljastaa hieman sen rooli syövän tai ei-syöpäsoluja.

Soluja käsiteltiin jossa siCtrl tai siSUZ12 ja jätetään hoitamatta tai altistunut fysiologisesti merkittävinä pitoisuuksina IFNy (0,2 ng /ml), joka on verrattavissa erittyy NK-solut altistetaan kasvainsoluihin [31,32]. SUZ12-ehtyminen pienentää H3K27me3 kaikissa solutyypeissä, ja lisääntynyt H3K27ac joissakin (HeLa, MDA-MB-231, PC3), mutta ei vaikuttanut SWI /SNF alayksiköstä (Kuva I S1 File). Seuraava RNA-seq määritykset suoritettiin arvioimaan vaikutusta SUZ12 Knockdown perustason tai IFNy aiheuttama geenien ilmentymisen (44 määritykset, 4 olosuhteet x 11 riviä), ja tulokset validoitiin käyttäen pääkomponenttianalyysi ja korrelaatio analyysi. Vaikutus kaatamalla SUZ12 geenien ilmentymisen vahvistettiin myös varmuuskopio siRNA vastaan ​​SUZ12. Täydellinen keskustelu katso jakso ”validointi RNAseq tiedot” S1 Teksti (Täydentävä Results), jossa viitataan validointitiedot kuvissa J-M S1 File, ja S2 taulukko.

Yhdenmukainen laaja rooli PRC2 at ISGs, SUZ12-Tukahdutettu ISGs (ZR-ISGs) havaittiin useissa solulinjoissa (kuvio 3, kuvio N S1 File, S2 taulukko). Niistä kaksi runsain ISG luokat (ZR-ISGs ja ISGs ei vaikuta SUZ12 (N-ISGs)), oli solun liittyviä eroja absoluuttinen määrä ZR-ISGs (vaihteluväli 13-152, keskiarvo 70, mediaani 43), mutta siSUZ12 tehostettu induktion välillä 13% ja 77% (keskiarvo 45%, mediaani 43%) 7/8 solulinjoissa (kuvio 3). Nämä arvot ovat konservatiivisia, koska oli muita monimutkaisempia alempi runsautta geeniluokkaa jossa SUZ12 vaikuttaa ISG lauseke (S1 taulukko). Useimmat N-ISGs (68%) ja ZR-ISGs (72%) oli kunkin solutyypin (Kuva O S1 File), mikä osoittaa, että sen lisäksi, sydänsarjaan, jokainen rivi indusoi selvästi ISG cocktail. Tämä on sopusoinnussa yhteydessä-erityisluonne immuunivalvonnan [3], ja soluspesifisiä chromatin sitovia PRC2 [33]; todellakin geenien tukahduttaa SUZ12 yksinään (ZRG-N), 77% oli ainutlaatuinen yksi solulinja (kuvio O S1 File). Myös osa ZR-ISGs oli alhaisempi kuin syöpä vs. syöpälinjojen, jossa kolme ei-syöpälinjojen sijoittui 7

th, 8

th, ja 11

th kaikkien 11 riviä arvioidaan ( S1 Taulukko).

Heatmaps osoittavat vaikutuksen neljän hoitojen (sarakkeet 1-4, näppäile taulukossa oikealla) ISG ilmaisun paneeli keuhko-, haima-, rinta-, kohdunkaulan, lisämunuaiskuoren ja eturauhasen syöpäsolun linjat. Solut transfektoitiin siCtrl tai siSUZ12 ja jätetään hoitamatta tai stimuloidaan IFNy 6 tuntia. ISGs lajitellaan SUZ12-tukahdutettu ISGs (Zr-ISGs, keltainen) ja ISGs joita ei säännellä PRC2 (N-ISGs, vihreä). Prosenttiosuus Zr-ISGs ja N-ISGs on esitetty pie kaavioita päällekkäin heatmap, ja kokonaismäärä ISGs riville on merkitty alla kunkin heatmap.

Seuraavaksi kääntyi vaikutus PRC2 ehtyminen perustason geenin ilmentymisen. Meidän microarray analyysi SW13 lisämunuaissyöpäpotilailla soluissa ei havaittu merkittävä vaikutus immuunijärjestelmän geenit kunnes käsitelty IFNy (kuvio 1), mutta mietimme jos saattaa olla näkyvämpi vaikutus perusilmennystä immuuni reittejä muissa syöpätyyppeihin. Tulkita avain vaikuttavia reittejä, käytimme Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [34]. Silmiinpistävän, siSUZ12 indusoi perusekspression useiden immuuni komponenttien 6/8 syöpälinjojen, joista ”sytokiini /-sytokiinireseptorin vuorovaikutus” (CCRI) geeniperimä vaikutti kaikkiin 6 riviä (kuviot 4 ja 5), ​​ja 4 riviä CCRI luokka oli alkuun tai toisen sijoittunut geeniperimä (* kuvassa P S1 File). Näitä havaintoja validoitu useiden geenien kaksi siRNA vastaan ​​SUZ12 (S2 taulukko). Niistä kuusi syöpälinjojen jossa CCRI geeniperimä aiheutettiin 61% geeneistä oli säädelty erityisesti 1 tai 2 solulinjoista (kuvio Q S1 File). Näin ollen PRC2 paitsi säätelee ISGs, mutta sen vaikutus immuunijärjestelmää syövän soluissa ulottuu lukuisia sytokiineja ja sytokiinireseptorit, ja muistuttaa ISGs, se vaikuttaa eri CCRI geenien erillisen syövän yhteyksissä.

Yhteenveto GSEA analyysi geenien differentiaalisesti aiheuttama siSUZ12 suhteessa siCtrl 6 syövän ja 4 ei-syöpä solulinjat. Solulinjat sisältyvät heatmap osoitetaan oikealle; merkittävä signaali on merkitty harmaalla. Samanlaisia ​​biologiset reitit on ryhmitelty, ja korostettu selvä värin oikealle, ja niiden yleinen luokka nimi mainitaan vasemmalle.

. Heatmap of CCRI geenien merkittävästi aiheuttama siSUZ12 (Differential Todennäköisyys 0,9) 11 solulinjoissa (ei-syöpä vihreä, syöpä sininen). Solulinjan vastaavat nimet kunkin numeron nähdä (F). Blue tähdet tässä ja myöhemmissä paneelit osoittavat solulinjoja jossa CCRI koulutusjakso on merkittävästi rikastettu mukaan GSEA. BE Heatmaps osajoukkoja tiedot (A) erotetaan kudos tyyppi: B. Rintojen (184 ei-syöpä

vs

. MCF7 ja MDA-MB-231 syöpä), C. Lung (Beas-2B non -cancer

vs

. A549 syöpä), D. Prostate (BPH-1 syöpäsolujen

vs

. PC-3 syöpä), ja E. Toinen 4 syöpäsolulinjoista haiman (Pancin .04.03 ja AsPC1), kohdunkaulan (HeLa) ja lisämunuaisen kuorikerroksen (SW-13) alkuperää. F. taajuus aiheuttama CCRI geenien kaikissa 271 CCRI geenejä kussakin solulinjassa.

Vastakohtana syöpälinjojen, siSUZ12 ei rikastamiseksi immuuni geenin sarjaa ei-syöpä rinta-, eturauhas- ja keuhkosyöpä linjat (Kuva 4, Kuva Q S1 File). Laajentaa tätä analyysiä, käytimme GSEA analysoida julkaistu RNAseq tietoja SUZ12-knockdovvn ihmisen HEK-293T-soluissa [35]. Nämä ovat ei-syöpä peräisin olevat solut hermoston alkuperää, jotka ilmentävät viruksen onkogeenien, mutta transformoitiin

in vitro

riippumatta immuunijärjestelmän [36]. GSEA paljasti, että PRC2 ehtyminen ei vaikuttanut merkittävästi CCRI tai muiden immuunijärjestelmän väyliä (kuvio 4). Siten PRC2 muuttunut CCRI väyliä merkittävästi 6/8 syöpäsolulinjoissa, mutta 0/4 ei-syöpä yhteyksissä. PRC2 ehtyminen sääteli joitakin CCRI geenien syöpäsolujen solulinjat, mutta vähemmän kuin syöpäsoluissa, riittämätön saavuttaa merkitystä GSEA, ja vaikutti geenit olivat erillisiä syövässä vs syöpäsolujen linjat vastaavat kudoksista (kuvio 5) . Nämä tiedot osoittivat laaja rooli PRC2 säätelyssä immuunijärjestelmää, joka on muuttunut ja laajentunut merkittävästi syöpään.

SUZ12 Knockdown indusoi Genes kaksiarvoisella Promoottorit

Jos haluat määrittää, PRC2 välittämää tukahduttamisesta siSUZ12 aiheuttama geenien, erityisesti CCRI alaluokkaa, on suora, me louhittu H3K27me3 chip seuraavissa tietoja saatavilla A549 keuhkosyövän soluja, ja verrattiin sen RNAseq tiedot +/- siSUZ12 (kuvio 6A). Samanaikaisesti, vertasimme H3K4me3 jakelu, joka merkitsee aktiivisen tai poised promoottoreita. Valvomatta klustereiden tunnistettu 10 erillistä H3K27me3 /H3K4me3 kuvioita. Useimmat erittäin aiheuttama siSUZ12 geenejä, mukaan lukien CCRI osajoukko oli klustereita 1-4, joilla on laaja H3K27me3 promoottori kattavuus (Kuva 6A-6D). Kuitenkin useimmat geenit korkea promoottori H3K27me3 ei vastannut siSUZ12 (kuvio 6A), mikä korostaa mittaamalla vaikutus geenien ilmentymisen. Erityisesti keskimääräinen H3K4me3 signaali oli huomattavasti suurempi poikki siSUZ12 reagoivaa geenejä, mukaan lukien CCRI osajoukko verrattuna geeneihin, jotka eivät vaikuttaneet siSUZ12 tai 1000 random geenien sarjaa (Kuva 6E). Näin ollen geenit, jotka indusoituvat PRC2 häiriöiden on kahdenarvoinen H3K27me3 /H3K4me3 allekirjoitus, ja siSUZ12 aiheuttama CCRI geenit ovat tyypillisiä tämän ryhmän.

ChIP-seuraavat tiedot A549-soluja käytettiin arvioimaan kromatiinin tavaramerkkien siSUZ12 indusoi geenejä. A. Ohjaamaton K-means klusterointi suoritettiin H3K27me3 ja H3K4me3 signaaleja, ja piirrettiin lämpökarttoja ympärille TSS (lisätietoja katso ”chip seuraavat data-analyysin S1 teksti, Täydentävä Methods). 10 Tuloksena klusterit (Cluster ID (CID) 1-10) on kuvattu järjestyksessä keskimääräisen log2Fold muutos geenien ilmentyminen jälkeen siSUZ12 kohtelun esitetty piste tontteja oikealle. On pistekuvaajana, kaikki geenit (vasemmalla) tai CCRI geenejä (oikealla) osoittaa log2Fold muutoksen kunkin geenin; punaisia ​​pisteitä osoittaa geenien merkittävästi aiheuttama siSUZ12 (Differential todennäköisyys 0,9). Perusekspression näkyy oikeassa reunassa (vaaleanharmaa: alhainen, harmaa: tiedotusväline tummanharmaa: korkea). B. Näyttää geeniryppäät paljasti paneelissa A. Osuus kaikista geenien aiheuttama siSUZ12 (punainen) asiakastunnukset 1-4 tai 5-10 (kuten on esitetty piste tonteista A). C. osuus CCRI reitin geenien aiheuttama siSUZ12 (punainen) asiakastunnukset 1-4 (punainen ääriviivat) tai 5-10 (sininen ääriviivat). D. keskiarvo H3K27me3 ChIP signaali ympärille TSS varten ilmoitettu ryhmille geenien (Key oikealle, ZR-Genes: kaikki SUZ12 tukahdutettu geenejä, N-Genes: ei vaikuta siSUZ12, ZR-CCRI: CCRI geenejä, jotka ovat SUZ12-tukahdutettu ; N-CCRI: CCRI geenejä ei vaikuta SUZ12, Rand: 1000 satunnainen geeni erilaista, n = mediaani muiden neljän geenin sarjaa). E. Sama kuin (D) lukuunottamatta H3K4me3 ChIP signaaleja asiakastunnukset 1-4 (eli korkea H3K27me3).

pienimolekyylisiä EZH2 estäjät Augment Useita Immuunijärjestelmän Pathways

Tuloksemme esiin mahdollisuuden, että lääkkeet, jotka estävät PRC2 voi edistää immuunijärjestelmän reitin aktivaatio syöpäsoluissa. Kun neljä syöpä solulinjoja käsiteltiin 2 uM GSK343 ​​[37] tai UNC1999 [38] joko huumeiden pieneni huomattavasti H3K27me3 tasoilla (kuvio R S1 File). RT-PCR-analyysi paljasti, että 8 SUZ12-tukahdutettu ISGs (ZR-ISGs) 4 solulinjoissa (32 tapausta) UNC1999 täydennetty IFNy-vaste 30 tapauksessa (94%) ja GSK343 ​​teki niin 15 (50%) (kuvio S S1 File). Hoito ei ollut vaikutusta ei-ISGs kuten

PITX2

tai

HPRT

tai mRNA: n tai proteiinin tasot IRF1, joka on PRC2 riippumaton ISG (kuviot R, S S1 File). UNC1999 indusoi mRNA: t suuremmassa määrin kuin GSK343 ​​huolimatta ilmeisesti samankaltaisia ​​vaikutuksia irtotavarana H3K27me3 tasoilla. Tämä saattaa heijastaa hienoisia eroja kinetiikka ja /tai kokonaismäärä H3K27me3 ehtyminen tietyissä tehostajat tai promoottorit, jotka eivät paljasti Western-analyysi koko H3K27me3. Riippumatta, nämä tiedot osoittavat, että EZH2 estäjät, kuten siSUZ12, lisätä mRNA induktio PRC2-tukahdutettu ISGs.

Lopuksi arvioi PRC2 esto tehostaa sytokiini induktio vastauksena muiden immuunijärjestelmän signaaleja ja ovatko nämä vaikutuksia havaitaan proteiini tasolla. Tämän vuoksi meidän käsiteltiin A549 keuhkosyövän solujen TNFa, IL1B,

E

.

coli

lipopolysakkaridi (LPS), samoin kuin IFNy, ja arvioidaan eritys sytokiinien CXCL10, IL6 ja IL8 . Toisin kuin mRNA-induktio, PRC2 esto ei yksinään parantaa proteiinin tasoja, mutta kun solut altistettiin yksi neljästä immuunijärjestelmän signaaleja, siSUZ12 tai UNC1999 lisätyn sytokiini-proteiinin induktion (kuvio 7A-7C, kuvio T S1 File, S2 taulukko). Nämä tiedot ovat sopusoinnussa vakiintuneiden, transkription jälkeisiin sääntely sytokiinien tuotannon ehkäisemiseksi haitallisia immuunireaktioita, kuten krooninen tulehdus. Esimerkiksi lisäksi geenin transkriptio (sisällä suoran valvonnan PRC2), sytokiinien myös tiukasti säädeltyä tasolla mRNA vakauden ja /tai kääntäminen kautta kuvioita kuten AU-Rich Element (ARE), perustamisasiakirjaan Decay Element (YKK ), Coding Region tekijä Epävakaus (CRD) ja monet muut. [39] Tuloksemme viittaavat siihen, että PRC2 säätelee transkription osan, mutta ei post-transkriptionaalisen kontrollin, joka vaatii ylimääräisen signaalin immuunijärjestelmää.