Krooninen sairaus

tiivistelmä

pahanlaatuinen mesoteliooma (MM) on aggressiivinen kasvain aiheuttaa korkeaa kuolleisuutta. Yksi syy tähän paradigman voi olla olemassaolon alapopulaatio kasvaimen aloittamista solujen (-lämpökameroissa), joka antaa MM huumeiden vastarintaa ja toistumisen. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja kuvata TIC alaryhmän MM soluissa, käyttäen sferoidiviljelmiä, mesospheres, mallina MM -lämpökameroissa. Mesospheres, tyypillistä, että stemness markkereita CD24, ABCG2 ja Oct4, aloitti kasvaimet immuunivajaissa hiirillä tehokkaammin kuin tarttuneet solut. CD24 knock-down solujen menetti palloja muodostavan kapasiteetin ja esillä alempi kasvainten muodostumiseen. Kun sarjasiirteillä, mesospheres vähitellen tehokkaammin tumrigenic lisääntynyt taso kantasolujen merkkiaineita. Osoitamme myös, että mesospheres on mitokondrioiden ja metaboliset ominaisuudet ovat samanlaiset kuin normaalien ja syövän kantasoluja. Lopuksi, me osoitamme, että mesoteliooma-aloitetaan solut ovat erittäin herkkiä mitochondrially suunnattu E-vitamiinia sukkinaatti. Tämä tutkimus asiakirjoja, jotka mesospheres voidaan käyttää uskottava malli mesoteliooma-aloittamista soluja ja että niitä voidaan hyödyntää etsittäessä tehokkaita aineita vastaan ​​MM.

Citation: Pasdar EA, Smits M, Stapelberg M, Bajzikova M, Stantič M, Goodwin J, et al. (2015) karakterisointi mesoteliooma-Käynnistetään Cells sekä alttius syöpälääkkeet. PLoS ONE 10 (5): e0119549. doi: 10,1371 /journal.pone.0119549

Academic Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 08 syyskuu 2014; Hyväksytty: 14 tammikuu 2015; Julkaistu: 01 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Pasdar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. Alkuperäinen raakadata tallennetaan Griffith yliopistossa järjestelmä. https://research-storage.griffith.edu.au/owncloud/index.php/apps/files/?dir=%2Fdocuments%2FPasdar%20et%20al%20PLoS%20One.

Funding: Teos tukee osittain avustusta Australian Research Council, Cancer neuvoston Queensland, ja Euroopan aluekehitysrahaston (jäljempänä BIOCEV hanke, CZ.1.05 /01.01.00 /02,0109) ja JN. EAP tukivat Douglas Francis Green PhD Scholarship tarjoamia Queensland asbestiin liittyvien sairauksien Society. LFD tukivat Griffith University Research Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pahanlaatuinen mesoteliooma (MM), primaarikasvaimen keuhkosairaudet, on erittäin aggressiivinen, hyvin vähän, jos lainkaan hoitovaihtoehtoja. Tyypillisesti diagnosoitu 20-40 vuotta sen jälkeen, kun altistuminen asbestille, tärkein karsinogeeni MM, tämä kasvainsairaus on hyvin aggressiivinen ja kuolleisuus on erittäin korkea muutaman kuukauden selviytymisen diagnoosin jälkeen [1, 2], uusiutumisen kasvain esiintyvien pian hoidon aloittamisen [3]. Huolimatta nykyisen kiellon asbestin käyttö teollisuusmaissa ja puutteen rajoittavien lainsäädännön käsittelemisestä ja asbestin käyttö kehitysmaissa [4], MM ilmaantuvuus jatkaa nousuaan seurauksena pitkä latenssiaika.

on esitetty, että kasvaimen heterogeenisyys, seurauksena geneettinen epävakaus ja kapealla tekijät tuumorin sisällä, on suurin syy resistenssin hoitoon syöpäpotilailla [5, 6]. Genominen tutkimukset MM kasvainten korostavat myös sisäiseen ja kasvain epäyhtenäisyyttä tämän syöpätyypin [7, 8]. Taustalla olevien mekanismien kasvaimen heterogeenisuus ovat vielä vilkasta keskustelua ja erilaisia ​​malleja on ehdotettu määritellä tätä ilmiötä [9]. Ehdotettu syöpä kantasolu (CSC) malli voidaan vakuuttavasti kuvata heterogeenisyys ja hierarkkinen organisaatio solujen kasvaimia [10]. CSCS (kutsutaan myös kasvaimeen aloittamista solujen -lämpökameroissa), pieni osa-populaatio solujen karsinoomat, on kyky itse uudistaa ja tuottaa erilaistuneita soluja, joilla on korkea proliferatiivinen kapasiteetti, että (uudelleen) muodostavat kasvain massa [11 ], samoin kuin kartuttaa kasvaimet eivät vastaa hoitoon [12, 13]. Läsnäolo -lämpökameroissa voi myös osittain selittää korkea vastus MM terapiaan, vaikka tämä näkökohta MM patofysiologia on vain osittain ymmärretty [14, 15].

Tässä tiedonannossa raportoimme olemassaolosta -lämpökameroissa mesoteliooma tunnusomaiset piirteet pallojen peräisin eri mesoteliooma solulinjojen kuin aiemmin vahvistettu malli viljelemällä kantasolujen ja -lämpökameroissa [16-18]. Olemme myös läsnä luonnehdinta MM -lämpökameroissa sekä alttius syöpälääkkeet.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

perustettu ihmisen MM solulinjat Ist-Mes-2 (epithelioid histotype), meso-2 (sarcomatoid histotype), MM-BI (kaksivaiheinen histotype) [19], ja hiiren AE17 solulinja (epithelioid histotype) [20], viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antimykoottista /antibiootti cocktail (Invitrogen). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Sillä alalla muodostumista, kiinnittyneet solut viljeltiin tiheydellä 10

4 2×10

4 solua /ml seerumitonta alustaa (SFM), joka käsittää DMEM-F12-väliaineessa (Invitrogen), johon oli lisätty hiiren NeuroCult leviämisen Supplement (StemCell Technologies), 20 ng /ml ihmisen rekombinantti-EGF: ää ja 20 ng /ml FGF2 (R Oct4: eteenpäin-CCC CAG GTT GGA GTG GGG CT, reverse-GGA GGC CCC ATC GGA GTT GC; ABCG2: eteenpäin-ACG AAC GGA TTA ACA GGG TCA, reverse-CTC CAG ACA CAC CAC GGA T; SOX4: eteenpäin GAT TCC GCC CAC AGA GAG TC, reverse-GGT AGC TCA GGA AAG CGA CA; Klf4: CTG GGT CTT GAG GAA GTG CT, reverse-GGC ATG AGC TCT TGG TAA TGG; c-Myc: eteenpäin-GGA CTT GTT GCG GAA ACG AC, reverse-CTC AGC CAA GGT TGT GAG GT; ABCB5: eteenpäin-ACT GAG AAA GGA AGC AGT TGG A, reverse-TAA AGG AAG GCA GGC TCC AT; GAPDH: eteenpäin-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC, reverse-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG.

Transfektio pieni hiusneula-RNA (shRNA) B

Ihmisen CD24-spesifinen shRNA konstrukteja pRS selkäranka ohjauksen alaisena U6-promoottori ja asiaan tyhjän vektorin saatiin Origene Technologies (Rockville). Fugene HD-transfektioreagenssia (Promega) käytettiin pysyvästi transfektoida Ist-Mes-2-solujen kanssa shRNA CD24 ja tyhjän vektorin (vale-transfektoitujen solujen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Stabiili yhden solun johdettu kloonit valittiin lisäämällä 4 ug /ml puromysiiniä elatusaineeseen ja seurataan transfektio käyttäen qPCR tai western blotting.

arviointi superoksidi sukupolven, mitokondrion kalvon potentiaalia, mitokondrioiden massa , solusyklin, apoptoosin ja solukoko

Solunsisäiset superoksidianionia tasot arvioitiin käyttäen fluoresoiva koetin MitoSOX. 10

5-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä, ja 70%: n konfluenssiin, käsiteltiin 20 uM MitoSOX 30 min, pestiin suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja analysoitiin virtaussytometrillä (FACS Fortessa, Becton Dickinson). Superoksidi tasot ilmaistiin fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI). Mitokondrioiden massa arvioitiin käsittelemällä soluja 50 uM MitoTracker Green FM 30 min ja analysointiin virtaussytometrialla. Arviointia solusyklin, 10

6 elävät solut pestiin ja kiinnitettiin 70% EtOH: ssa yön yli ja värjättiin 100 ug /ml propidiumjodidia (PI), ja analysoitiin FACS Calibur virtaussytometrillä (Becton-Dickinson). Signaalit yhdestä ydin ja yhdistettyjä soluja suljettiin käyttäen kaksinkertaisen gating moduuli. Apoptoosi arvioitiin standardin anneksiini V /PI menetelmällä. Solukoko arvioitiin käyttäen Scepter kädessä automatisoitu solulaskijalla (Millipore) valmistajan ohjeiden.

CS, SDH ja SQR aktiivisuus

CS-aktiivisuus arvioitiin pelkistämällä DTNB: tä [5,5 ’ -dithiobis- (2-nitrobentsoehappo)] entsyymin ja sen yhdistettynä reaktio oksaloasetaatin ja asetyyli-CoA. Lyhyesti, 10 ug proteiinia lysaattia lisättiin seokseen, jossa oli 10 mM DTNB: tä ja 30 mM asetyyli-koentsyymi A: Absorbanssin muutos on DTNB mitattiin Tecan Infinite 200 PRO lukija 90 s 412 nm: ssä sen jälkeen, kun on lisätty 10 mM oksaaliasetaatiksi on 200 ul reaktiotilavuudessa. SDH-aktiivisuus arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu (Dong et al., 2011). Sillä SQR toimintaa, 40 ug proteiinia lysaattia lisättiin 1 ml SQR määrityspuskurissa (10 mM KH2PO4, pH 7,8, 2 mM EDTA, 1 mg /ml BSA), 80 uM dikloorifenoli, 0,2 mM ATP, 4 uM rotenone ja 10 mM sukkinaatti, ja inkuboitiin 30 ° C: ssa 10 min. Absorbanssi mitattiin minuutin välein 30 minuuttia aloittamisen jälkeen reaktiota decylubiquinone (80 uM) [23].

korkean resoluution respirometria

Hapen kulutus arvioitiin käyttäen Oxygraph-2k korkea- resoluutio respirometrin ja tiedot analysoitiin käyttämällä Datlab ohjelmistoa (molemmat Oroboros), oleellisesti, kuten on kuvattu [24]. Kaikki mittaukset suoritettiin 37 ° C: ssa 2 ml kammioissa. Arviointiin ehjien solujen seerumittomassa DMEM käytettiin, kun taas digitoniini-permeabilised solut suspendoitiin MiR05 mitokondrion hengitystä väliaineessa. Kaikkien kokeissa 10

6 solua kohden käytettiin kammioon. Määrä hapenkulutus (happi flux) laskettiin negatiivinen kulmakerroin happipitoisuuden. Cellular happi flux korjattiin instrumentaalinen tausta, joka johtuu epäspesifinen anturi hapenkulutusta. Edellytykset hengitys olivat seuraavat: GM_L-glutamaattia (2 mM) /malaatti (10 mM); GM_P-kuin ennen plus ADP (2,5 mM); GMS_P-kuin ennen ja sukkinaattia (10 mM); GMS_E-kuin ennen plus CCCP (5 uM); S (Rot) _E-kuin ennen plus rotenone (0,5 uM). Symbolit seistä: GM_L-vuoto (hapenkulutus ei kytketty ATP tuotanto); GM_P-hengitystä kautta CI; GMS_P-hengitystä kautta CI + CII; GMS_E-kytkettynä irti hengitystä; S (Rot) _E-irrottamisen hengitystä kautta CII.

glukoosin oton, ATP taso ja laktaatti määritykset

glukoosin oton, soluja inkuboitiin vähän glukoosia (1 g /l) DMEM yön yli 5% CO

2 ja 37 ° C. Sitten ne inkuboitiin 30 min 50 uM 2-nitrobenzodeoxyglucose (2-NBDG) matalan glukoosin DMEM. Taso loisteputki glukoosianalogi soluissa arvioitiin virtaussytometrialla ja ilmaistaan ​​MFI. ATP arvio, solut ympättiin 96-kuoppalevyille 10

4 solua per kuoppa ja solunsisäisiä ATP-tasot analysoitiin käyttäen lusiferaasi-pohjainen kit (CellTiter-Glo Luminescent Assay, Promega). Tulokset normalisoitiin proteiinin kokonaismäärän. Laktaatille määritystä, solut ympättiin 10

4 per kuoppa 96-kuoppalevyille. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, soluviljelyalustaan ​​käytettiin arvioinnissa laktaatin käyttämällä fluorometristä kittiä (Cayman Chemicals). Tulokset normalisoitiin kokonaisproteiinin.

Tilastollinen

pariksi Studentin t-testiä käytettiin arvioimaan eroja kokeellisia tuloksia, joissa erot

p

0.05 pitää tilastollisesti merkitsevä.

tulokset

muodostaminen mesospheres alkaen MM solulinjoista erilaisia ​​fenotyyppejä

merkittävä piirre -lämpökameroissa on niiden kyky itse uudistaa kautta epäsymmetrinen solu jako. Voit varmistaa, että MM-solut käsittävät väestöryhmästä erottuva kyky uusiutua, perustettiin MM solulinjojen Ist-Mes-2 (epiteelin histotype), Meso-2 (sarcomatoid histotype) ja MM-BI-solut (kaksivaiheisesti histotype), kuten sekä hiiren AE17 MM soluja viljellään olosuhteissa vahvistettu rikastamiseksi solupopulaatioiden -lämpökameroissa. Rikastamiseen on -lämpökameroissa,-soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa (SFM) [25], joka on tila säilyttää soluja erilaistumattomassa tilassa, joka on aiemmin käytetty eristämään eri kantasoluja ja -lämpökameroissa [26]. SFM, kaikki MM solut kasvoivat pallomaisia ​​pesäkkeitä, kutsutaan mesospheres, jossa halkaisija on 30-100 um, kun 3-5 päivää viljelmässä (kuvio 1A). Kaikki MM solulinjoissa tutkittiin, kiinnittyneet solut lisääntyivät vähemmän tehokkaasti kuin vastaavan alan solut, kun se asetetaan täydellisessä elatusaineessa, ja Ist-Mes-2-soluissa olivat proliferatiivinen kuin MM-BI ja meso-2-soluissa (kuvio 1 B). Mesospheres säilyy kyky muodostaa uusia palloja jälkeen mekaanisen dissosiaation ja uudelleen kylvö tuoreeseen SFM. Taajuus pallo muodostavien solujen edustavat -lämpökameroissa arvioitiin rajoittavan laimennuksen määritystä kuten aiemmin on kuvattu [16, 21, 22]. Se voidaan laskea tontteja, joka perustuu leikkauspiste klo 37% arvoa rinteillä yksittäisten solulinjojen että solujen määrä tarvitaan muodostamalla yksi pallo oli 1,81 ± 0,24 Ist-Mes-2, 4,54 ± 0,39 MM-BI ja 7,53 ± 0,89 ja Meso-2-soluissa (taulukko 1). Että yksittäinen solu voi muodostaa pallon, kun asemassa SFM on dokumentoitu kuvassa 1C, joka esittää ajasta riippuva pallo muodostuminen alkaa yhdellä Ist-Mes-2 cell.

(A) Faasikontrasti- kuvia mesospheres alkaen perustettu MM solulinjat. (B) leviämisen nopeudella yhden solun johdettujen pallojen uudelleen viljelty normaaleissa erilaistumiseen väliaineessa verrattuna vanhempien mesoteliooma soluja. Tätä koetta varten solut ympättiin samalla numeron kiinnittynyt väliaineessa, ja proliferaatiota aluksi pysyvä ja alalla solujen arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Suhde leviämisen kurssi alalla johdettuja tarttuvien solujen inkuboitiin 72 h on 3.37 varten Ist-Mes-2, 1,72 ja Meso-2 ja 4,25 MM-BI soluissa. (C) Yksi Ist-Mes-2 solujen ylläpidettiin SFM ja pallo muodostuminen päivinä 1, 3, 5 ja 7 dokumentoitu. Tiedot paneelissa B ovat keskiarvoja ± S.D. peräisin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kuvat paneeleissa A ja C edustavat kolmesta erillisestä kokeesta. Mittakaavapalkki paneeleissa A ja C edustaa 100 um.

Mesospheres ilmaista kantasolu- markkereita ja tehokkaasti tuottaa kasvaimia

Olemme äskettäin suoritettu globaali geeniekspressioanalyysiä pallo ja kiinnittyvä Ist-Mes-2 solut, jotka dokumentoitu ”stemness allekirjoitus” Ist-Mes-2 mesospheres [27]. Tulosten todentamiseksi microarray tietojen ja edelleen vahvistaa ominaisuuksia alalla solujen, analysoitiin sekä aloilla ja adherentteja yksikerrossoluissa: n ekspressiota varten markkereita, jotka ovat usein liittävät -lämpökameroissa [10] ja että havaittiin myös lisääntynyt mikrosiruanalyysillä of Ist-Mes-2 aloilla [27]. Korkeampi ilmentyminen

CD24

,

Oct4

ja

ABCG2

mRNA: ta (1,5-4-kertainen nousu) havaittiin aloilla verrattuna vastaaviin tarttuneet solut. Testaamiseksi plastisuus MM soluja, yksisoluisia johdettu palloja tehtiin normaali kiinnittynyt viljelyolosuhteet muodostamisen jälkeen mesospheres sallia niiden uudelleen kiinnitys. Tulokset osoittavat, että kun erilaistumista, kiinnittyneet solut, jotka ovat peräisin aloilla osoittavat samanlaista ilmentymistaso kantasolujen markkereita, että alkuperäisessä kiinnittyneitä soluja (kuvio 2A). Mesospheres osoitti myös lisääntynyt ilmentyminen useiden muiden merkkiaineiden stemness eli

SOX4

,

C-MYC

,

ABCB5

ja

Klf4

(kuvio 2B) .

(A) Ist-Mes-2, Meso-2 ja MM-BI solujen annettiin muodostaa palloja, minkä jälkeen nämä asetettiin täydelliseen elatusaineeseen aiheuttaa erilaistumista ja uudelleen tarttumista soluihin. Suhteellinen tasot

CD24

,

ABCG2

ja

Oct4

mRNA: t arvioitiin alkuperäisessä kiinnittyneitä soluja (asetettu 1), pallot ja uudelleen tarttuvien solujen. (B) Ist-Mes-2, Meso-2 ja MM-BI solut palloja testattiin tason

SOX4

,

C-MYC

,

ABCB5

ja

Klf4

mRNA ja niiden taso ilmaistu suhteessa kuin tarttuvien solujen. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. johdettu kolmen erillisen kokeen, symboli ”*” tarkoittaa merkittävästi erilainen tietoja

p

0,05, ”**” niille, joilla

p

0,005.

sen tutkimiseksi, mesospheres ja kiinnittyneet yksikerrossoluissa eroavat niiden kyky muodostaa kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä, Ist-Mes-2 mesosfääri ja kiinnittyneet solut injektoitiin subkutaanisesti Balb-c /nude-hiiriin 10

4, 10

5 ja 10

6 solua hiirtä kohti, ja kasvaimen aloittamista ja etenemistä seurattiin kaikukuvaukseen (USI). Sphere peräisin olevat solut olivat tehokkaampia tuumorin muodostumisessa kuin tarttuva kollegansa, erityisesti alemman solujen määrä (kuvio 3A-3C). Tarkastus kasvaimen kuvien hankkimien USI paljasti multilobular luonne pallo-johdettu kasvainten, joka ei ole ilmeinen, että kiinnittyvä soluista peräisin karsinoomien (kuvio 3D).

Ist-Mes-2 kiinnittyneet ja alalla solua injektoitiin s.c. Balb-c /nude-hiiriin 10

4 (A), 10

5 (B) ja 10

6 solua hiirtä kohti (C). Tuumoritilavuus arvioitiin käyttäen USI ja on ilmaistu suhteessa alun perin havaittu kasvain (~ 20 mm

3). (D) Kolme erilaista edustavat kuvat ottanut ultraääni sphere- ja tarttuu solusta johdettuja kasvaimet näkyvät kasvaimia kasvanut 10

6 solua hiirtä kohti. Katkoviiva osoittaa ääriviivat USI-visualisoitu kasvaimia. Oikealla puolella, valokuva edustavan kasvaimen kasvanut 10

6 pallo (ylempi kuva) ja kiinnittyneitä soluja (alempi kuva) näkyy. Data paneeleissa A-C ovat peräisin kokeista, joka sisältää 4-5 hiirtä ryhmää kohti ja ovat keskiarvoja ± SEM Symboli ”*” osoittaa merkittävästi erilaisia ​​arvoja

p

0,05.

Mesospheres levitä sarja kasvaimia yhä aggressiivinen luonne

Voit tarkistaa, onko mesosfääri solut voivat muodostaa kasvaimia peräkkäin johtuen kyky uusiutua ja -lämpökameroissa, me heidät asetettiin serial ksenografti Balb-c /nude-hiiriin. Ist-Mes-2 alalla solujen annettiin muodostaa kasvain, ja MM-solut, jotka ovat peräisin kasvaimeen pantiin sitten viljelmässä tuloksena solulinja (1

st sukupolven G1). Näitä soluja käytettiin jälleen muodostamaan palloja, jotka oli oksastettu nude-hiirissä, jolloin saadaan toisen sukupolven kasvaimista, joista 2

toisen sukupolven solulinja (G2) on peräisin. Tämä menettely toistettiin vielä kaksi kertaa, jolloin saatiin G3 ja G4 solulinjat. Jokaisen sukupolven viive kasvaimen aloittamista lyhentää siten, että se oli 52 päivää G1, 15 päivän G2 7 päivää G3 ja 5 päivää G4 (kuvio 4A). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että tasot kantasolujen merkki (CD24, ABCG2, Oct4) mRNA: t asteittain yksittäisissä alalla sukupolvet (kuvio 4B). Havaitsimme myös sukupolvi riippuvaista kasvua CD24, CD47, EpCAM ja Oct3 /4-proteiinia, mikä tukee käsitystä, että stemness kasvaa jokaisen sukupolven (kuvio 4C ja 4D). Testata mitokondrioiden toimintaan yksittäisissä sukupolvi, olemme tutkineet toiminnan CS, komponentti trikarboksyylihappoa (TCA) kierto ja korvike mitta mitokondrioiden massasta. Kuvio 4E esittää asteittainen nostaminen entsyymin. Dokumentoida syövän morfologiassa kasvaimia, jotka ovat peräisin kustakin alalla sukupolven, me värjättiin kasvaimen osiot läsnä merkkiaine MM, Mesothelin, ja H 0,05. Kuvat edustavat kolmea eri kasvaimia.

Koska pallo johdetut viljelmät eri sukupolven kasvaimia osoitti yhä CS aktiivisuutta, arvioimme näiden solujen niiden mitokondrioiden toimintaan tarkemmin. Ensin testataan yksittäiset sukupolven pallo solujen hengitystä. Analyysi hengityksen ehjä sekä permeabilised soluihin käyttäen Oxygraph korkean resoluution respirometrin paljasti, että G1 sukupolvi solut hengitettäväksi lisää (molemmat kautta rutiini hengitys sekä kautta hengityksen avulla monimutkaisia ​​I, CI, ja CII) kuin G0 soluja (palloja valmistettu alkuperäisen kiinnittyvä Ist-Mes-2-solut). Hengityksen G2-G4 soluja hieman heikkeni, mutta oli silti huomattavasti suurempi kuin vanhempien alalla soluja (kuvio 5A ja 5B). Tämä kehitys oli melko samanlainen mitokondrion massa (kuvio 5C), superoksidi sukupolven (kuvio 5D), glukoosin otto (kuvio 5E) ja mitokondrioiden potentiaali (kuvio 5G). Toisaalta, taso ATP laski yksittäisissä alalla sukupolvet (kuvio 5F) ja samanlainen suuntaus todettiin laktaattituotanto (kuvio 5H). Testasimme myös kahden toiminnan CII, SDH ja sukkinaatti kinonireduktaasin (SQR) aktiivisuus. Kuva 5I dokumentoi ei muutosta SDH ja kuvassa 5J lasku G1 soluissa SQR toimintaa. Havaitsimme hieman asteittain koon kasvu solujen eri sukupolvien (Kuva 5K). Transmissioelektronimikroskopia (TEM) kuvaa paljasti morfologisia eroja mitokondrioissa yksittäisten sukupolven soluissa (kuvio 5L). Ensimmäisen sukupolven soluja on pyöreä tai soikea mitokondrioita kanssa kristat järjestetty yhdensuuntaisesti toistensa kanssa ja jotkut mitokondrioita ympäröity karkea endoplasmisen retikulumin. G2 solut ovat kahdenlaisia ​​mitokondrioita yhtä usein mitokondrioita kanssa irronneen matriisi, ja mitokondriot tiheä matriisi ja laajentuneet kristat sekä osittainen lokalisointi karkea ER läheisyydessä mitokondrioita, samanlainen G1 soluihin. G3 soluilla tiheä mitokondrioita kanssa lamellitiiviste mutta vähemmän suora kristat, ja G4 solut on haarautunut mitokondrioita ja laajentuneet (vesicular) kristat ja tiheä matriisi.

Sphere solut edustavat yksittäisiä sukupolvien arvioitiin hengityksen avulla rutiinia protokollaa (A) ja protokolla permeabilised soluja (B) avulla Oxygraph 2k korkean resoluution respirometrin. Symbolit GM_L, GM_P, GMS_P, GMS_E ja S (Rot) _E edustaa rutiini hengitys, hengityksen kautta monimutkainen I, hengityksen kautta monimutkainen I + II, kytkemätön hengitys ja kytkemätön hengityksen kautta CII vastaavasti. (C) Mitokondrioiden massa arvioitiin käyttäen MitoTracker Green kuten yksityiskohtaisesti Menetelmät jaksossa. Superoksidi arvioitiin käyttämällä fluoresoivaa koetinta MitoSOX (D), glukoosin otto käyttäen fluoresoivaa glukoosianalogi 2-NBDG (E), ATP-tasot lusiferaasi perustuva määritys (F), ΔΨ

m käyttäen fluoresoiva koetin TMRM (G ), laktaattitasot käyttäen kaupallista kittiä (H), SDH (I) ja SQR (J) toiminta käyttämällä entsymaattisia määrityksiä, ja kädessä pidettävät solut counter solujen koko (K). (L) TEM suoritettiin yksittäisten sukupolven pallo soluissa yksityiskohtaisesti Menetelmät jaksossa. Data paneeleissa A-K ovat keskiarvoja ± S.D., Ja ovat peräisin kolmesta erillisestä kokeesta. Symboli ”*” tarkoittaa tilastollisesti merkittävää muutosta

p

0,05. Kuvien paneelin L edustavat kolmen erillisen kokeen. Valkoinen palkki paneelissa K ylemmässä kuvien edustaa 500 nm, alemmassa kuvien 200 nm.

CD24 knock-down vaimentaa kykyä mesoteliooma solujen muodostaa palloja ja muodostaa kasvaimia

CD24 on glukosylfosfatidyl inositoli-kytketty limaa kaltainen solun pinnan proteiini, jonka tehtävä soluadheesiota, ja se ilmaistaan ​​erilaisissa syövissä [28-30]. Tämä merkki on yhteydessä huonoon ennusteeseen erilaisissa kasvaimissa ja sen alassäätöä estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia kasvainsoluissa [31], kun taas lisääntynyt ilmentyminen CD24 edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [32].

varmistamiseksi edelleen roolia CD24, erittäin ilmaistu Ist-Mes-2 aloilla, että ”stemness” MM soluja, sen ilme oli vakaasti alassäädetty käyttäen shRNA. Valitsimme useita klooneja knock-down soluja, joista klooni 2 CD24

– solut osoittivat noin 80% lasku CD24, joka on dokumentoitu sekä western-blottauksella ja qPCR (kuvio 6A ja 6B). Suoritimme sitten kaikki kokeet osalta kloonin 2 soluja. CD24

– Ist-Mes-2-solut hankittiin epiteelin kaltainen morfologia ja oli tappiollinen vanhempien solujen taipumus muodostaa palloja (kuvio 6C). Tarkemmin, ei merkkiäkään pallo muodostumisen jälkeen havaittiin ylläpitää CD24

– soluja SFM 7 päivää, ja solut jatkoivat sinnikkäästi kulttuurin muutaman päivän löysä aggregaatteja ennen he kuolivat. CD24 knock-down myös merkittävästi tukahdutti leviämisen Ist-Mes-2-soluissa, joka on dokumentoitu kuvassa 6D. Me seuraavaksi arvioidaan roolia CD24, että mitogeenisen MAPK-reitin, joka on laukaista epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), ja että on osoitettu yli-ilmentyvän MM [33]. Tuloksemme osoittavat suhteellisen korkeaa fosforyloitu EGFR mesospheres, kun taas alemmilla määrillä pEGFR havaittiin CD24

– soluja. Loppupään proteiineja MAPK-reitin, CD24

– soluja heikompi fosforylaatio P38 mutta ei ERK1 /2, kun taas P38 todettiin fosforyloituu alalla soluissa (kuvio 6E ja 6F). Lopuksi suoritimme kontrollikoetta sulkea pois mahdollisuutta, että fosforylaatiota EGFR aloilla johtuu EGF mediassa. Adherentit vanhempien, CD24

– ja mock-transfektoituja Ist-Mes-2-soluja ylläpidettiin täydellisellä alustalla 24 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa lisätty EGF: n ja yhdessä alalla soluja, jotka pidettiin EGF-sisältävien SFM Ne arvioidaan WB EGFR ja pEGFR (kuvio 6G ja 6H). Tulokset osoittavat, että EGF: n läsnäollessa keskipitkällä käytetään viljelyyn tarttuvien solujen ei tue fosforylaatiota EGFR, joka on näin ollen luontainen ominaisuus pallosta solujen.

(A) Vanhempien, mock-transfektoituja, klooni 2, clone3 ja ”sekoittaa” solujen (Ist-Mes-2 solut transfektoitu CD24 shRNA ja valittiin useita klooneja), arvioitiin CD24 käyttämällä western blottauksella aktiini kuin latauskontrollina. Suhteellinen taso CD24 soluissa näkyy perustuu densitometristä arvioinnin paneeli B, joka myös dokumentoida CD24 mRNA-tasolla liittyvä

GAPDH

. (C) Vanhempien ja CD24

– Ist-Mes-2-soluja (klooni 2) kasvatettiin joko seerumia sisältävässä väliaineessa tai SFM. (D) Vanhempien, valetransfektoidun ja CD24

– kiinnittyvä ja pallo Ist-Mes-2-solut arvioitiin lisääntymistä 48 h ymppäyksen jälkeen viljelmässä identtinen solujen määrä käyttäen kristalliviolettia määrityksessä. (E) Vanhempien, valetransfektoidun ja CD24

– kiinnittyvä ja pallo Ist-Mes-2-solut arvioitiin P38, pP38 MAPK, ERK1 /2, pERK1 /2, EGRF ja pEGRF Western-blottauksella anti-aktiini-IgG