Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentyminen tai aktivointi syklisen AMP-vaste-elementti sitova proteiini (CREB ) on tiedetty olevan osallisena useissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien keuhkosyöpä. Geenejä säädellään CREB on raportoitu tukahduttaa apoptoosin, indusoi solujen lisääntymistä, tulehduksen ja kasvaimen etäpesäke. Kuitenkin kriittinen kohdegeenien CREB keuhkosyövän ei ole hyvin ymmärretty. Tässä olemme määritelleet GSK-3α yhtenä CREB kohdegeenien, joka on kriittinen elinkelpoisuuden keuhkosyövän soluja. CREB Knockdown vähensi ilmaus GSK-3α ja suoran sitoutumisen CREB on promoottori

GSK3A

tunnistettiin. Kaplan-Meier analyysi julkisen tietokannan osoitti ennustetyövälineenä merkitys poikkeavien GSK-3α ilmentymistä keuhkosyövässä. GSK-3α tukahdutetaan solujen elinkykyä, pesäkkeiden muodostumisen, ja kasvaimen kasvua. Ensimmäistä kertaa, osoitimme, että GSK-3α säätelevät CREB keuhkosyövässä ja tarvitaan solujen elinkykyä. Pääteltiin CREB-GSK-3α akseli uutena terapeuttisena kohteena keuhkosyövän hoitoon.

Citation: Park SA, Lee JW, Herbst RS, Koo JS (2016) GSK-3α on uusi kohde CREB ja CREB-GSK-3α Signaling Osallistuu elinkykyyn in Lung Cancer. PLoS ONE 11 (4): e0153075. doi: 10,1371 /journal.pone.0153075

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 06 helmikuu 2015; Hyväksytty: 23 maaliskuu 2016; Julkaistu: 06 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Cancer Institute apurahan R01-CA126801 (jotta ja Seok Koo) ja Cancer Center Support Grant CA-16359 (Yalen Cancer Keskusta). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

transkriptiotekijä syklisen AMP-vaste-elementti sitova proteiini (CREB) säätelee erilaisia ​​solun prosesseja, jotka sisältävät solujen erilaistumista, lisääntymistä, eloonjääntiä, glukoosiaineenvaihduntaan, immuuni asetus, ja synaptic plastisuus liittyvät muistin [1-7] . Aikaisemmin osoitimme, että CREB on kriittinen sääntelyn limakalvojen erilaistumiseen normaalin ihmisen trakeobronkiaalisen epiteelin (NHTBE) solut [8]. Lisäksi vähentynyt selviytymisen kesto oli merkitsevästi yhteydessä yliekspressio CREB tai aktivoitua CREB (p-CREB) in tupakoimattomia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [9] ja knockdown CREB estää elinkelpoisuuden keuhkosyöpäsoluissa [10]. Useat seriini-treoniini-kinaasit voivat aktivoida CREB ja p-CREB indusoi useiden cAMP-vaste-elementin sisältävien geenien osalta, joissa tärkeitä rooleja toimintaa CREB. Useita lähestymistapoja tunnistamiseksi CREB kohdegeenien on raportoitu [11-14], mutta erillisiä kohdegeenien CREB keuhkosyövässä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

GSK-3, joka on kaksi isoformia GSK-3α ja GSK- 3β, on seriini /treoniini proteiinikinaasi, joka on osallisena solusyklin etenemisen, erilaistumista ja apoptoosia. GSK-3 on konstitutiivisesti aktiivinen leposoluissa ja se fosforyloi ja estää onkogeenisten signalointi kuten β-kateniinin /WNT reitin [15-21]. Vaikka GSK-3 on tutkittu tuumorisuppressorina [22-24], on yhä enemmän todisteita siitä, että GSK-3: lla onkogeenisessä asemassa erilaisissa ihmisen syövissä. Useimmat tutkimukset ovat keskittyneet roolia koko GSK-3: n tai GSK-3β [25-27], mutta viimeaikaiset tutkimukset liitetty onkogeeninen rooli GSK-3α akuutti myelooinen leukemia (AML) [28], eturauhassyöpä [29], ja haimasyövän [30]. Mielenkiintoista, CREB yliekspressio tai sen lisääntynyt aktiivisuus on yhdistetty etenemistä näiden ihmisen syövissä [31-36]. Erityisesti CREB toimii esikasvaintekijän AML [31, 37] ja GSK-3α on myös kriittinen kohde AML hoito [28]. Äskettäin, GSK-3α ja GSK-3β on raportoitu olevan uusi kinaasi tavoitteet tivantinib, joka on tehokas, selektiivinen inhibiittori reseptorin tyrosiinikinaasin c-MET, keuhkojen syöpäsoluja. Tivantinib osoitti suurempi teho GSK-3α enemmän kuin GSK-3β ja GSK-3α tai GSK-3β ilmentyminen aiheutti apoptoosia keuhkosyövän soluihin [38].

Täällä ensimmäinen tunnistettu, että GSK- 3α, ei GSK-3β, säätelevät CREB keuhkojen syöpäsoluja. Lisäksi tutkimme, että on olemassa positiivinen korrelaatio korkean GSK-3α ilmaisun ja lyhyempiä selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita. Knockdown GSK-3α vaimenee solujen elinkykyä, pesäkkeiden muodostumista, ja kasvaimen kasvua. Yhdessä nämä havainnot implicates että GSK-3α on kriittinen kohdegeenin CREB ja CREB-GSK-3α signalointi on potentiaalinen terapeuttinen kohde keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen keuhkosyövän solulinjat (H1993, H1437, H1734, ja A549) saatiin American Type Culture Collection. Keuhkosyöpä-soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% (tilavuus /tilavuus) lämpöinaktivoitua naudan sikiön /seerumia (FBS; Sigma Aldrich), 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliini G: natrium- ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia (Invitrogen). Normaalit ihmisen tracheobronchial epiteelisolujen (NHTBE) saatiin Lonza Walkersville, Inc. ja viljeltiin BEGM

™ useita täydentää. Kaikki solut ovat kuljetettiin suoraan alkuperäisestä matalan passage varastoja ja käytettiin ennen kulkua 30. Solut testattiin myös viimeisten kolmen kuukauden aikana oikea morfologia mikroskoopilla ja havaitsemaan mykoplasmakontaminaation käyttäen MycoAlert mycoplasma havaitseminen kit (Lonza Walkersville, Inc .). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2.

Vasta-aineet /Kemikaalit

Monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine (A2228) oli Sigma Aldrich. Kanin polyklonaalinen vasta-aine GSK-3α (ab28833) hankittiin Abcam. Forskoliini (3828), anti-CREB (9197), anti-p-CREB (9198), anti-sykliini A2 (4656), anti-sykliini B1 (4138), anti-sykliini E2 (4132), ja GSK-3β ( 12456) saatiin Cell Signaling Technology. Rabbit monoklonaalinen sykliini D1-ainetta (2261-1) hankittiin Epitomics.

Knockdown /yliekspressio Genes

äänenvaimennin CREBin siRNA ja GSK-3α siRNA: ita ostettiin Thermo tieteellisiä tai Invitrogen; CREB siRNA (109994, Invitrogen), GSK-3α siRNA-1 (L-003009-00-0005, ON-TARGETplus SMARTpool, ThermoScientific) ja GSK-3α siRNA-2 (145366, Invitrogen). BLOCK-se Fluorescent Oligo (Invitrogen) käytettiin kontrollina. Kukin siRNA transfektoitiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Lisäksi, solut infektoitiin lentiviruksen shScrambled tai shRNAs kohdistaminen CREB: n tai GSK-3α 8 ug /ml polybreeniä, ja infektoidut solut valittu puromysiini. Sekvenssit shRNAs on lueteltu S1 taulukossa (saatavana verkossa). CREB-yliekspressio, H1437 ja A549-solut transfektoitiin plasmidi-DNA: pCMV-tyhjä tai pCMV-CREB (Clontech Laboratories, Inc.) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

elinkykyyn

Cell elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Sen jälkeen, kun solut transfektoitiin siRNA: illa 72 tuntia, soluja inkuboitiin MTT: tä (lopullinen konsentraatio 0,5 mg /ml) 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa inkubaattorissa. Seuraavat MTT Inkuboinnin 150 ui 100% DMSO: ta, lisättiin kiteiden liuottamiseksi. Elävät solut laskettiin lukemalla absorbanssi aallonpituudella 570 nm käyttäen mikrolevylukijaa SpectraMax (Molecular Devices).

Colony muodostumisen määritys

24 h transfektion jälkeen, jonka osoitti siRNA: t, 2 x 10

3 solut siirrettiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kasvaa 7-14 päivää. Väliaine poistettiin, kiinnitettiin 10% formaliinilla 15 minuutin ajan, ja sen jälkeen värjäämällä kristallivioletilla visualisoimiseksi pesäkkeitä.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA puhdistettiin soluista käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen). Käänteistranskriptio kokonais-RNA suoritettiin käyttäen M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen

SYBR

Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems) ja iCycler lämpösyklilaitteella (Bio-Rad Laboratories). Primer sekvenssit on lueteltu S1 taulukossa (saatavana verkossa).

Western Blot analyysi

Standard SDS-PAGE ja western blottausmenettelyt käytettiin ekspression analysoimiseksi eri proteiineja. Kokosolulysaattien kustakin keuhkosyövän solulinjat testattiin valmistettiin käyttämällä SDS lysis-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS: ää, 10% glyserolia ja 0,02% bromifenolisinistä), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ja fosfataasia. Kaikki proteiinit tehtiin näkyviksi käyttäen piparjuuren peroksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja Amersham ECL

™ Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Life Sciences). Intensiteetti Yksittäisten bändejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ densitomet- ohjelmistoja ja ilmaistu suhteessa aktiini signaali, mittana proteiinin suhteellinen runsaus eri näytteissä.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

SimpleChIP entsymaattinen kit (Cell Signaling) käytettiin, kuten on kuvattu valmistajan. PCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä ilmoitettu promoottorialueet ja reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja 1% koko panos näytettä käytettiin kontrollina. Primer sekvenssit on lueteltu S1 taulukossa (saatavana verkossa).

Immunovärjäys

immunofluoresenssimenetelmällä, havaitsemiseksi ensisijainen vasta suoritettiin käyttäen fluoresoivia konjugaatteja Alexa Fluor

® 488-vasta-aine (Invitrogen) yhdessä pidentää

® Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI (Invitrogen). Ennen värjäystä kiinteän parafinoidut kudoksissa, me seurasimme standardi protokolla, joka sisältyy vaiheita, kuten deparaffinization, antigeeni noutoa sekä läpäiseväksi.

virtaussytometria

solusyklin virtaussytometrialla, solut olivat kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin propidiumjodi- jodivärjäyksen (BD Pharmingen) DNA sisällöstä. Apoptoosi mitattiin käyttäen FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen) seuraten valmistajan ohjeita.

In vivo

Studies

Kaikki toimenpiteet hyväksynyt Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Yalen yliopistossa ja sopeutui oikeudellisten valtuuksien ja liittovaltion suuntaviivat hoito ja huolto koe-eläimillä (protokolla #: 2012-11464). Nainen J: NU nude hiiret saatiin Jackson Laboratory ja käytetään 6-7 viikkoa vanhoja. H1993-soluja esikäsiteltiin 20 nM ohjaus siRNA tai GSK-3α siRNA 24 h, jonka jälkeen elinsiirron (2 x 10

6 solua /kylki, ksenografti, n = 7 /ryhmä) kylkeen hiirillä. Lisäksi, H1993-shScrambled, H1993-shGSK3A # 2, tai H1993-shGSK3A # 4-solut ympättiin selkä kylkien (6 x 10

5 solua /kylki; shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, ja shGSK3A # 4 n = 5). Kaikki ksenograftit istutettiin sekä oikean ja vasemman selkä kylkiin hiirillä. Kasvaimen tilavuus mitattiin digitaalisen jarrusatulat ja laskettava kaavalla 0,52 x pituus x leveys

2. Hiiret lopetettiin lopussa tutkimuksesta on sijoitettu hiilidioksidi kammioon.

tilastolliset menetelmät

kvantitointi Tulokset esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Tilastollinen merkitys eroja ryhmien määritettiin Studentin

t

-testi, jossa on

P

arvo on alle 0,01 katsotaan olevan tilastollisesti merkitsevä. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin analysoimaan univariate selviytymisen, ja vertailuja elossapysymisaikajakaumat ryhmissä suoritettiin käyttäen log-rank-testi.

Tulokset

GSK-3α säädellään CREB vuonna keuhkosyövän solut

tutkimiseksi kriittisen CREB kohdegeenien keuhkosyöpä, teimme qPCR-analyysi käyttämällä spesifisiä alukkeita vastaan ​​osajoukko liittyvien geenien solun eloonjääntiin, proliferaatioon ja elinkelpoisuuden CREB pudotus soluissa. Olemme havainneet, että mRNA-tasolla GSK-3α, ei taso GSK-3β, oli merkittävästi vaimentua CREB siRNA kaikissa keuhkosyövän solulinjat testasimme (H1993, H1437, H1734, ja A549) (kuvio 1A). Lisäksi, proteiinin ilmentymisen GSK-3α oli dramaattisesti tukahdutettiin CREB pudotus kaikki neljä keuhkosyövän solulinjat testattiin (kuvio 1 B), mutta proteiinin määrä GSK-3β ei ole muuttanut CREB pudotus (kuvio 1C).

(A) vaikutus CREB knockdown mRNA- tasolla

GSK3A

,

GSK3b

, ja

CREB

. Jokainen ilmoitettu solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CREB siRNA (40 nM, kukin) 48 h, jonka jälkeen qPCR analyysi. Kaikki arvot kuvaajat edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kaksipuolinen

t-

testi. *,

P

0,01. (B-C) vaikutus CREB pudotus proteiinin tasot GSK-3α (B) ja GSK-3β (C). Jokainen ilmoitettu solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CREB siRNA (40 nM, kukin) 72 tuntia, jonka jälkeen Western blot -analyysillä.

Olemme huomanneet, että

GSK3A

promoottorin sisälsi useita otaksuttu CREB sidoskohdissa määritettynä TFSEARCH (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (kuvio 2A). Sen tutkimiseksi, onko CREB sitoutuu ihmisen

GSK3A

promoottorin, suoritimme ChlP määritys käyttäen immunosaostus CREB vasta-aineen ja IgG negatiivisena kontrollina. Ei vain alukesetin A, joka kattaa CREB konsensus sitoutumiskohdan (-39–53), mutta myös kolme muuta alukesarjat (B: -459–476, C: -545–557, ja D: -603 ja – 616) osoitti sitoutumista CREB on

GSK3A

promoottori. Kuitenkin, ei-spesifisille alueille (NS-1, NS-2, ja NS-3) promoottorin ei osoittanut sitoutumista CREB (kuvio 2B). Lisäksi knockdovvn CREB merkittävästi tukahdutti yhdistys CREB kanssa

GSK3A

promoottori (kuvio 2C). Yhdenmukaisia ​​aiempien tietojen, jotka osoittivat CREB pudotus tukahdutti ilmentymisen GSK-3α, yliekspressio CREB indusoituu voimakkaasti GSK-3α ilmentyminen proteiinitasolla jälkeen ohimeneviä tai stabiili yliekspressio CREB (kuvio 2D). Itse asiassa, ilmaukset p-CREB ja GSK-3α nostettiin forskoliinin, joka aktivoi entsyymin adenylyylisyklaasi ja lisää solujen syklisen AMP (kuvio 2E). Yhdessä ehdotamme, että CREB on potentiaalinen ylävirtaan säädin GSK-3α keuhkojen syöpäsoluja.

(A) Kaavamainen piirros esittäen sijainnit CREB sitovia osia, jotka sijaitsevat geenin promoottori ihmisen

GSK3A

(TFSEARCH). AD: tietyille alueille pohjamaaleille jotka kattavat CREB sitovia elementtejä, V: -39–53, B: -459–476, C: -545–557, D: -603–616, NS-1, – 2, ja -3: alueista, alukkeita, jotka ovat ei-spesifinen sitoutuminen elementit NS-1: -126–230, NS-2: -183–378, ja NS-3: -1214–1356. Primer sekvenssit ovat S1 taulukossa (saatavana verkossa). (B) Suoraan sitoutuminen CREB on

GSK3A

promoottori. Siru määritys tehtiin kromatiini valmistettu H1993 ja H1734 soluja. Sitoutumisen CREB on

GSK3A

promoottorin havaittiin visualisointi PCR-tuotteen. Yksittäinen bändejä havaittu tulo näytteet osoittavat spesifisyys PCR-alukkeita. (C) suora sitoutuminen CREB on

GSK3A

promoottorin CREB-knockdown soluissa. Proteiini taso CREB kussakin vakaa solulinjasta varmistettiin western blot-analyysi. (D) vaikutus CREB ilmentymisen vaikutus ekspressioon GSK-3α. H1437-solut transfektoitiin samalla määrällä pCMV-tyhjä tai pCMV-CREB ekspressiovektoriin ja ilmentymistä CREB, p-CREB, ja GSK-3α tutkittiin Western blot -analyysillä (vasemmalla). A549-ohjaus (A549-ctrl) tai A549-CREB-solut transfektoitiin pCMV vektoreita ja valitaan puromysiiniä (1 ug /ml). Vaikutus CREB ilmenemistä GSK-3α varmistettiin myös (oikealla). (E) Vaikutus forskoliinin induktioon tason p-CREB ja GSK-3α. A549 ja H1437-soluja käsiteltiin forskoliinilla (10 uM, 30 min) ja ilmaisu kunkin proteiinin tutkittiin Western blot -analyysillä.

GSK-3α on huono ennuste tekijä keuhkosyöpä

on olemassa näyttöä siitä, että GSK-3β yliekspressoituu keuhkosyöpä. Yli-ilmentyminen GSK-3β toimii itsenäisenä merkki huonosta ennusteesta varten NSCLC ja sen estäminen tukahduttaa soluproliferaatiota NSCLC soluissa [39]. Kuitenkin rooli GSK-3α keuhkosyövässä vielä enemmän tutkimuksen. Tässä olemme huomanneet, että GSK-3α on yli-ilmentynyt useissa keuhkosyövän solulinjat verrattuna NHTBE-soluissa (kuvio 3A).

(A) Protein tasot GSK-3α, p-CREB, ja CREB useita keuhkojen syöpäsolulinjoissa verrattuna NHTBE soluihin. (BD) Kaplan-Meier-analyysi kokonaiselinaika alhainen tai korkea

GSK3A

(

GSK3A

koetinsarjaa 202210_x_at) ilmentymistä in (B) 1760 keuhkosyöpäpotilaita, (C) 487 keuhkoadenokarsinooma potilaiden ja (D) 422 keuhkojen okasolusyöpä kanssa lisähoito. Kokonaiselossaoloaika analyysi potilaista suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisen vaaran malleja ja seurantatiedot annetun ajanjakson.

lisäksi arvioitava meidän toteaminen

GSK3A

yliekspressio on merkitystä ihmisen keuhkosyöpä, käytimme julkisesti saatavilla Kaplan-Meier-piirturi (https://kmplot.com/analysis), joka on koostuu 1760 keuhkosyöpään potilailla, jotka saavat kemoterapiaa /sädehoitoa, joka perustuu tietokantoihin (CARRAY: n = 504; GSE14814 : n = 90; GSE19188: n = 156; GSE29013: n = 55; GSE31210: n = 246; GSE3141: n = 111; GSE37745: n = 196; GSE4573: n = 131; GSE8894: n = 138, ja TCGA: n = 133). Sen määrittämiseksi, onko

GSK3A

mRNA (202210_x_at) runsautta kasvaimissa liittyi yleiseen eloonjäämiseen, suoritimme eloonjäämiseen analyysiin käyttävien potilaiden Coxin suhteellisen vaaran malleja ja seurantatietoja 200 kuukauden kuluttua leikkauksesta. Yliekspressio

GSK3A

mRNA-tasot on yhteydessä huonoon eloonjäämisaste keuhkosyöpäpotilaita (harzard suhde (HR) = 1,42, logrank P = 4.9e-06) (kuvio 3B). Mielenkiintoista,

GSK3A

mRNA-tasot voimakkaammin yhteydessä huonoon eloonjäämisaste keuhkosyöpää sairastavien potilaiden adenokarsinooma (HR = 1,99, logrank P = 2.4e-06) (kuvio 3C). Kuitenkin positiivinen

GSK3A

ekspressiota ei korreloi merkitsevästi lyhyempi elinaika potilailla, joilla on okasolusyöpä histologia tyypin (kuvio 3D). Olemme myös havainneet, että yli-ilmentyminen

CREB

mRNA taso oli yhteydessä huonoon eloonjäämisaste keuhkosyöpää sairastavien potilaiden hyvin samankaltainen malli

GSK3A

mRNA (S2 Kuva). Tuloksemme kliinisiä kasvainnäytteet osoittaa, että poikkeava aktivaatio GSK-3α liittyy ihmisen kuolleisuus keuhkosyöpäpotilaiden, erityisesti keuhkojen adenokarsinooma.

inhibitio GSK-3α estää elinkelpoisuuden keuhkosyövän soluja

vaikutuksen määrittämiseksi GSK-3α, joka on CREB kohdegeenin, olemme vahvistaneet vaikutus CREB pudotus solun elinkelpoisuutta useita keuhkosyövän solulinjat. Yhdenmukainen aiemmat raportit [10], CREB esto tukahdutti elinkelpoisuutta keuhkosyövän soluja (kuvio 4A). Seuraavaksi knockdown GSK-3α sen erityisen siRNA johti väheneminen elinkelpoisuutta kaikkien keuhkosyövän solulinjat testasimme (kuvio 4B). Lisäksi, pudotus GSK-3α johti vähentyneeseen pesäkkeiden muodostumista soluissa (kuvio 4C). Näin ollen, GSK-3α pudotus suppressoi merkitsevästi solujen elinkelpoisuuden KRAS-WT keuhkosyövän solulinjoja (H1993 ja H1437), verrattuna KRAS-mutantti keuhkosyövän solulinjoja (H1734 ja A549). Olemme edelleen tutkittiin, mikä vaikutus GSK-3α Knockdown solun kuolemaan käyttämällä FACS-analyysiä. Kuten esitetty kuvassa 4D solut jotka ilmentävät shGSK3A osoitti lisääntynyttä solukuolemaa verrattuna kullekin valvonta solulinjan. Validointi siRNA: iden tai shRNAs ilmenemistä GSK-3α suoritettiin qPCR tai western blot analyysi useita keuhkosyövän solulinjoja (S1 Kuva). Nämä tulokset viittaavat siihen, että GSK-3α säätelee positiivisesti elinkelpoisuuden keuhkosyövän soluja.

(A) vaikutus CREB pudotus solun elinkelpoisuutta. Keuhkosyövän solulinjat (H1993, H1437, H1734, ja A549) transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA (50 nM), tai CREB siRNA (10, 50 nM), 72 tuntia, jonka jälkeen MTT-määrityksellä. Kaikki arvot kuvaajat edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kaksipuolinen

t

-testi. *,

P

0,01. (B) vaikutus GSK-3α pudotus solun elinkelpoisuuden. Solut transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA, tai GSK-3α siRNA (40 nM, kukin) 72 tuntia ja kvantitatiivisen tiedon jälkeen MTT: llä. Kaikki arvot kuvaajat edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kaksipuolinen

t-

testi. *,

P

0,01. (C) vaikutus GSK-3α Knockdown kolonioiden muodostumista. Yksi päivä transfektion jälkeen ohjaus siRNA (40 nM), tai GSK-3α siRNA (10, 40 nM), solut siirrostettiin uudelleen 6-kuoppaisilla, joilla on alhainen tiheys (2 x 10

3 /kuoppa) ja inkuboitiin 7-14 päivää. Keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kaksipuolinen

t-

testi. *,

P

0,01. (D) vaikutus GSK-3α Knockdown solun kuolemaan. H1734 ja H1993-solut infektoitiin lentiviruksen ilmentävien shRNA kohdistaminen GSK-3α (kahden sekvenssin; shGSK3A # 2 ja shGSK3A # 4) 8 ug /ml polybreeniä. 48 tunnin kuluttua infektiosta, solut valittiin 0,5 ug /ml puromysiiniä ja 3 päivää. Valitut solut tehtiin värjäämällä anneksiini V ja PI analyysi apoptoottisen solukuoleman LSRII.

CREB-GSK-3α signalointi on kriittinen sääntelyn Sykliinien

Saadaksemme käsityksen rooli GSK-3α keuhkosyövän solujen elinkelpoisuuden, ensin tutki GSK-3α säätelee solusyklin käyttämällä FACS-analyysiä. Mielenkiintoista on, että GSK-3α pudotus tukahdutetaan S-vaiheen solusyklin, jotka voivat osallistua alennettua solujen elinkelpoisuuden keuhkosyövän soluja (kuvio 5A). Kuten kuviossa 5B, proteiinin ilmentyminen useiden Sykliinien, mukaan lukien sykliini A2, sykliini B1, sykliini D1, ja sykliini E2 suppressoitui merkittävästi GSK-3α pudotus keuhkosyövässä solulinjoissa. Lisäksi nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että CREB voi säädellä Sykliini [12, 31, 40, 41]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että GSK-3α voisi toimia positiivisesti elinkelpoisuuden keuhkosyöpään solujen säätelemällä Sykliini.

(A) vaikutus GSK-3α Knockdown solun syklin. Indikoitu soluja nälkiinnytettiin seerumittomassa RPMI-väliainetta 24 tuntia ja jota kasvatetaan RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää vielä 24 tuntia. Kerätyt solut värjättiin PI analyysin solu- syklin LSRII. (B) vaikutus GSK-3α Knockdown geenissä ilmauksia, jotka liittyvät solujen elinkelpoisuuden tai solusykliä kuten sykliini A2, sykliini B1, sykliini D1, ja sykliini E2. Keuhkosyöpä solut transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA, tai GSK-3α siRNA (40 nM, kukin) 48 tuntia ja seurattiin Western blot-analyysi.

GSK-3α on kriittinen kasvaimen kasvu

vieressä osoitettu rooli GSK-3α kasvaimen kasvua

in vivo

käyttäen ihonalaista injektioita ohjaus tai GSK-3α-köyhdytettyä soluissa. Kasvainten kasvua seurattiin viiden viikon kuluttua solut eksplantoitiin nude-hiirissä. Edustaja valokuvia hiirillä lopussa viiden viikon osoitti, että kasvaimia, jotka ovat peräisin GSK-3α-köyhdytettyä solujen suppressoitui merkittävästi verrattuna kasvaimia, jotka ovat peräisin kontrolli-soluissa (kuvio 6A). Yhdenmukainen hypoteesia ja data, GSK-3α knockdown johti merkittävään tukahduttaminen kasvaimen kasvussa ja kasvaimen tilavuus (kuvio 6B). Varmistimme vaikutus GSK-3α heikentymisen ilmentymistä GSK-3α tai sykliini B1 kudoksissa, jotka ovat peräisin ksenografteja (S5 kuvio). Toistuvasti, huomasimme, että täydellistä poistamista

GSK3A

soluissa voisi kehittyä kasvaimia nude-hiirissä (kuvio 6C ja 6D). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat selvästi, että alentuneesta GSK-3α heikentää keuhkosyöpä kasvaimen kasvua

in vivo

.

(A) edustaja kuvia ksenograftien peräisin ohjaus siRNA tai GSK-3α siRNA hoidetun H1993-soluissa. 24 tunnin kuluttua siRNA transfektion (20 nM, kumpikin), solut istutettiin ihon alle oikealle ja vasemmalle puolelle selän kylkiin naisten nude-hiirten (ksenografti n = 7 /ryhmä). (B) Kasvaimen tilavuus ksenograftien johdettu ohjaus- tai GSK-3α-vajaiden H1993-soluja arvioitiin kunakin ajankohtana kuten on osoitettu. Kasvaimen tilavuus mitattiin digitaalisen jarrusatulat ja laskettava kaavalla 0,52 x pituus x leveys

2. Kaksipuolinen

t

-testi. *,

P

0,01. (C) edustaja kuvia ksenograftien peräisin H1993-shScrambled, shGSK3A # 2, tai shGSK3A # 4 soluja. Solut inokuloitiin subkutaanisesti selän paljaiden hiirien kylkiin (vasen: shScrambled solut, oikealla: shGSK3A solut), ja tuumorin tilavuus mitattiin yli ilmoitettuina ajankohtina (shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, ja shGSK3A # 4 n = 5). Kaksipuolinen

t

-testi. *,

P

0,05.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa ensin tunnistettu GSK-3α uutena kohteena CREB keuhkojen syöpäsoluja. Tutkimuksemme osoittaa onkogeenisia roolit GSK-3α kuin CREB kohdegeenin ja uutena ennustetekijöiden biomarkkereiden keuhkosyövässä. GSK-3α on osoitettu olevan terapeuttinen kohde useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien AML, haimasyöpä ja eturauhassyöpä. Kuitenkin rooli GSK-3α keuhkosyövässä yhä suurelta osin edelleen tuntematon. Täällä tuloksemme osoittavat, että alentuneesta GSK-3α heikentää kannattavuutta keuhkosyövän solujen

in vitro

ja

in vivo

. GSK-3α on yli-ilmentynyt useissa keuhkosyövän solulinjat ja keuhkojen kasvain kudoksia. Myös poikkeava GSK-3α liittyi lyhyempi elinaika erityisesti potilailla, joilla keuhkojen adenokarsinooma. Vielä tärkeämpää on, CREB säätelee ilmentymistä GSK-3α, mutta ei GSK-3β, viittaa siihen, että on olemassa erityinen käsivarsi CREB-GSK-3α signalointi keuhkosyöpä.

aktiivisuus CREB säätelee useita fosforylaation mekanismit ja fosforylaatio CREB seriinin-133 tarvitaan rekrytointi yhteistyössä aktivaattori CREB-sitovan proteiinin (CBP) /p300 ja sen transkriptionaalisen aktiivisuuden. Itse asiassa, GSK-3 on ollut tunnettu repressorin CREB aktiivisuuden. CREB DNA: ta sitova aktiivisuus inhiboituu GSK-3β yliekspressio ja kasvoi litium- tai natrium- valproaatti, jotka ovat GSK-3-inhibiittoreita ihmisen neuroblastoomasoluja [42]. Lisäksi GSK-3β on raportoitu tukahduttaa useita CREB-kohdegeenien [43, 44]. Kääntäen, tuoreessa tutkimuksessa on raportoitu, että GSK-3 edistää yhdistyksen CREB ja sen co-aktivaattorit kanssa MEIS1, joka on homeobox (HOX) DNA-sitova kofaktori, aiheuttaa HOX-välitteisen transkription ja muutosta MLL leukemiat [45]. Vaikka toiminnallinen seuraus CREB aktiivisuuden GSK-3 ei ole vielä selvä, meidän tutkimus viittaa vahvasti siihen, että CREB säätelee positiivisesti GSK-3α, ei GSK-3β, keuhkojen syöpäsoluja, mikä tarjoaa uuden käsitteen CREB-GSK-3α signalointi .

Vaikka GSK-3β, ja se voi toimia kasvaimen promoottori keuhkosyöpä on osoitettu [39], rooli GSK-3α keuhkosyövässä edelleen heikko. Nykyisissä tutkimuksessa havaittiin, että GSK-3α yliekspressoituu keuhkosyövän solulinjat verrattuna normaaliin keuhkoputken epiteelisolujen. Knockdown GSK-3α keuhkojen syöpäsoluja aiheuttaa solujen proliferaatio sekä induktion merkittävä apoptoosin. Nämä tulokset osoittavat, että GSK-3α on myös ratkaiseva rooli kasvun keuhkosyövän soluja.

mekanismi GSK-3α, kuten kasvaimen promoottori keuhkosyöpä on käytännössä tuntematon. On osoitettu, että GSK-3α edistää onkogeenistä KRAS toiminnon kautta IKK-NF-KB: n aktiivisuuden haimasyöpä. Kirjoittajat ehdottivat GSK-3α keskeisenä alavirtavaikuttajainhibiittorit KRAS säädellä NF-KB: n signalointireittien [30]. Mielenkiintoista on, että meidän tutkimus osoitti, että GSK-3α pudotus erittäin tukahdutetaan solujen elinkelpoisuuden KRAS-WT keuhkosyövän solulinjat, H1993 ja H1437-soluissa, verrattuna KRAS-mutantti keuhkosyövän solulinjat, H1734 (G13C) ja A549 (G12S) solut . Vaikka on epäselvää, KRAS asema liittyy suoraan roolia GSK-3α keuhkojen syöpäsoluja, ehdotamme, että toiminta GSK-3α in KRAS signalointia voitaisiin säännellä solutyyppispesifisten tavalla.

paremmin ymmärtää rooli GSK-3α ja tutkia kriittisten geenien vaikuttaa GSK-3α keuhkosyövän, me aluksi seulotaan osajoukon NF-KB kohdegeenien, kuten

MYC

,

WT1

,

BIRC2

,

IL-9

,

HMOX1

, ja

TERT

, joita säätelee yleiseurooppalaisen GSK-3-estäjän AR -014418 haimasyövän [30]. Tuloksemme ei ollut täysin yhdenmukainen aiempien tutkimuksessa, mutta havaitsimme merkittävän laskun mRNA tason TERT GSK-3α Knockdown ja vähän eroa muihin NF-KB kohdistuu analysoitu (EDN1, CYP19A1, HMOX1, WT1, ja BIRC2) (S3 kuvassa). Lisäksi olemme havainneet, että ilmentyminen useiden Sykliinien jotka tunnetaan CREB kohteena gens oli merkittävästi vaimentua GSK-3α pudotus useita keuhkosyövän solulinjat. Vaikka meidän tutkimus ei suoraan tunnistaa kuinka Sykliineiksi säätelevät GSK-3α, nämä tulokset tukevat voimakkaasti uusi rooli GSK-3α aktiivisena säätelijänä elinkelpoisuuden keuhkosyövän soluja.

Teoriassa estyminen GSK-3 voi johtaa β-kateniinin stabilointi ja hyperactivation Wnt /β-kateniinin signalointi [46-49]. Kuitenkin, Doble et al. osoittivat, että molemmat isomuodot GSK-3 on estynyt β-kateniinin stabilointi. GSK-3α /β double-knockout hiiren alkion kantasoluja (ESC) näytetään hyperactivated Wnt /β-kateniinin signalointi [50]. Tämän mukaisesti raportti, on yhä enemmän todisteita siitä, että yksittäinen menetys joko GSK-3α tai GSK-3β isoformi ei johda β-kateniinin stabilointi [28, 39]. Tietomme osoittivat myös, että GSK-3α ei indusoi tason β-kateniinin ja AXIN2, joka on ak- siini-sukua oleva proteiini, joka on tärkeä rooli Wnt /β-kateniinin signalointireitin (S4 kuvassa). Nämä tulokset tukevat että GSK-3α voisi toimia riippumaton β-kateniinin stabilointi keuhkosyövän mutta tarkempaa analyysiä on täydennettävä täysin ymmärtää roolit GSK-3α ja GSK-3β in β kateniinin stabilointi keuhkosyövässä.

havainnot että GSK-3α ilme on syy-yhteydellinen merkitys selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita, viittaavat GSK-3α voisi olla käyttökelpoinen ennustetyövälineenä biomarkkereiden keuhkosyövän, erityisesti keuhkojen adenokarsinooma. Lisätutkimukset tutkitaan mekanismeja kohdistaminen CREB-GSK-3α väylän keuhkosyöpä on olennaista määritettäessä ja kehittämiseen GSK-3α erityisiä estäjät. Lopuksi ehdotamme, että GSK-3α on lupaava terapeuttinen kohde uutena kohdegeenin CREB diagnosoida kasvain ja kehittää hoidon kannalta merkityksellinen keuhkosyöpään.

tukeminen Information

S1 Kuva.