Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pescadillo on nucleolar proteiini, joka on ehdotettu olevan osallisena sikiön kehityksen ribosomien biogeneesin. Sääntelemättömään ilmentymiseen ihmisen pescadillo (PES1) kuvattiin joissakin kasvaimissa, mutta sen tarkka rooleja kasvainten synnyssä on epäselvä. Tässä tutkimuksessa olemme syntyy kolme tunnistavia monoklonaalisia vasta-PES1 korkea herkkyys ja spesifisyys, jonka kanssa PES1 ilmentymistä ihmisen paksusuolen syövän analysoitiin immunohistokemiallisesti. Out of 265 paksusuolensyöpä kudoksiin, 89 (33,6%) osoitti positiivisia PES1 ilme, joka oli merkittävästi suurempi kuin ei-syöpäkudokset (P 0,001). Hiljentäminen PES1 paksusuolen syöpäsoluissa johti vähentynyt proliferaatio, kasvun hidastumista ksenograftien, ja solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa, mikä osoittaa PES1 toimii onkogeeni. Sitten tutkitaan mekanismi, jolla PES1 ilmentymistä säätelevät ihmisen paksusuolen syövissä, ja osoittivat, että c-Jun, mutta ei JunB, JunD, c-Fos, tai mutantti c-Jun, säätää positiivisesti PES1 promoottorin transkription aktiivisuus. Lisäksi kartoitimme -274 /-264 alueella PES1 promoottorin kuin c-Jun sitoutuva sekvenssi, joka oli validoitu chromatin immunosaostuksella ja elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset. Lisäksi olemme osoittaneet, välillä on positiivinen korrelaatio c-Jun ja PES1 ilmentymisen paksusuolen syöpäsoluissa ja paksusuolen syöpä kudoksiin. Ylävirtaan c-Jun, kävi ilmi, että c-Jun-NH2-pään kinaasien (JNK) on tärkeää valvoa PES1 ilmentymistä. Tutkimuksessamme ensinnäkin, paljastaa onkogeenisiä roolia PES1 paksusuolen syövän ja selvennetään molekyylimekanismin ohjaa PES1 ilme.

Citation: Xie W, Feng Q, Su Y, Dong B, Wu J, Meng L, et ai. (2012) Transcriptional asetukseen PES1 Expression c-Jun Colon Cancer. PLoS ONE 7 (7): e42253. doi: 10,1371 /journal.pone.0042253

Editor: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia

vastaanotettu: 20 tammikuu 2012; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2012; Julkaistu: 30 heinäkuu 2012

Copyright: © Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National 973 Program of China (2009CB521805) ja National Nature Science Foundation of China (81172367). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pescadillo

koodaa nucleolar proteiinia useita kuvioita, kuten BRCA1 C-terminaali (BRCT) domain, klustereita happamien aminohappojen verkkotunnuksia, useita ydinvoiman lokalisointi signaaleja, ja konservoituneen sivusto SUMOylation [1]. Se identifioitiin aluksi geenin olennainen seeprakala alkionkehityksen [2]. Myöhemmin tutkimuksissa havaittiin, että pescadillo on erittäin konservoitunut hiivasta ihmisen [1], [3] – [5]. Ihmisen ortologi Pescadillo (PES1) muodostaa stabiilin kompleksin Bop1 ja WDR12 (PeBoW kompleksi), joka on ratkaisevan tärkeää nucleolar lokalisointiin ja sen tehtävä rRNA käsittely [6] – [8]. BRCT-deletoitu tai -mutated muodossa PES1 on vähemmän stabiili, eikä sitä voida sisällyttää PeBoW kompleksin [9]. Toinen nucleolar proteiini B23 fyysisesti vuorovaikutuksessa PES1 ja osallistuu valvontaan nucleolar lokalisoinnin PES1 [10]. Pescadillo on osoitettu olevan tärkeitä rooleja normaalissa alkionkehityksessä, ribosomin biogeneesin, DNA-replikaation, kromosomaalinen vakautta, ja solusyklin etenemisen. Häiriöt pescadillo tai sen ortologeille hiivassa, zebrefish, ja hiiri heikentynyt alkionkehityksen [2], [3], [11], [12]. PES1 on tärkeä merkitys pre-rRNA käsittely ja 60S ribosomialayksikköä kypsymisen kautta muodostumista PeBoW kompleksin [3], [7], [9], [13]. Lisäksi knockdovvn PES1 indusoiman solusyklin pysähtymisen ja laski fosforylaation retinoblastoomaproteiinia (Rb) [14]. Lisäksi PES1 on osoitettu sitoutuvan DNA suoraan ja säädellä geenin transkriptiota [15], mikä viittaa siihen, että PES1 on monitoiminen proteiini osallistuu erilaisten biologisten prosessien säätelyyn.

Äskettäin sääntelemättömään ilmentymiseen ja PES1 havaittiin liittyvän syövän kehitys [1], [16] – [18]. PES1 epänormaalisti yläreguloituja aikuisen ihmisen glioblastomas [1], pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCCs) [19], ja mahasyövän [20]. PES1 ilmentyminen oli myös merkitsevästi lisääntynyt rintasyövän soluja ja kudoksia sekä mRNA ja proteiini tasoilla [21], ja sen mahdollisesti ohjataan estrogeenin [22]. Lisäksi, PES1 on liitetty kromosomaalinen epävakauden [18], [23] ja transformaatio nisäkässolujen [16]. Huolimatta näistä havainnoista, vähän tiedetään tarkka rooli PES1 kasvainten synnyssä ja tekijät ohjaavat PES1 ilmentymistä jäävät vielä.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet korkea ilmentyminen PES1 paksusuolen syövän kudoksissa. Olemme havainneet, että PES1 näyttelee onkogeenisen rooli proliferaatiota paksusuolen syövän solujen ja kasvaimen muodostumista nude-hiirimallissa. Transkriptiotekijä c-Jun parantaa PES1 ilmentymisen sitoutumalla promoottorin alueella PES1 ja positiivinen korrelaatio c-Jun ja PES1 ilmentyminen on ilmeistä, paksusuolen syövän soluja ja kudoksia.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

kerääminen kudosnäytteiden hyväksyttiin ja valvoma Research eettisen komitean Pekingin yliopisto Cancer Hospital Institute. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen käyttöä. Eläinkokeissa, mukaan lukien vasta sukupolvi ja ksenografti kasvainmuoto, hyväksyttiin ja valvoma tutkimus eettisen komitean Pekingin yliopisto Cancer Hospital Institute.

Materiaalit

IImentämisplasmidien c-Jun, JunB, JunD ja c-Fos ystävällisesti Dr. Zhihua Liu (Peking Union Medical College, Kiina). Kaksinkertainen mutantti c-Jun-S63A /S73A oli lahja Dr. Dirk BOHMANN (University of Rochester Medical Center). pGL3-Basic ja PRL-SV40 plasmidit hankittiin Promega (Madison, WI, USA). Vasta-aineita c-Jun (H-79, sc-1694) ja c-Fos (sc-52) olivat Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet JunB (D253, BS1196) ja JunD (V249, BS1198) olivat Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA). Vasta-aine JNK1 (ab27709) oli peräisin Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-β-aktiini hankittiin California Bioscience (Coachella, CA, USA). Anti-GAPDH oli peräisin ProteinTech (Chicago, IL, USA). Kinaasi-inhibiittorit U0126 ja LY294002 ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA, USA). SP600125 ostettiin Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

sukupolven monoklonaalinen vasta-aine

erittäviä hybridoomia anti-PES1 vasta-aineet tuotetaan standardin mukaisesti protokollaa. Lyhyesti, viisi BALB /c-hiiriä (hankittiin Animal Center of Kiinan Academy of Medical Sciences) immunisoitiin rekombinantilla GST-PES1 proteiinia (50 ug per hiiri) emulgoituna Freundin adjuvanttiin (Sigma) neljä kertaa 3 viikon välein. Päivänä 4 viimeisen immunisoinnin jälkeen perna poistettiin yhdestä immunisoiduista hiiristä, ja solut fuusioitiin Sp2 /0-myeloomasolujen kanssa, käyttäen 50% (v /v) polyetyleeniglykoli 4000 (Merck, Darmstadt, Saksa). Hybridoomia viljeltiin HAT (hypoksantiini, aminopterine ja tymidiiniä, Sigma) valinta-alustalla. 14 päivän kuluttua supernatantit kerättiin ja seulottiin spesifisten anti-PES1 monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), ELISA: lla. Vakaa hybridoomaa laajennettiin ja mAb puhdistettiin proteiini A /G-kytketyn Sepharose-helmiä (Invitrogen) kromatografia.

Soluviljely ja transfektio

HCT116, SW480, RKO, ja AGS soluja saatu American type Culture collection (ATCC). Soluja ylläpidettiin DMEM tai RPMI-1640-alustassa (Hyclone, Logan, UT, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa 5% CO

2 ympäristössä. Transfektioon, solut siirrostettiin viljelylevyille, kasvatettiin 50-80% konfluenssiin ja transfektoitiin plasmideilla tai siRNA: lla käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. DNA plasmiditransfektiolla, 1,6 ug DNA: ta käytettiin kuoppaa kohti 12-kuoppaiselle viljelylevylle. SiRNA transfektio, 50 pmol siRNA käytettiin kuoppaa kohti 12-kuoppaiselle viljelylevylle. Transfektion jälkeen soluja inkuboitiin vielä 48-72 tuntia ennen korjataan lusiferaasimääritystä tai geenin ilmentymisen testaamiseen. Vaihtoehtoisesti, transfektion jälkeen 48 tuntia, soluja käsiteltiin osoitetulla estäjät vielä 36 tunnin ajan. siRNA sekvenssit käytetään kaataa ilmaus c-Jun ja JNK1 olivat seuraavat: siRNA-c-Jun, GCAAAGAUGGAAACGACCUUCUAUGTT; siRNA-JNK, AAAGAAUGUCCUACCUUCUTT.

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin modifioidussa RIPA-puskuria, joka sisälsi 50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na

3VO4, 20 mM NaF, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS ja 1 x proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Mannhelm, Saksa). Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) 2 h huoneen lämpötilassa, kalvot inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa seurasi inkubointi sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuren peroksidaasiin (Jackson, West Grove, PA). Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Pierce, Rockford, IL, USA). Suhteellinen optiset tiheydet proteiiniryhmänä kuin lastaus valvonta (GAPDH) kvantitoitiin Scion Image ohjelmisto.

immunohistokemiallinen analyysi

immunohistokemiallisella värjäyksellä, kaikki kliiniset näytteet kiinnitettiin juuri valmistettu 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um: n leikkeitä. Paiston jälkeen 60 ° C: ssa yön, kohdat poistettiin vaha ja nesteytyksestä. Sen jälkeen antigeeni retrievaling suoritettiin kautta korkean paineen ruoanlaiton EDTA (pH 8,0, Zymedin). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla 3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli salvattu 5% rasvaton maito, leikkeitä inkuboitiin erityisiä PES1 mAb 3B1 (1:500) 4 ° C: ssa yön, jota seuraa inkubaatio sekundaarisen vasta-aineen EnvisionTM kit (Dako Cytomation, Cambridge, UK) 45 minuutin ajan huonelämpötila. Reaktiotuote visualisoitiin diaminobentsidiini (DAB, Sigma) 5 min ajan huoneenlämpötilassa, ja leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Puhdistettu IgG normaalin hiiren seerumia käytettiin negatiivisena kontrollina. Tulokset arvioitiin erikseen kahdella patologit (Q.F. ja B.D.). Näytteen yli 20% immunovärjäyty- soluja luokiteltiin positiivinen asia.

esto PES1 RNA interferenssin

vakaasti kaataa endogeenisen PES1 ilmaisua, käytimme lentivirus pakkaus shRNA ekspressiovektori ( ostettu GenePharma, Shanghai, Kiina) tartuttaa soluja. Kohdesoluja infektoitiin lentiviruksen 24-48 tunnin mukaan valmistajan ohjeiden. RNAi oligonukleotidit jota käytettiin kaataa endogeenisen PES1 lauseke on seuraava: PES1-RNAi-1, GGAACACTGTAGAGCGTTTAA; ja PES1-RNAi-2, GAAGATGCAGAGGCTGGTTCA.

Proliferaatiomääritys

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille alkuperäisen tiheys on 1,0 x 10

3 per kuoppa. Kullakin ajanhetkellä, solut värjättiin steriilillä MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetratsolium, 0,5 mg /ml, Sigma), 4 tuntia 37 ° C: ssa, minkä jälkeen poistettiin elatusaine ja lisäämällä 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO). Absorbanssi mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa, jonka aallonpituus on 490 nm. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksissä

Solut maljattiin 6-kuoppalevyille (1 x 10

3 solua per kuoppa) ja niitä viljeltiin kahden viikon ajan. Pesäkkeet värjättiin 0,5% kristallivioletilla 30 minuutin ajan sen jälkeen, kun kiinnitys metanolilla 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa.

Solusyklianalyysiä

Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitetty 75% etanolia (PBS: ssä) 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli pesty kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 0,1 mg /ml RNaasi (Sigma). 30 minuutin kuluttua 37 ° C: ssa, solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä (BD, Calibur). Solusyklin jakautumisen laskettiin Cell Quest ja Mod-fit ohjelmisto.

-tuumoriksenografti määritys

nu /nu-naaraita hiiriä (Vital River Laboratories, Peking, Kiina) välillä 7 ja 8 viikkoa käytettiin

in vivo

tutkimuksissa. Jokainen koeryhmä koostui 4-5 nude-hiirten. 4 × 10

6 solua 100 ui PBS: ää ihonalaisesti ruiskutetaan kainaloon nude-hiirten. Sen jälkeen 22 päivää hiiret olivat ajosuunta ja tuumorit poistettiin ja painotettu. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD hiirtä kussakin ryhmässä.

Geenien ilmentyminen mikrosirujen

RNA eristettiin solujen Trizol reagenssilla (Invitrogen) protokollan mukaisesti ehdottamia tarjoaja. Geeniekspressioprofiilien in PES1-vaiennetaan HCT116 ja ohjaus solut tutkittiin käyttäen Agilent Human Genome CGH Microarray 44K. Normalisoinnin jälkeen, taitos muutos ilmaisun laskettiin. AP-arvo alle 0,05 ja kertamuutosta kynnys 2 valittiin tunnistamaan tilastollisesti merkitsevä transkription muutoksia.

lusiferaasianalyysissä

analysoimiseksi promoottorin aktiivisuutta PES1, 5′-sivuava alue plus 172 bp: n transkriboidaan PES1 sekvenssi muodostettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: Forward, 5’CCGCTCGAGCTGGCATTATCCTGGAGTCAC-3 ’(Xhol-kohta alleviivattu), Reverse, 5’CCCAAGCTTGAAAAGAGTCGACCCCATGC-3′ (HindIII-alleviivattu). Monistettu fragmentti genomisesta DNA: HCT116-solujen insertoitiin pGL3-basic plasmidivektoriin ja tuloksena saatu plasmidi nimettiin pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). Lusiferaasireportteri plasmidit, pGLB-PES1 (-1413 /+ 172), pGLB-PES1 (-902 /+ 172), pGLBPES11 (-416 /+ 172), pGLB-PES1 (-315 /+ 172), pGLB-PES1 (-282 /+ 172), pGLB-PES1 (-274 /+ 172), pGLB-PES1 (-264 /+ 172), pGLB-PES1 (-254 /+ 172) ja pGLB-PES1 (-75 /+ 172 ) kertyi pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). pGLB-PES1-promoottori tai 5’-deleetiorakenteita kotransfektoitiin PRL-SV40 soluihin. Transfektion jälkeen 72 tuntia, solut kerättiin Passive Lysis Buffer (Promega) ja solulysaateista analysoitiin lusiferaasiaktiivisuuden kanssa Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) B

Solut kiinnitettiin 1% formaldehydiin 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja kerättiin kaapimalla. Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit hajotettiin 400 ul: aan lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 1% SDS: ää, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF: ää, 1 x proteaasi-inhibiittorit cocktail). Näytteitä inkuboitiin jäillä 10 min ja sonikoitiin neljä kertaa 15 sekunnin ajan kerrallaan välein 15 sekunnin saada kromatiinin fragmentteja noin 200-1000 bp: n nukleotidin. Näytteet sentrifugoitiin 12000 rpm, 4 ° C: ssa 10 min. Poistamisen jälkeen ohjaus alikvootti (20 ui supernatanteista laimennettiin 80 ul: aan laimennus- puskuria ja säilytettiin -20 ° C: ssa), supernatantit laimennetaan 9 tilavuudella ChIP laimennuspuskuria (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF: ää, 1 x proteaasi-inhibiittorit cocktail). Näytteet esi-inkuboitiin proteiini A /G-helmiä plus 10 ug lohen sperman DNA: ta 4 ° C: ssa 2 h, ja sitten sentrifugoidaan 1000 rpm, 4 ° C: ssa 2 min. Supernatantit inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 0,2 ug c-Jun-spesifisen vasta-aineen tai IgG, joka oli esi-inkuboitu proteiini A /G-helmiä ja 10 ug lohen sperman DNA: ta. Helmet pestiin sitten TSE I (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40), TSE II (0,1% SDS, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl), TSE III (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM LiCl: a, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% deoksikolaatti) puskurit kääntyä yhden kerran, minkä jälkeen pestiin kaksi kertaa TE-puskurilla (pH 8,0). Viimeisen pesun immunopresipitaatit eluoitiin ja kääntää silloitettu inkuboimalla yön yli 65 ° C: ssa eluutiopuskuria (1% SDS, 100 mM NaHCO

3). Sitten DNA puhdistettiin PCR-puhdistuskittiä (Qiagen, Hilden, Saksa). Eluoitu DNA PCR-monistettiin alukkeilla kattaa c-Jun-sitomiskohta PES1 promoottorin. Kromosomaaliseen DNA: han tulo ja ChIP-DNA-spesifisen IgG tehtiin sama PCR-monistusta. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia, ja havaitaan kautta ultraviolettivalotus. Seuraavia alukkeita käytettiin PCR: ään. Alukkeina c-Jun sitova (Primer-S, 139 emäsparin fragmentti, -363–225 alueelle PES1 promoottori), Forward pohjamaali, CTTGACAACGCAATCCTATCG; Käänteinen pohjamaali, CCTGATGACGATTCATTGACTGT; ja negatiivinen kontrolli alukkeita (Primer-N, 110 emäsparin fragmentti, -1473–1364 alueelle PES1 promoottori), Forward pohjamaali, CAACTAGCTGGGGTTACAGG; Reverse-aluke, GAGATCAGGAGTTTGAGAC. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: kanin polyklonaalista anti-c-Jun (H-79, Santa Cruz) ja kanin normaali IgG (Santa Cruz).

elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) B

Cells pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja kerättiin kaapimalla. Sentrifugoinnin jälkeen solujen pelletit suspendoitiin uudelleen 160 ul: ssa jääkylmää puskuria A (10 mM Hepes, 10 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF) ja inkuboitiin jäillä 20 min. Ja sitten toinen 40 ui puskuria A, joka sisälsi 2,5% NP-40 lisättiin näyte ajoittain vorteksoimalla 10 s. Sentrifugoinnin jälkeen 12.000 rpm 4 ° C: ssa 5 min, solupelletit suspendoitiin uudelleen 40 ui jääkylmää puskuria B (20 mM Hepes, 400 mM KCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) ja pantiin jäillä ajoittainen vorteksoimalla 25 minuutin ajan. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla. Sisältäviä supernatantteja ydin- proteiinia säilytettiin -70 ° C: ssa. Sitoutumismääritykset suoritettiin inkuboimalla 8 ug ydin- proteiinin sitoutumisen puskuriin (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM KCI, 1 mM DTT: tä, 10 ug lohen sperman DNA: ta), 30 fmol biotiini-leimattujen oligonukleotidien kanssa lopullisessa tilavuudessa 20 pl 20 min huoneen lämpötilassa. Kylmä kilpailu, 1000-kertainen ylimäärä leimaamatonta oligonukleotidien lisättiin sitova reaktio 20 min ennen kuin lisättiin leimatun oligonukleotideja. Sillä supermuutoksena määrityksiä, 0,1 ug vasta-ainetta inkuboitiin sitovia seoksia, jotka sisältävät 10 fmol biotiini-leimattu koetin 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. DNA-proteiini-kompleksit erotettiin elektroforeesilla 6% luonnonmukaisella polyakryyliamidigeelillä 0,5 x TBE: ssä 100 V: ssa 180 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Geelit siirrettiin sitten positiivisesti varatulle nylonmembraanille. Sitoutunut koettimet tehtiin näkyviksi HRP-konjugoitua streptavidiinia ja kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Kemiluminesenssiin nukleiinihapon havaitseminen pakki). Oligonukleotidikoettimista käytetään EMSA olivat seuraavat: Probe1, CTTCCGCCCCTCTCCGTCCCAACATGCAAC (-284 /-255 sekvenssin PES1-promoottori); Probe-W (sisältävät aiemmin tunnistettu villin tyypin c-Jun sitova sekvenssit), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCTGACTCACCCGGGCCCGGG; Probe-Am (sisältäviä mutatoitu AP-1 sitovia sekvenssejä), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCGTCGGATCCCGGGCCCGGG [24]. Koettimet syntetisoitiin ja leimattu biotiinilla SBS Genetech (Peking, Kiina). Täydentävä oligonukleotidit 20 mM Tris (pH 7,6), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, ja 1 mM DTT.

Reaaliaikainen RT-PCR

solun totaali-RNA uutettiin soluista, joissa TRIzol reagenssia (Invitrogen), ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen IMPROM-II ™ Reverse Transcription System (Promega). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin ABI StepOne Real-Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Suhteellinen geenin ilmentymistä laskettiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmää seuraten valmistajan ohjeita. Housekeeping geeni glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin

(GAPDH) B käytettiin sisäisen valvonnan normalisoida

PES1

mRNA ilmaisun. Seuraavia alukkeita käytettiin:

PES1

, eteenpäin CCCAAGCAGAGGCAAAGG, käänteinen CTGACATCTCCCCATCGG;

c-Jun

, eteenpäin CGCCCCTGTCCCCCATCG, käänteinen TGTGCCACCTGTTCCCTG;

GAPDH

, eteenpäin CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG, käänteinen CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG. Alukkeet kvantitatiivisen RT-PCR validoida tulokset Microarray lueteltiin taulukossa S1.

Tilastollinen

Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Kahden pyrstö riippumatonta-näyte

t

testiä käytettiin määrittämään merkitystä erot eri koeryhmään. Korrelaatio c-Jun ja PES1 paksusuolen syövän kudoksissa analysoitiin Pearsonin korrelaatiokerrointa SPSS-ohjelmiston. Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä P 0,05.

Tulokset

PES1 yliekspressoituu paksusuolensyöpä

ensinnäkin syntyy kolme monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) tunnistamaan ihmisen PES1. ELISA: lla ja Western blot-analyysi, nämä kolme mAb: t osoitettiin sitoutua spesifisesti GST-PES1 proteiinia, mutta ei GST (Fig. S1A ja S1B). Lisäksi nämä mAb: t voivat tunnistaa endogeenisia PES1 Western blot määrityksessä (kuvio. S1C). Seuraavaksi vahvistettiin spesifisyys mAb 3B1 analysoimalla kokosoluliuotteista valvonta- ja PES1 shRNA transfektoitiin AGS mahalaukun syöpäsoluja. Proteiini vyöhyke, joka vastaa odotettua molekyylikoon PES1 (69 kD) oli ablatoitu lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) vastaan ​​PES1 (Fig. S1D). Lisäksi olemme osoittaneet, että mAb 3B1 voitaisiin hyödyntää ELISA, Western blot ja immunosytokemia analyysi suurempi herkkyys ja affiniteetti, verrattuna kaupallista vasta-ainetta (kuvio. S1E-G).

ekspression tutkimiseksi PES1 paksusuolen syövän kudoksissa, teimme immunohistochemistical analyysi ihmisen paksusuolen syövän kudosten ja sovitettu viereisiin kudoksiin mAb 3B1. Kuten kuviossa 1A ja 1B, PES1 osoitti vahvaa tumavärjäystä (ruskea ytimet) syöpäsoluissa ja imusolmukkeiden, vastaavasti. Niistä 265 paksusuolensyöpä kudoksiin, 89 (33,6%) olivat positiivisia PES1 ilmaisua, kun taas vain 2,7% (7/265) vierekkäisten kudosten osoitti PES1 värjäytymistä (Fig. 1 E). Ero PES1 ilmaisun välillä paksusuolensyöpä kudosten ja ei-syöpä kudoksiin oli merkittävä (P 0,001). Lisäksi 20/40 (50%) imusolmukkeiden myönteisesti PES1 värjäytymistä, myös huomattavasti korkeampi (P 0,001) kuin ei-syöpä kudoksiin. Näin ollen, nämä tulokset osoittivat, PES1 ekspressio oli säädelty ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin.

immunohistokemiallinen analyysi PES1 ilmentymisen ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin. Luvut osoittavat vahvasti ytimet värjäytymisen PES1 paksusuolen syövän kudoksissa (A) ja imusolmukkeiden (B). Negatiivinen värjäys PES1 ei-syöpäkudoksiin vieressä kasvain on esitetty (C). Normaalin hiiren IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina paksusuolensyöpä kudosten ja esitetään (D). Edustavia alhainen (x 100) ja korkea (x 400) suurennus näytetään. (E) Yhteenveto PES1 ilmentymistä ihmisen paksusuolen syövän kudoksissa, sovitettu viereisiin kudoksiin, ja imusolmukkeet. osoittaa merkittävää eroa paksusuolensyöpä vs. Hyväksytty viereiseen kudokseen. b ilmaisee merkittävää eroa imusolmukkeiden vs. viereisten noncancerous kudoksiin.

PES1 edistää paksusuolen syövän solujen lisääntymistä ja kasvua

in vitro

ja

in vivo

tutkimiseksi biologinen toiminta PES1 patogeneesissä paksusuolen syöpä, lentivirus–välitteinen vakaa ablaatio PES1 suoritettiin HCT116, RKO, ja SW480 paksusuolen syöpäsoluja, jossa on kaksi paria shRNAs. Molemmat shRNA tehokkaasti vaiennettu endogeenistä PES1 näissä solulinjoissa (Fig. 2A). In vitro paljasti, että ehtyminen endogeenisen PES1 johtanut merkittävään estoja solujen lisääntymisen (Fig. 2B) ja pesäkkeiden muodostumista (Kuva. 2C). Solusyklianalyysiä osoitti lisäksi, että solut pyrkivät kasaantumaan G1 vaiheessa, mutta vähemmän S-vaiheessa, kun PES1 ablaatio (Fig. 2D), osoittaa G1 /S pidätykseen. Ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa vakaassa tasot apoptoottisten solujen välillä ohjaus shRNA ja PES1-specific shRNAs-transfektoiduissa soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi olemme inokuloitiin PES1-ablatoitu HCT116 ja RKO-soluja nude-hiiriin vaikutuksen tutkimiseksi PES1 on ksenograftin kasvaimen muodostumisen. Kuten on esitetty kuviossa. 2E, vaimentaminen PES1 esti kasvaimen kasvua

in vivo

.

(A) Western blot analyysi PES1 proteiinia HCT116, RKO, ja SW480-solut transdusoitiin shRNA-ohjaus ja PES1 shRNA rakentaa ( PES1-shRNA-1 ja PES1-shRNA-2), vastaavasti. (B) kasvukäyrät osoitti solujen transdu- PES1 shRNAs, kuten tutkittiin MTT-määrityksellä. Arvot esitetään edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) vaiennettu PES1 laski pesäkkeen muodostumista. Kuvat osoittavat tulokset pesäkkeiden muodostumista määrityksessä soluja levyn (vasen paneeli). Suhteellinen pesäkemäärät (oikea paneeli) saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) vaiennettu PES1 johti solusyklin pysähtymiseen. Kvantitointi solu- syklin jakaumat oli peräisin kolmen erillisen kokeen. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD. (E) hiljentäminen endogeeniset PES1 estää kasvaimen kasvua HCT116 ja RKO solu nude-hiirissä. Oikea paneeli esittää kasvaimen paino shRNA-ohjaus ja shRNA-1. Arvot esitetään edustavat keskiarvoja ± SD.

perehtyä PES1 n biologisiin toimintoihin, suoritimme mikrosiruanalyysi kanssa PES1 vakaasti vaiennetaan HCT116-solut ja ohjaus soluja. Geenit saman kuvion muutoksia sekä shRNA-1- ja shRNA-2-transfektoidut solut kyytiin. Kaikkiaan 633 geenien havaittiin olevan toisin ilmaista (joko 2 kertainen lisäys tai vähennys) päälle PES1 vaiennettu, mukaan lukien 305 säädelty ja 328 alas geenien. Bioinformatical analyysi suoritettiin tunnistaa reitit vaikuttavat PES1 ablaatio Gene ontologia Analysointityökalu (Fig. S2A). Nämä toteutustavat rankattiin mukaan merkitystä (P-arvot). Yhdenmukainen tulosten funktionaalista analyysia, geenit liittyvät valvontaan solujen lisääntymistä muodostavat pääosan luokka vaikuttaa PES1 ablaatio (Fig. S2A). Sitten tutkittiin ilmentymistä neljä alas geenien (

Bcl2

,

fgf9

,

satb1

, ja

avp

) ja neljä ylöspäin geenien (

id3

,

MSX2

,

gdf11

, ja

Smad3

) kvantitatiivisen RT-PCR: HCT116 ja SW480-soluissa, ja vahvistivat tulokset mikrosiruanalyysi (Fig. S2B).

PES1 ilmentymistä säätelee c-Jun koolonkarsinoomasoluissa

Olimme kiinnostuneita selvittää tekijä (t) ohjaamalla PES1 yli-ilmentymisen paksusuolensyöpä kudoksissa . Alustavat tiedot osoittivat, että oli korkeampi PES1 mRNA: n ekspression paksusuolensyöpä kudoksissa kuin ottelun viereisiin kudoksiin, mutta ei ole vapautuneilla metylaatio havaittiin promoottorialueen PES1 geeni (tietoja ei esitetä). Lisäksi useita mahdollisia transkriptiotekijän sitoutumiskohtien PES1 promoottorin todettiin, mukaan lukien aktivaattori proteiini-1 (AP-1) sitoutumiskohtiin. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää transkription säätelyyn PES1, 2060 bp: n 5′-sivuavan sekvenssin PES1 geenin ja 172 bp: n transkriboidun sekvenssin kloonattiin HCT116-solut ja subkloonattiin pGLB lusiferaasireportteriplasmidi. Me tutkimme seuraavaksi, onko AP-1 voi säädellä PES1 transkription. Transkriptiotekijä AP-1 koostuu useista osista, kuten c-Jun, JunB, JunD ja c-Fos, jotka muodostavat homo- tai hetero- dimeerin sitoa promoottorisekvenssit alavirran geenien [25]. Asetus näistä AP-1 alayksiköiden on PES1 promoottori tutkittiin lusiferaasireportterilla määrityksessä. PGLB-PES1-promoottori (-2060 /+ 172) oli ko-transfektoitiin c-Jun, JunB, JunD tai c-Fos osaksi HCT116 ja SW480-soluja, jonka ilmentyminen on vahvistanut Western blot (kuvio. 3A). PES1 promoottorin aktiivisuus suuresti kasvanut c-Jun, mutta vähän muiden alayksiköiden (Fig. 3B). Testasimme myös synergistisiä vaikutuksia c-Jun: sta ja c-Fos on PES1 promoottorin aktiivisuutta. Tätä varten, pGLB-PES1-promoottori (-2060 /+ 172) oli ko-transfektoitiin c-Jun ja c-Fos. Lusiferaasiaktiivisuus aiheuttama kotransfektoimalla kanssa c-Jun ja c-Fos ei merkittävästi lisääntynyt ja jopa pienempi kuin, että c-Jun yksinään (Fig. 3B), mikä viittaa siihen, että hetero- välillä c-Jun: sta ja c-Fos on riittämätön edistää promoottorin aktiivisuutta PES1. Fosforylaatio seriini-63 ja Serine-73 NH

2-terminaalin transaktivaatiodomeenin c-Jun by JNK (c-Jun NH

2-terminaali kinaasien) on välttämätön transkriptionaalista aktiivisuutta c-Jun [ ,,,0],26]. Olemme huomanneet, että korvaaminen näiden seriinijäännösten alaniineilla (c-Jun-S63A /S73A) suuresti heikentynyt fosforylaation (Fig. 3C) ja PES1 promoottorin aktiivisuutta (Fig. 3d), mikä viittaa siihen, että fosforylaatio c-Jun on kriittinen aktivoimiseksi PES1 ilme.

(A) Western blot analyysi havaitsemiseksi kohdunulkoinen c-Jun, JunB, JunD ja c-Fos in HCT116 ja SW480-soluissa. GAPDH näkyy latauskontrollina. (B) lusiferaasireporttiterilla määritys paksusuolen syöpäsoluissa. pGLB-PES1-promoottori (-2060 /+ 172) kotransfektoitiin kanssa osoitti plasmidit HCT116and SW480-soluihin. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Tyhjän vektorin käytettiin kontrollina ja suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus asetettu 1. (C) ilmentäminen villityypin ja c-Jun-S63A /S73A in HCT116 ja SW480-soluissa. Fosforylaatiota c-Jun havaittiin myös. (D) pGLB-PES1-promoottori (-2060 /+ 172) oli ko-transfektoitiin c-Jun tai c-Jun-S63A /S73A osaksi HCT116 ja SW480-soluja, sitten reportteri-määritys suoritettiin, kuten (B).

c-Jun säätelevät PES1 promoottorin aktiivisuutta suoraan sitovia PES1 promoottorin

kartoittaa c-Jun-sitoutumiskohdan on PES1 promoottorin, sarja 5′-deleetio mutanttia ja analysoitiin kotransfektiojärjestelmää c-kesäkuu Verrattuna alueen -2060 /+ 172, lisädeleetio,

eli

-1413 /+ 172, -902 /+ 172, -416 /+ 172, -315 /+ 172, -282 /+ 172, ja -274 /+ 172, ei merkittävästi muuta reportteriaktiivisuutta, mutta lisädeleetio -274–264 aiheutti -80% vähennys lusiferaasiaktiivisuudessa (Fig. 4A). Samalla olemme analysoineet deleetiomutantteja ilman eksogeenisen c-Jun, ja totesi myös, että poistetaan -274–264 vähensi huomattavasti reportteri aktiivisuus (Fig. 4A) .Nämä tiedot viittaavat siihen, -274 /-264 on mahdollinen c -Jun sitoutuva sekvenssi on PES1 promoottori. Seuraavaksi me suorittaa kromatiinin immunosaostuksella (chip) määritys perustelemaan c-Jun: n sitoutumisesta PES1 promoottori. Kuten on esitetty kuviossa.