Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohonneita immuniteettiä sytokiinin TGF-β1 syövän ja HIV-infektion on liitetty tukahduttaminen suojaavia immuunivasteita. Kopioinnin säätely TGF-β1 on monimutkainen ja vielä täysin ymmärretä. Me raportoimme tässä ensimmäistä kertaa, että transkriptiotekijän GLI2 säätelee TGF-β1 ihmisen CD4

+ T-soluja.

In silico

seulonta paljasti viisi novel otaksuttu GLI sitoutumiskohtia ihmisen

TGF-β1

promoottori. Ainakin kaksi näistä sivustojen ihmisen

TGF-β1

promoottori säätelee GLI2 aktivaattori kuin knockdovvn

GLI2

sääntelyn CD4

+ CD25

hi T-soluja, korkea tuottajat TGF-β1, merkittävästi vähentynyt

TGF-β1

transkriptio. Lisäksi naiivit CD4

+ T-solujen, alhainen tuottajat TGF-β1, lisäsivät perustason on

TGF-β1

mRNA seuraavat lentiviraalinen infektion GLI2. Transkriptionaalinen säätely

TGF-β1

by GLI2 on uusi laajennus Sonic Hedgehog (SHH) ja

TGF-β1

rajat sääntelyä ja voi antaa käsityksen haitallista korkeus TGF-β1 mikä patogeneesi syövän ja HIV-infektion.

Citation: Furler RL, Uittenbogaart CH (2012) GLI2 Säätelee TGF-β1 Human CD4

+ T Cells: Implications in Cancer ja HIV patogeneesi. PLoS ONE 7 (7): e40874. doi: 10,1371 /journal.pone.0040874

Editor: Derya Unutmaz, New York University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 31 heinäkuu 2012

Copyright: © Furler, Uittenbogaart. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health AI-081636 ja AI-028697 (University of California Los Angeles, Center for aIDS Research), joka on Jonsson Kattava Cancer Center Seed Grant, ja Stein Oppenheimer Endowment palkinnon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) on pleiotrooppinen sytokiini, joka säätelee immuunivasteen monien sairauksien kuten syövän ja HIV-infektio, ja sillä on tärkeä rooli estää synnyssä [1] – [5]. Se valmistetaan useita solutyypit, kuten CD4

+ CD25

hi säätelevien T-solujen, makrofagien, sekä fibroblasteissa. TGF-β1 vähentää leviämisen T- ja B-lymfosyyttien, efektoritoimintojen monia soluja immuunijärjestelmän ja indusoi perifeeristen säätelijä-T-solujen [6]. Vaikka TGF-β1 on kriittinen koko nisäkkään kehitykselle ja estää poikkeavan aktivaation isännän immuunijärjestelmää, kohonnut TGF-β1 voi heikentää suojaavia immuunivasteita kasvaimia ja tulehduksia.

Poikkeava korkean TGF-β1 by pahanlaatuisten solujen havaittiin lisäävän etäpesäkkeitä sekä estää suojaavan isännän immuunivasteen kasvaimia [7]. Kroonisen HIV-infektio, TGF-β1 on kohonnut useita osastoja, kuten imukudoksen, verta, ja aivo-selkäydinnesteessä [8] – [10]. Kohonneeseen TGF-β1 voi aiheuttaa kehittämiseen aiheuttama (i) Treg havaittiin kroonisessa HIV-infektion [11], [12], ja ne voivat edistää toimintahäiriö immuunijärjestelmän aikana myöhäisvaiheen tauti. HIV-1: n Tat-proteiinin indusoi TGF-β1 ihmisen leukosyyteissä [13] – [15], kondrosyyttien [16], ja myös hiiren CD2

+ T-solut on Tat-siirtogeenisen hiiren mallia [17]. Mekanismeja kasvainten aiheuttaman ja Tat-välitteisen TGF-β1 induktio ei tunneta. Syöpä ja aids ovat vain kaksi monista sairauksia, joissa TGF-β1 on rooli synnyssä.

Expression aktiivisen TGF-β1 on tiukasti säännelty transkription, translaation ja translaation jälkeiset tasot. Vaikka TGF-β1 ilmentyminen on ollut kiivasta tutkimuksen, olemme vielä kaukana ymmärtämään tämän sytokiinin monimutkainen sääntely.

In silico

analyysi TGF-β1 promoottorialueen osoittaa useita oletetun sitoutumiskohtia tunnettujen transkriptiotekijöiden. Jotkut näistä transkriptiotekijöiden, kuten Sp-1 ja Zf9, on aiemmin havaittu välittävän

TGF-β1

transkriptio, mutta nämä tekijät eivät yksin riitä aiheuttamaan mRNA ilmaisun [18], [19]. Siksi tutkimme johon muut transkriptiotekijät indusoivat TGF-β1 mRNA.

Olemme löytäneet kuusi otaksuttu sitoutumiskohtia (viisi aiemmin ilmoittamattoman) ihmisen GLI transkriptiotekijöiden mukaan

in silico

analyysi ihmisen

TGF-β1

promoottori. GLI2 transkriptiotekijä on yksi tärkeimmistä alavirran efektorit Sonic Hedgehog (SHH) reitti, joka on osoitettu olevan rooli funktiona hankittu immuniteetti [20], [21]. SHH polku säätelee aktivointi [22], leviämisen [23], [24], ja sytokiinien sääntely [25] CD4

+ T-soluja. Koska useat vuorovaikutukset TGF-β1 ja SHH väyliä olemassa (taulukko 1), olemme keskittyneet sääntelyä TGF-β1 by SHH koulutusjakson perheenjäsenten eli GLI proteiinit, immuunijärjestelmän.

todisteita siitä, että ainakin kaksi kuudesta oletetun GLI-sitoutumiskohtia tarvitaan GLI2-välitteisen transkription säätelyyn ihmisen

TGF-β1

promoottori. Ainakin yksi näistä kahdesta sivustojen tulee toimia tarkkailla TGF-β1 sääntelyä GLI2. Lisäksi lakkauttamalla

GLI2

ihmisen CD4

+ CD25

hi Treg, osoitamme, että GLI2 tarvitaan TGF-β1 ilme. Transkriptionaalinen säätely

TGF-β1

by GLI2 ei ole vielä kuvattu ja lisää ymmärrystämme monimutkaisia ​​

TGF-β1

sääntelyä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

käyttö anonyymi perifeerisen veren mononukleaaristen solujen saamiseksi T-solujen ja epiteelin 293T solulinja tarkasteli käyttäjä UCLA Institutional Review Board (IRB), jossa todettiin, että tämä toiminta ei liittynyt ihmisillä, ja siksi ei vaatinut IRB tarkastelun tai varmentamista.

in Silico seulonta

seulonta luulotellun GLI sitoutumiskohdista ihmisen

TGF-β1

promoottorit tehtiin

in silico

analysoinnin ohjelmalla ohjelmaa Matlnspector (https://www.genomatix.de). Valikoima kaksikymmentä kiloemäksen ympäröi ensimmäistä ihmisen

TGF-β1

promoottorin käyttää seulomaan oletetun transkriptiotekijän sitoutumiskohtia. Kaikki kuusi otaksuttu GLI sitoutumiskohdista ensimmäisten kiloemästä on

TGF-β1

promoottori # 1 (viisi mahdollista sivustoja) tai promoottori # 2 (yksi potentiaalinen sivusto) oli matriisi samankaltaisuuspistemäärä yhtä suuri tai suurempi kuin 0,8. Sitoutumiskohtien tavataan ensimmäisen proksimaalisen promoottorialue ovat uusia ja ovat tämän tutkimuksen.

Luciferase Promoottori Tutkimukset

Ihmisen

TGF-β1

promoottori-lusiferaasireportterista konstruktioita, phTG5 ja phTG1, oli ystävällisesti S.J. Kim [18]. Villityypin phTG5 konstrukti mutatoitua putatitve GLI sitoutumiskohdat (site A, B, tai A ja B) käyttäen kohdennetun mutageneesin (sivusto: 5′-CAGCCCCCCCATGCC-3 ’5’-CAGCaaCaaaATGC-3′, sITE B: 5′-GAGCCCGCCCACGCGA-3 ’5’-GAGCaaGaaaACGCGA-3′, mutatoitunut emäkset pienillä kirjaimilla). Villityypin phTG1 konstrukti mutatoitu oletetun GLI sitova Site E käyttäen kohdennetun mutageneesin (site E: 5′-CCCACCACCCACGAA-3 ’5’CCaAaaAaaaACGAA-3′, mutatoitunut emäkset pienillä kirjaimilla). Villityypin promoottorin mutatoitu promoottorit, tai pGL3 tyhjä vektori ohjaus yksilöllisesti kotransfektoidaan kanssa konstitutiivinen aktivaattorin vektori pGLI2ΔN (ystävällisesti toimittanut E. Roessler [26]) tai kontrolli pcDNA3 Lipofectamine 2000 käyttäen standardimenetelmiä osaksi 293T-solut, ihmisen epiteelisolulinjaa, jotka sisältävät Adeno ja SV-40-viruksen DNA-sekvenssejä, saatu American Type Culture Collection (ATCC). PGLI2ΔN plasmidi sisältää konstitutiivisesti aktiivinen GLI2-geenin, koska aminopään katkaisu. Aminoterminaalinen domeeni ihmisen GLI2 geeni on tukahduttavan funktion, ja se on poisto on osoitettu lisäävän transkription alavirran kohdegeenien, kuten GLI1 [26]. 293T solulinja valittiin, koska sen transfektion tehokkuuden ja alhainen GLI1 ilmaisun, joka on meidän lukema varten GLI2 aktivointia. Lusiferaasiekspressiota mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Cell eristäminen, Culture, Stimulaatio

Aiemmin hoitamattomat CD4

+ T-solut, jotka ilmentävät CD4, CD31, CD45RA, ja CD62L, puhdistettiin ja eristettiin ihmisen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC), käyttämällä negatiivista valintaa. CD4

+ CD25

hi säätelijä-T-solut rikastettiin ihmisen verestä käyttäen RosetteSep ja Robosep sarjat Stem Cell Technologies. Ensisijainen soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa, joka koostuu Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan, jota oli täydennetty lipidit on poistettu ja BSA: ta (Sigma-Aldrich), 1100 ug /ml, ihmisen transferriiniä (Sigma-Aldrich) on 85,5 ug /ml, 2 mM glutamiinia, ja penisilliini /streptomysiiniä 25 U /25 ug /ml. Kaikki stimulaatio olosuhteet ensisijainen T-solut tehdään αCD3 /αCD28 päällystetty M-450 helmiä Invitrogen. Solun pinnalla ja solunsisäisiä immunofenotyypeissä oli validoitu virtaussytometrialla, kuten on kuvattu aiemmin [27]. Toteamiseen solunsisäisen FoxP3 solut ensin värjättiin solun pinnan markkereita, kiinteät ja läpäiseviksi eBioscience suositellaan puskurit valmistajan ohjeiden mukaisesti, inkuboitiin sitten FITC tai eFluor 450 konjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita FoxP3 (eBioscience, klooni PCH101).

siRNA knockdown

knockdovvn

GLI2

primaarisissa ihmisen säätelijä-T-solujen tehtiin käyttämällä Accell siRNA suunnitellut ja vahvistanut ThermoFisher /Dharmacon. Ei-kohdistaminen siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Positiivinen kontrolli siRNA GAPDH käytettiin tarkistaa knockdown. Knockdovvn GLI2 tehtiin käyttäen kaupallisesti saatavilla ja validoitu siRNA päässä Dharmacon (A-006468-14 – Target sekvenssi – 5 ’GGUUUGAAUCUGAAUGCUA 3’). Erillinen riippumaton negatiivinen kontrolli käyttämällä salatun

GLI2

siRNA-sekvenssin (5’AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ’) käytettiin käsitellä off-tavoite vaikutuksia.

GLI2

Knockdown varmistettiin arvioimalla

GLI1

mRNA: n ilmentymisen stimulaation jälkeen. GLI1 on aiemmin osoitettu olevan transkriptionaalisesti säätelevät GLI2 ja on positiivinen kontrolli varten

GLI2

knockdown.

Puhdistettu CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ säätelijä-T-solujen inkuboitiin siRNA ja seerumitonta Accell väliaineessa (Dharmacon) 72 tunnin ajan ennen stimulaatiota αCD3 /αCD28 päällystettyjä helmiä. Kaksikymmentäneljä tuntia stimulaation jälkeen, solut kerättiin mitata

TGF-β1

-mRNA-tasojen RT-PCR: llä. TGF-β1 tasot normalisoituivat

18S rRNA

ja verrattuna stimuloimattoman soluihin.

RT-PCR

Taqman Gene Expression pohjamaali /koetin sarjat

TGF-β1 , GLI1

, 18S rRNA ja

GAPDH

Applied Biosystems Inc. käytettiin mittaamaan selostukset tasot erilaisissa olosuhteissa. Ilmaisu on

TGF-β1, GLI1

, ja

GAPDH

normalisoituivat 18S rRNA tasoja ja suhteellinen ilmentyminen olosuhteiden välillä laskettiin arvioida upregulation /downregulation transkription.

lentiviruksen Infektiot

GLI2ΔN

siirtogeeni laitettiin kolmasosa sukupolven HIV-1-vektorin UCLA Vector Core. Suurin osa HIV viruksen koodaava sekvenssi poistettiin, ja korvattiin siirtogeeni. LTR: t muutettiin olla ”itse-inaktivoivan” ja transkription vektorin genomin pakkaus solut ajettiin ei-HIV-promoottori. Virus tehtiin käyttämällä 293T-soluja, jotka oli ko-transfektoitiin vektorilla plasmidi ja kolme muuta plasmidit koodaavat A) viruksen entsyymejä ja rakenteellisia proteiineja, paitsi Env, B) Rev, joka on mukana HIV RNA liikenteen, ja C) VSV glykoproteiini, joka on yleiseurooppalainen trooppinen kirjekuori, jonka avulla virus pääsyn lähes mihin tahansa soluun tyyppi. Naiivi CD4

+ T-solut infektoitiin 100 ng p24 miljoonaa solua kohden seerumittomassa väliaineessa 96 tunnin ajan. RNA eristettiin määrittämiseksi muutoksia geenien ilmentyminen käyttäen RT-PCR: ää. GFP sisältävä lentivirus käytettiin negatiivisena ohjaus ja myös mitata infektiotehokkuus.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

ChIP analyysi tehtiin sen määrittämiseksi, GLI2 sitoutuu

TGF-β1

promoottori. Regulatory CD4

+ CD25

hi-T-solujen negatiivisesti eristettiin edellä kuvatulla tavalla. solut stimuloitiin αCD3 /αCD28-päällystettyjä helmiä yön yli. GLI2 ExactaChIP Kit (R 290 bp: n kappale).

Bcl2

promoottorialueen havaittiin positiivisena GLI-sitova ohjaus käyttäen alukkeita ExactaChIP kit. 238 bp: n alueella

IL-10

promoottori, joka ei sisältänyt oletetun GLI2 sitoutumiskohdan mitattiin negatiivisena kontrollina (5′-TGATTTCCTGGGGAGAACAG-3 ’ja 5′-CCCACCCCCTCATTTTTACT-3’).

on kaksi raportoitu promoottorit ihmisen

TGF-β1

geeni.

In silico

analyysi ihmisen

TGF-β1

proksimaalisen promoottorin alueille käyttäen Genomatix ohjelma paljasti viisi aiemmin tunnistamattomia otaksuttu GLI-sitoutumiskohtia (A-E) on erittäin konservoitunut alue ihmisen genomin. Site F toinen promoottori on aikaisemmin tunnistettu ja tutkittu [28]. Sivustoja A ja B (joka menee päällekkäin C), kaikki sijaittava lusiferaasireportteri- konstrukti phTG5 käytetty promoottori mutageneesitutkimukset. Site E on läsnä phTG1 konstruktio. Arvioitu emäsparin asennot mahdollisia GLI sitoutumiskohtien näytetään suhteessa kahteen raportoitu transkription aloituspaikkoja ihmisen

TGF-β1

geeni.

samanaikainen immunosaostus

Co-immunopreciptation arvioimiseksi suoritettiin sitovat ihmisen GLI2 HIV-1 Tat. Dual transfektiot tehtiin 293T-soluissa käyttäen kolmea eri sarjaa plasmideja: (GLI2-6xMYC + HIV-1: n Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3-ohjattu), (HIV-1: n Tat-FLAG + pcDNA3-ohjaus). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut hajotettiin ja vapautuneita proteiineja kerättiin yhteistyössä IP (Pierce Co-IP Kit Thermo Scientific). Agaroosi hartsi on päällystetty yhdellä kolmesta vasta-: Sigma F1804 anti-FLAG M2-vasta-ainetta (sitoutumaan Tat jalkaosaan), CST 71D10 anti-MYC-vasta-ainetta (sitoutua GLI2 jalkaosaan), tai isotyyppikontrolli-vasta-ainetta. Sen jälkeen co-tutkimusajanjakson eluointien ajettiin SDS-PAGE geelillä seuraa Western blotting -tekniikalla.

Tilastot

Kaikki analyysit suoritettiin UCLA AIDS Institute Biostatistics Core tai GraphPad Prism 5 Software . Muuttujat ilmaistiin tarkoittaa standardin keskivirhe. ANOVA ja kaksisuuntainen Wilcoxonin Rank summa testi, pariksi tarvittaessa käytettiin analysoimaan eroja väestön. P-arvo pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Kuusi Otaksuttavat GLI toutumiskohtiin sijoituttava Human

TGF-β1

Promoottorit

kautta

in silico

analyysin avulla Matlnspector (https://www.genomatix.de) löydettiin kuusi otaksuttu GLI sitoutumiskohtien kahden raportoitu ihmisen

TGF-β1

promoottorit, kuten aiemmin raportoitu sivustolle toinen promoottori [28] lisäksi viisi kohdetta, jotka olivat aiemmin tunnistamattomia. Sekä Genomatix ohjelmisto ja UCSC genomin (www.genome.ucsc.edu) ohjelmat osoittavat suurta sekvenssin säilyttäminen ympäröivä

TGF-β1

promoottorialueen nisäkkäillä mikä viittaa toiminnallisen merkitystä ihmisen

TGF -β1

promoottorit. Konsensus sitova sekvenssi GLI transkriptiotekijöiden on havaittu 5′-TGGGTGGTC-3 ’[29], [30]. Kuusi otaksuttu GLI sitoutumiskohtia tässä tutkimuksessa on korkea-asteen matriisin samankaltaisuuden

43 ja on lueteltu kuviossa 1. runsaus mahdollisia GLI sitoutumiskohtien ensimmäisten tuhat emäsparia transkription aloituskohdasta, että

TGF-β1

promoottori viittaa siihen, että tämä proksimaalinen promoottorialue voidaan säädellä GLI transkriptiotekijät.

GLI2 käynnistää ensimmäisen Human

TGF-β1

promoottori kautta ainakin kaksi Oletetusta GLI-sitoutumiskohtien

oletetun GLI sitoutumiskohta toisen TGFp-1-promoottori on raportoitu olevan ei-reagoivat SHH stimulaation Eichenmuller

et al.

[28]. Kuitenkin viisi mahdollista aluetta ensimmäisellä promoottori ei ole aiemmin raportoitu säänneltävä GLI proteiineja. Käytimme reportteri-konstrukti, joka sisältää ensimmäiset 500 emäsparia ihmisen TGF-β1-promoottorin, joka on sijoitettu ylävirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geenin Kim

et al.

(PhTG5) [18]. Tämä ekspressiovektori transfektoitiin 293T-soluihin yhdessä konstitutiivinen GLI aktivaattori rakentaa pGLI2ΔN [26], tai pcDNA3-plasmidin ohjaus arvioida GLI2-säätelyyn promoottorin ihmisen TGF-β1-geenin.

ihmisen

TGF-β1

promoottorialueen laitettiin pGL3-basic sivektorissa. (A) Kolme GLI sitoutumiskohtien tällä alueella (Sites A, B, ja C) mutatoitiin erikseen tai yhdessä (WT = villityyppinen

TGF-β1

promoottori phTG5, MUT-A = site Mutaatio , MUT-B = sivustot B /C mutaatio, MUT-A /B = sites A /B /C-mutaatio, pGL3 = ohjaus vektori). Nämä

TGF-β1

promoottori: lusiferaasi konstruktit transfektoitiin 293T-soluihin kanssa konstitutiivisen GLI aktivaattori (GLI2dN) ja normalisoitiin negatiivisen kontrollin (pcDNA3). GLI aktivaattori indusoi nelinkertainen lisäys lusiferaasin aktiivisuuden phTG5 kontrolliin verrattuna. Mutaatio molempien GLI sitoutumiskohtia (phTG5AB) kumosi tämän induktion (n = 10, * p = 0,0011, ** p = 0,0033). (B): n oletettu GLI sitova Site E mutatoitiin reportteriplasmidilla phTG1 (WT = villityyppi-TGF-1: n promoottori phTG1, MUT-E =-sivu E-mutaatio, pGL3 = kontrollivektori). GLI aktivaattori indusoi kuusi-kertainen lusiferaasiaktiivisuuden phTG1 kontrolliin verrattuna. Mutaatio GLI sitoutumiskohdan E laski tämän induktion noin kaksinkertaiseksi (n = 12, *** p = 0,0025).

jälkeen kotransfektoimalla GLI2ΔN ja phTG5 293T-soluihin, olemme havainneet noin 4-kertainen nousu lusiferaasin ilmentymistä kontrolleihin (kuvio 2). Koska promoottorialueen phTG5 sisältää kolme kuudesta oletetun GLI sitoutumiskohtia (A, B, C) käytettiin kohdennettua mutageneesiä muuttua näiden oletettujen GLI sitoutumiskohtia yksittäin tai yhdistelmänä (merkitty phTG5A, phTG5B, ja phTG5AB vastaavasti ). Vaikka mutaation kanssa single-site vain vähän pienentää lusiferaasin ilmentyminen, mutaatio sekä sivustojen vähentää reportterigeenin ilmentymisen alas ohjaus tasolle. Nämä havainnot osoittavat, että GLI2 voi aktivoida transkriptiota ihmisen

TGF-β1

promoottorin ja että sitoutuminen vähintään yksi näistä sivustoista tarvitaan näin tapahtuisi. Mutaatio Site E, joka on edelleen ylävirtaan transkription aloituskohdasta, tehtiin arvioimaan rooliaan GLI2 aiheuttama TGF-β1 ilme. Käytimme lusiferaasireportteri- konstrukti phTG1 sisältävät -1362-11 emäksiä lähellä transkription aloituskohdasta ihmisen TGF-β1-promoottori [18]. Seuraavat mutaatio mahdollista GLI-sitoutumiskohdan, lusiferaasin ilmentyminen väheni noin kaksinkertaiseksi seuraavat kotransfektiolla konstitutiivinen GLI2 aktivaattori. Tarkempi analyysi tarvitaan tutkia otaksuttu GLI sitoutumiskohtien muille kuin sivustojen A, B ja E ovat myös toiminnallisia.

Aiemmin hoitamattomat ihmisen CD4

+ T-solut eristettiin negatiivisen valinnan ja tartunnan lentiviruksesta joka sisältää GLI2ΔN aktivaattori-rakenteen tai GFP-ohjaus. 72 tuntia infektion jälkeen, RNA kerättiin mitata

TGF-β1

transkriptien. (A) Suhteellinen

TGF-β1

mRNA mitattiin RT-PCR: llä ja normalisoitiin 18S rRNA.

TGF-β1

mRNA oli merkittävästi lisääntynyt (n = 6, * p = 0,0313) infektoiduissa soluissa GLI2ΔN verrattuna infektoitujen solujen GFP-ohjaus. (B) tartunta tehokkuus mitattiin 69% käyttäen GFP ilmentävät ohjaus lentiviruksen. (C 3D).

CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ Treg rikastettiin PBMC ja sitten inkuboitiin 72 tuntia ei-kohdistuksen (NT) tai

GLI2

siRNA. Soluja stimuloitiin sitten (1 αCD3 /αCD28 helmi: 1 solu) vielä 24 tunnin ajan. RT-PCR: ää käytettiin mittaamaan

TGF-β1

mRNA-tasoja. Suhteellinen

TGF-β1

tai

GLI1

mRNA normalisoitiin 18S rRNA. (A)

GLI2

Knockdown in Treg merkittävästi vähentynyt

TGF-β1

transkriptio (n = 7, * p = 0,0189). (B)

GLI1

mRNA mitattiin myös kontrollina GLI2-säädellään geenin; osoittaa, että knockdovvn

GLI2

vuonna Treg myös vähentynyt

GLI1

mRNA (n = 5, ** p = 0,0278). (C) sekvenssi

GLI2

siRNA oli salattu (Scram) ylimääräisenä

GLI2

siRNA negatiivisen kontrollin ja ei ollut merkittävästi erilainen kuin kohdistaminen ohjaus.

GLI2 säätelee

TGF-β1

transkriptio Ensisijainen ihmisen CD4

+ CD25

hi Treg

Vaikka yliekspressio siirtogeenisten GLI proteiinit voivat moduloida

TGF-β1

transkription naiivi CD4

+ T-solut, halusimme arvioida fysiologinen rooli GLI2 aktivaation ensisijainen soluja, jotka ilmentävät korkeita TGF-β1. Aiemmat tutkimukset ovat käyttäneet siRNA että pudotus erityisiä geenejä ensisijainen Treg [31], [32]. Knockdovvn

GLI2

tehtiin käyttäen kaupallisesti saatavilla Dharmacon Accell siRNA arvioida sen tehtävää TGF-β1 transkriptio primaarisissa ihmisen Treg.

GLI2

siRNA Knockdown primaarisissa ihmisen CD4

+ CD25

hi Treg stimuloidaan αCD3 /αCD28 päällystettyjä helmiä vähentynyt ilmentyminen

TGF-β1

mRNA noin 5-kertaiseksi ( Kuvio 4A, p = 0,0189). Arvioida knockdovvn GLI2 toiminnan,

GLI1

mRNA: n ekspressio mitattiin RT-PCR: llä.

GLI1

geenin transkriptio on tunnettu alavirran kohde aktivoidun GLI2 transkriptiotekijä. Vähentynyt ilmentyminen

GLI1

mRNA tukee siRNA-välitteisen knockdovvn

GLI2

(kuvio 4B, p = 0,0278). Erillinen riippumaton negatiivinen kontrolli käyttämällä salatun

GLI2

siRNA-sekvenssin (5′-AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ’) käytettiin käsitellä off-tavoite vaikutukset (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittavat, että GLI2 on tärkeää säännellä

TGF-β1

transkriptio primaarisissa ihmisen Treg. Lajitellut Treg olivat CD3

+ CD8

CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ T-soluja. Puhtaus Treg oli yli 85% (kuvio 4D).

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) tehtiin arvioida sitoutumisen GLI2 ihmisen

TGF-β1

promoottori. Ensisijainen ihmisen sääntely CD4

+ CD25

hi-T-solut olivat negatiivisesti eristetty ja stimuloidaan αCD3 /αCD28 päällystettyjä helmiä yhdessä yössä. PCR tehtiin arvioimaan GLI2 sitovia. Koko DNA: ta käytettiin positiivisena kontrollina PCR. GLI2 sidottu

TGF-β1

promoottori ”Site E” ihmisen

TGF-β1

promoottori. GLI2 ei sitoudu ei-suunnattu alue ihmisen

IL-10

promoottori (Lane 8).

GLI2 sitoutuu ihmisen

TGF-β1

promoottori

Kromatiini immunosaostuksella (chip) tehtiin arvioimaan sitoutuminen GLI2 ihmisen

TGF-β1

promoottori. Ensisijainen ihmisen sääntely CD4

+ CD25

hi-T-solut olivat negatiivisesti eristetty ja stimuloidaan αCD3 /αCD28 päällystettyjä helmiä yhdessä yössä. Stimuloitu Treg inkuboitiin agaroosihelmiä päällystetty αGLI2 tai αIgG kontrollivasta-aineita. Kuten on esitetty kuviossa 5, GLI2 sidottu

TGF-β1

promoottori. GLI2 sitoutuminen osoitettiin olevan ”Site E” (kuva 5) ihmisen

TGF-β1

promoottori. Kuitenkin GLI2 ei sitoudu ei-suunnattu alue ihmisen

IL-10

promoottori (Kaista 8).

Co-immunosaostus käytettiin testaamaan sitoutumista HIV-1 Tat ihmisen GLI2. Dual transfektiot tehtiin 293T-soluihin (plasmidi yhdistelmiä näkyy oikealla) ilmaisemaan Tat-FLAG ja GLI2-6xMYC proteiinit (pcDNA3 = tyhjä ohjaus vektori). (A) Helmet päällystettiin anti-FLAG-vasta ja inkuboitiin solulysaatteja transfektioiden # 1-3 näkyy oikeassa reunassa. Seuraavat pesu- ja eluutiovaiheet, sitoutunut proteiini ajettiin SDS-PAGE-geelillä ja sen jälkeen Western blotting -tekniikalla arvioida GLI2 sitovia. Anti-myc-vasta-ainetta käytettiin vahvistamaan sitoutumisen GLI2 Tat, kun Tat on sitoutunut helmi. (B) Helmet päällystettiin anti-myc-vasta-aineen ja inkuboitiin solulysaatteja transfektioiden # 1-3 näkyy oikeassa reunassa. Seuraavat pesu- ja eluutiovaiheet, sitoutunut proteiini ajettiin SDS-PAGE-geelillä ja Western-blottaus tehtiin etsiä HIV-1: n Tat sitovia. Bändit kehitetty noin 27 kDa. Anti-flag-vasta-ainetta käytettiin varmistamaan sitoutumisen Tat GLI2 kun GLI2 oli sitoutunut helmi.

HIV-1: n Tat sitoutuvan GLI2

plasmassa nousevat ja selkäydinnesteessä ( CSF) tasot immunosuppressiivisten sytokiinien kuten TGF-β1 havaitaan HIV-1 taudin etenemiseen [8] – [10], joka johtaa kasvuun iTreg [11], [12]. HIV-1-transak- ja viruksen proteiinia Tat on liitetty indusoijana TGF-β1 sekä

in vitro

sekä

in vivo

malleissa [13] – [17]. Vaikka Tat on osoitettu lisäävän TGF-β1, taustalla transkription mekanismia ei ole vielä selkeästi määritelty.

Koska huomasimme, että GLI2 säätelee TGF-β1 transkriptionaalisella tasolla, testasimme onko HIV-1: n Tat sitoutuu ihmisen GLI2 ja voi siten lisätä tai vakauttaa TGF-β1 transkriptio käyttäen yhteistyössä immunopreciptation (co-IP) arvioimaan sitoutumiseen ihmisen GLI2 HIV-1 Tat. Dual transfektiot tehtiin 293T-soluissa, jossa on kolme erilaista plasmidien: (GLI2-6xMYC + HIV-1: n Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3-ohjattu), (HIV-1: n Tat-FLAG + pcDNA3-ohjaus). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut hajotettiin ja vapautuneita proteiineja kerättiin yhteistyössä IP (Pierce Co-IP Kit Thermo Scientific). Agaroosi hartsi on päällystetty yhdellä kolmesta vasta-: Sigma F1804 anti-FLAG M2-vasta-ainetta (sitoutumaan Tat jalkaosaan), CST 71D10 anti-MYC-vasta-ainetta (sitoutua GLI2 jalkaosaan), tai isotyyppikontrolli-vasta-ainetta. Sen jälkeen co-tutkimusajanjakson eluointien ajettiin SDS-PAGE geelillä seuraa Western blotting -tekniikalla. Kuten kuviossa 6 on esitetty, HIV-1: n Tat sitoutuu spesifisesti GLI2, joka oli sidottu helmi. Päinvastainen reaktio osoitti myös spesifisyys, mikä osoittaa, että nämä kaksi proteiinia voivat todellakin olla vuorovaikutuksessa. Sitoutuminen HIV-1 Tat GLI2 viittaa mahdollisen mekanismin TGF-β1 induktio HIV-1-infektion. Edelleen kokeita on tehtävä testata toiminnallinen synergia HIV-1 Tat ja GLI2 vaikuttaa transkription TGF-β1 promoottori.

Keskustelu

Tuloksemme osoittavat, että transkriptiotekijä GLI2 soittaa aiemmin tuntematon, mutta tärkeä rooli monimutkainen transkription säätelyyn

TGF-β1.

kautta

in silico

seulonta-analyysi me paljasti kuusi mahdollista GLI-sitoutumiskohtia ihmisen TGF-β1 promoottori , joista viisi oli aiemmin tuntemattomia. Käyttämällä mutaatioanalyysiin ihmisen

TGF-β1

promoottori, huomasimme, että GLI2 Parantaa

TGF-β1

transkriptio vähintään kolmessa viidestä otaksutun GLI-sitoutumiskohtia (Sites A, B, E). Lisäksi tuloksemme osoittavat, että infektio ensisijainen naiiveja CD4

+ T-solut (matala TGF-β1 ilmentäviä soluja), jossa on konstitutiivisesti aktiivinen GLI2 lentivirukselle Parantaa

TGF-β1

transkriptio. Lisäksi siRNA knockdovvn

GLI2

primaarisissa ihmisen CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ Treg (high TGF-β1 ilmentävien solujen) laski merkittävästi

TGF-β1

transkriptio . Samalla osoitetaan Chip että GLI2 suoraan sitoutuu ”Site E”

TGF-β1

promoottori. Tämä hiljattain tunnistettu mekanismi GLI2 välittämää TGF-β1 sääntely voi olla vaikutuksia sairauksien kuten syövän ja aidsin, joissa suuria määriä TGF-β1 myötävaikuttaa patogeneesiin.

Vaikka rooli GLI-säätelyyn on

TGF-β1

transkriptio ei ole aikaisemmin esitetty, on olemassa epäsuora todiste tästä mekanismista. Eichenmuller

et al.

Havaitsivat, että

Ptch1

hiirten, joilla on konstitutiivinen aktivaatio SHH koulutusjakson, on yli 400-kertainen tasot

TGF-β1

mRNA selostukset [28]. Vaikka tutkijat havaitsivat, että oletetun GLI sitoutumiskohta toisen promoottori ei reagoi GLI1, ne eivät tutkia roolia GLI2 säätelyssä viiden otaksuttu GLI sitoutumiskohtia, jotka havaitsimme ensimmäisen TGF-β1 promoottori.

Lisäksi useita raportteja korostaa läheistä suhdetta TGF-β1 ja SHH /GLI perheille [33], [34]. Liu

et al.

Raportoitiin vuorovaikutusta SHH reitin molekyylin Gli3 ja Smad proteiinit (TGF-β1 reitti transkriptiotekijöiden) [35]. Lisäksi Dennler

et al.

Raportoitu että GLI2 ja GLI1 voitiin indusoida kautta Smad välittyvä mekanismi [36]. TGF-β-superperheen geenien

BMP-2, 4

,

7

kaikilla on GLI reagoivien elementtien niiden promoottorien [37] – [39]. Lin

et al.

Sai SHH-reagoivan elementin 5′-ylävirran promoottorialue

TGF-β2

[40].