Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

BIRC6 on jäsenenä estäjät Apoptosis Protein (IAP) perhe jonka uskotaan suojaamaan erilaisia ​​syöpäsolujen apoptoosia. Päätavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko BIRC6 on merkitystä eturauhassyövässä ja voisi olla hyödyllinen uutena terapeuttisena kohteena.

Methods

BIRC6 ilmentyminen solulinjoissa arvioitiin käyttäen Western blot analyysi ja kliinisissä näytteissä käyttämällä immunohistokemialla kudossiruina. Biologinen merkitys BIRC6 määritettiin siRNA aiheuttama väheneminen

BIRC6

ilmentymisen LNCaP-soluissa ja sen jälkeen toiminnalliset analyysit.

Tulokset

Kohonnut BIRC6-proteiinin ekspressio havaittiin eturauhasessa syöpäsolun linjat ja kliinisissä näytteissä erotuksena niiden hyvänlaatuinen kollegansa. Lisääntynyt BIRC6 ilmentyminen liittyi Gleason 6-8 syöpiä ja kastraatio vastus. Vähentäminen BIRC6 ilmentymisen LNCaP-soluissa johti merkittävään vähenemiseen soluproliferaation joka liittyy apoptoosin lisääntyminen ja lasku autophagosome muodostumiseen. Doksorubisiini-indusoitua apoptoosia todettiin kytketty vähenemiseen BIRC6 proteiinin ilmentymisen.

Johtopäätös

tiedot viittaavat siihen, rooli BIRC6 eturauhasen syövän etenemiseen ja hoitoon vastus, ja ilmoittaa ensimmäiselle aika, että

BIRC6

geeni ja sen tuote on potentiaalisesti arvokkaita kohteita hoitoon eturauhasen syöpiä.

Citation: matala CG, Luk ISU, Lin D, Fazli L, Yang K, Xu Y, et ai. (2013) BIRC6 Protein, estäjä Apoptosis: Role in Survival of Human eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 8 (2): e55837. doi: 10,1371 /journal.pone.0055837

Editor: Kin Mang Lau, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 16 elokuu 2012; Hyväksytty: 02 tammikuu 2013; Julkaistu: 08 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Low et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes of Health Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhasen syöpiä yleensä läsnä androgeeniriippuvaisissa kasvaimet, alttiita kasvun pysähtymisen /indusoiman apoptoosin androgeeniablaatio hoito [1]. Vaikka aluksi tehokasta, androgeeniablaatio usein johtaa kehitystä kastraation-resistenttejä (androgeeni-riippumaton) eturauhassyöpä, joka on yleensä kestää myös muut käytettävissä olevat hoidot. Sinänsä kastraatio vastus yleisesti merkitsee loppuvaiheessa muodossa eturauhassyövän ja on merkittävä este tautien hallinta [1]. Kehittäminen kastraatio kestävä eturauhassyöpä on tunnusomaisesti liittyy merkittävän lisäyksen vastustuskykyä apoptoosin, merkittävä kuoleman koulutusjakson huumeiden toimia [1] – [3]. Apoptoosiresistenssiin johtuvat ylössäätöä Antiapoptoottisten geenejä ja niiden tuotteita uskotaan olevan keskeinen tekijä kehitettäessä kastraation vastustuskyvyn sekä yleistä vastustuskykyä syövän hoitomuotoja. Selvittämiseen rooli anti-apoptoottisten geenien /proteiinien etenemisen eturauhasen syöpä on siis todennäköisesti johtaa parannuksiin hoitoon tulenkestävien sairauden.

estäjät Apoptosis Protein (IAP) perhe on raportoitu pelata rooli apoptoosin vastuksen erilaisissa syöpäsolun linjat ja on ominaista läsnäolo proteiineja yhdestä kolmeen kappaleena Bakuloviraalista IAP Repeat (BIR) domain. IAP: t on osoitettu sitoutuvan ja estää erilaisia ​​pro-apoptoottisten tekijöiden, mikä vaimentaa tehokkaasti indusoiman apoptoosin monenlaisia ​​efektorien, mukaan lukien kemoterapia-aineet ja säteilytys [4]. Bir verkkotunnus on olennaista vuorovaikutusta IAP: t pro-apoptoottisia tekijöitä, kuten kaspaaseiksi. Kaspaasit ovat perheen kysteiini-asparagiinihappo-proteaasien, läsnä pro-muodossa, joka, kun aktivoidaan pilkkominen, on vastuussa hajoamista kuoleman substraattien, kuten poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) siten käynnistää apoptoosin. Lohkaista kaspaasi-3 ja pilkottiin PARP voidaan helposti havaita Western blot -analyysillä ja niitä käytetään yleisesti merkkiaineina apoptoosin [5].

Apoptosis liittyy usein autophagy, menetelmällä, jossa lysosomaalisen hajoamisen solun oma komponentit [6]. Siihen liittyy pakkauksiin proteiinien ja soluelimiin sisällä autophagosomes, minkä jälkeen fuusioimalla lysosomeihin johtaa hajoamista proteiinien ja organelleja. Rooli autophagy kehittämisessä syövän ja sen hoito on monimutkainen, sillä on olemassa näyttöä siitä autophagy voivat edistää ja tukahduttaa syövän kasvua [7]. Inhibitio autophagy rikkomalla olennaisia ​​autophagy geenien on osoitettu edistävän kasvaimen kehittymisen ja siten autophagy voi olla kasvain-estävä vaikutus [8] – [11]. On kuitenkin olemassa yhä enemmän todisteita siitä, että autophagy voi toimia selviytymismekanismi syöpäsoluja vasteena monenlaisia ​​rasituksia, mukaan lukien hoito syöpälääkkeiden [7].

havaitsemiseksi autophagic aktiivisuus viljellyissä soluissa Western blot havaitseminen LC3B-II käytetään usein. LC3B-II on nimenomaan liittyy autophagosomes ja tasot LC3B-II on osoitettu korreloivan määrä autophagosomes soluissa [12] – [15]. Koska LC3B-II on hajonnut upon autophagosome-lysosomifuusio, LC3B-II tasot tarjoavat vain tilannekuvan määrän autophagosomes soluissa kerralla pisteen ja eivät osoita ylössäätöä tai alas-säätely autophagy sen kokonaisuudessaan [13], [15]. Näin ollen, lasku määrän autophagosomes solussa voi tapahtua väheneminen autophagosome muodostuminen tai kasvu autophagosome hajoamista. Havaitseminen muita kriittisiä autophagy proteiinit kuten Beclin-1 voi tarjota lisää tietoa aktivoinnin autophagy näissä soluissa. Tämä proteiini on mukana sekä signalointireitin aktivoimalla autophagy ja alkuvaiheen autophagosome muodostumisen [12], [16]. Tällä hetkellä ei ole olemassa näyttöä siitä rooli IAP: t säätelyssä autophagy ihmisillä.

BIRC6 proteiini on 528 kDa, epätavallisen suuri jäsen IAP perhe. Se koostuu yhdestä N-terminaalista BIR domeenin ja C-terminaali ubikitiinistä konjugoimalla (UBC) domain; jälkimmäinen on kimeerinen E2 /E3 ubikitiini-ligaasiaktiivisuutta sekä anti-apoptoottista aktiivisuutta [17]. Kautta BIR domain, BIRC6 kykenee sitoutumaan ja estämällä aktiivisen kaspaasien, mukaan lukien kaspaasit-3, 6, 7 ja 9, ja tällaiset vuorovaikutukset on osoitettu taustalla BIRC6 kyky inhiboida kaspaasi kaskadin ja lopulta apoptoosin [17]. Kautta UBC toimialallaan BIRC6 helpottaa proteasomaalisten hajoamista proapoptoottisten proteiinien kaspaasi 9 [18], SMAC /DIABLO [18], [19] ja HTRA2 /OMI [17], [20]. BIRC6 on myös tärkeä säätelijä sytokineesin ja siten sillä on tärkeä rooli solujen lisääntymisen [21].

Viimeaikaiset todisteet tukevat laajaa roolia BIRC6 in annetaan apoptoosiresistenssiin syöpäsolujen, kuten on esitetty

vuonna vitro

tutkimukset soluja gliooma [22], keuhkosyövässä [23], kohdunkaulasyövän [19], [21], [24], [25], fibrosarcomas [18], [24], osteosarcomas [21] , rintasyöpiä [24], [26] ja paksusuolen syövissä [27]. Rinta- ja keuhkosyövän solut, apoptoosia laukaisee menetys BIRC6 ilmentymisen on osoitettu ottamaan p53 vakauttamiseen [23], [26]. BIRC6 ilmentyminen syövän kliininen näytteissä on havaittu peräsuolen syövän [28] ja lapsuuden

de novo

akuutti myelooinen leukemia (AML) [29]. Jälkimmäisessä, kohonnut ilmentyminen

BIRC6

mRNA liittyi epäsuotuisaan vastaus kemoterapiaa ja huono uusiutumisen elinaika hinnat [29]. Rooli on BIRC6 eturauhassyövän, kuitenkin, ei ole raportoitu.

Esillä olevassa tutkimuksessa, analyysi ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja kliinisistä näytteistä osoitti merkittäviä nousuja BIRC6 ilmentymisen pahanlaatuisia soluja /kudoksia erillisinä niiden hyvänlaatuinen kollegansa. Erityisesti lisääntynyt BIRC6 ilmentyminen liittyi Gleason 6-8 syöpiä ja kastraatio vastus. Lisäksi siRNA aiheuttama pudotus on BIRC6 johti huomattavaan vähenemiseen solun proliferaation LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että BIRC6 edustaa uutta terapeuttinen kohde hoidettaessa tulenkestävien eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Chemicals, liuottimia ja liuoksia saatiin Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, ON, Kanada, ellei toisin ole mainittu.

Clinical eturauhassyöpäkudoksille

Näytteet saatiin potilailta, heidän tietoon perustuvan suostumuksen jälkeen protokolla hyväksymä Clinical Research Ethics Board of University of British Columbian ja BC Cancer Agency. Gleason-lajitellut kudossiruina (TMA) käytettiin koostuu 35 hyvänlaatuinen eturauhasen yksilöitä, 6 eturauhasen-intraepiteelisen neoplasia yksilöitä ja 157 eturauhasen eturauhassyöpää yksilöitä. Syöpä yksilöt koostui 74 Gleason pisteet 6, 23 Gleason pisteet 7, 43 Gleason pisteet 8, 2 Gleason pisteet 9, ja 15 Gleason pisteet 10 kudoksia, joita ei ole tehty neo-adjuvanttia hormonihoito ja 10 eturauhassyöpäkudoksille jotka olivat olleet alistetaan neo-adjuvanttia hormonihoito ja oli edennyt kastraatio-resistenttejä. Jälkimmäinen 10 kudokset oli Gleason-pistemäärät 8 (n = 6) ja 10 (n = 4), ennen hoitoa. Näytteet TMA rakentamiseen oli valittu sattumanvaraisesti kokoelmista Vancouverin Eturauhasen Centre, Vancouver General Hospital (toimittanut Department of Pathology, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada). Kudospreparaattia ja TMA rakentaminen suoritettiin, kuten on kuvattu [30].

immunohistokemia

immunohistokemiallinen analyysit tehtiin, kuten on kuvattu [31] käyttämällä kanin polyklonaalista anti-BIRC6-vasta-ainetta (Novus Biologicals, Littleton, CO ; NB110-40730) kanssa 1:100 laimennus. Kaikki osiot käytetään immunohistokemia vasta- värjättiin 5% (w /v) Harris hematoksyliinillä.

BIRC6 Protein Pisteytys

BIRC6 värjäys kudosten arvioitiin patologi ja tietty pistemäärä 0, 1 , 2 tai 3, jotka edustavat ei BIRC6 värjäystä, heikko, kohtalainen ja vahva BIRC6 värjäytymisen intensiteettiä vastaavasti. Prosenttia positiivisuus (mittana värjäys taajuus) laskettiin kullekin ryhmälle perustuen useita kohtia, joissa värjäytymisvoimakkuuksia ’1’ tai suurempi.

Solulinjat

Kuusi ihmisen eturauhasen syöpäsolu linjat (LNCaP, PC3, PC3-M, DU145, C42, Vcap), kaksi eturauhasen hyvänlaatuisen solulinjoja (BPH1, RWPE1) ja kahden solulinjan tiedetään ekspressoivan BIRC6 (OVCAR-8, HeLa) ylläpidettiin media täydennetty FBS: lla ( 10%), penisilliini G (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml), kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 [22]. Syövän soluja viljeltiin käyttäen RPMI-1640-väliaine, BPH1 soluja viljeltiin käyttäen DMEM, ja RWPE1 soluihin käyttäen Keratinosyyttien-SFM (Gibco-BRL, Burlington ON, Kanada). Solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Sen vaikutuksen määrittämiseksi apoptoosin BIRC6 ekspressiota LNCaP-soluissa, 600000-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli ja inkuboitiin sitten doksorubisiinin (1 ug /ml).

Western-blottaus

Solulysaatit valmistettiin käyttämällä solun lyysipuskuria (1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikoolihappoa). Havaitsemista varten BIRC6 (528 kDa), 10 ug kokosolulysaatissa ajettiin kahden osan (5% ja 12,5%) SDS-polyakryyliamidigeelissä. Geelit leikattiin, ja BIRC6 on sähkön avulla PVDF-kalvon tris (25 mM), glysiiniä (191,5 mM), metanolia (10%), SDS (0,05%), käyttäen puolikuivaa siirtolaitetta. Kalvot koetettiin varten BIRC6 kanin polyklonaalista anti-BIRC6 vasta-aine (1:500; Novus Biologicals). Havaitsemista varten PARP, kaspaasi-3, LC3B-I, LC3B-II ja Beclin-1-proteiinin ilmentyminen, 5-15 ug kokosolulysaatissa ajettiin 10 tai 12,5% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja sen jälkeen proteiinin siirtoa, kalvot olivat koetettiin käyttäen kanin anti-PARP ja anti-kaspaasi-3-vasta-aineita (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA), kanin anti-LC3B vasta-aineita (0.85:1000; Abcam, Cambridge, MA) ja kanin anti-Beclin-1-vasta-aineita (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Aktiini tai vinkuliini käytettiin lastaus valvontaa ja havaita kalvoilla käyttäen kaniinin anti-aktiini polyklonaalista vasta-ainetta (1:2000; Sigma-Aldrich) ja hiiren anti-vinkuliini vasta-aine (1:3000; Sigma-Aldrich).

sirna (siRNA) ja Cell transfektio

Custom siRNA syntetisoidaan Dharmacon (Lafayette, CO) ja tunnettuja kohdistaa

BIRC6

oli seuraavat sekvenssit: siRNA-1, sense, 5′- GUU-UCA-AAG-CAG-GAU-GAU-G-dTdT-3 ’[23] ja siRNA-2, sense, 5′-CUC-AGG-AGA-GUA-CUG-CUC-A-dTdT-3’ [ ,,,0],21]. Non-kohdistaminen siRNA (siGENOME Non-kohdistaminen Smartpool; Dharmacon) käytettiin kontrollina. Jotta voidaan tutkia vaikutus siRNA: iden on BIRC6 proteiinin ilmentymiseen, LNCaP-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille antibioottia RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty naudan sikiön seerumilla (10%). 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin 100 nM siRNA lipofektamiinin 2000 reagenssia (Invitrogen, Burlington, ON) seuraten valmistajan ohjeita. Ajoneuvon ohjaus- ja ei-suunnattu siRNA levitettiin toistamaan soluviljelmissä.

MTT elinkyvyn

Kaksikymmentä viisi tuhatta solua siirrostettiin kuoppa 24-kuoppaisen lautasen ja transfektoitiin siRNA-2 . 0, 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen, 50 ui MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja viljelmiä inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa 4 tuntia . Viisisataa ui 20% SDS-liuosta lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa valolta. Näytteet (100 ui) siirrettiin sitten 96-kuoppaisille levyille. Absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä.

Cell Cycle

solusyklin jakautuminen LNCap-soluja määritettiin virtaussytometrialla propidiumjodidia (PI) värjäytyneiden solujen. Soluja viljeltiin RPMI-10% FBS: ia ja käsitellään sen jälkeen

BIRC6

siRNA. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia hoidon jälkeen siRNA, solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja säilytettiin sitten 4 ° C: ssa yön yli. Kiinnitetyt solut pestiin kerran PBS: llä. Sentrifugoinnin jälkeen solut värjättiin 10 ug /ml propidiumjodidia (PI), 1 mg /ml RNaasi ja 0,1% Triton X-100: ssa 30 minuuttia jään päällä. DNA histogrammit saatiin analysoimalla 10,000 solua. Solujen osuus G1, S ja G2 + M solusyklin määritettiin.

anneksiini-V-määritykset

Apoptoosi mitattiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelija (FACS) anneksiini -V konjugoitu fluoreseiini (anneksiini-V-FITC) (BD Biosciences Pharmingen), varhaisen apoptoosin ja propidiumjodidilla (PI) myöhään apoptoosin värjäystä valmistajan ohjeiden protokollaa. Soluja viljeltiin RPMI-10% FBS: ia ja käsitellään sen jälkeen

BIRC6

siRNA. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia hoidon jälkeen siRNA, solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen 1X Binding Buffer (BD PharMingen, San Diego, CA), jonka pitoisuus on ~ 1 x 10

6 solua /ml. Solususpensiot (100 ui, ~ 1 x 10

5 solua) siirrettiin uusiin putkiin, ja 5 ui anneksiini V-FITC: llä ja 5 pl PI: n alikvootteja lisättiin. Soluja inkuboitiin pimeässä 15 minuutin ajan 21 ° C: ssa. Anneksiini-FITC fluoresenssin mitattiin FL1 kanavan (käyttäen 530/30 kaistanpäästösuodattimen) ja PI FL3 kanavan (660/20 BP suodattimen kaistanpäästösuodattimen). Kymmenentuhatta tapahtumaa kerättiin. Apoptoosi arvioitiin laskemalla prosenttiosuus anneksiiniV-positiivisten solujen. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD kolminkertaisista kulttuurin.

LC3-GFP puncta muodostumisen määritys ja kvantifiointi

LNCaP-soluja ympättiin peitinlaseil- 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin 100 nM ei-kohde- siRNA tai BIRC6 siRNA-2 seuraavana päivänä käyttäen Oligofectamine. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia siRNA transfektiosta solut transfektoitiin 3 ug LC3-GFP kuoppaa kohti XtremeGENE (Roche) ja solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 27 tunnin transfektion jälkeen. LC3-GFP puncta muodostuminen indusoitiin 6 tunnin ajan ennen kiinnittämistä käsittelemällä 10 uM klorokiinin seerumivapaassa väliaineessa. Kiinnityksen jälkeen peitelaseja asennettu DAPI asennus ratkaisu. Fluoresenssikuvia oli ottanut -konfokaalimikroskoopilla. Kvantifiointi autophagic solut: Autophagic soluja, joita kutsutaan soluiksi, jotka sisältävät enemmän kuin 15 LC3-GFP puncta. Prosenttiosuus autophagic solujen laskettiin määrä autophagic solujen jaettuna useissa LC3-GFP-positiiviset solut × 100.

Tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

-testi käytettiin ja tulokset

P

-arvo 0,05 pidettiin merkittävinä.

tulokset

Kohonnut BIRC6 Protein tasot Human eturauhassyöpäsolulinjat

Western blotting paljasti vahvan BIRC6 proteiinin ilmentyminen kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa tutkittiin (Fig. 1). Sitä vastoin vain vähäinen BIRC6 proteiinin ilmentymisen havaittiin BPH1 ja RWPE1 hyvänlaatuinen eturauhasen solulinjoissa. Kohtalainen tai voimakas BIRC6 ekspressiota havaittiin OVCAR8 ja Hela-solut ilmoittamat muut [17], [22]. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

BIRC6 proteiinin ilmentymisen pahanlaatuisten eturauhasen soluissa (kaistat 1-6), positiivinen kontrolli pahanlaatuisia kohdunkaulan ja munasarjojen solut (kaistat 7-8) ja hyvänlaatuinen eturauhasen solujen (kaistat 9-10 ).

Kohonnut BIRC6 Protein tasot Gleason Jakouurteellinen Clinical eturauhassyöpäkudoksille

Kliininen eturauhasen kudosleikkeiden, morfologisesti luokiteltu hyvänlaatuinen kudokseen ja syöpien Gleason pisteet 6-8 ja 9-10 , värjättiin ja pisteytettiin BIRC6 ilme. Positiivinen sytoplasminen värjäys BIRC6 oli yleisesti alhainen hyvänlaatuinen epiteelin, huomattavasti voimakkaampi hyvin eriytetty Gleason asteen 3 ja voimakkainta huonosti eriytetty Gleason 4. asteen eturauhassyöpäkudoksille (Fig. 2A-D). Gleason luokka 5 kudosten ilmaistaan ​​yleensä alhaisempi BIRC6 värjäystä suhteessa muihin eturauhassyövän kudoksissa, samanlainen kuin hyvänlaatuinen kudoksiin. Osiot sisältävät sekä hyvän- kudosta ja syöpäkudoksessa (Gleason luokka 3) osoitti vahvan positiivisen BIRC6 värjäytymistä pahanlaatuinen epiteelin ja poissa tai heikko ilmentyminen hyvänlaatuinen epiteelin (tuloksia ei ole esitetty). Tarkoittaa värjäytymisvoimakkuuksia PIN oli hieman koholla verrattuna hyvänlaatuinen epiteeli, vaikkakaan ei merkitsevästi koholla (tuloksia ei ole esitetty). Vuonna Gleason sai kudoksiin (kuvio. 2E), ilmaus BIRC6 oli alhainen hyvänlaatuisen kudosten ja kasvoi tasaisesti suurimmillaan vuosina Gleason pisteet 7 syöpiä. Ekspressio Gleason pisteet 8 syöpiä oli pienempi ja vielä pudota samalle tasolle kuin hyvänlaatuinen kudosten nähtiin Gleason pisteet 9-10 yksilöitä. Keskimääräinen värjäytymisvoimakkuuksia kussakin ryhmässä oli 1,00 ± 0,80 S.D. hyvänlaatuisen epiteelin ja 1,53 ± 0,92 S.D. (

P

= 3,24 x 10

-3) ja Gleason pisteet 6, 2,22 ± 0,90 S.D. (

P

= 4.45 x 10

-6) ja Gleason pisteet 7 ja 1,60 ± 0,82 S.D. (

P

= 1,63 x 10

-3) ja Gleason pisteet 8 eturauhassyöpäkudoksille. Intensiteetti BIRC6 ilmaisun Gleason pisteet 9-10 eturauhassyöpäkudoksille oli samanlainen kuin hyvänlaatuinen kudokset (0,71 ± 0,47 S.D .;

P

= 0,10). Myös matalan intensiteetin ilmaisun havaittu Gleason pisteet 9-10 eturauhassyöpäkudoksille oli heijastavat suuri osa tyypillisesti heikko BIRC6 ilmentävien Gleason luokan 5 syöpiä löytyy tässä ryhmässä.

, nuolet osoittavat heikkoja soluliman BIRC6 värjäystä eturauhasen hyvänlaatuista onteloerityssolut (pisteet ”1”). B, nuolet osoittavat kohtalainen sytoplasmista BIRC6 värjäytymistä Gleason asteen 3 syöpäsolujen (pisteet ”2”). C, nuolet osoittavat vahvaa sytoplasmista BIRC6 värjäytymistä Gleason 4. asteen eturauhassyövän solut (pisteet ’3’). D, nuolet osoittavat heikkoja sytoplasmista BIRC6 värjäytymistä Gleason arvosana 5 syöpäsolujen (pisteet ”1”). E, musta palkki edustaa keskimääräistä BIRC6 värjäytymisen intensiteetti hyvänlaatuista eturauhasen epiteelissä (n = 35) ja Gleason pisteet 6 (n = 74), 7 (n = 23), 8 (n = 43) ja 9-10 (n = 17) potilaan eturauhassyöpäkudoksille. Harmaat palkit edustavat taajuuden BIRC6 ilmaisun (pisteet ≥1). Kohonneita värjäytymisvoimakkuuksia havaittu Gleason pisteet 6 (*

P

= 3,24 × 10-3), 7 (*

P

= 4,45 × 10-6) ja 8 (*

P

= 1,63 × 10-3) eturauhassyöpäkudoksille verrattuna hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelissä. Virhepylväät kuvaavat standardipoikkeamat. F, musta palkki edustaa keskimääräistä BIRC6 värjäytymisen intensiteetti hoitamaton korkea laatu (Gleason pisteet 8-10) eturauhassyöpäkudoksille (n = 60) ja kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) kudoksia, jotka olivat kehittyneet Gleason pisteet 8-10 syövät seuraavat neo -adjuvant hormonihoito (n = 10). Harmaat palkit edustavat taajuuden BIRC6 ilmaisun (pisteet ≥1). Kastrointi kestävä eturauhassyöpäkudoksille oli merkittävästi korkeampi keskiarvo BIRC6 värjäytymisen intensiteettiä kuin käsittelemätön korkealaatuista eturauhassyöpäkudoksille (*

P

= 1,38 × 10-3). Virhepylväät kuvaavat standardipoikkeamat.

Gleason pisteet 6, 7 ja 8 pahanlaatuiset epithelia useammin ilmaistaan ​​BIRC6 (värjäystä intensiteetti pisteet ≥1) kuin hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelin (Fig. 2E). Kaikki pahanlaatuisia kudokset osoitti tiheä BIRC6 ilmaisun kytketty korkean BIRC6 intensiteetin, paitsi Gleason pisteet 9-10 kudoksia, jotka osoittivat tiheä BIRC6 ilmaisun kytketty matalan keskimääräisen intensiteetin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että eturauhassyövän etenemistä hyvälaatuisesta Gleason pisteet 8 eturauhasen syöpiä liittyy Kohonneet BIRC6 proteiinin ilmentymisen.

Kohonnut BIRC6 Protein tasot kastraatio kestävä Clinical eturauhassyöpäkudoksille

Tissue osastoja potilaiden eturauhasen syöpiä (Gleason pisteet 8-10), joka oli edennyt kastraatio vastus seuraavien neo-adjuvanttia hormonihoito (n = 10) värjättiin ja pisteytettiin BIRC6 ilmaisun ja verrattiin osien korkealuokkaisesta eturauhasen syöpiä (Gleason pisteet 8-10), joita ei ole tehty neo-adjuvanttia hormonihoito (n = 60). Keskimääräinen värjäystä intensiteetti BIRC6 oli merkitsevästi korkeampi kastraatio kestävä eturauhasen syöpiä kuin käsittelemättömien kontrollien (2,30 ± 0,67 SD ja 1,35 ± 0,84 SD vastaavasti;

P

= 1,38 x 10

-3) (kuvio . 2F). BIRC6 ilmaisu taajuus oli erittäin korkea molemmissa kudoksen. Tiedot viittaavat siihen, että kehitys kastraatio kestävä eturauhassyövän liittyy Kohonneet BIRC6 proteiinin ilmentymisen.

vähentäminen BIRC6 Expression Vähentää Eturauhassyöpä elinkykyyn ja Proliferation

On raportoitu, että vähentäminen BIRC6 ilme indusoi apoptoosia (esim rintasyöpäsoluissa). Käytimme LNCaP-solulinjasta tutkia vähentää BIRC6 eturauhassyöpäksenografteilla solujen elinkykyä. Inkubointi LNCaP-solujen, jotka on transfektoitu

BIRC6

-targeting siRNA-1 ja -2 (kaistat 3, 4, 7, 8, 11, 12) johti merkittävään häviämiseen BIRC6 proteiinin, verrattuna soluihin, käsiteltiin lipofektamiinia vain (kaistat 2, 6, 10), lipofektamiini + ei-suunnattu siRNA (kaistat 5, 9, 13) tai mitään hoitoa (kaista 1) (Fig. 3A). Vaikutus oli ilmeinen 30 h transfektion ja tuli näkyvämpi 54 ja 78 h. On huomattava, että transfektoitujen solujen Lipofectamine vain, tai lipofektamiini- + kuin kohdistaminen siRNA, osoittivat pientä kasvua BIRC6 ilmaisua, mikä johtuu oletettavasti ajoneuvoon. Kaikki seuraavat Knockdown kokeet tehtiin käyttämällä siRNA-2.

, hoito LNCaP soluviljelmiä siRNA kohdistamista BIRC6 johtaa vähentämiseen BIRC6 proteiinin ilmentymisen. BIRC6 proteiinin ilmentyminen käsittelemättömissä LNCaP-soluissa (kaista 1, 78 h) ja LNCaP-soluja inkuboitiin lipofektamiinin vain (kaistat 2, 6, 10), siRNA-1 kohdistaminen BIRC6 (kaistat 3, 7, 11), siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 (kaistat 4, 8, 12) tai ei-suunnattu siRNA (kaistat 5, 9, 13) 30, 54 ja 78 h transfektion jälkeen. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. B, hoito LNCaP soluviljelmiä siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 johtaa alentunut solujen lisääntymistä, kuten on esitetty MTT: llä. Viljelmiä käsiteltiin 30 h lipofektamiini- ainoastaan ​​tai lipofektamiini- plus joko ei-kohdistettu siRNA tai siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 ja inkuboidaan sitten 24, 48 ja 72 h tuoretta väliainetta. Suhteellinen solujen numerot siRNA-2 viljelmät olivat huomattavasti alhaisemmat kuin ei-kohdistuksen siRNA käsitellään viljelmien 2,85%, 10,78% ja 25,88% 54, 78 ja 102 h. Virhepylväät kuvaavat standardipoikkeamat.

jälkeen transfektion, siRNA-2 transfektoiduissa viljelmissä pieneni selvästi solujen elinkelpoisuuden suhteen ei-kohdistuksen siRNA-käsitellyissä viljelmissä (kuvio. 3B). Näin ollen solujen elinkelpoisuuden siRNA-2 viljelmissä oli huomattavasti alhaisempi kuin ei-suunnattu siRNA-käsitellyissä viljelmissä 2,85%, 10,78% ja 25,88%: iin 54, 78 ja 102 h, vastaavasti. Oli taipumus siRNA-2-käsitellyt solut muodostamaan synsytian kaltaisia ​​rakenteita, jossa klustereita solut yhdistettiin pitkän kara-ulokkeita. Tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta. Vaikutus BIRC6 hiljentäminen solusyklin etenemistä tutkittiin myös. Knockdovvn BIRC6 LNCaP-soluissa ei aiheuttanut merkittävää muutosta solussa pyöräily (Fig. S1).

vaikutus BIRC6 vähentämiseen tutkittiin myös PC-3 syöpäsolujen. Samanlainen kuin LNCaP-solut, siRNA-2 transfektoitiin PC-3-solut osoittivat merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden verrattuna ei-suunnattu siRNA-käsitellyissä soluissa 72 tuntia transfektion jälkeen (kuvio. S2).

vähentäminen BIRC6 Expression indusoi apoptoosia ja estää Autophagosome Formation

BIRC6 vähentäminen indusoi apoptoosia LNCaP osoituksena anneksiini V värjäys ja immmunoblotting. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, oli merkittävä nousu anneksiini-V-positiivisten solujen siRNA-2 transfektoiduissa soluissa (12,19% ± 1,9%) verrattuna ei-kohde siRNA (3,65% ± 0,60%, p = 0,0104) ja Lipofectamine käsiteltyjä soluja (3,55% ± 0,0447%, p = 0,0123). Yhdenmukainen anneksiini-V-määrityksen tulokset, BIRC6 knock-down-solut osoittivat merkittäviä muutoksia ilmentymisessä apoptoosin markkereita (kuvio 4B). Kasvu katkaistun kaspaasi-3, menetys täyspitkät PARP ja kasvu on lohkaistaan ​​PARP havaittiin verrattuna LNCaP-solujen, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen siRNA (kaista 3, 4). Mielenkiintoista, havaitsimme täyspitkä PARP laskua transfektion LNCaP solujen lipofektamiini- tai ei-kohdistaminen (kontrolli) siRNA (kaistat 2, 4), joita on saatettu aiheuttamia epäspesifisen hajoamisen täyspitkä PARP erityisesti LNCaP. Menetys täyspitkä PARP Tätä valvontaa ei liittynyt vastaavaan kasvuun pilkotun PARP ja ei kytketty merkittävään kasvuun lohkaistaan ​​kaspaasi-3, mikä osoittaa, että valvonta ei johtanut apoptoosin.

A, apoptoosin LNCaP Lipofectamine (Lipo), ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (NT) tai

BIRC6

siRNA2 minkä jälkeen sitä inkuboitiin 48 tuntia, joka arvioidaan virtaussytometrianalyysillä anneksiini V /PI värjätään solut. Pohjalta Q2 + Q3-arvot (apoptoottisten solujen populaatiot),

BIRC6

siRNA merkittävästi lisääntynyttä apoptoosia LNCaP-soluja verrattuna Lipo (p = 0,0104), tai NT-siRNA käsiteltyjen solujen (p = 0,0123). (Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta); B, hoito LNCaP-solujen siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 johtaa kaspaasi-3 (kuten on esitetty ulkonäkö katkaistun kaspaasi-3) ja hajoaminen sen substraatin, PARP (kuten on esitetty menetys täyspitkä PARP ja ulkonäkö pilkotun PARP tuote). Käsittelemättömät LNCaP-soluja (kaista 1); LNCaP-soluja inkuboitiin lipofektamiinin vain (kaista 2), siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 (kaista 3) tai ei-suunnattu siRNA (kaista 4), 96 h transfektion jälkeen. C, hoito LNCaP-solujen siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 johtaa pienenee Beclin-1 ilmentymisen ja vähentäminen LC3B-II. Käsittelemättömät LNCaP-soluja (kaista 1); LNCaP-soluja inkuboitiin lipofektamiinin vain (kaista 2), siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 (kaista 3) tai ei-suunnattu siRNA (kaista 4), 113 h transfektion jälkeen. D, autophagosome muodostumista BIRC6-vaiennetaan soluissa oli merkitsevästi pienempi verrattuna soluihin käsitelty ei-kohdistuksen ohjaus siRNA. Solut, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen siRNA ohjaus (vasemmalla) osoitti enemmän LC3-GFP puncta kuin transfektoidut solut siRNA-2 kohdistaminen BIRC6 (oikealla), mikä osoitti levinnyt ekspressio LC3-GFP. E, Alennettu BIRC6 ilmentäviä LNCaP-soluissa osoittaa huomattavasti vähemmän autophagic soluja (33,6%) verrattuna kontrollisoluihin (51%). Autophagic solut kvantitoitiin laskemalla solut yli 15 LC3-GFP puncta alla -konfokaalimikroskoopilla.

transfektio LNCaP-solujen siRNA-2 (kaista 3) johti merkittäviin muutoksiin autophagy merkki ilmaisun ( kuva 4C). Väheneminen LC3B-II-proteiinia (lipidoitunut muoto LC3-I) havaittiin mitään vaikutusta LC3B-I-proteiinin tasot sekä lasku Beclin-1-proteiinin ilmentymisen (verrattuna kontrolleihin; Kaistat 1, 2, 4) . Lisäksi autophagosome muodostumista BIRC6-vaiennetaan soluissa oli merkitsevästi pienempi verrattuna soluihin käsitelty ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (

P

= 0,036), joka käy ilmi loisteputki LC3 puncta kertymistä sytoplasmassa (Fig. 4D, E) . Yhdessä tulokset osoittavat, että vähentäminen BIRC6 proteiinin ilmentymisen siRNA-2-käsiteltyjen LNCaP johtaa apoptoosin lisääntyminen ja lasku autophagosome muodostumiseen. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Doxorubicin aiheuttama apoptoosi LNCaP liittyy vähentäminen BIRC6 Protein Expression

doksorubisiini, lääke käytetään terapiassa eturauhassyövän [32], on raportoitu laukaista apoptoosin yhdessä selvää kerääntymistä p53 [33]. Vaikutuksen tutkimiseksi doksorubisiinin aiheuttaman apoptoosin BIRC6 ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa, LNCaP-soluja inkuboitiin 24 tuntia tai ilman doksorubisiinia (1 ug /ml). Kuten on osoitettu Western blot-analyysi, doksorubisiinin kanssa johti merkittävään alentumiseen BIRC6 ilmentymisen (Fig. 5A). Lisäksi oli vähentää täyspitkä PARP-proteiinin ilmentymistä ja lisätä pilkotun PARP, osoittaa apoptoosin. Lisäksi oli väheneminen solutiheyden todisteet solun heikkeneminen (kuvio. 5B). Hoito LNCaP doksorubisiinin osoitti annoksesta ja ajasta riippuva väheneminen BIRC6 ilmaisun (Fig. S3). Ymmärtää onko BIRC6 vähennys oli syynä tai seurauksena doksorubisiinin aiheuttamaa-apoptoosin, ohimolohkon BIRC6 ja PARP doksorubisiinin jälkeen hoidon tutkittiin.