Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tällä hetkellä saatavissa diagnosointimenetelmät ja lavastus eturauhassyövän puuttuu herkkyyttä erottaa sairastavien potilaiden veltto eturauhassyöpä ja ne vaativat radikaaleja hoitoa. Muutoksia avain adherens (AJ) ja tiiviin liitoksen (TJ) komponentit on tervehdittiin mahdollisia biomarkkereita eturauhassyövän etenemisen, mutta suurin osa tutkimusta on tehty yksittäisistä molekyyleistä.

tavoite

Valaistaan ​​paneeli biomarkkereita, jotka voivat auttaa erottamaan lepotilassa eturauhassyöpä aggressiivisia etäpesäkkeitä.

Methods

Analysoimme ilmentymisen 7 tunnettu AJ ja TJ komponenttien johdetut solulinjat normaalin eturauhasen epiteelikudoksessa (PNT2), ei-invasiivisia (CAHPV-10) ja invasiivisen eturauhassyövän (LNCaP, DU145, PC-3) geenien ilmentyminen, western blotting ja immunofluoresenssimenetelmin.

tulokset

Claudin 7, α kateniinin ja β-kateniinin proteiinin ilmentyminen ei ollut merkitsevää eroa CAHPV-10-solut ja PNT2 soluja. Kuitenkin PC-3-solut, proteiini tasot klaudiini 7, α kateniinin laskivat tuntuvasti säännelty (-1,5 kertainen, p = 0,001) tai havaita vastaavasti. Immunof- osoitti β-kateniinin lokalisointiin PC-3-solujen olevan soluliman vastakohtana kalvo-.

Johtopäätös

Nämä tulokset viittaavat poikkeava Claudin 7, α – ja β-kateniinin ilmentymisen ja /tai lokalisointi kuviot voivat olla otaksuttu markkereita erottamiseksi paikallinen eturauhassyöpä aggressiivisia etäpesäkkeitä, kun niitä käytetään yhdessä.

Citation: Morgan C, Jenkins SA, Kynaston HG, Doak SH (2013) The Role of Adheesiomolekyylit biomarkkereina varten Aggressiivinen Eturauhassyöpä Fenotyyppikuvaus. PLoS ONE 8 (12): e81666. doi: 10,1371 /journal.pone.0081666

Editor: Frédéric André, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2013; Hyväksytty 17. lokakuuta 2013 Julkaistu: 16 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Morgan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Eturauhasen Action (avustus viitenumero G2009 /27) ja The St David Medical Foundation, College of Medicine, Swansea University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (CAP) on yleisin syöpä miehillä Britanniassa. Joka vuosi lähes 35000 tapauksia CaP diagnosoidaan ja sen osuus on noin 12% kaikista male syöpäkuolemaa Britanniassa [1]. Varhainen diagnoosi elimeen rajoittunut korkki on välttämätöntä, sillä eturauhasen poistoleikkauksen tai sädehoidon tarjoaa ainoa mahdollisuus täydelliseen paranemiseen ja edenneen taudin on lievittävä ja tehokas (pitkällä aikavälillä). Lisäksi alussa elimeen rajoittunut korkki ei ole aina hengenvaarallinen ja voi seurata ja veltto kurssi, joka ei vaadi hoitoa. On yleisesti hyväksyttyä, että tällä hetkellä käytettävissä käytetyt menetelmät diagnosointiin ja lavastus korkki (prostataspesifisen antigeenin tasoja, Gleason ja kliiniset ja patologiset laatu) puuttuu herkkyys erottaa potilaalla on veltto, elimeen rajoittunut cap, jotka vaativat radikaaleja hoitoa ja ne vaarassa uusiutumisen jälkeen radikaalin hoidon. On selvää, että on tarpeen tunnistaa molekyylimarkkereita CaP etenemisen, invaasio ja metastaasi ennustaa diagnoosin ja ohjata hoitoon.

Jotta syövän metastaaseja, solut täytyy ensin irtautumaan primaarikasvaimen. Epiteelikudoksessa, solut on liitetty toisiinsa kalvolla rakenteista, joita kutsutaan tiiviiden liitosten (TJ), vyöliitos (AJ) ja desmosomeja [2]. Yhdessä ne säilyttävät arkkitehtuuri epiteelin. AJ proteiinit käsittävät kadheriinin ja kateniinin perheitä. E-kadheriinin on ensisijaisesti läsnä epiteeli ja edustaa prototyyppinen jäsen kadheriinin perheen. Sytoplasmisen alueen E-kadheriinin sitoutuu sytosolin proteiineja, joita kutsutaan catenins (α, β ja p120) [3]. β-kateniinin sitoutuu suoraan E-kadheriinin taas α-kateniinin sitoo epäsuorasti sen vuorovaikutus β-kateniinin [4]. Yhdessä desmosomeja ne ovat ensisijaisesti vastuussa tarttumisen vierekkäisten solujen [5] ja muodostaa stabiileja solu-solu kontakteja. TJ erottaa apikaalisella ja basolateraaliseen alueiden solukalvon ja säännellä ionien, veden ja makromolekyylien epiteelin läpi [6]. TJs muodostuvat kalvoon sitoutuneet proteiinit (claudins, occludin, tricellulin) ja adapteri ja telineet proteiinit (liitosadheesiomolekyyliin molekyyli, ZO-1, ZO-2, ZO-3 cingulin, MUPP1) [7].

viime aikoihin asti TJs ovat vain koettu solujen tiivisteet [8]. Nyt kuitenkin häviöt TJ proteiineja tunnustetaan niiden yhteydessä erilaisia ​​syöpiä. Vapauttaminen TJ proteiinien liittyy menetys epiteelisolujen polariteetin ja erilaistamattomuuden joka on tunnettu tapahtuma varhaisessa vaiheessa karsinogeneesissä [7]. Huonosti eriytetty rintojen [9], [10], kilpirauhasen [11], kohdun limakalvon [12] ja ruoansulatuskanavan [13] syövät ilmentymisen tiiviin liitoksen proteiinien on osoitettu vähennettävä, kun rintasyövän potilaiden menetyksen toiminnallisia TJ proteiinit on myös liitetty huonompi ennuste [14], [15]. Koska TJ proteiinit määritellään kohtaan, jossa kalvot kaksi solua liittyä yhteen ne huolehtivat keskeisestä pitämällä solut yhteen ja ovat keskeinen este, joka syöpäsolujen täytyy voittaa, jotta levitä [16].

Vaikka näyttöä jatkaa kasvuaan koskien ilmaus TJ ja AJ komponenttien syöpä useimmissa tutkimuksissa pyritään tutkivat yksittäisiä molekyylejä. Syövät ovat heterogeenisiä luonteeltaan ja näin ollen on mahdotonta diagnosoida syöpä tai ennustaa sairauden etenemisestä käyttämällä yhtä biomarkkereiden.

käytetty viiden kaupallisesti saatavilla eturauhasen solulinjoissa, jotka ovat peräisin normaalin eturauhasen epiteelin ei-invasiivisia eturauhassyöpä ja metastaattinen syöpä analysoida ilmentymisen 7 tunnettu AJ ja TJ komponentteja, jotka on nimetty poikkeuksellisesti ilmaistu eturauhassyövän kudosnäytteistä [17], [18], [19], [20], [21], ensimmäisessä vaiheessa mahdollisesti valaisemaan paneeli biomarkkereita, jotka voivat erottaa veltto syövän aggressiivisesta etäpesäkkeitä, kun niitä käytetään yhdessä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

eturauhasen epiteelisolujen (PNT2) ja eturauhasen syöpäsolujen johdettu syövän metastaattisen imusolmukkeisiin (LNCaP) ja luun (PC-3) saatiin European Collection of Cell Cultures. Syöpäsolujen, jotka ovat peräisin ei-invasiivisen eturauhassyövän (CAHPV-10) ja syövän metastaattisen aivoihin (DU145) hankittiin American Type Culture Collection. PNT2, LNCaP, DU145 ja PC-3 viljeltiin rutiininomaisesti RPMI 1640, 2 mM L-glutamiini Glutamiini ja 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia (Invitrogen, Paisley UK). CAHPV-10-soluja viljeltiin Keratinosyyttien seerumia 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen, Paisley UK).

Soluja kasvatettiin kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa. Soluja osa-viljellä käyttäen 0,25% trypsiini /EDTA: ta (Sigma-Aldrich, Dorset, UK).

Vasta-aineet

Ensisijainen vasta-aineita hiiren ZO-1 ja kanin Occludin, Claudin-1 ja Claudin -7 ostettiin Invitrogen (Paisley, UK). Kani, α-kateniinin, β-kateniinin, E-kadheriinin ja kanin β-aktiini hankittiin New England Biolabs (Hertfordshire, UK). Piparjuuren peroxidise konjugoidun sekundaarisen anti-hiiri /anti-kani-vasta-aineet hankittiin myös yhtiöstä New England Biolabs (Hertfordshire, UK).

immunof-, lisäksi ensisijainen vasta-aineita α-kateniinin, β-kateniinin saatiin Abcam ( Cambridge, UK). Anti-hiiri (Qdot655) ja anti-kani (Qdot525) sekundääriset vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Invitrogen (Paisley UK).

Geenien ilmentyminen analyysi

Yhteensä-RNA uutettiin käyttäen RNeasy Extraction Kit ( Qiagen, Crawley, UK) ja jäljellä DNA poistettiin käsittelemällä DNA-vapaan ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) mukaan valmistajan ohjeiden. cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja High Capacity cDNA-synteesin käänteistranskriptio Kit (Applied Biosystems, Warrington, Iso-Britannia). Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin iCycler iQ lämpösyklilaitteeseen (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) käyttämällä SYBR Green tunnistus menetelmiä. Alukesarjat (taulukko 1) on suunniteltu eksonin eksonin ulottuu, jotta minimoidaan se mahdollisuus, että mikä tahansa kontaminoivan genomisen DNA: n tulisi monistaa. Alukesarjat käytetty testattiin myös varmistaa ne kaikki osoittivat yhtä vahvistusta tehokkuutta. Kaikki reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena 2 ui cDNA: ta, 12,5 ui iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) ja 0,2 uM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, lopullisessa reaktiotilavuudessa 25 ui. β-aktiini ja HPRT käytettiin viitteenä geenejä. PCR-monistus-olosuhteet olivat 95 ° C 3 min, jota seurasi 40 sykliä 94 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s. Kertainen ekspression normalisoitui vastaan ​​normaalin eturauhasen epiteelin PNT2-soluissa.

Western blotting

Yhteensä proteiini uutettiin käyttäen RIPA-puskuria (Sigma Aldrich, Dorset, UK). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia ajettiin joko 7,5% tai 12% tris-glysiini-PAGE-geelit (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) riippuen proteiinin koko kiinnostava. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Membraanit blokattiin 5% rasvaton kuiva maito tween /TBS estää ei-spesifisen sitoutumisen (kaikki Sigma Aldrich, Dorset, UK) ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa käyttäen ensisijaista vasta-aineita, Occludin (1:83), ZO- 1 (1:250), Claudin-1 (1:125), Claudin-7 (1:125) α-kateniinin (1:1000), β-kateniinin (1:1000) ja E-kadheriinin (1:500) . β-aktiini (1:1000) käytettiin kontrollina proteiinimäärän. Membraanit pestiin vapaaksi primaarisen vasta-aineen ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitu sekundäärisen anti-hiiri /anti-kani-vasta-aineita (1:1000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen Immun-Star WesternC chemiluminescene havaitseminen kit (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Iso-Britannia) ja suhteellinen ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen densitomet- ja määrä Yksi ohjelma (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Iso-Britannia). Western blotit suoritettiin kahtena kappaleena.

Immunofluoresenssi

jälkeen mRNA: n ja proteiinin analyysi, Claudin 7 α-kateniinin ja β-kateniinin näytti olevan samanlainen ilmaisun tasoilla normaalissa eturauhasessa soluja, jotka tulivat muuttaa soluissa johdettu aggressiivista etäpesäkekasvainkudoksen. Siksi immunof- vasta suoritettiin näiden molekyylien onko muutoksiin proteiiniekspressiossa seurasi poikkeava lokalisointi. Solut ympättiin 1 x 10

5 solua /ml päälle steriili mikroskooppiobjektilaseille sisältyvät steriili quadriperm kudosviljelylevyille (Invitrogen, Paisley UK). Solut jätettiin yöksi kiinni dioja ja kasvatetaan yhtenäisiksi 5 päivää. Kun solut konfluentteja väliaine poistettiin, levyt pestiin kaksi kertaa steriilillä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (Invitrogen, Paisley UK) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. PFA poistettiin pesemällä levyt PBS /100 mM glysiiniä (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 5 min kolme kertaa. Solut permeablised 0,1% Triton X-100 PBS: ssä 10 minuutin ajan ja pestiin PBS: ssä kolme kertaa. Sammuttamiseksi reaktiiviset ryhmät seuraavat PFA kiinnitys, kalvot inkuboitiin natriumboorihydridiä (Fisher Scientific, Leicestershire, UK), jonka pitoisuus on 1 mg /ml 10 minuutin ajan. Tämä suoritettiin kolme kertaa ja sen jälkeen 5 minuutin PBS pestä ennen estää dioja 10% naudan seerumialbumiinia (BSA) /PBS 30 minuuttia. Esto-liuos poistettiin suorittamalla 3 x 2 minuutin pesua PBS: ssä. Laseja inkuboitiin anti-Claudin 7 (1,100 1% BSA /PBS), α-kateniinin ja β-kateniinin (1:50 1% BSA /PBS). Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Primaarinen vasta-aine poistettiin 3 x 5 min pesua, jota seurasi inkubointi sekundaarisia vasta-aineita (1:100 6% BSA /PBS) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Toissijainen vasta poistettiin 3 x 5 minuuttia PBS ennen levyjä pestiin vedellä (2 min) 70%, 85% ja 95% etanolia (2 min kukin). Objektilasit analysoitiin käyttämällä AxioCam fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss Oy, Hertfordshire, UK).

Negatiiviset kontrollit (poissulkemiseksi autofluorisaatiota) tehtiin korvaamalla ensisijaisen vasta-aineen 1% BSA /PBS.

tilastollinen

analyysi suoritettiin käyttäen muuttujien ANOVA testi. Dunnettin post hoc analyysi tehtiin verrata syöpäsolujen normaalin epiteelin PNT2 säätökennoja ja Tukey post hoc analyysi tehtiin useita ryhmä vertailuja.

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

HUOMAUTUS: Vain eroja geenien ilmentyminen ja proteiinin tasot täyttävään p-arvo ja biologinen kertamuutosta 1,5 katsotaan merkittävä muutos.

Tulokset

Gene Expression Analysis

Quantitative real-time PCR (Fig. 1) osoitti occludin mRNA-tasot olivat merkittävästi erilaiset kaikkien ryhmien (

p

0,001). Merkittävä väheneminen occludin mRNA-tasojen havaittiin CAHPV-10 (-19,08 kertainen,

p

= 0,001), DU145 (-3,2 kertainen,

p

= 0,003) ja PC-3 ( -4,3 kertainen,

p

= 0,003) syöpäsolujen verrattuna normaaliin eturauhasen epiteelisolujen (PNT2). Ei ollut mitään merkittävää eroa occludin mRNA: n ilmentymisen välillä syöpäsoluja riippumatta invasiivisen kapasiteettia. Kuitenkin, mRNA-tasot olivat merkittävästi jopa säädetty (2,2-kertainen,

p

= 0,001) LNCaP syöpäsolujen verrattuna eturauhasen epiteelisolut (PNT2).

Expression tasoilla on normalisoida normaalin eturauhasen solulinja PNT2 joiden ekspressiotaso on asetettu 1. * tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05) verrattuna PNT2.

Mitä tulee ZO-1, ei ollut merkitsevää eroa transkription tasojen normaalissa eturauhasessa epiteelisolut ja kaikki eturauhasen syöpäsoluja.

Claudin 1-geenin ilmentyminen merkitsevästi säädeltiin kaikissa syöpäsoluissa verrattuna PNT2. In CAHPV-10 ja LNCaP eturauhassyövän solut, Claudin 1 oli säädeltiin -10 kertaiseksi (

p

= 0,001) ja -100-kertainen (

p

= 0,001) vastaavasti . DU145 osoitti -2,1-taitettava asetuksen (

p

= 0,001) ja PC-3 osoitti -3,8 kertainen (

p

= 0,001) pienentää ilmentymistaso.

Claudin 7 geeniekspressiotasot oli samanlainen PNT2 ja CAHPV-10 (lauseke arvo 1,1). Sen sijaan Claudin 7 transkriptio oli merkitsevästi ylös säädellään LNCaP, (4,63-kertainen,

p

= 0,001), mutta alaspäin säännellään DU145, (-5,3 kertainen,

p

= 0,004 ) ja PC-3, (-24,8 kertainen,

p

= 0,01) verrattuna PNT2. Siellä oli myös merkittävä alaspäin asetusta ilmennystasoissa kun klaudiini 7 mRNA verrattiin välillä CAHPV-10 ja (DU145, (

p

= 0,02) ja PC-3 (

p

= 0,0001). Kun mRNA-tasot CAHPV-10 verrattiin DU145 ja PC-3, merkittävä alassäätöä in ilmentyminen havaittiin (molemmat DU145 ja PC-3

p

= 0,001).

β-kateniinin geenin ilmentyminen merkitsevästi säädellä vähentävästi CAHPV-10-solut, (-3 kertainen,

p

= 0,015) verrattuna PNT2 samalla merkittävän ylössäätöä havaittiin LNCaP, (3,8 kertainen,

p

= 0,001), DU145, (2,2-kertainen,

p

= 0,001 ) ja PC-3, (2,1-kertainen,

p

= 0,001). oli myös merkittävä ylössäätöä ilmennystasoissa kun mRNA-tasot CAHPV-10 verrattiin DU145 (

p

= 0,006) ja PC-3 (

p

= 0,001).

E-kadheriinin geenin ilmentymisen tasot olivat merkitsevästi väheni CAHPV-10 (-2,3 kertainen,

p

= 0,004), DU145 (-5,6 kertainen,

p

= 0,001) ja PC-3 (-7,25 kertaiseksi,

p

= 0,001) verrattuna PNT2. Ei ollut mitään merkittävää eroa E-kadheriinin geenin ilmentymisen tasojen ei-invasiivisia ja invasiivisen eturauhassyövän soluissa. Sen sijaan LNCaP osoitti jälleen merkittävä säätely ylöspäin E-kadheriinin verrattuna PNT2 (1,6-kertainen,

p

= 0,037).

Protein Expression Analysis

Western blot ja tiheysmittaus suoritettiin (Fig. 2) onko mRNA ekspressiotasot olivat vertailukelpoisia proteiinin tason (taulukko 2). Proteiini tasot occludin olivat alas säännelty eturauhassyövän solut CAHPV-10 (-2,8 kertainen), DU145 (-1,6 kertainen) ja PC-3 (-9,3 kertainen) mutta säädellään ylöspäin LNCaP (2,4-kertainen) verrattuna PNT2. Kuitenkin, koska suuri toistojen välinen vaihtelu (tuloksia ei ole esitetty), ei ollut merkitsevää eroa minkään eturauhasen soluissa.

β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Western blotit suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja vanteet ovat edustavia saatujen tulosten.

Protein tasot ZO-1 ei osoittanut mitään merkittävää eri puolilla tahansa solulinjoista (CAHPV-10 1,1-kertaiseksi, LNCaP 3.6-kertainen, DU145, 2,5-kertaiseksi ja PC-3 -1,1 kertainen).

verrattuna PNT2, Claudin 1 pitoisuus väheni kaikissa eturauhassyövän solut. CAHPV-10 oli säädeltiin -2,1-kertaiseksi, DU145 -2,3 kertaiseksi ja PC-3 -1,8 kertaiseksi. LNCaP oli ainoa solulinjan osoittaa merkittävää alassäätöä verrattuna PNT2 (-9,3 kertainen,

p

= 0,04).

Claudin 7-proteiinin tasoa ei ilmennyt eroja CAHPV-10 ( 1,2-kertainen) ja PNT2 mutta tasot laskivat tuntuvasti säännelty LNCaP (-1,1 kertainen), DU145 (-1,1 kertainen) ja PC-3 (-1,5 kertainen). Kaikki oli

p

= arvo 0,01. Kuitenkin LNCaP ja DU145 ei täyttänyt biologinen kertamuutosta ja siksi näitä muutoksia ei otettu huomioon. Lisäksi kun klaudiini 7 proteiinin tasot CAHPV-10 verrattiin PC-3, merkittävä alas-asetus on myös dokumentoitu (

p

= 0,01).

Mitä tulee α- kateniinin proteiini tasoilla, ei ollut merkitsevää eroa CAHPV-10 ja PNT2, kun taas LNCaP (4,4-kertainen,

p

= 0,03), DU145 (-2 kertainen

p

= 0,04 ) α-kateniinin tasoja laskivat tuntuvasti säätelee eriasteinen verrattuna PNT2. Sillä PC-3 huomattavan alas asetusta α – kateniinin proteiini tasoilla havaittiin, niin että proteiini bändi oli huomaamaton ja tiheysmittaus arvoa ei voitu saada. Lisäksi, CAHPV-10-proteiinin tasot olivat merkitsevästi erilaisia ​​kuin LNCaP (

p

= 0,03) ja DU145 (

p

= 0,04).

ei ollut merkittävää eroa in β-kateniinin proteiinin tasojen CAHPV-10 (1,1), LNCaP (2-kertainen), DU145 (1,4-kertainen) tai PC-3 (1,5-kertainen) ja PNT2, näin vaikka PC-3 osoitti biologisen kertainen muutos, tulos jätetty huomiotta.

E-kadheriinin proteiinin tasot merkittävästi alaspäin asetusta näkyi CAHPV-10 (-1,7 kertainen,

p

= 0,01) ja DU145 (-1,5 kertainen,

p

= 0,01). Jälleen huomattava alas asetuksen PC-3, niin että proteiini bändi oli huomaamaton ja tiheysmittaus arvoa ei voitu saada. LNCaP-solut E-kadheriinin oli up säännelty proteiinin taso (2,7 kertainen

p

= 0,01).

Immunofluoresenssikoe

Sen määrittämiseksi, ovatko AJ ja TJ proteiineja oli läsnä oikeille solukomponenttien sijainti (solukalvon), immunofluoresenssilla hyödynnettiin.

immunofluoresenssitesti (Fig. 3) ja Claudin 7 osoitti vahvaa värjäytymistä solussa kalvo PNT2, CAHPV-10 ja LNCaP. Sekä DU145 ja PC-3, fluoresenssivärjäys vähennettiin. Värjäytyminen vähenee merkittävästi sekä DU145 ja PC-3-solujen värjäystä ilmeistä sekä solukalvon ja sytoplasmassa. Värjäys α- kateniinin osoitti vahvaa spesifisen värjäytymisen on solukalvon PNT2, CAHPV-10 ja LNCaP-soluissa, kun taas DU145 ja PC-3-signaalin intensiteetti väheni merkittävästi ja epäspesifinen. Mitä tulee P-kateniinin fluoresenssivärjäyksellä, PNT2, CAHPV-10 ja DU145 näytteillä erityisiä värjäytymisen solukalvon. β-kateniinin intensiteetin LNCaP ja PC-3-solut oli vahva solukalvon ja paikoissa solu-solu-kontakti, mutta PC-3 värjäytymistä näkyi myös sytoplasmassa.

LNCaP, proteiini lokalisointi tapahtuu solukalvon ja värjäytymisen intensiteetti näyttää samankaltaisia ​​PNT2 (lukuun ottamatta β-kateniinin, joka näyttää olevan suurempi ekspressio). Vuonna DU145 soluissa, ilmaus kaikkien proteiinien vähenee ja lokalisointi on hajanainen ja sytoplasminen. PC-3-solut, Claudin 7 ja α- kateniinin, fluoresenssi pienenee merkittävästi ja /tai soluliman jakelun, kun taas β-kateniinin fluoresenssi on vahvempi, mutta myös sytoplasman sen lokalisoinnin.

Keskustelu

ensimmäinen askel metastaattisen cascade on menetys solu-soluadheesion jotta solujen irtautumaan primaarikasvaimen. Siten AJs ollut merkittävä painopiste syövän tutkimuksiin ja nyt TJ komponentit ovat myös tunnustusta osallistumisesta. Muutokset keskeisten AJ ja TJ komponentteja kuten α-kateniinin, E-kadheriinin, β-kateniinin ja Claudin 1 on tervehdittiin mahdollisia biomarkkereita eturauhassyövän etenemisen [18], [22], [23], [24], mutta suurin osa tutkimusta on tehty yksittäisiä molekyylejä. Syöpä on heterogeeninen luonteeltaan, mikä on tarpeen paneelin biomarkkereiden, toisin kuin yksittäisten molekyylien, auttaa määrittämään syövän etenemisessä ja jos kyseessä on eturauhassyöpä, erottaa lepotilassa syövän aggressiivinen etäpesäkkeitä. Tämän seurauksena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ilmaus useita tunnettuja TJ ja AJ komponentit, kollektiivisesti, tärkeänä ensimmäisenä vaiheena määritettäessä paneeli oletettujen biomarkkereita, jotka voivat auttaa erottamaan lepotilassa eturauhassyöpä aggressiivisia etäpesäkkeitä. Seitsemän otaksuttu biomarkkerit valittiin johtuen niiden poikkeava ilmaisu, joka on dokumentoitu tieteellisessä kirjallisuudessa ja tutkittu aikaisemmissa potilaan keskitetty tutkimuksissa [17], [18], [20], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. 7 AJ ja TJ proteiinit valitaan olivat E-kadheriinin, α- ja β- kateniinin, ZO-1, occludin, klaudiini 1 ja klaudiini 7 ja niiden ilmentyminen tutkittiin käyttämällä

in vitro

malli eturauhassyövän etenemisen . Ulos 7, me esiin 3 (Claudin 7, α- ja β- kateniinin), jonka mRNA, proteiini tasoa ja /tai lokalisointi ovat samanlaisia ​​soluja, jotka ovat peräisin sekä normaaleissa että elimeen rajoittunut eturauhassyöpä mutta niiden tasojen ja /tai lokalisointi kaikki muuttuisivat peräisin olevia soluja aggressiivinen etäpesäkkeitä. Klaudiini 7-mRNA: n ja proteiinin tasot ei-invasiivisen eturauhassyövän soluissa (CAHPV-10) olivat samankaltaisia ​​kuin eturauhasen epiteelisolujen. Lisäksi sekä mRNA ja proteiini tasot laskivat tuntuvasti säännelty aggressiivisin metastaattinen solulinja PC-3 verrattuna CAHPV-10. Nämä tulokset tukevat Sheehan et ai, joka väheni Claudin 7 ilmaisun korreloi korkealuokkaisesta Eturauhaskasvainten [19]. Siksi Claudin 7 proteiini pitoisuudet voivat olla heijastusta aggressiivisuus näiden eturauhassyövän solut ja voidaan muuttaa ainoastaan ​​kaikkein aggressiivinen muodossa tauti. Lisäksi lisäanalyysi immunofluoresenssilla paljasti, että Claudin 7 lokalisointi PC-3-soluissa oli sytoplasmista sekä kalvoon sitoutunut. Poikkeava lokalisointi Claudin 7 sytoplasmaan on osoitettu esiintyvän rintasyövän soluissa [28] ja ruokatorven okasolusyöpä [2]. Tämä uusjakoa Claudins on katsottu johtuvan useista mekanismi mukaan lukien proteiini alas sääntelyn seurauksena sytoplasman hintoihin [2]. Näiden tulosten perusteella voidaan arveltu, että Claudin 7 voisi olla mahdollinen ehdokas erottaa indolent syövät kaikkein aggressiivinen metastaattinen muotoja, mikä edellyttää validointi potilasnäytteistä.

Yhdessä Claudin 7, α kateniinin tasoja ei-invasiivisia syöpäsolujen olivat samankaltaisia ​​tasoja eturauhasen epiteelisolujen, mutta kuten Claudin 7, oli merkittävästi vähentynyt kaikkein aggressiivinen metastaattisen soluja. Merkittävä suhde alennetaan α-kateniinin ilmaisun ja korkean Gleason on raportoitu eturauhas- kasvaimissa [24]. Samoin, α-kateniinin on raportoitu olevan läsnä eturauhassyövissä, joissa on pieni gleason grade [17]. On ehdotettu, näin ollen, että menetys α-kateniinin johtaa menetykseen e-kadheriinin toiminto johtaa huonompi ennuste [18], kun taas repletion α-kateniinin α-kateniinin null syöpäsolujen on raportoitu lisätä vyöliitos muodostumista ja vähentää transkriptionaalista aktiivisuutta β-kateniinin, sykliini D1 tasoja ja soluproliferaatiota [26].

β-kateniinin mRNA-proteiinin tasot ja immunofluoresenssivärjäyksellä intensiteetti CAHPV-10-solut olivat samanlaisia ​​kuin normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen ja mielenkiintoisesti, immunofluoresenssilla paljasti β-kateniinin PC-3-solujen olevan sekä ja sytoplasman. β-kateniinin paikantuu sytoplasmaan seurauksena vyöliitos kompleksin hajoamiseen ja sitten siirtyy tumaan, jossa se kykenee sen transkription vaikutus [29]. Tämä poikkeava lokalisointi sytoplasmaan on osoitettu myötävaikuttavan kilpirauhasen carciongenesis [30] ja jotka liittyvät huonoon ennusteeseen syöpäpotilaista [31]. Tuloksemme viittaavat siihen, että se voi olla tärkeää tarkastella sytoplasman lokalisaatio β-kateniinin, toisin kuin kvantitatiivisesti arvioida se mRNA: n tai proteiinin tasot, ja otaksutun biomarkkeri aggressiivinen tauti.

On huomattava, että mRNA ja proteiinin ilmentyminen tasoilla LNCaP solulinjassa harvoin noudattivat samaa suuntausta kuin DU145 ja PC-3. Tämä ero ekspressiotasoja voidaan selittää metastaattista potentiaalia ja erilaistumista tilan solulinjassa. LNCaP on dokumentoitu heikkolahjaisina metastaattista potentiaalia ja pysyy hyvin eriytetty vietynä hiiri malleja [32]. Siten voidaan oletettu, että seuraavat etäpesäke imusolmukkeisiin, tämä solulinja on palannut takaisin entistä epiteelin muodon seurauksena kolonisaation [33] ja kasvua. Lisäksi oli myös joitakin eroavaisuuksia mRNA ja proteiini tasot Claudin 7 ja occludin LNCaP, ja β-kateniinin CAHPV -10 ja DU145 ja α-kateniinin CAHPV-10 ja LNCaP. MRNA käännetään proteiinin voidaan olettaa, että pitäisi olla korrelaatiota mRNA ja proteiini tasoilla. Kuitenkin tutkimuksissa on tutkittu korrelaation mRNA ja proteiini ekspressiotasot ovat raportoineet minimaalinen tai rajoitettu korrelaatioita [34]. Proteiinin määrä havaittujen voidaan todennäköisesti vaikuttaa käännös ja transkription jälkeisen muutoksia tarjoamalla toissijainen verran ilmentymisen kontrolli, joka voisi selittää näitä eroja.

Johtopäätös

Koska heterogeenisen luonteen syöpä analyysi yksittäisten molekyylien tuottaa tietoa rajoitetusti on mahdotonta diagnosoida syöpää tai ennustaa taudin etenemistä yhdellä biomarkkereiden. 7 biomarkkerit analysoidaan täällä, on raportoitu olevan poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​eturauhassyöpä kudosnäytteistä vaan lähinnä tapauskohtaisesti. Kuitenkin meidän

in vitro

tutkimus on osoittanut, että ulos näistä 7 vain 3 (Claudin 7, α-kateniinin ja β-kateniinin) voidaan kollektiivisesti käyttää erottamaan paikallinen eturauhassyöpä soluista edustavat aggressiivinen etäpesäkkeitä. Uskomme, että tämä

in vitro

tunnistamiseen muutoksia useilla keskeisillä geenien yhdistelmä korostaa käyttämällä useita molekyylimarkkereita ja on tärkeä ensimmäinen vaihe määriteltäessä paneeli oletettujen biomarkkereita, jotka voivat auttaa erottamaan lepotilassa eturauhassyöpälääke aggressiivinen etäpesäkkeitä. Suuri potilas IHC tutkimus on nyt tarpeen vahvistaa nämä tulokset.