Krooninen sairaus

tiivistelmä

Soricidin on 54 aminohapon peptidi löytyy Halvaannuttavan myrkky lyhythäntäpäästäinen (

Blarina brevicauda

) ja on todettu estävän ohimenevä reseptorin potentiaali ja vallinoid tyyppi 6 (TRPV6) kalsiumkanavia. Me raportoimme, että kaksi lyhyempää peptidit, SOR-C13 ja SOR-C27, jotka ovat peräisin C-pään soricidin, ovat korkean affiniteetin antagonisteja ihmisen TRPV6 kanavia, jotka on säädelty useissa syövissä. Tässä raportoimme molekyylikuvantamisen menetelmiä, jotka osoittavat

in vivo

diagnostisia mahdollisuuksia SOR-C13 ja SOR-C27 kohdistaa kasvain sivustoja hiirillä munasarjojen tai eturauhasen kasvaimia. Tuloksemme viittaavat siihen, että nämä uudet peptidit voivat tarjota väylä toimittaa diagnostisia ja terapeuttisia reagensseja suoraan TRPV6-rikas kasvaimet ja sellaisena, on sovellusmahdollisuuksia varten erilaisia ​​karsinoomien kuten munasarja-, rinta-, kilpirauhas-, eturauhas- ja paksusuolen, sekä tietyt leukemiat ja lymfoomat.

Citation: Bowen CV, DEBAY D, Ewart HS, Gallant P, Gormley S, Ilenchuk TT, et al. (2013)

In vivo

Detection of Human TRPV6-Rich kasvaimet Anti-Cancer peräisin olevia peptidejä Soricidin. PLoS ONE 8 (3): e58866. doi: 10,1371 /journal.pone.0058866

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 02 marraskuu 2012; Hyväksytty: 07 helmikuu 2013; Julkaistu: 15 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Bowen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Research Council Industrial Research avun ohjelma (IRAP) ohjelma (https://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/irap/index.html) ja Atlantin Kanada Opportunities Agency (ACOA) (http: //www.acoa-apeca.gc.ca/eng/Pages/Home.aspx) ja Kanadan hallituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SG, TTI, TL, CR ja JMS ovat työntekijöitä Soricimed Biopharma Inc. At aika suorittaa ja tulosten tulkintaan, HSE oli työntekijä NRC. Novaceutics Consulting ei ole kuuluvansa Soricimed. JMS on seuraavat patentit julistaa: US 7119168 ja peptidejä ja menetelmiä syövän hoitamiseksi, joka on myönnetty 10 lokakuu 2006; US 7273850 menetelmiä inhiboimiseksi kalsiumin oton syöpäsolun vähentää solujen lisääntymistä antamalla kaikki tai osa peptidin ja syövän hoitomenetelmissä, joissa syöpäsolut osoittavat lisääntyneen ilmentymisen TRPV6, antoi 25 syyskuu 2007; ja US 8211857 ​​vaateiden suunnattu peptidi, joka koostuu SOR-C13 tai SOR-C27, syövän hoitoon myönnetty 3. heinäkuuta 2012. JMS ilmoittaa myös vireillä patentteja myönnetty: US 13/526045 varten jatkoa US 12/866397 (US myönnetty patentti 8211857) ja menetelmiä inhiboimiseksi kalsiumin ottoa syöpäsolujen vähentää solujen lisääntymistä ja menetelmiä syövän hoitamiseksi; Kanada (CA 2718949), Eurooppa (EU +09721272,4), Japani (JP 2011-500019), ja Hong Kong (+11106921,8) PCT hakemuksen kansalliseen vaiheeseen suunnataan peptidi, joka koostuu SOR-C13 ja SOR-C27; Kanada 2544467 peptidin suunnattu farmaseuttisiin koostumuksiin ja lääketieteellisiä hoitoja; US 12/824935 ja TRPV6 sitovat peptidit, jotka käsittävät kaikki tai osan SOR-C27 konjugoitu biomolekyylin. JMS ilmoittaa PCT-hakemuksia kansakunnan vaiheessa Kanada (CA 2766272), Eurooppa (EU +10791109,1), Hong Kong (sarjanumero +12110289,5), Japani (JP 2012-516450), Meksiko (MX /a /2012/000086) ja Brasilia (PI1012676 -9). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Pohjois-Amerikassa 1 70 naista kehittää munasarjasyöpä niiden käyttöikää. Huolimatta viime aikoina saavutetut edistysaskeleet henkilökortteja, munasarjasyöpä edelleen vaikea havaita ja tunnistetaan tyypillisesti vasta kun se on metastasized muihin kehon osiin [1]. Ennuste alkuvaiheen havaitseminen on välillä 70%: sta 100% eloonjäämisluvut; kuitenkin, 70% tapauksista diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa, joissa 5 vuoden pysyvyys on vain 15% ja 25% [2]. Tällä hetkellä ei ole luotettavia ei-invasiivisia toteamistulokset olemassa munasarjasyöpä.

kalsiumpitoisuus huolellisesti säännelty solun osiin kautta integroidun toiminnan eri kalvon kanavat ja pumput. Viime vuosien tietyt perheen jäsenet kalsiumionin tulva kanavat, kutsutaan TRPV kanavat, ovat nousseet mahdollisina syövän biomarkkereita, jotka saattavat osoittautua arvokkaita kehittää parempia kasvaimen havaitsemisen ja /tai kohdennettuja lääkehoito. Vuonna 1999 novel kalsiumkanavien raportoitu kanin munuaistiehyessä [3], ja rotan ruuansulatuskanavassa [4] kutsutaan ECaC1 ja CAT1, vastaavasti, jotka muistuttivat kapsaisiini-reseptorin (vanilloidireseptorin, VR1) [5]. ECaC1, Cat1, ja VR1 osoittautui liittyvän ohimenevä reseptorin potentiaali (TRP) kalsiumkanavan in

Drosophila

joka välittää photoreception [6] – [8]. Tähän mennessä ainakin 30 TRP kanava homologeja on todettu nisäkkäillä, jotka on jaettu kuuteen keskeiseen alaperheiksi: trpA (ankyriiniproteiinista), TRPC (kanoninen), TRPM (melastatin), TRPML (mucolipin), TRPP (polycystin) ja TRPV (vanilloidi ) [9] – [11]. TRPV alaryhmä kuusi jäsentä nimettiin TRPV1 on TRPV6. Ensimmäiset neljä kanavaa liittyvät läheisesti toisiinsa ja ovat rooleja tunnistus eri panokset kuten venytys, kuumuus, happamuus, haitallisille vaikutuksille (nosiseptioon) ja kipu [9], [11]. Nämä kanavat näytteille suhteellisen alhainen selektiivisyys kalsiumionin (P

Ca /P

Na ~ 1 ja -15). Sen sijaan TRPV5 ja TRPV6 ovat erittäin kalsium ioni-selektiivisiä (P

Ca /P

Na~100). Molemmat näistä kanavista on ilmaistu apikaalisella kalvoja eri kudoksissa, mukaan lukien munuainen, suoli, haima ja eturauhasen [12] – [14]. Esimerkiksi, TRPV5 ilmaistaan ​​distaalisessa tubulukset munuaisten, jossa se toimii takaisinimeytyminen kalsiumionin ennalta-virtsasta [12]; TRPV6 on hallitseva ruoansulatuskanavassa, jossa se osallistuu apikaalisella tulo kalsiumin [14].

TRPV6 on osallisena kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [15] – [18]. TRPV6 proteiini on yli-ilmentynyt karsinoomat munasarjojen ja muiden syövän, kuten rinta-, paksusuoli-, eturauhas- ja kilpirauhasen [14]. TRPV6 mRNA on kohonnut erilaisissa kasvainsolulinjoissa lukien paksusuolen, ihmisen leukemian ja eturauhasen [19] – [23]. Eturauhassyövän, TRPV6 mRNA-tasot korreloivat positiivisesti kasvaimen etenemiseen ja aggressiivisuus kuten osoitetaan Gleason pisteet, patologinen vaiheessa ja extra-eturauhasen etäpesäkkeitä [20], [24]. Todellakin, TRPV6-positiivisia eturauhasen kasvaimet ovat huonon ennusteen takia taipumus tunkeutua ympäröivään kudokseen [25].

välinen yhteys kasvaimen kasvua ja yli-ilmentyminen TRPV6 voi liittyä voimistaa kalsium-riippuvaisen soluproliferaation ja apoptoosin inhibitio. Schwarz et ai. [26] osoitti, että pieniä annoksia Econazole kapasitiivinen kalsium sisäänvirtausta esto, vähensi sekä kalsiumin sisäänvirtaus signaalit ja solujen lisääntymistä in HEK-293-solut transfektoitu TRPV6. Vuonna LNCaP eturauhassyöpäsolulinja, säätely ylöspäin TRPV6 augments leviämisen ja solujen eloonjäämistä hidastetaan apoptoosin mekanismilla, näyttää liittyvän aktivoitumisen tumatekijä aktivoitujen T-solujen (NF-AT) transkriptiotekijä [27]; vähentäminen TRPV6 siRNA pienentää proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin. Rintasyöpäsoluissa, tamoksifeeni vähentää ilmentymistä TRPV6 ja kalsiumin signalointia, vaikutus, joka saattaa osittain selittää syövän vaikutukset tämän estrogeeniantagonistiksi [28]. Lisäksi knockdovvn TRPV6 siRNA paransi tehokkuutta tamoksifeenin. Näin ollen kuten on ehdotettu tuoreessa julkaisussa esto TRPV6 kanavan tarjoaa uudenlaisen terapeuttisen strategian kasvainten yli-ilmentävät TRPV6 kanavan [29].

Soricidin (hakunumero P0C2P6) on uusi paralyyttistä peptidin eristetyt alaleuan sylki rauhasten lyhythäntäpäästäinen (

Blarina brevicauda

, yksi yleisimmistä nisäkkäistä Atlantin Kanada) ja raportoitu estävän kalsiumin ottoa

kautta

TRPV6 kanavien [ ,,,0],30]. Sen jälkeen, kahden peptidin sekvenssit C-päähän soricidin (SOR-C13 ja SOR-C27, taulukko 1) on esitetty sitoutuvan TRPV6 munasarjan syöpäsolujen suurella affiniteetilla [31]. Tässä me kuvaili TRPV6 sitoutumisominaisuuksia SOR-C13 ja SOR-C27 ja kyky näiden peptidien kohdistaa ihmisen ovariokasvainten vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Konjugoimalla peptidit fluoresoivalla väriaineella tai magneettikuvaus (MRI) varjoainetta, pystyimme tarkkailemaan bio-keskittymisen ja bio-jakelun peptidien

in vivo

lopulta kuvantamisen ilmentävien kasvainten TRPV6. Nämä havainnot avaavat uusia diagnostisia ja /tai terapeuttisia keinoja varhaisen havaitsemisen ja munasarjojen kasvaimia ja mahdollisesti muiden TRPV6-rikas kasvaimet mukaan lukien rinta-, paksusuoli-, eturauhas- ja kilpirauhasen, sekä tietyt leukemiat ja lymfoomat.

Materiaalit ja menetelmät

peptidit

sekvenssit soricidin, SOR-C13 ja SOR-C27 peptidit on esitetty taulukossa 1. peptidit valmistettiin CanPeptide (Montreal, Kanada ) kiinteän faasin synteesissä. SOR-C13 ja SOR-C27 osoitti odotetun molekyylimassa ajan-of-lennon massaspektrometriaa (M

+ H

+ of 1566,42 ja 2958,02) peptidillä puhtaus (HPLC) 96,9% ja 96,8% tässä järjestyksessä . Peptidi sisältö lyofilisoidun valkoista jauhetta (trifluoriasetaattisuola) oli 83,5% ja 65,2%. Myöhemmät peptidipitoisuudet laskettiin perustuen vapaa emäs peptidi.

Solution NMR rakenne SOR-C27

Näytteiden esikäsittely.

Ydinmagneettisen resonanssin (NMR) spektroskooppiset tiedot oli hankittu määrittää konformationaaliselle rakenteelliset piirteet SOR-C27-peptidin eri olosuhteissa. Kantaliuos (näyte # 1) 10 mM SOR-C27 valmistettiin 90/10 H

2O /D

2O 50 mM kaliumfosfaattipuskuria pH 6,6. Näytteestä # 1, kolme ylimääräistä näytteet valmistettiin: # 2) kantaliuosta 200 mM NaCl, # 3) kantaliuosta 100 mM dodecylphosphocholine (DPC) ja # 4) kantaliuosta laimennetaan 2 mM 100 mM natriumdodekyylisulfaattia (SDS ). Näyte # 1 hankittiin lämpötiloissa alueella 274-308 K. peptidi oli täysin liukoinen kaikissa ratkaisuihin ja kaikissa olosuhteissa.

NMR-spektroskopia.

Näytteet 1-3

1H-NMR-tiedot esitetään koottiin DRX-500-spektrometrillä (Bruker Biospin AG, Fällanden, Sveitsi), jotka toimivat 500,13 MHz käyttäen 1 mm OD H [CN] koetin. Näytteen 4,

1H (ja välillisesti

13C ja

15N) NMR-aineistoja kerättiin koskevasta AVANCEIII 700 spektrometri toimii 700,13 MHz käyttäen 1,71 mm: n OD HC [N] koetin.

1 H kemialliset siirtymät olivat referenssinä 2,2-dimetyyli-2-silapentaani-5-sulfonaatti läpi veden resonanssin kalibroitu kussakin lämpötilassa.

13C ja

15N kemialliset siirtymät olivat epäsuorasti viitattu läpi

1 H viittaaminen.

rakenteellinen määritys näytteet 1 ja 4, vaiheherkällä 2D

1 H-

1H NOESY aineistoja (120, 250 ja 400 ms sekoitusaika) ja

1 H-

1H TOCSY (MLEV17; 120 ms sekoitusaika, näyte 4 DIPSI-2; 90 ms sekoitusaika) aineistoja tallennettiin ennalta -saturation tai pehmeällä pulssi veden tukahduttaminen. Tietueet kerättiin 1024 × 380 monimutkainen pistettä, apodized kanssa 70 ° siirtynyt sini-neliö-bell ikkunatoiminto molempiin suuntiin, nolla täytetty ja lineaarinen ennustettu epäsuora mitta, jolloin saatiin lopullinen 2D kirjon 2048 × 2048 todellinen pistettä.

lujuuslaskelmat.

NMR-spektrit analysoitiin, ja piikkien asemat ja tilavuudet määritettiin käyttäen Sparky 3.110 ohjelmisto toimii Linux PC-järjestelmä. Rakenteellisiin määritys, kaikki spin järjestelmien tunnistettiin kemialliset siirtymät ja ominaispiirre TOCSY rajat huippu kuvioita. Sivuketjun ja takaisin luun resonanssit Asn7, Thr9, Phe17 ja Val23 oli helppo siirtämän ainutlaatuisen TOCSY kuvioita ja jokainen jäännös esiintyy vain kerran järjestyksessä. Alkaen nämä jäännökset, sekvenssispesifisiä toimeksiannot selkäranka ja sivuketjun resonanssit määritettiin käyttäen standardimenetelmiä,

eli

alkaen helposti määritetty tähteet, viereisten tähteet peräkkäin määritettiin seuraamalla H

α

i

H

N

i + 1

ja H

N

i

H

N

i + 1

NOESY yhteyksiä. Kun vierekkäiset tähteet tunnistettiin, pidemmän matkan NOESY yhteyksiä määrättiin. Sillä rakenne laskelmat SOR-C27 puskuroituun veteen, DPC ja SDS misellejä, etäisyys rajoituksiin määritettiin integrointi rajat huiput 250 ms (näyte 4, 200 ms) NOESY spektri, ja luokitellaan neljään ryhmään: voimakas, keskikokoinen , heikko ja hyvin heikko vastaavat välisen protonin Etäisyysalueet 2,3, 2,0-3,5, 3,3-5,0, ja 4,8-6,0 Å, vastaavasti.

Kaikki rakenteelliset laskelmat perustuivat aikaisempiin tutkimuksiin käyttäen XPLOR 3.1 ohjelmistopaketti. Lyhyesti, ensimmäisen satunnaisen kelan laajennettava rakenne, käytettiin tuottamaan yhteensä 50 upotettu rakenteisiin. Tiiviit yhteydet poistettiin energian minimointi 1000 konjugaattigradienttimenetelmä vaiheet ennen siirtymistä hillitty simuloitu jäähdytys molekyylidynamiikan (MD) laskelmat. Kahdeksan porrasta, joka käsittää yhteensä simulaation aikana 120 ps käytettiin MD-simulaatiot. Aluksi järjestelmä asetettiin 1500 K ja kaikki voima vakioita liimata, NOESY ja sitoutumattomien yhteisvaikutuksia ei skaalattu 10% niiden koko arvot. Kun kolmas vaihe, voima vakiot oli lineaarisesti skaalattu täyden arvoihin. Viiden viime vaihetta lämpötila laskettiin tasaisesti 300 K Laskettu rakenteet sitten energia minimoidaan 2000 konjugaattigradienttimenetelmä vaiheita.

Diffusion määräsi spektroskopia (DOSY) pystyy tarkasti määrittää diffuusiovakiot molekyylien liuoksessa . DOSY tiedot hankittiin SOR-C27 /SDS näyte. 3 kDa SOR-C27 peptidejä ja 80 kDa SDS siinimisellien samanlainen diffuusionopeuksista sopusoinnussa vahva sitoutuminen peptidin SDS misellit.

Culture solulinjojen

transfektio ja yliekspressio TRPV6 HEK-293-soluja.

Ihmisen HEK-293-soluja (6-9 kohdat) maljattiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 5 x 10

5 solua kuoppaa kohti, 24 tuntia ennen transfektiota . Kukin kuoppa laimennettiin seerumittomalla alustalla ja inkuboidaan 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, sitten yhdistettiin hitaasti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa. Jälkeen 20 minuutin inkuboinnin jälkeen solut altistettiin transfektion, joka koostuu 0,5 ug PDI-CaT-L plasmidi-DNA (lahja Dr. V. Flockerzi, Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Universität des Saarlandes [23]), ja 1,5 ui Lipofectamine-2000 reagenssia. PDI-CaT-L on bisistroninen sisältävä ekspressiovektori cDNA proteiinia koodaavan alueen TRPV6 ja mutatoidun vihreä fluoresoiva proteiini (S65T; EGPF), joita erottaa sisäinen ribosomin ilmaisu päällä (β-aktiini-promoottori /KOZAK /TRPV6 /IRES /EGFP in pCAGGS) [23]. IRES oli peräisin enkefalomyokardiittivirukselle [32]. Transfektio HEK-293-solujen kanssa bisistroninen vektori mahdollistaa samanaikaisen tuotannon TRPV6 ja EGFP ja valintaa fluoresoivien solujen tuottamiseksi TRPV6 varten elektrofysiologiaan mittauksiin. Aiempien tutkimusten käyttämällä tätä plasmidia ja muita vastaavia plasmideja, se määritettiin, että TRPV6 kanava ilmentyy voimakkaasti, paikallistaa kalvon pinnalla, glykosyloituja ja konstitutiivisesti aktiivista synnyttäen Ca

2 + -invoked sisäänpäin nykyisen [33] – [35].

Culture syöpäsolulinjois-.

Kaikki solulinjat saatiin American Type Cell Collection ja kasvatettu suositeltavat 37 ° C: ssa ilmakehässä 5% CO

2. SKOV-3 (ATCC HTB-77) on tuumorisolulinja alunperin johdettu askeettinen nestettä naispuolisen rekisteröidylle munasarjakasvain. Ne viljeltiin McCoyn 5a, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). DU145 (ATCC HTB-81) on kasvainsolu, joka on peräisin aivojen vaurion miespuolisella kohteella, jolla on metastaattinen eturauhassyöpä. Ne viljeltiin Eaglen Minimum Essential Medium (ATCC), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää. SKOV-3 ja DU145 ovat tuumorigeenisia CD-1 nude-hiiriin, jotka muodostavat primääri munasarjojen ja eturauhasen adenokarsinooman, vastaavasti.

TRPV6 elektrofysiologia.

Kokosolun Laastaripuristinmittaukset suoritettiin HEK-293 solut, jotka ilmentävät TRPV6 ja EGFP. Transfektoidut solut tunnistaa helposti ulkopuolisten transfektoiduista soluista käyttäen fluoresoivaa Axiovert 135 mikroskoopilla (Olympus). Nauhoitukset tehtiin käyttäen Axopatch 1D vahvistinta ohjataan ja seurataan pClamp 9 -ohjelmiston (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Tietokokonaisuuksien digitoitiin 20 kHz ja suodatettuna 2 kHz. Patch-pipetit vedettiin borosilikaattilasista käyttäen P-80C pipetillä (Sutter Instrument, San Rafael, CA, USA), ja oli vastuksia 2-4 MQ kun täytetään pipetin sisältävä liuos: 145 mM cesium-metaanisulfonaatti, 8 mM NaCl, 1 mM MgCl

2, 3,64 mM CaCl

2, 10 mM HEPES ja 10 mM EGTA: ta (puskurin solunsisäistä Ca

2+), jonka pH säädettiin arvoon 7,2 käyttäen CsOH. Solunulkoisen sisälsi: 145 mM NaCl, 10 mM CsCl, 10 mM CaCl

2, 2 mM MgCI

2, 2,8 mM KCI, 10 mM HEPES ja 10 mM glukoosi pH säädetty arvoon 7,2 NaOH: ta käyttämällä.

eristämiseksi TRPV6 virtaukset, HEK-293 ja transfektoitiin HEK-293-solut olivat jännite-lukitaan +50 mV 50 ms lineaarinen jännite ramppi (-110 mV +90 mV) protokollaa sovelletaan läsnä ollessa tai puuttuessa TRPV6 estäjä, La

3 + ioneja (10 uM), SOR-C27, SOR-C13 tai SOR-C27-Cy5.5. Vaikka La

3+ ioni on ei-spesifinen estäjä ei tällä hetkellä ole tiedossa selektiivinen TRPV6 kanavan. Ramppi oli keskimäärin 10 kertaa 2 s välein välillä ramppien.

Analyysi suoritettiin off-line käyttämällä IGOR (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR, USA) ohjelmiston. Tilastollinen merkittävyys määritettiin pariksi Opiskelijan t-testiä (kaksisuuntainen). Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM, joiden

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävinä.

Imaging tutkimukset

Tuotanto kasvaimista kuvantamistutkimukset.

Kuten aiemmissa tutkimuksissa, CD-1 karvattomia hiiriä (6-8 viikkoa vanhoja, Charles River) käytettiin fluoresenssileimayhdistei- (uroshiirillä) ja MK (naaras hiiret) tutkimuksissa [36], [37]. Hiiriä pidettiin häkeissä ryhmissä kolmesta viiteen, ja pidettiin 12 tunnin valo /pimeä aikataulu 22 ° C ja suhteellinen kosteus 50 ± 5%. Steriloitu ruokaa ja vettä oli vapaasti saatavilla. Ihonalainen kasvaimen istutuksen suoritettiin hiirillä kevyessä isofluoraani anestesiassa. SKOV-3 tai DU145 (6 x 10

6 solua /50 ui Matrigel laimennus 1:01 suolaliuoksessa) istutettiin vasempaan kylkeen hiiristä käytettiin fluoresenssi tutkimuksessa taas 1 x 10

7 SKOV-3 solut injektoitiin hiirille, joita käytetään MRI tutkimuksessa. Koko kasvaimia, lasketaan kaavalla pituus x leveys

2/2, seurattiin jarrusatulat. Yli 6 viikon aikana, kasvainten kasvanut maksimikoko 300 mm

3. Tämä tutkimus tehtiin tiukka mukaisesti ja noudatettava Kanadan neuvoston Animal Care. Protokolla hyväksyttiin Animal Care komitean Dalhousien yliopisto (protokolla # 09-047). Kaikki Leikkaus suoritettiin asianmukainen anestesiassa ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

valmistaminen SOR-C27-Cy5.5 varten Fluoresoiva Studies.

SOR-C27 (6,64 x 10

-4 mmol) johdannainen ainoa Cys14 tioliryhmä saattamalla reagoimaan 25% suurempi kuin maleimidijohdannaista Cy5.5 (8,86 x 10

-4 mmol; GE Healthcare Amersham) mukaisesti annetuilla ohjeilla. Merkittyjen peptidi erotettiin reagoimattomasta komponentteja käyttäen Sephadex G-25-kolonnista (20 x 1,5 cm). Fraktiot, jotka sisälsivät koodattu peptidi lyofilisoitiin ja puhtaus varmistettiin HPLC: llä.

Koska SOR-C13 ei sisällä yksittäinen uniikki konjugaatio sivusto, kytkemällä peptidi on Cy5.5-NBS esterin (GE Healthcare Life Sciences. Baie d’Urfé, QC) johti sekoitus tagged peptidien kautta Lys1 ja Lys8. Näin ollen sitova ja fluorescents tulokset voitaisiin vinossa ja siten vain alustava

in vivo

tutkimukset tehtiin.

valmistelu ja luonnehdinta SPIO- (SOR-C27)

x MRI tutkimuksiin .

Monitoring biodistribuutio MRI perustuu varjoainetta, kuten super-paramagneettinen rautaoksidi (SPIO) helmet voidaan kemiallisesti kiinnittyneet kiinnostava yhdiste SOR-C27 (SOR-C13 ei käytetty, koska se ei sisältävät yhden ainutlaatuinen konjugaatio site). SPIO helmiä funktionalisoitu maleimidiryhmiä (MicroMod 77-96-201) käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Helmet saatettiin reagoimaan 5-kertainen molaarinen ylimäärä on juuri valmistettu ja puskuroitu SOR-C27 (1 mM, 50 mM PBS, pH 7,2) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seos laimennettiin 50% metanolia ja sentrifugoidaan 400 RCF, kunnes supernatantti oli lievä punainen väri, jolloin saatiin pelletti SOR-C27 funktionalisoitu SPIO helmiä. SPIO-peptidi pelletti pestiin ja suspendoitiin uudelleen steriiliin Dulbeccon PBS: ää (DPBS) pitoisuuteen 2,5 mg Fe /ml injektiota varten hiiriin. Ohjaukseen, SPIO helmet valmistettiin saattamalla maleimidi-funktionalisoitu helmiä juuri valmistetulla kysteiini liuosta käytetään vastaavaa protokollaa. Kysteiini lohkot maleimidiryhmiä helmien tekevät niistä ei-reaktiivinen.

määrä SOR-C27 peptidit per helmi määritettiin kvantitatiivisen

1H-NMR-analyysi supernatantin määrittää useita reagoimatta peptidi molekyylejä. Keskimäärin 75 SOR-C27-molekyylejä konjugoitiin kullekin SPIO hiukkanen. Konjugaatio peptidin helmiin varmistettiin trypsiinillä pilkkomalla helmisuspensiota ja analyysi vapautunut peptidifragmenttien massaspektrometrialla. Pilkkomisen jälkeen ja poistamalla helmiä sentrifugoimalla, tuloksena supernatantti sisälsi kaksi peptidifragmenttien sekvenssien kanssa sopusoinnussa katkaisua SOR-C27-peptidin.

loisteputki kuvantaminen perustamiseen ja tiedonkeruu.

kaikki optisen kuvantamisen kokeet suoritettiin käyttäen pientä-eläin aikatason tutkia Optix MX2 prekliinisiin lämpökamera, ja kuvat analysoitiin tai rekonstruoitu kuten fluoresenssi keskittyminen karttoja ART Optix Optiview analyysin ohjelmisto 2.0 (Advanced Research Technologies, Montreal, QC). 670 nm pulssi laserdiodin, jonka toistotaajuus 80 MHz ja aika resoluutio on 12 ps valopulssin käytettiin viritykseen. Fluoresenssiemissio 700 nm kerättiin erittäin herkkä aikakorreloitua yhden fotonin laskenta järjestelmä ja havaita nopeasti valomonistinputkella. Tiedot kirjattiin ajallinen point-leviäminen toiminnot (TPSF). Kuvantaminen, isofluoraani nukutettu hiiriin sijoitettu eläimen vaiheessa kammioon, joka mahdollisti ylläpitoon kaasumaisen anestesian.

Kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden -300 mm

3, SOR-C27-Cy5.5 (100 ug) injektoitiin intraperitoneaalisesti (ip) osaksi TRPV6-positiivisia (SKOV-3) vierassiirrettä kasvain kantavissa hiirissä, ja optisesti kuvannetaan useita aikavälein (0,5, 1, 2, 4 ja 24 tuntia) injektion jälkeen. Kilpailevan tutkimuksissa tunnisteettomat SOR-C27-peptidin (10 mg) injektoitiin 10 minuuttia ennen injektiota Cy5.5 tagged SOR-C27 (100 ug). Lopussa kuvantamisen, eläimet tapettiin syvässä anestesiassa sydämensisäisellä perfuusio käyttämällä suolaliuosta. Elimet ja kasvain leikattiin irti ja skannattu

ex vivo

optisen imager.

fluoresoiva kuvantamisen käsittelyyn ja analysointiin.

ART Optix Optiview analyysin ohjelmisto käytettiin arvioitaessa fluoresenssi vaimenemisnopeus. Ohjelmisto de-sekava mitattu fluoresoiva intensiteetti ajan vaimennuskäyrää käyttäen Levenberg-Marquardt-algoritmin, joka soveltaa epälineaarista pienimmän neliösumman minimointi Algoritmi kertoimet usean eksponentiaalinen laajeneminen fluoresenssin rappeutuminen. Kahden eksponentin Liitäntävarusteet käytettiin, ja pitkä (τ

1) ja lyhyt (τ

2) fluoresenssin elinikä komponentteja sekä niiden painotettu keskiarvo (τ

av), olivat automaattisesti lasketaan seuraavaa yhtälöä:

missä A

1 edustaa amplitudi ensimmäisen räjähdysmäinen fluoresenssi ja A

2 edustaa amplitudi toisen räjähdysmäinen fluoresenssi.

Magneettikuvaus metodologia.

Kaikki MRI suoritettiin sijoitukset Magnex Scientific 3 Tesla kliinisessä pään MR skanneri (Oxford, UK) jälkivarustaa pieneläinten kuvantaminen käyttäen Magnex Scientific gradienttikela (sisähalkaisija 21 cm; maksimi toiminta kaltevuus vahvuus 200 mT /m) rajapinta Varian Inc. Direct Drive spektrometri (Palo Alto, CA). 25 mm ID ”Litzcage” Quadrature-RF-kelasta (Doty Scientific, Columbia, SC), viritetty 128,8 MHz, käytettiin lähetys /vastaanotto-tilakelaa kuvantamiseen.

In vivo

kuvat saatiin käyttämällä 3D tosi-FISP (T2 /T1 painotettu) kuvantaminen sekvenssin. Toistoaika (T

R), kaikuajan (T

E), flip kulma ja kaistanleveyden (BW) on optimoitu parhaan kuvanlaadun. Sekvenssi koostui T

R /T

E = 8/4 ms, flip kulma = 30 ° ja BW = 50 kHz. Näkökenttä (FOV) 38,4 x 25,5 x 25,5 matriisikoodatun mitat 256 x 170 x 170 hankintaan käytettiin 150 um

3 isotrooppinen spatiaalinen resoluutio kuvia 6 signaali keskiarvot (~48 minuuttia per magneettikuvaus). Tämä FOV mahdollisti samanaikaisen kuvantamisen kasvaimen sivuston sekä nivusten ja polvitaipeen imusolmukkeet.

Hiiret nukutettiin kyllästysannoksella 3% isofluoraani (100% happea) kanssa induktiokammiota, ja siirrettiin integroitu nokkakartioon ja RF kela kuvantaminen kelkka (kehitetty house) ylläpitäminen 1,5-2% isofluoraani ajaksi MRI scan. Hengitystiheys ja sisäinen ruumiinlämpö hiiriä seurattiin MRI yhteensopivia fysiologisten seuranta- ja portitusjärjestelmässä (SA Instruments Inc, Stony Brook, NY). Sisäinen ruumiinlämpö hiiren (mitattu rektaalisesti), pidettiin 37 ± 1 ° C: n kautta, lämpötila takaisinkytkentäsilmukan ja ilman lämmitys.

Hiiret injektoitiin -300 ui, joka vastaa noin 24 mg Fe /kg kehon painosta joko kysteiini tukossa SPIO helmiä (CYS-SPIO; ohjaus,

n

= 9) tai SOR-C27 konjugoituja helmiä (SOR-C27-SPIO;

n

= 9) joko laskimoon (iv) tai ip injektio ja kuvattiin 2 tuntia (päivä 0) ja 26 tuntia (päivä 1) injektion. Baseline skannaukset (päivä -1) kunkin hiiren tehtiin myös ennen injektioita, jotka mahdollistavat asianmukaisen vertailun kasvain ja imusolmuke morfologia ja kontrasti ennen ja jälkeen injektion. Kun MRI aika-kurssi, eläimet tapettiin ja kasvaimet otettiin heti irrotettiin histologista /biokemiallisia analyysi.

MRI Image Processing.

Kaikki kuvat olivat ensimmäinen nolla-täytettiin ImageJ (NIH) ohjelmisto . Kuvat otettiin yhteistyössä rekisteröity rview (Colin Studholme, University of California) kullekin hiirelle. Puoliautomaattista tilavuus segmentointi rutiini toteutettiin kautta segmentointi sisään rview selvittää tarkasti kasvainten.

Tulokset

Solution NMR rakenne SOR-C27

Tietoa SOR-C27 peptidi sekundaarinen rakenne saatiin tutkimalla H

α kemialliset siirtymät kolmen eri olosuhteissa, 10 mM fosfaattipuskuroitu vesi, natriumdodekyylisulfaatti (SDS) ja dodecylphosphocholine (DPC). Rakennelaskelmat hyödyntämällä ydin- Overhauser- vaikutus (nOe) etäisyys rajoituksiin 10 mM SOR-C27 puskuroituun veteen, NaCl tai DPC (Fig. 1A) tuotti yhteensä 40 alimman energiarakenteet jokainen joka ei ollut rikkomuksia NOESY rajoitteiden 0,5 Å . Koska yksikään osan peptidin voitaisiin tunnistaa hyväksymällä säännöllinen rakenne, rakenteelliset oikeellisuustarkistuksista ei ole tehty. Kuitenkin SDS misellejä muutoksiin amidi

1 H kemialliset siirtymät havaittiin jäämiä Lys15, Phe17, Leu18, His19, Ser21, Val23, ja Arg27 osoitus rakenteellisesta muutoksesta anionisen ympäristössä. Rakenne laskeminen SOR-C27 100 mM SDS misellien avulla nOe etäisyyden rajoitusten tuotti kaksi kierrosta olevan α-heliksin (tähteet 15-25), joka oli yhdenmukainen top 10 alin energia rakenteiden 50 lasketaan (Fig. 1 B) .

edustaja NMR liuos rakenteen 10 mM SOR-C27 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, 200 mM NaCl tai 100 mM dodecylphosphocholine (A). Edustava NMR ratkaisu rakenne 2 mM SOR-C27 anionisiin 100 mM natriumdodekyylisulfaattia misellejä osoittavat induktion kierrejouset rakenne jäännöksistä 15: stä 25 (B).

elektrofysiologia of TRPV6 ja SOR-C27 ja SOR -C13

Wild-type HEK-293-solut eivät ilmennä TRPV6 kanavia.

Elektrofysiologiset kokeet suoritettiin HEK-293-solut, jotka on transfektoitu TRPV6 kanavia. Ensinnäkin, sulkea pois esiintyminen TRPV6 kanavien villityypin HEK-293-soluihin, koko solun patch clamp tallenteita, joissa on 50 ms lineaarinen jännite ramppi (-110 mV +90 mV) levitettiin puuttuessa tai läsnä La

3 + ioneja (10 uM). Lantaani-ionit, jotka estävät TRPV6 nykyinen, ei ollut vaikutusta nykyiseen amplitudien herättämän ramppi (kontrolli: 106 ± 27 Pa La

3 + ionit: 111 ± 13 pA,

n

= 3;

p

0,05, Fig. 2). Koko solun patch clamp tallenteet HEK-293-solut transfektoitu TRPV6 /EGFP ostettiin puuttuessa tai läsnä La

3 + ioneja (10 uM). Lantaani-ionit vähensi amplitudit TRPV6 virtojen herättämän rampit 82 ± 5% (kontrolli: 1065 ± 450 Pa La

3 + ionit: 224 ± 105 Pa

n

= 3; Fig . 2). Amplitudit virtojen mieleen tuoma ramppi villityypin HEK-293 (106 ± 27 pA,

n

= 3) olivat merkittävästi pienemmät (

p

= 0,002) kuin virtoja TRPV6 /EGFP transfektoiduissa HEK-293-soluja (1065 ± 450 pA,

n

= 3).

mitatut virrat villityypin HEK-293-solut ovat induktiivisia mitään yli-ilmentyminen TRPV6 kanavia. Sillä TRPV6 /EGFP HEK-293, puuttuminen La

3 + ioneja oli suuri nykyinen nykyisen käytetä tehokkaasti estetty läsnäollessa La

3 + ioneja. Vaikutus La

3 + ioneja (10 uM) virroista herättämän 50 ms ramppi (alhaalla) villityypin HEK-293-soluihin ja TRPV6 /EGFP HEK-293-soluja.

SOR -C13 ja SOR-C27 vähentää amplitudi TRPV6 virtaukset.

Samanlaisia ​​tutkimuksia suoritettiin luonnehtia n nousevien konsentraatioiden vaikutusta peptidien SOR-C13 ja SOR-C27 on TRPV6 kanavilla. Kun läsnä on 83,5 nM, 417,5 nM, 835 nM ja 25 uM SOR-C13 amplitudi TRPV6 virtojen väheni 18 ± 4,0% (

p

0,05,

n

= 9), 22 ± 4% (

p

0,05,

n

= 9), 24 ± 4% (

p

0,05,

Kuva.