Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Voit löytää uusia merkkiaineita määrä tehostaa haimasyövän (PC) diagnoosi The secretome kahden PC solulinjojen (BxPC-3 ja MIA PaCa-2) oli profiloitu. UL16 sitova proteiini 2 (ULBP2), yksi proteiineista yksilöityjen PC solussa secretome, valittiin arviointia biomarkkerina PC havaitsemiseksi, koska sen mRNA-tasolla havaittiin myös merkittävästi koholla PC kudoksissa.

menetelmät

ULBP2 ilmentymisen PC kudoksissa 67 potilasta tutkittiin immunohistokemiallisesti. ULBP2 seerumissa 154 PC potilaiden ja 142 tervettä verrokkia mitattiin helmi-immunomääritys, ja tehoa seerumin ULBP2 PC havaitsemiseksi verrattiin laajalti käytetty serologinen PC markkeri hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA 19-9).

tulokset

immunohistokemiallinen analyysit paljastivat kohonnut ilmentyminen ULPB2 PC kudoksissa verrattuna viereisen ei-syöpä kudoksiin. Samaan aikaan seerumin ULBP2 kaikkien PC potilaat (n = 154) ja aikaisen vaiheen syöpäpotilaille olivat merkittävästi korkeammat kuin terveillä verrokeilla (

p

0,0001). Yhdistelmä ULBP2 ja CA 19-9 ylitti kunkin merkin yksinään erottavien PC potilailla terveistä yksilöistä. Tärkeää on, analyysi ala vastaanotin toimii ominaiskäyrät osoitti ULBP2 oli ylivoimainen CA 19-9 in discriminating potilailla, joilla on varhaisen vaiheen PC terveiden verrokkien.

Johtopäätökset

Yhdessä meidän tulokset osoittavat, että ULBP2 voi edustaa uusia ja käyttökelpoisia seerumin biomarkkeri haimasyövän seulontaan.

Citation: Chang YT, Wu CC, Shyr yM, Chen TC, Hwang TL, Yeh TS, et ai. (2011) Secretome-Based tunnistaminen ULBP2 uutena seerumimarkkerina Haimasyöpä Detection. PLoS ONE 6 (5): e20029. doi: 10,1371 /journal.pone.0020029

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2011; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 20, 2011

Copyright: © 2011 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Taiwan National Science (NSC 96-2320-B-182-031-MY3), Department of Health (DOH-99-TD-C-111-006), ja opetusministeriö (EMRPD180241 ja EMRPD180091). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden Yhdysvalloissa, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 7% [1], [2]. Vuonna 2010 yli 43000 uutta PC tapauksissa arvioitiin kehittää ja 36800 kuolemantapausta odotettiin Yhdysvalloissa [1]. Taiwanissa, se sijoittui kymmenes joukossa syöpään liittyvien kuolemien vuonna 2008 ja osoittaa lisääntynyt kuolleisuus viime vuosikymmenen aikana [3]. Aikaisen leviämisen PC ja myöhäinen ilmeisiä oireita, alle 8% PC potilaista diagnosoidaan lokalisoitu vaiheessa, kun kirurginen hoito on mahdollinen [1], [4], [5]. Niinpä on olemassa kiireellinen tarve kehittää parempia strategioita varhaista havaitsemista PC.

Nykyinen lähestymistapoja PC diagnoosi perustuvat pääasiassa kuvantaminen ja endoskooppisilla menetelmillä [6], joka, koska vatsakalvontakaiset sijainti haiman , on rajallinen todennäköisyys varhaisen diagnoosin [7], [8]. Nousua seerumin hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA 19-9) on laajalti käytetty PC havaitseminen; mutta tämä lähestymistapa on riittämätön suhteessa sekä spesifisyys ja herkkyys [6], [9], [10]. Lisäksi CA 19-9, yli 40-proteiineja on raportoitu mahdollisina serologinen biomarkkereita PC havaitsemiseksi [11]. Valitettavasti useimmat ovat joko rajoitettu spesifisyys ja /tai herkkyys, tai odotettava validointi laajamittaisen kohortti yksilöitä [11] – [17], vaikka näyttöä siitä, että käyttö kombinatoorista biomarkkereiden paneeli parantaa tarkkuutta PC diagnoosi [12] . Siksi löytö uusia ja käyttökelpoisia seerumimarkkereiden voisi helpottaa parantamaan PC diagnoosi ja /tai prognoosi.

Äskettäin secretome perustuvia lähestymistapoja on yleisesti käytetty määritettäessä mahdollisia syövän biomarkkereiden [18], [ ,,,0],19]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme analysoineet secretome kaksi PC-solulinjojen, BxPC-3 ja MIA PaCa-2 ja arvioitiin yksi tunnistetuista proteiineista, UL16 sitova proteiini 2 (ULBP2), mahdollisena PC biomarkkereiden. Immunohistokemiallinen värjäys Tulokset vahvistivat kohonneita ULBP2 PC kudoksissa verrattuna viereisen ei-syöpä kollegansa. Helmi-pohjainen immunomäärityksissä edelleen vahvisti kohonnut seerumin ULBP2 PC potilailla verrattuna terveisiin yksilöihin. Tärkeintä on, yhdistetty käyttö ULBP2 CA 19-9 parantunut herkkyys ja tarkkuus PC varhaisen havaitsemisen tässä tapauksessa verrokkitutkimuksen, joka tarjoaa lupaava lähestymistapa PC diagnoosi varhaisessa vaiheessa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasjoukko ja kliinisissä näytteissä

Kasvain näytteitä 67 PC potilailla (mediaani-ikä, 64; alue: 35-82) kerättiin Chang Gung Memorial Hospital (CGMH), Lin-Kou, Taiwanissa. Kudosnäytteet kerättiin leikkauksen, arvioidaan patologit ja tallennetaan CGMH Tissue Bank käyttöön asti. Seeruminäytteistä 154 PC potilailla (mediaani-ikä, 70, alue, 31-87) kerättiin Taipeissa Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. Lisäksi tulevat verinäytteet, mukaan lukien 142 seeruminäytteet terveiltä luovuttajilta (mediaani-ikä, 58, alue, 34-86), 25 plasmanäytteet terveiltä luovuttajilta (mediaani-ikä, 54, alue, 29-79), 28 seeruminäytteistä nenänielun karsinooma ( NPC) potilasta (mediaani-ikä, 46, alue, 31-80), 29 seeruminäytteistä kolorektaalisyöpää (CRC) potilasta (mediaani-ikä, 61, alue, 30-83), ja 30 plasmanäytettä mahasyöpä (GC) potilailla (mediaani-ikä, 66, alue, 33-83), kerättiin CGMH, Lin-Kou, Taiwan. Alikvootit näistä näytteistä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Tämä tutkimus seurasi opinkappaleisiin Helsingin julistuksen ja kaikki aiheet allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen hyväksymä Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital tai Taipei Veterans General Hospital, Taiwan ennen niiden osallistumista tähän tutkimukseen ja käytön kudoksen tai verinäytteistä ennen hoitoa.

Soluviljely

PC solulinjat BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1 ja AsPC-1 hankittiin Bioresource Collection ja Research Center (Hsinchu, Taiwan) . BxPC-3 ja AsPC-1 ylläpidettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Biological Industries, Israel) -supplemented RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, CA, USA). MIA PaCa-2 ja PANC-1 pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Invitrogen), jossa oli 10% FBS: ää ja 2,5% hevosen seerumia (Biological Industries) ja 10% FBS: ää, vastaavasti. Neljä solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ympäristöön.

Generation of secretome aineisto syöpäsolulinjojen

käytettävien menetelmien valmistamiseksi syöpäsolun medium (CM) ja secretome profilointi kuvattiin aiemmin [20] ja yksityiskohtaiset materiaalit ja menetelmät S1.

Public domain tietokantahaku ilmentämiseen profiilien valittujen kohdegeenien

ilmaisu profiilit erittyvien proteiinien PC kudoksissa etsittiin National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus-tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GSE1542 aineisto valittiin tunnistamiseksi kandidaattigeenit koholla ekspressiotasot PC-soluissa [21]. GSE1542 aineisto sisältää geenin ilmentymisen profiilit haimatiehyen soluja eristettiin 24 potilailla, joilla on haiman adenokarsinooma ja 25 luovuttajilta, joilla on normaali haima [21]. Keskimääräinen intensiteetit Kunkin geenikoettimena terveillä ja syöpä- ryhmien laskettiin saamiseksi Kasvaimen /Normal (T /N) suhde; geenejä T /N-suhteet ≥2 katsottiin up-säänneltyjen ehdokkaita. Joukossa, joilla on

p

-arvot alle 0,05 laskettu

t

-testi oli edelleen valittiin parhaiden ehdokkaiden korkeissa ilmentymistä syöpäkudokset.

Western blot-analyysi

proteiinit solu-uutteissa ja CM erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore, MA, USA), ja tutkittiin vasta-aineiden transformoiva kasvutekijä-β-indusoidun proteiinin ig-h3 ( BIGH3) (1:1000 laimennus; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), ULBP2 (1:1000 laimennus; R Millipore). Kiinnostavia proteiineja havaittiin inkuboimalla 1 tunnin ajan sopivan piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology), ja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- järjestelmä (PerkinElmer, MA, USA).

Immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin vasta-aineilla BIGH3 (1:100 laimennus; Santa Cruz Biotechnology) ja ULBP2 (1:20 laimennus; R 0, ei solujen värjäytymisen) ja prosentuaalinen solujen värjäytymisen [3 , ≥90%; 2, 50-89%; 1, 10-49%; 0, 0-9%)]. Molemmat tulokset olivat kerrotaan ja jaetaan sitten 3 saada lopullinen pistemäärä. Positiivinen värjäytyminen määriteltiin lopputulos ≥0.67 [22], [23].

Serum analysoi

Serum BIGH3 ja CA 19-9 tasot määritettiin käyttämällä ELISA-tuotesarjoja R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tiedot käsiteltiin SPSS ohjelmistoversio 13.0 (IL, USA).

Tulokset

Secretome analyysi kaksi haimasyövän solulinjoissa

Voit löytää mahdollisia seerumin PC biomarkkereita, The erittyvien proteiinien PC solulinjoja systeemisesti analysoitiin. Kaaviomainen esitys vuokaavion käytetty on esitetty kuviossa. 1A. Proteiinit läsnä 24 h seerumittomassa CM BxPC-3 ja MIA PaCa-2-solut erotettiin SDS-PAGE, visualisoitiin Coomassie-sinivärjäyksellä (Fig. 1 B, ylempi paneeli), viipaloitu 40 jakeet, pilkottiin yksittäin trypsiini ja analysoitiin C-18 käänteisfaasi- nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS). Proteiini värjäyskuvio solulysaatin on myös esitetty rinnakkain osoittaa, että eritetyt proteiinit olivat rikastettu CM, ja sen malli on aivan erilainen kuin syntyy solunsisäisiä proteiineja (Fig. 1 B, ylempi paneeli). Jakelu sytosoliproteiiniin, alfa-tubuliinin, tutkittiin lisää kontrollina. Alfa-tubuliinin havaittiin selvästi solu-uutteissa, mutta ei CM (Fig. 1 B, alempi paneeli), mikä osoittaa, että proteiinit otetaan talteen CM ei johtunut solukuolemaan.

(A), The strategia koostuu syövän secretome ja kudosten tranacriptome analyysi. (B), proteiinit (50 ug) CM-ja solujen uutteita (CE) syöpäsolujen erotettiin 10% SDS-PAGE ja värjättiin Coomassie-sinisellä (ylempi kuva) tai koki immunoblottausanalyysillä alfa-tubuliinin (alapaneeli ). (C), immunoblot-analyysi anti-BIGH3 ja ULBP2 vasta-aineet.

Kun hakuja Mascot algoritmin ja asettamalla sulku on 95,0% peptidin todennäköisyydellä ja 95,0% proteiinia todennäköisyydellä Scaffold ohjelmisto, 1011 ja 1141 proteiineja useita (≥2) peptidi osumia löytyivät BxPC-3 ja MIA PACA-2 CM, vastaavasti (tukeminen taulukot S1 ja S2), jolloin 1427 ei-tarpeeton ja 725 päällekkäisiä proteiineja.

Generation of ehdokas biomarkkereiden lista PC havaitsemiseksi

Voit tarkentaa ehdokaslistan, ekspressiotasot yhteisen 725 proteiineja haimatiehyen soluja tutkittiin joukko perustuva analyysi julkaisema Ishikawa et al. [21], jossa ne verrattuna geenin ilmentymisen haimatiehyen soluissa, jotka ovat peräisin 24 haiman adenokarsinooma potilaista ja 25 luovuttajien normaali haima (Fig. 1A). Tämä analyysi paljasti, että 10 725 proteiinien merkittävästi voimistunut (≥2-kertainen yliekspressio,

p

0,05) haiman duktaalikarsinooma verrattuna ei-kasvain haimatiehyen soluja (taulukko 1). Niistä keruloplasmiini on vahvistettu yliekspressoituvan PC kudoksissa [24], ja kohonnut seerumin ERO1 kaltaisen proteiinin alfa on raportoitu PC potilailla verrattiin terveisiin kontrolleihin [17], mikä osoittaa, että yhdistetty analyysi secretome ja transcriptome on toteuttamiskelpoinen strategia löytää uusia ehdokasta PC markkereita.

yli-ilmentyminen ULBP2 ja BIGH3 PC kudoksissa

keskittäneet huomiomme ULBP2 ja BIGH3 mahdollisina PC markkereita (taulukko 1) koska toinen array-analyysi oli myös osoittanut, että niiden mRNA tasot olivat lisääntyneet huomattavasti PC kudoksissa [25], ja ei ollut vielä tutkittu PC. Olemme varmisti BIGH3 ja ULBP2 että CM kerätty neljästä PC-solulinjojen (BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1 ja AsPC-1) Western blot -analyysillä (kuvio. 1C). Edelleen immunohistokemiallinen analyysit osoittivat positiivista värjäytymistä BIGH3 ja ULBP2 vuonna 41,9% (13/31) ja 100,0% (67/67), tässä järjestyksessä, PC kudosleikkeiden. Tarkastus kunkin kudoksen osassa, joka sisältää sekä ei-syöpäsoluja ja syöpäsoluja ductal kudoksissa paljasti suurempi ekspressio sekä proteiinien syöpäkudoksiin kuin ei-syöpä kollegansa useimmissa kudosleikkeiden tutkittiin (Fig. 2A, tukeminen kuviot S1 ja S2). Immuunihistokemialliset tulokset Molempien proteiinien tuumorikudoksissa olivat tilastollisesti suurempi kuin ei-syöpä kollegansa: 0,54 ± 0,46 vs. 0,14 ± 0,27 BIGH3 (

p

0,0001) ja 2,71 ± 0,49 vs. 1,89 ± 0,74 ULBP2 (

p

0,0001) (Fig. 2B). Edelleen analyysit osoittivat, että niiden ekspressiotasot kasvainkudoksissa ei tilastollisesti liittynyt iän, sukupuolen, histologinen luokka, yleinen kasvain vaiheessa tai kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) luokittelu haimasyövän (tukeminen taulukot S3 ja S4).

(A), immunohistokemiallinen värjäys BIGH3 (vasen paneeli) ja ULBP2 (oikea paneeli) pariksi pericancerous viereisen ei-syöpä (alempi paneeli) ja kasvaimen (ylempi paneeli) kudoksiin. Mittakaava, 100 pm. Alkuperäinen suurennos, × 400. (B), Box-juoni analyysi immunohistokemiallisella värjäyksellä arvosanat pariksi viereisen ei-syöpä (AN) ja kasvaimen kudokset. Laatikko osoittaa 25

th ja 75

th persentiilit tietojen välillä; keskimmäinen viiva osoittaa mediaani; katkoviiva osoittaa keskimmäinen 90% jakelun.

Seerumin BIGH3 ja ULBP2 PC potilailla

arvioimiseksi potentiaalin BIGH3 ja ULBP2 seerumin PC markkereita, tutkimme heidän tasot seerumista PC potilaista (n = 154) ja terveillä verrokeilla (n = 142). Mittasimme seerumin BIGH3 tasot käyttäen kaupallista ELISA-pakkausta ja sen määritettiin seerumin ULBP2 tasot käyttäen helmi-immunomääritys kehitetty laboratoriossamme, joka pystyy havaitsemaan tyypillisesti erittäin alhainen seerumin ULBP2 ( 1 ng /ml), joka voisi olla mitataan tarkasti käyttämällä in-house sandwich-ELISA. Meidän helmi-immunomääritys voi tarkasti havaita ULBP2 tasoa laajalla 4,3 pg /ml 31,9 ng /ml (tukeminen kuva S3). Huomasimme, että seerumin ULBP2, mutta ei BIGH3, olivat merkittävästi koholla PC potilailla verrattuna terveillä verrokeilla: 1,87 ± 1,67 vs. 1,29 ± 0,49 ug /ml BIGH3 (

p

= 0,328; kuva 3A) ja 200,2 ± 168,6 versus 51,4 ± 64,6 pg /ml ULBP2 (

p

0,0001; kuva 3B). Käyttäen raja-arvo 60 pg /ml ULBP2, huomasimme, että herkkyys ja tarkkuus arvot syövän havaitsemiseen olivat 83,8% ja 73,9%, tässä järjestyksessä. Seerumin BIGH3 ja ULBP2 tasot eivät olleet tilastollisesti korreloi iän, sukupuolen, histologinen luokka, yleinen kasvain vaiheessa tai TNM luokittelu PC tässä tapauskontrollitutkimuksessa (tukeminen taulukko S5). Nämä havainnot osoittavat, että ULBP2 saattaa olla uusi seerumimarkkerina PC havaitsemiseen.

seerumin BIGH3 (A), ULBP2 (B), ja CA 19-9 (C) mitattiin 154 haimasyövän potilaille (PC) ja 142 tervettä verrokkia (Ctrl). Tiedot esitetään Rasiakuvaajat. (D), ROC käyrä analyysit kykyä BIGH3, ULBP2, CA 19-9, ja kahden markkeripaneeli käsittää ULBP2 ja CA 19-9 erottamaan PC potilaiden valvontaa.

Euroopan tehoa ULBP2 ja CA 19-9 PC seulontaan

seerumin CA 19-9, joka on tällä hetkellä käytössä seerumin PC biomarkkerina, annettiin lisäksi testattiin samoissa näytteissä. Huomasimme, että seerumin CA 19-9 tasot olivat korkeampia PC potilailla kuin terveillä verrokeilla (63,4 ± 24,4 versus 28,3 ± 20,2 U /ml,

p

0,0001, Fig. 3C); kuten ULBP2, CA 19-9 tasot eivät korreloi kliinis ominaisuudet (tukeminen taulukko S5). Tarkempi analyysi osoitti, ettei korrelaatiota kahden molekyylin potilaan kohortin (r = 0,061,

p

= 0,453 Pearson korrelaatio; tukeminen Kuva S4). 40 U /ml, kynnysarvon nykyisin käytettävien PC seulontaan, herkkyys ja spesifisyys arvot CA 19-9 olivat 84,4% ja 74,6%, tässä järjestyksessä. Erityisesti käyttämällä raja-arvo 60 pg /ml ULBP2, pystyimme syrjiä 21 24 PC sairastavien potilaiden CA 19-9 tasoilla 40 U /ml terveistä yksilöistä. Lisäksi 24 36 tervettä yksilöiden CA 19-9 tasoilla 40 U /ml voidaan jakaa edelleen potilailta perustuu ULBP2 tasoilla 60 pg /ml.

hyödyllisyys ULBP2 ja CA 19 -9 kuten tunnistus markkereita testattiin edelleen soveltamalla ROC-käyrä analyysi. Tämä analyysi osoitti, että ULBP2 (AUC = 0,862; 95%: n luottamusväli [CI], 0,821-0,904) suoritetaan hieman parempi kuin CA 19-9 (AUC = 0,856; 95% CI, 0,809-0,902) seulontatestinä merkki (Fig. 3D). Tärkeintä on, logistiikkaregressiomallin [26] osoitti, että diagnostinen kapasiteetti yhdistelmä ULBP2 ja CA 19-9 oli suurempi kuin kummankaan merkki yksinään (AUC = 0,910; 95% CI, 0,877-0,943; Fig. 3d) . Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ULBP2 saattaisi olla käyttökelpoinen seerumin PC markkeri, varsinkin kun sitä käytetään yhdessä CA 19-9.

sopivuus ULBP2 ja CA 19-9 PC varhaiseen havaitsemiseen

sitten arvioitiin sopivuuden ULBP2 kuin varhaisen havaitsemisen markkeri PC testaamalla seerumin ULBP2 määrinä potilailla, joilla alkuvaiheen primaarikasvainten (TNM-T1 /T2), ei imusolmuke etäpesäke (TNM-N0), ja varhain yleinen kasvain vaiheet (vaihe I-II). Huomasimme, että seerumin ULBP2 tasot olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla alkuvaiheen primaarikasvainten (205,7 ± 184,3 pg /ml,

p

0,0001, n = 34), ei imusolmuke etäpesäke (191,6 ± 155,2 pg /ml,

p

0,0001, n = 57), ja varhaisessa yleinen kasvain vaiheessa (181,2 ± 158,8 pg /ml,

p

0,0001, n = 106) kuin myös terveiden (51,4 ± 64,6 pg /ml; n = 142; Fig. 4A). Seerumin CA 19-9 tasot olivat kohonneet myös alkuvaiheessa Primaarikasvaimen (56,3 ± 26,9 U /ml,

p

0,0001), imusolmuke etäpesäke (62,1 ± 25,5 U /ml,

p

0,0001), ja yleinen kasvain vaiheessa (60,7 ± 24,4 U /ml,

p

0,0001) verrattuna terveisiin kontrolleihin (28,3 ± 20,2 U /ml, n = 142,) ( kuva 4B). ROC-käyrä analyysit osoittivat lisäksi, että ULBP2 oli sopivampi kuin CA 19-9 erotteleva terveiden verrokkien potilailta PC diagnosoitu TNM-T1 /T2 (AUC = 0,854 [95% CI, ,778-,930] versus AUC = 0,796 [95% CI, 0,690-0,901]), TNM-N0 (AUC = 0,866 [95% CI, 0,811-0,920] versus AUC = 0,841 [95% CI, 0,764-,917]) tai vaiheen I /II (AUC = 0,846 [95% CI, +0,798-+0,895] versus AUC = 0,839 [95% CI, 0,782-+0,896] Fig. 4C). Vielä tärkeämpää on, näiden kahden yhdistelmä markkereita oli parempi erottelemaan terveille henkilöille ja TNM-T1 /T2 (AUC = 0,883; 95% CI, ,816-0,949), TNM-N0- (AUC = 0,893; 95% CI, 0,841-0,946), tai vaiheen I /II-PC potilailla (AUC = 0,897; 95% CI, 0,856-0,937) kuin kumpikaan merkki yksinään (Fig. 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ULBP2 on potentiaalisesti käyttökelpoinen seerumimarkkerina PC varhaisen havaitsemisen, varsinkin yhdessä CA 19-9.

pitoisuudet seerumissa ULBP2 (A) ja CA 19-9 (B) terveillä verrokeilla ( Ctrl) verrattiin potilailla, joilla alkuvaiheen PC. Tiedot esitetään Rasiakuvaajat. (C), ROC käyrä analyysit kyky ULBP2 (musta viiva), CA 19-9 (katkoviiva), ja molempia proteiineja (paksu viiva) syrjiä alkuvaiheen PC potilaiden valvontaa.

veren ULBP2 määrinä potilailla, joilla muiden syöpätyyppeihin

Voit testata, onko ULBP2 on myös markkeri muut pahanlaatuiset sairaudet, päätimme ULBP2 veressä sairastavien potilaiden CRC, NPC, ja GC. Huomasimme, että seerumin ULBP2 tasot tiettyjä kehityssuuntia olevan suurempi potilailla, jotka kärsivät NPC (65,5 ± 74,3 pg /ml,

p

= 0,122, n = 28) verrattuna terveisiin kontrolleihin (51,4 ± 64,6 pg /ml) ja olivat kohtuullisesti, mutta huomattavasti, suurempi CRC potilailla (70,6 ± 73,8 pg /ml,

p

= 0,038, n = 29; Fig. 5A); plasmapitoisuudet ULPB2 eivät olleet merkittävästi erilaiset terveiden yksilöiden (86,1 ± 101,2, n = 25) ja GC potilasta (78,1 ± 79,7 pg /ml, n = 30,

p

= 0,673; Kuva. 5B). Kuitenkin seerumin ULBP2 tasot olivat silmiinpistävän koholla PC potilailla verrattuna CRC (200,2 ± 168,6 versus 70,6 ± 73,8 pg /ml,

p

0,0001) ja NPC (200,2 ± 168,6 versus 65,5 ± 74,3 pg /ml,

p

0,0001) potilailla (Kuva. 5A). Se havainto, että ULBP2 tasot pysyivät muuttumattomina tai vain marginaalisesti koholla kahden muun maha-suolikanavan syöpien, CRC ja GC, viittaa siihen, että ULBP2 voi edustaa suhteellisen spesifinen PC markkeri.

(A), seerumin ULBP2 tasot terveillä verrokeilla (Ctrl ) olivat verrattuna potilailla, joilla nenänielun karsinooma (NPC, n = 28) ja peräsuolen karsinooma (CRC, n = 29). (B), plasma ULBP2 tasot kontrolleissa (Ctrl, n = 25) verrattiin mahalaukun syöpäpotilailla (GC, n = 30).

Keskustelu

CA 19 -9 parhaillaan pidetään käytännöllisin seerumin PC merkki [27], [28]. Koska CA 19-9 on myös koholla muihin ruoansulatuskanavan sairaudet, kuten haimatulehduksen, hepatiitin, sappitietukos, ja muut ruoansulatuskanavan syöpiä [9], [27], [28], sen spesifisyys ei ole luotettava. Lisäksi se ei ilmenny henkilöillä, joilla Lewis a-b- genotyyppi [29], ja huonosti eriytetty PC näyttää tuottaa vähemmän CA 19-9 kuin kohtalaisesti tai hyvin eriytetty syöpiä [28], mikä rajoittaa sen havaitsemisen herkkyyttä. On selvää, tunnistaminen romaani PC merkkiaineiden kiertää nämä rajoitukset olisi tervetullut kehitys.

Tässä tutkimuksessa käytimme yhtenäistä lähestymistapaa yhdistettynä analyysit PC solun secretome ja transcriptome tunnistaa uusia PC merkki ehdokkaita, ja toimittaa ensimmäiset todisteet että ULBP2 on potentiaalinen uusi ehdokas seerumimarkkerina PC diagnoosi. ULBP2 yliekspressoitiin PC-soluissa verrattuna viereiseen ei-syöpä kudoksiin (Fig. 2). Helmi-pohjainen immunomäärityksissä suoritettiin yli 150 seerumi näytteitä PC potilaista ilmeni, että seerumin ULBP2 tasot paitsi syrjiä potilaille terveiltä luovuttajilta, mutta myös osoitti suurta potentiaalia PC varhaiseen havaitsemiseen (kuviot. 3 ja 4). Vaikka useita mahdollisia seerumin PC markkereita on raportoitu, harvoja on osoitettu olevan parempi kuin CA 19-9 [30], [31]. Tärkeää on, meidän vertailu seerumin ULBP2 CA 19-9 tässä tapauskontrollitutkimuksessa osoitti, että seerumin ULBP2 on ylivoimainen CA 19-9 varhaisena diagnostinen markkeri (Fig. 4). Tämä havainto on erityisen merkittävä, kun otetaan huomioon, että useimmat PC potilaista kuolee yhden vuoden sisällä, koska niitä ei diagnosoitu, kunnes syöpä pääsee pitkälle [1]. Diagnostinen ja prognostisten potentiaalia ULBP2 kliinisessä ympäristössä täytyy todentaa käyttämällä suurempaa sarjan seerumin yksilöitä. Lisäksi lisäehdokkaita lueteltu taulukossa 1 ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti PC, mutta niiden ekspressiotasot voitiin analysoida PC kudoksissa käyttäen Human Protein Atlas (HPA) tietokanta, joka sisältää immunohistokemiallinen (IHC) värjäys profiilit 10118 proteiinien erilaisia ​​syöpä- ja ei-syöpä kudoksia perustuu 13154-vasta-aineita (versio 7.1, https://www.proteinatlas.org/) [32]. Haimme 8 proteiinien HPA tietokantaan ja löysi 5 niistä havaittiin yli 50% PC kohdat tutkittu. Noteworthily, alfa-liukoinen NSF liitosproteiinissa, anneksiini A11, ja ERO1 kaltainen proteiini alfa ilmaistiin yli 50% PC jaksoon, joissa kohtuullisesta voimakkaaseen IHC värjäytymistä (tukeminen taulukko S6). Nämä kolme proteiinit voivat edustaa potentiaalisina PC biomarkkereita, jotka edellyttävät lisätutkimuksia.

Konsensus on sulautunut yhteen sen ajatuksen ympärille, että tehokas ja tarkka havaitseminen alkuvaiheen syöpä todennäköisesti luottaa markkeripaneelit omistavia parempi spesifisyys ja herkkyys kuin kunkin merkin yksinään [26], [33]. Kuten edellä mainittiin, CA 19-9 on tällä hetkellä käytetään PC havaitsemiseen, mutta sen käyttöä seulontaan aine on ongelmallista. Siten merkki paneeli, joka yhdistettynä CA 19-9 kanssa muita hyödyllisiä markkereita, kuten ULBP2, voisi parantaa kykyä havaita ja valvoa syöpään. Itse asiassa molempia merkkiaineiden osottaneet parannettu diagnostinen tehokkuus verrattuna perinteiseen lähestymistapaan, jossa käytetään CA 19-9 yksin, varsinkin suhteen havaitsemiseen alkuvaiheen PC (Fig. 4).

Vaikka ULBP2 on ilmoitettu olevan kudoksen ja seerumin ennustetekijöitä markkeri munasarjasyöpä [34] ja melanooma [35], tässä järjestyksessä, uskomme, että ULBP2 vielä potentiaalia suhteellisen erityinen ja hyödyllisiä seerumin testi PC diagnoosi. Useat riviä todisteet tukevat tätä: (a) ULBP2 seerumi /plasmassa eivät merkitsevästi koholla GC, CRC tai NPC potilaista verrattuna terveisiin yksilöihin tässä tutkimuksessa; (B) Li et al. ovat raportoineet, että ULBP2 ei ollut havaittavissa seerumeissa munasarjasyöpä potilaiden [34]; (C) Paschenin et al. osoittivat, että ULBP2 ollut mitattavissa yli 20% testatuista seerumeista melanoomapotilailta etenkin alkuvaiheen potilailla [35]; ja (d) ULBP2, toisin kuin CA 19-9, ei näytä ilmaista alemmilla tasoilla huonosti eriytetty PC kuin kohtalaisen tai hyvin eriytetty syöpiä (tukeminen taulukot S4 ja S5). Kuitenkin arviointi ULBP2 kuin haimasyöpä merkki edellyttää laajamittaista counter-seulonta, erityisesti käyttämällä seeruminäytteistä haimatulehdus potilaista.

ULBPs ja suurten histocompatibility monimutkainen luokan I liittyvä ketju (MIC) ovat solun pinnalla ligandit NK ja T cell-ilmaistaan ​​immunoreseptorin (NKG2D), jotka ovat harvoin ilmaistaan ​​normaalit solut, mutta näkyvät monenlaisia ​​maligniteetteja [36], [37]. Nämä ligandit voivat aktivoida luonnollisten tappajasolujen (NK) ja sytotoksisten T-solujen sitoutumalla NKG2D, ja sen jälkeen edistää solujen sytolyysin ja puhdistuma syövän [38], mikä viittaa siihen, että kasvainsolut yli-ilmentävät näitä ligandeja ovat alttiimpia soluvälitteisissä valvontaan. Todellakin, MIC ilmentyminen on kuvattu indikaattorina paremman ennusteen CRC potilailla [39], ja vapauttamaan NKG2D ligandien kasvainsoluista on aiemmin osoitettu uutena syövän immunoevasion mekanismi [40], [41]. Äskettäin on ehdotettu, että proteolyyttinen irtoaminen ULBP2 kasvainsoluista välittävät matriksimetalloproteaaseja (MMP), ja se voi heikentää immunogeenisyyttä kasvainsolujen [41]. Via secretome analyysi tässä tutkimuksessa useita MMP, kuten MMP-1, -7, -9, -11, -13, -14, ja -28 voitiin havaita CM PC solulinjoista (tukeminen taulukot S1 ja S2) . Lisäksi kohonnut MMP-7, -8, -9, ja -11 on kuvattu PC kudoksissa; kaksi näistä, MMP-7: n ja MMP-11, ovat vahvasti liittyy huono syövän ennusteeseen [42]. Nämä havainnot viittaavat yhdessä siihen, että seerumin ULBP2 tasot PC potilailla voisi heijastaa osallistumista proteolyyttisen katkaisun MMP vapautuu syöpä itse. Aktivoimalla NK ja sytotoksisten T-soluvälitteinen immuniteetti, eliminointi ULBP2 liukoisen muodon voisi olla tehokas terapeuttinen strategia PC. Tämä kiehtova mahdollisuus oikeuttaa lisätutkimukset.

Yhteenvetona olemme tässä kertoa, että ULBP2 seerumin PC potilaat ovat huomattavasti korkeammat kuin terveillä verrokeilla. Yhdistelmä ULBP2 ja CA 19-9 ylitti kunkin merkin yksinään erottavien PC potilailla terveistä henkilöistä. Vielä tärkeämpää on, analyysi ala ROC-käyrän osoitti ULBP2 oli ylivoimainen CA 19-9 in discriminating potilailla, joilla alkuvaiheen haimasyövän välillä terveiden verrokkien. Siten ULBP2 voi edustaa uusia ja käyttökelpoisia seerumin biomarkkereiden alustavaan seulontaan haimasyövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

havaitseminen BIGH3 ilmentymisen 31 haimasyövän kudoksiin immunohistokemiallisesti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s001

(PDF) B Kuva S2.

havaitseminen ULBP2 ilmentymisen 67 haimasyövän kudoksiin immunohistokemiallisesti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s002

(PDF) B Kuva S3.

Standard käyrä ULBP2 määräytyy helmi-immunomääritys kehitettyjä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s003

(PDF) B Kuva S4.

korrelaatio seerumin ULBP2 ja seerumin CA 19-9 tasoilla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s004

(PDF) B Taulukko S1.

Luettelo proteiinien tunnistettu BxPC-3 kunnostettua alustaa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s005

(PDF) B Taulukko S2.

Luettelo proteiinien yksilöityjen MIA PaCa-2 kunnostettu alusta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s006

(PDF) B Taulukko S3.

korrelaatio kliinis ja BIGH3 ilmentymisen kudosleikkeissä 31 haimasyövän potilaille.