Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Periostin, IFN aiheuttama transmembraaniproteiiniksi 1 (IFITM1) ja Wingless-tyypin MMTV integraatiokohdan perheen jäsen 5B (Wnt-5b) oli aikaisemmin tunnistettu hyökkäyksen edistänyt geenit pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) vertaamalla geeniekspressioprofiilien vanhemman ja erittäin invasiivisia klooni. Olemme aiemmin raportoitu, että Periostin ja IFITM1 edistänyt hyökkäyksen HNSCC soluja. Tässä osoitimme, että Wnt-5b yli-ilmentyminen edisti hyökkäyksen HNSCC soluja. Lisäksi stromelysiini-2 (matriksimetalloproteinaasi-10; MMP-10) todettiin yhteiseksi säädelty geeni keskuudessa Periostin, IFITM1 ja Wnt-5b yliekspressoivassa HNSCC soluihin käyttäen microarray aineistoja. Tässä tutkimuksessa selvitimme rooleja MMP-10 hyökkäyksen HNSCC.

menetelmät ja havainnot

tarkasteltiin MMP-10 HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisesti. Korkea MMP-10 oli usein havaittu ja korreloi merkitsevästi invasiivisuus ja etäpesäkkeiden HNSCC tapauksissa. Seuraavaksi tutkimme rooleja MMP-10 hyökkäys HNSCC solujen

in vitro

. Kohdunulkoinen yli-ilmentymisen MMP-10 edisti hyökkäyksen HNSCC soluja, ja knockdown MMP-10 tukahdutti hyökkäyksen HNSCC soluja. Lisäksi MMP-10 Knockdown tukahdutetaan Periostin ja Wnt-5b-edistänyt hyökkäystä. Mielenkiintoista, MMP-10 yli-ilmentyminen indusoi laski p38 aktiivisuuden ja MMP-10 Knockdown aiheuttama lisääntynyt p38 aktiivisuutta. Lisäksi, hoito p38-estäjän SB203580 in HNSCC soluissa esti hyökkäyksen.

Päätelmät

Nämä tulokset viittaavat siihen, että MMP-10 on tärkeä rooli invaasiossa ja etäpesäkkeiden HNSCC, ja että invaasio ohjaavat MMP-10 on osittain liittyy p38 MAPK esto. Ehdotamme, että MMP-10 voidaan käyttää markkerina ennustamiseksi etäpesäkkeiden HNSCC.

Citation: Deraz EM, Kudo Y, Yoshida M, Obayashi M, Tsunematsu T, Tani H, et al. (2011) MMP-10 /Stromelysin-2 Edistää Invasion of pään ja kaulan alueen syöpä. PLoS ONE 6 (10): e25438. doi: 10,1371 /journal.pone.0025438

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institute, Ruotsi

vastaanotettu: 24 tammikuu 2011; Hyväksytty: 05 syyskuu 2011; Julkaistu: 05 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Deraz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoitettiin osittain opetus-, tiede- ja Japanin kulttuuri avustusten-in-tuki (Y. Kudo ja T. takata) ja Kurozumi Memorial Foundation avustus (Y. Kudo). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on yksi yleisimpiä ihmisen syövän, joiden vuotuinen ilmaantuvuus yli 500000 tapauksissa maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta edistysaskeleet hoidon strategioita, kuolleisuus ja epäonnistuminen hoitovaihtoehtojen HNSCC potilaat ovat edelleen korkealla. Korkea kuolleisuus ja huono ennuste HNSCC ennustetaan esiintymisen imusolmukkeiden etäpesäkkeiden, joka on yleinen tapahtuma syöpäpotilailla [2]. HNSCC kehittyy kertyy useita geneettisiä ja epigeneettisiä muutoksia on monivaiheinen prosessi, [3]. Yrittää tunnistaa geenien etäpesäke ovat keskeisiä varhaiseen ennustamiseen HNSCC käyttäytymistä. Prosessi etäpesäke koostuu peräkkäisiä ja selektiivinen vaiheita kuten leviämisen, angiogeneesin induktio, irrallisuus, liikkuvuuteen, invaasio liikkeelle, aggregaatiota ja selviytyminen liikkeessä, solun pidätys kaukaisilla hius- ja ekstravasaatiota osaksi elin parenkyymiin [4], [5] . Tunnistaminen uusia ja metastaasit liittyvien molekyylien HNSCC ja ymmärtämään paremmin mekanismeja, jotka karsinoomasoluja aikana suoritettava vaiheet ja metastaasit ovat erittäin tärkeitä suunnitella paremmin hoitostrategioita tämän taudin hoitamiseksi.

geenien ilmentyminen mikrosirut ovat nousseet ja niiden laajaa käyttöä on johtanut potentiaalisten kandidaattigeenejä. Lisätutkimuksia biologista käyttäytymistä ja merkittävä kliininen tulos näiden geenien etenkin HNSCC on erittäin kiinnostava. Olemme aiemmin perustaneet HNSCC solulinjassa, MSCC-1, mistä imusolmuke etäpesäke [6]. Lisäksi olemme eristäneet erittäin invasiivinen klooni MSCC-INV1 päässä MSCC-1-soluissa käyttämällä

in vitro

invaasiomääritys laite [7]. Sitten, vertasimme transkription profiilia emosoluina (MSCC-1) ja erittäin invasiivisia klooni (MSCC-INV1) by mikrosiruanalyysillä jotta voidaan tunnistaa geenejä, jotka eroavat toisistaan ​​ilmaisun [8]. Useita geenejä valikoidusti yli-ilmentyy erittäin invasiivisia klooni. Näistä geenit, Periostin (osteoblastien-kerroin 2 (fasciclin I like)) oli kaikkein ilmentyy suuresti geenin ja toinen oli IFITM1 (IFN-indusoidun transmembraani- proteiini 1). Itse asiassa, osoitimme, että Periostin ja IFITM1 edistänyt invaasio sekä

in vitro

ja

in vivo

[8], [9]. Havaitsimme myös Wingless-tyyppinen MMTV Integraatiokohdan perheen jäsen 5B (Wnt-5b) kolmanneksi erittäin ilmaistu geeni MSCC-INV1. Täällä vahvisti kykyä Wnt-5b edistää hyökkäyksen HNSCC solujen

in vitro.

Lisäksi tunnistimme matriksimetalloproteinaasi-10: n (MMP-10) yhteisenä voimistunut geenin invaasio edistämällä molekyylejä, mukaan lukien Periostin , IFITM1 ja Wnt-5b. Matrix (MMP) edustavat perheen sinkki riippuvaisten proteinaaseille, jotka pystyvät hajottamaan ECM komponentteja kuten kollageenien ja proteoglykaanien ja niillä on rooli normaalin kehityksen ja kudosvaurioita erilaisissa patofysiologisissa olosuhteissa, joihin liittyy niveltulehdus, haavan paranemista ja kasvainten kehittymiseen [10 ]. MMP voidaan jakaa alaryhmiin, kuten; kollagenaasit, stromelysiinit, gelatinaasit, ja kalvotyyppi MMP [11]. Jotkut jäsenet MMP: t osallisena hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden HNSCC kuten MMP-2, kalvotyyppi-1 MMP (MT1-MMP), ja MMP-9 [12], [13]. Yliekspressio näiden MMP on korreloinut hyökkäystä, etäpesäkkeitä, ja huono ennuste. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme roolit MMP-10 hyökkäyksen HNSCC.

Tulokset

Wnt-5b edistää hyökkäyksen HNSCC

Wnt-5b on jäsenenä Wnt-geeniperheen, ryhmä erittyy glykoproteiineja, jotka on tärkeä rooli syövän synnyssä ja useissa kehitys- prosesseja ja laukaisee solunsisäisen vasteet läpi eri signalointireittejä. Vertaamalla transkription profiilia vanhemman solujen ja erittäin invasiivisia klooni mikrosiruanalyysillä, Wnt-5b oli kolmas voimakkaasti ilmaisi geenin erittäin invasiivisia klooni jälkeen Periostin ja IFITM1. Ensin tutkittiin, Wnt-5b oli mukana hyökkäyksen HNSCC. Korkeampi ilmentyminen Wnt-5b erittäin invasiivinen klooni verrattuna kanta- soluihin varmistettiin RT-PCR: llä (kuvio 1A). Olemme tutkineet ilmentymisen Wnt-5b-mRNA: n kuuden HNSCC solulinjoissa. Wnt-5b-mRNA: n ilmentymistä havaittiin lähes kaikissa HNSCC solulinjojen paitsi HSC4 solujen (kuvio 1A). Selventää rooli Wnt-5b invasiivisuus on HNSCC, me syntyy Wnt-5b-yliekspressoivia soluja transfektoimalla Wnt-5b osaksi HSC4 soluja ilman Wnt-5b ilme. Saatuaan vakaa klooni Wnt-5b-yliekspressoivia soluja (kuvio 1 B), niitä käytettiin tarkistamiseen invasiivisuutta

in vitro

invaasiomääritys. Wnt-5b yli-ilmentyminen merkitsevästi tehosti hyökkäyksen HNSCC solujen

in vitro

(kuvio 1 B). Vahvista Wnt-5b-edistänyt hyökkäystä HNSCC soluja, tutkimme knockdovvn Wnt-5b käyttämällä siRNA HSC2 solujen korkea ilmentyminen Wnt-5b. Hoito Wnt-5b siRNA vähensi ilmentymistä Wnt-5b mRNA ja estivät merkittävästi invaasiota (kuvio 1 B). Vaikka Wnt-5b ei vaikuttanut solujen kasvuun (kuvio 1 C), se merkittävästi edistänyt solun motiliteettia HNSCC solujen osoituksena haavan paranemista määrityksessä (kuvio 1 D). Mielenkiintoista on, että Wnt-5b siRNA inhiboi merkittävästi solun motiliteettia HNSCC soluja (kuvio 1 D). Lisäksi olemme verrattiin geeniekspression profiilin kontrolli- ja Wnt-5b-yli-ilmentävät HSC4 solujen mikrosiruanalyysillä (Data S1). S100A8, SERPINB4, osteo- ja SERPINB3 oli voimistunut ja TGF-SS2, CDH11 ja trombospondiinista 1 oli vaimentua in Wnt-5b-yliekspressoivia soluja (taulukko S1).

A

Expression of Wnt- 5b erittäin invasiivisia klooni ja HNSCC solulinjoissa. Expression of Wnt-5b-mRNA MSCC-1, MSCC-INV1 sekä kuusi HNSCC solulinjoissa; HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, ja Ho-1-U-1 tutkittiin RT-PCR: llä. Expression of Wnt-5a mRNA tutkittiin myös 6 HNSCC solulinjoissa. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.

B,

Wnt-5b edisti hyökkäyksen HNSCC soluja. Tuottamiseen Wnt-5b yli-ilmentäviä soluja, Wnt-5b ekspressiovektori transfektoitiin HSC4 soluja ilman Wnt-5b ilmentymistä. Saimme vakaa klooni ja ilmentymistä Wnt-5b tutkittiin Western blottauksella anti-Wnt-5b polyklonaalista vasta-ainetta (vasen yläpaneeli). Käytimme tyhjää vektoria transfektoidut solut (tyhjä) kontrollina. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. Invasiivisuus Wnt-5b-yliekspressoivia soluja (oikealla ylempi paneeli) tutkittiin

in vitro

invaasiomääritys. 1,5 × 10

5 Solut sijoitettiin ylempään osastoon soluviljelyinsertissä. 12 tunnin kuluttua inkubaation tunkeutui solut alempaan membraanin kiinnitettiin formaliinilla ja värjättiin hematoksyliinillä. HSC2 solujen Wnt-5b ilmentyminen transfektoitiin Wnt-5b siRNA (siWnt-5b) tai ohjaamaan siRNA (siControl). Salatun sekvenssi, joka ei osoita merkittävää homologiaa rotan, hiiren tai ihmisen geenisekvenssien käytettiin kontrollina. Vaikutus pudotus arvioitiin RT-PCR: llä (vasen alapaneeli). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Invasiivisuus Wnt-5b-tippuu alas solut tutkittiin

in vitro

invaasiomääritys (oikea alapaneeli). 24 tunnin inkubaation jälkeen tunkeutunut solut alempaan membraanin kiinnitettiin formaliinilla ja värjättiin hematoksyliinillä. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen kuin tyhjän vektorin transfektoiduista soluista tai ohjata siRNA transfektoitujen solujen

P

0,01.

C,

Solulisääntyminen Wnt-5b-yliekspressoivia soluja ja Wnt-5b-tippuu alas soluissa. Solut maljattiin 24-kuoppalevyille, ja trypsinisoitiin solut laskettiin solulaskurilla 0, 2, 4 ja 6 päivää. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen.

D,

Migration Wnt-5b-yliekspressoivia soluja ja Wnt-5b-tippuu alas soluissa. Kulkeutumista soluihin määritettiin haavan paranemista määrityksessä. 24 tunnin jälkeen raapiminen solut, vaihe-kontrastin kuvia (10 x kenttä) haavan paranemista valokuvattiin digitaalisesti käännettyä mikroskooppia. Etäisyyden haavan alueet mitattiin kuvia, asetettiin 100%: 0 h, ja keskimääräinen prosentuaalinen osuus etäisyydet haavan alueet laskettiin. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen kuin tyhjän vektorin transfektoiduista soluista tai valvoa siRNA transfektoidut solut

P

0,01.

MMP-10 on tunnistettu yhteiseksi Kohdegeenin Periostin, IFITM1 ja Wnt -5 b yliekspressio

tunnistaa yhteisiä kohdegeenejä Periostin, IFITM1 ja Wnt-5b yli-ilmentyminen, vertasimme geeniekspressioprofiilien välillä ohjaus HSC2 solujen ja Periostin yli-ilmentäviä HSC2 soluja, ohjaus Ca9-22 solut ja IFITM1- yli-ilmentävät Ca9-22 soluja, ja ohjaus HSC4 solujen ja Wnt-5b-yli-ilmentävät HSC4 soluissa (kuvio 2A). Tämän seurauksena, useita ryhmiä geenien vaihteleva biologisten tehtävien normaalin kehityksen ja prosessin maligniteetin todettiin olevan yleinen Periostin, IFITM1, ja Wnt-5b yli-ilmentäviä soluja (kuvio 2B). Useita yhteisiä kohdegeenien vaihtelevalla biologista käyttäytymistä lukien soluadheesion, solujen lisääntymistä, apoptoosin, solusyklin ja muiden tunnistettiin. Gene ontologian analyysi tehtiin käyttämällä Gene Spring GX-ohjelmisto tunnistaa biologisia toimintoja näiden molekyylien (kuvio 2B). Yhteinen up-geenien välillä Periostin- ja IFITM1-yli-ilmentymisen, Periostin- ja Wnt-5b-yli-ilmentymisen ja IFITM1- ja Wnt-5b-yli-ilmentyminen on lueteltu taulukossa S2, S3 ja S4, vastaavasti. Useita geenejä erittäin voimistunut keskuudessa Periostin-, IFITM1- ja Wnt-5b-yliekspressoivassa HNSCC soluissa (taulukko S5). Heistä stromelysiinin-2 (MMP-10) oli mukana. MMP: t tunnetaan perhe sinkki riippuvaisten proteinaaseille, jotka pystyvät hajottamaan ECM osia ja niillä on rooli kasvaimen kehitys [10]. Kuitenkin vähän tiedetään MMP-10 hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen. Siksi olemme keskittyneet MMP-10 yhteisenä voimistunut molekyylin aiheuttama hyökkäys liittyviä tekijöitä HNSCC ja tutkitaan sen asemaa hyökkäyksen HNSCC.

A

Schema osoittaa strategia tunnistaa yhteinen tavoite hyökkäystä liittyviä molekyylejä. Periostin, IFITM1, ja Wnt-5b on tunnistettu hyökkäystä liittyvien molekyylien vertaamalla geeniekspressioprofiili välillä vanhemman (MSCC-1-soluissa) ja erittäin invasiivinen klooni (MSCC-INV1 solut). Tunnistaa yhteiset tavoitteet hyökkäyksen liittyvien molekyylien, vertasimme geeni-ilmentymisen profiilit ohjaus vs. Periostin yli-ilmentäviä HSC2 soluja, ohjaus vs. IFITM1 yli-ilmentäviä Ca9-22 soluja, ja valvonta vs. Wnt-5b-yli-ilmentävät HSC4 soluja. Ektooppinen ilmentyminen tasolla Periostin, IFITM1 ja Wnt-5b kunkin soluissa on esitetty RT-PCR: llä. GAPDH ilmentyminen käytettiin latauskontrollina.

B,

Useita upregulated geenit löydettiin välillä Periostin ja IFITM1, Periostin ja Wnt-5b, ja Wnt-5b ja IFITM1. Käyttämällä Gene ontologia ohjelmisto, tunnistimme biologisten toimintojen näiden geenien. Taulukossa on esitetty näiden yhteisten voimistunut geenejä, jotka käsittävät erilaisia ​​perheitä vaihtelevalla biologisia toimintoja.

Korkea MMP-10 on hyvin korreloi invaasio kuvioita ja etäpesäkkeiden HNSCC

Ensin tarkasteltiin MMP-10 in 30 normaalissa suun limakalvon kudoksissa ja 116 HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisesti. Kliiniset tiedot 116 potilaan kuten ikä, sijainti, kasvaimen koon, invaasio kuvio, metastaasi, kasvaimen vaiheessa TNM luokittelu, hoito, selviytyminen ja MMP-10 ilmentyminen näkyy Data S2. Osoittaa vasta-aineen spesifisyys immunohistokemiallisella värjäyksellä MMP-10, teimme immunohistokemiallisella värjäyksellä ilman sekundaarista vasta-ainetta tai ilman primaarista vasta-ainetta negatiivisena kontrollina (kuvio S1). Korkea MMP-10 havaittiin 89 116 (76,7%) HNSCC tapauksista, kun taas ei-neoplastisia epiteelin ei näytä MMP-10 ilmentyminen (kuvio 3A). Sitten, vertasimme MMP-10 ilmaisutapoja invaasio kuvio, vaihe ryhmittely ja imusolmuke etäpesäke (taulukko 1). Käytimme Jacobsson luokittelua (Patterns I-IV) arviointiin hyökkäyksen kuvio (kuva S2) [14]. Out of 116 HNSCC tapauksissa 9, 12, 62, ja 33 tapausta osoitti kuvio I, II, III, ja IV (taulukko 1). Mielenkiintoista on, että esiintyvyys MMP-10-positiivisten tapausten kuvio III ja IV oli huomattavasti korkeampi kuin kuvion I ja II (kuvio 3B). On tunnettua, että kuviot III ja IV vastaavat huono erilaistumista ja korkea metastaattinen rate [14]. Korrelaatio MMP-10 ilmentyminen ja hyökkäys kuvio oli tilastollisesti merkitsevä (P 0,001) (taulukko 1). Myös verrattuna MMP-10 lausekkeen ryhmän lavastus. Neljäkymmentäyhdeksän HNSCC tapaukset olivat käytettävissä vaiheessa ryhmittelyä (I-IV) perusteiden mukaan Japanin Society pään ja kaulan alueen syöpä [15]. Useimmissa tapauksissa (97,1%) osoittivat korkeaa MMP-10 on edennyt jo pitkälle ryhmässä (III ja IV), kun taas 46,7% tapauksista osoittivat korkeaa MMP-10 alkuvaiheen ryhmässä (I ja II). Korrelaatio MMP-10 ilmentyminen ja vaiheessa ryhmittymä oli tilastollisesti merkitsevä (P 0,001) (taulukko 1). Lisäksi MMP-10-ekspressio korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke (P 0,001) (taulukko 1 ja kuvio 3B). Kaksikymmentä yhdeksän 89 HNSCC tapauksissa korkea MMP-10 oli imusolmuke etäpesäke, kun taas 5 27 HNSCC tapauksissa alhainen MMP-10 oli imusolmuke etäpesäke (kuvio 3B). Lisäksi tutkimme korrelaatio MMP-10 ilmentyminen ja eloonjäämisen HNSCC tapauksissa. Neljäkymmentäkaksi HNSCC tapaukset olivat saatavilla hengissä analyysiä. Mielenkiintoista, vaikka ei ollut tilastollista merkitystä (

P

= 0,21), potilailla, joilla on korkea MMP-10 pyrki osoittamaan huonoon ennusteeseen (kuvio 3C).

A,

immunohistokemiallinen MMP-10 116 HNSCC tapauksissa ja 30 normaalia epiteelin. Normaaliepiteelissä on täysin negatiivinen MMP-10 verrattuna HNSCC joissa useimmissa kasvainsoluissa osoittivat erittäin MMP-10. Edustavia matala-MMP-10 ilmentyminen normaalissa suun epiteelin ja HNSCC tapauksessa (Jacobsson n luokitus Pattern I), ja edustava tapauksia korkea MMP-10 (matala ja korkea suurennus) in HNSCC tapauksissa (Jacobsson n luokitus Pattern IV) esitetään. Mittakaava pylväs näkyy kunkin kuvan.

B,

Korrelaatio MMP-10 ilmaisun ja hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden HNSCC tapauksissa. Vasen kaavio osoittaa suhdetta MMP-10 ilmentyminen ja kuvio hyökkäystä. Jacobsson luokittelu (Patterns I-IV) käytettiin arviointiin hyökkäyksen kuvio (kuva S1) [14]. * Merkittävästi erilainen kuin kuvio I tai II

P

0,01. Oikea kuvaaja esittelee suhdetta MMP-10 ilme ja etäpesäkkeiden. * Merkittävästi erilainen matalasta MMP-10

P

0,01.

C,

MMP-10 ilmentyminen ja huono tulos. Neljäkymmentä-kaksi italialaista HNSCC tapaukset olivat saatavilla hengissä analyysiä. Kaplan-Meier-käyrät osoittavat eloonjäämistä HNSCC potilailla, joilla on korkea MMP-10 (•, n = 34) tai alhainen MMP-10 (▴, N = 8).

MMP-10 edistää hyökkäys HNSCC

seuraavassa lähemmin tarkastelemaan MMP-10-mRNA: n ja proteiinin 6 HNSCC solulinjoissa RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä, vastaavasti. Korkea MMP-10-mRNA: n ja proteiinin havaittiin Ca9-22, Ho-1-U-1 ja Ho-1-N-1-soluissa (kuvio 4A). Vuonna HSC2, HSC3 ja HSC4 soluja, MMP-10: n ilmentyminen oli alhainen (kuvio 4A). MMP-10-proteiinin ilmentyminen vastasi mRNA ekspressiotason. Sen tutkimiseksi, onko MMP-10 edistää hyökkäyksen HNSCC

in vitro

, me syntyy MMP-10 yli-ilmentäviä soluja käyttäen HSC2 ja HSC3 soluja, joilla on alhainen MMP-10 (kuvio 4B). Varmistimme korkeampi aktiivisuus MMP-10: n elatusaineessa MMP-10 yli-ilmentäviä soluja stromelysiini tsymografialla (kuvio 4B). Vaikka MMP-10 yli-ilmentyminen ei vaikuttanut solujen lisääntymistä (tietoja ei esitetty), se paransi huomattavasti invasiivisen aktiivisuutta sekä HSC2 ja HSC3 solut (

P

0,05) (kuvio 4C). Edelleen vahvistaa MMP-10-välitteisen hyökkäystä HNSCC soluja, tutkimme pudotus MMP-10 käyttämällä siRNA Ca-9-22 ja Ho-1-N-1-solut, joilla on korkea MMP-10. MMP-10 pudotus, käytimme 3 eri siRNA: ita (# 1, # 2 ja # 3). Kaikki siRNA myös cocktail 3 siRNA: iden vähensi MMP-10 lauseke (kuva S3). Käytimme cocktail 3 siRNA: iden seuraavissa tutkimuksissa. MMP-10 Knockdown esti MMP-10-mRNA ja proteiini Ca9-22 ja Ho-1-N-1-soluissa (kuvio 4D). MMP-10 Knockdown merkittävästi tukahdutti hyökkäys HNSCC soluja (kuvio 4E). Toteuttanut kaikki yhdessä, nämä tulokset osoittavat, että MMP-10 on tärkeä rooli hyökkäyksen HNSCC soluja.

A

Expression of MMP-10-mRNA ja proteiini kuudessa HNSCC solulinjoissa. MMP-10-mRNA: n HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, ja Ho-1-U-1 tutkittiin RT-PCR: llä. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. MMP-10-proteiinin ilmentymisen taso arvioitiin kuuden HNSCC solulinjojen Western blot -analyysillä. Kuvia lyhyen ja pitkän altistuksen MMP-10-proteiinin ilmentyminen on esitetty. ß-aktiini käytettiin latauskontrollina.

B,

Generation MMP-10-yli-ilmentävät solut. Saimme useita klooneja transfektoimalla pBICEP-FLAG-merkitty MMP-10 HSC2 ja HSC3 soluja. Kohdunulkoinen MMP-10 määritettiin Western blotting anti-FLAG-vasta-ainetta (vasen paneeli). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Entsymaattinen MMP-10 havaittiin stromelysiini tsymografialla (oikea paneeli). Aktiivinen muoto MMP-10 (nuoli pää) havaittiin elatusaineessa MMP-10-yli-ilmentävät solut.

C,

Invasive MMP-10-yliekspressoivia HSC2 (vasen paneeli) ja HSC3 (oikea paneeli) soluja verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoidut HSC2 ja HSC3 soluja (tyhjä) by

in vitro

invaasiomääritys. Solut kiinnitettiin sen jälkeen, kun on inkuboitu 12 h tai 20 h HSC2 soluissa tai HSC3 soluissa, vastaavasti. Kuvassa värjätään alapuolen kalvon, jossa solut tunkeutunut (ylempi paneeli). Käyrät osoittavat määrän hyökkäsi solujen MMP-10-yliekspressoivassa ja tyhjän vektorin transfektoiduissa soluissa (alempi kuva). Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen kuin tyhjän vektorin transfektoiduista soluista osoitteessa

P

0,01.

D,

MMP-10 siRNA tukahdutti hyökkäyksen HNSCC soluja. Cocktail 3 eri MMP-10 siRNA: t transfektoitiin väliaikaisesti Ca-9-22 ja Ho-1-N-1-solujen MMP-10 ilmentyminen. Salatun sekvenssi, joka ei osoita merkittävää homologiaa rotan, hiiren tai ihmisen geenisekvenssien käytettiin kontrollina. 48 tunnin kuluttua transfektion, MMP-10-mRNA: n ja proteiinin tutkittiin RT-PCR: llä ja Western blotting (WB), vastaavasti. GAPDH mRNA ja β-aktiini-proteiinia käytettiin latauskontrollina. Densitometrinen analyysi MMP-10: n ilmentyminen. MMP-10 /GAPDH-suhde on esitetty.

E,

Vastustamisesta hyökkäystä MMP-10 knockdovvn in Ca9-22 ja Ho-1-N-1-soluissa. Invasiivisuus MMP-10 tippuu alas solut tutkittiin

in vitro

invaasiomääritys verrattuna ohjaus siRNA transfektoituja soluja. Salatun sekvenssi, joka ei osoita merkittävää homologiaa rotan, hiiren tai ihmisen geenisekvenssien käytettiin kontrollina. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin ja lukumäärä tunkeutuu solujen laskettiin. Kuvassa värjätään alemman membraanin, jossa solut tunkeutunut (vasen paneeli). Kaavio osoittaa määrän hyökkäsi solujen (oikea paneeli). Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen ohjaus siRNA transfektoiduista soluista osoitteessa

P

0,01.

MMP10 Knockdown vaimentaa Periostin ja Wnt-5b-edistänyt invaasion HNSCC solujen

Nykyinen havainnot paljastivat, että MMP-10 on yleinen säädelty geeni keskuudessa Periostin, IFITM1, ja Wnt-5b yli-ilmentymisen. Vertasimme MMP-10 Periostin, IFITM1 ja Wnt-5b-yliekspressoivia soluja kuin vertailuryhmässä soluissa. MMP-10: n havaittiin voimistuvan Periostin tai Wnt-5b (kuvio 5A), mutta ei IFITM1 (tuloksia ei ole esitetty). Meidän mikrosiruanalyysi, 17,4-kertainen MMP-10 ilmentyminen havaittiin Periostin yli-ilmentäviä HSC2 soluja ja 5,8-kertainen MMP-10 ilmentyminen havaittiin Wnt-5b-yli-ilmentävät HSC4 soluja. Siksi tutkimme mahdollista roolia MMP-10 Periostin ja Wnt-5b-edistänyt hyökkäyksen HNSCC. Olemme tutkineet vaikutus MMP-10 Knockdown on invaasion Periostin yliekspressoivia Ca9-22 soluissa ja Wnt-5b-yliekspressoivia HSC4 soluissa. MMP-10-proteiinin väheni MMP-10 pudotus in Periostin- ja Wnt-5b yli-ilmentäviä soluja (kuvio 5B). Mielenkiintoista, MMP-10 Knockdown merkittävästi tukahdutti Periostin- ja Wnt-5b-edistänyt invaasiota (kuvio 5C), mikä osoittaa, että MMP-10 voi olla rooli invasiivisuus ohjaavat Periostin- ja Wnt-5b-yliekspressio HNSCC. Tutkimme myös MMP-10 knockdovvn in Periostin-overxpressiong HSC2 soluissa (kuvio S4). In samanlainen Periostin-overxpressiong Ca9-22 soluja, MMP-10 siRNA tukahdutetaan invasiivisen valmiuksia Periostin-overxpressiong HSC2 soluja. Lisäksi MMP-10 Knockdown merkittävästi esti hyökkäyksen hallinnassa Ca9-22 soluissa, kun taas MMP-10 Knockdown hieman esti hyökkäyksen hallinnassa HSC2 ja HSC4 soluja (kuvio 5C ja kuvio S4). Vuonna Ca9-22 soluissa, korkea MMP-10 ilmentyminen havaittiin, mutta ei HSC2 ja HSC4 soluja (kuvio 4A). Kuten Ca9-22 solut osoittivat endogeenisiä MMP-10 ilmentyminen korkeammilla tasoilla, ajattelimme, että MMP-10 siRNA tukahdutetaan invasiivisia valmiuksia kautta downregulation endogeenisen MMP-10 ilmentyminen Ca9-22 soluissa. Taso tukahduttaminen MMP-10 Knockdown oli todennäköisesti riippuvainen ilmentymistason MMP-10.

A,

ilmentymistä MMP10 mRNA tutkittiin RT-PCR hallinnassa Ca9 -22-solut, Periostin yli-ilmentäviä Ca9-22 soluja, ohjaus HSC4 solut ja Wnt-5b-yli-ilmentävät HSC4 soluja. GAPDH ilmentyminen käytettiin latauskontrollina.

B,

MMP-10 Knockdown osaksi Periostin- ja Wnt-5b-yliekspressoivia soluja. Cocktail 3 eri MMP-10 siRNA: t transfektoitiin väliaikaisesti Periostin-yli-ilmentävät Ca-9-22-solujen ja Wnt-5b-yli-ilmentävät HSC4 soluja. Salatun sekvenssi, joka ei osoita merkittävää homologiaa rotan, hiiren tai ihmisen geenisekvenssien käytettiin kontrollina. 48 tunnin kuluttua transfektion MMP-10-proteiinin tason tutkittiin Western blot -analyysillä anti-MMP-10-vasta-aineen MMP-10 siRNA transfektoitiin Periostin yli-ilmentäviä soluja. ß-aktiini käytettiin latauskontrollina.

C,

invasiivisuus MMP-10 siRNA transfektoiduissa Periostin yliekspressoivia Ca-9-22 soluissa (vasen paneeli) ja Wnt-5b-yliekspressoivia HSC4 solut (oikea paneeli) tutkittiin

in vitro

invaasiomääritys. 18 tunnin kuluttua inkubaation HSC4 soluja ja 24 tunnin inkuboinnin Ca9-22 soluja, solut kiinnitettiin ja lukumäärä tunkeutuu solujen laskettiin. Kuvassa värjätään alapuolen kalvon, jossa solut tunkeutunut (ylempi paneeli). Kuvaajat esittävät määrä hyökkäsi solujen Knockdown ja ohjaus soluja (alempi kuva). Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen valvontaa

P

0,01.

MMP-10-edistänyt invaasio liittyy p38 esto

Jotta tietää mekanismi MMP-10 edistää invaasio, havaitsimme aktiivisuus solusignalointimolekyylien, kuten p38: n, FAK, EK, Akt, Src, ja ERK western-blottauksella käyttämällä fosforylaation spesifisen vasta-aineen ohjaus ja MMP-10 yli-ilmentävät solut. Näiden molekyylien joukossa, p38 inaktivoitiin MMP-10 yli-ilmentymisen (kuvio 6A). Edelleen vahvistaa osallistumista p38 inhibition MMP-10-edistää invaasio, invasiivista kyky ohjaus ja MMP-10 yli-ilmentäviä soluja hoidon jälkeen p38-estäjän, SB203580 tutkittiin. Mielenkiintoista, SB203580 hoito merkittävästi edistänyt hyökkäyksen ohjaus solujen p38 aktiivisuutta (kuvio 6B). Toisaalta, SB203580 hoito ei edistää hyökkäyksen MMP-10 yliekspressoivia soluja ilman p38 aktiivisuutta. Lisäksi tutkimme mikäli p38-estäjän pelasti lohkon invaasion aiheuttama MMP10 Knockdown MMP-10 yliekspressoivia HSC2 ja HSC3 soluja. MMP-10 knockdovvn MMP-10-yli-ilmentävät solut edistänyt invasiivisen kapasiteetti käsittelyn jälkeen p38-estäjän (kuva S5). Kuitenkin p38 estäjä ei täysin pelastaa invasiivisen kapasiteetti tukahdutti MMP-10 siRNA (kuva S5). Lisäksi olemme vahvistaneet, että lisäksi vakioitua elatusainetta MMP-10 yli-ilmentäviä soluja esti p38-aktiivisuus HSC2 ja HSC3 soluja (kuvio 6C). Tutkimme myös p38 aktiivisuutta ja hyökkäystä MMP-10 knockdovvn in MSCC-INV1 soluissa. In MSCC-INV1 solujen MMP-10 Knockdown hieman voimistunut p38 aktiivisuutta (kuvio 6D) ja esti invasiivisen aktiivisuuden (kuvio 6E).

A

p38 esto havaittiin MMP-10 yli-ilmentävät solut. Veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun muodot p38, FAK, RSK, Akt, Src, ja ERK valvonta ja MMP-10 overexpresing solujen western blottauksella.

B,

Invasion valvonta- ja MMP-10 yliekspressoivia solujen käsittelyn jälkeen p38-estäjän. Invasiivisuus on tutkittiin

in vitro

invaasiomääritys tyhjissä vektori transfektoiduissa soluissa ja MMP-10 yliekspressoivia solujen SB203580 hoitoon. Tyhjä vektori transfektoituja soluja käytettiin kontrollina. 12 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin ja lukumäärä tunkeutuu solujen laskettiin. Kuvassa värjätään alapuolen kalvon, jossa solut tunkeutunut (ylempi paneeli). Kuvaajat esittävät määrä hyökkäsi soluja (alempi kuva). Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen kuin tyhjän vektorin transfektoiduista soluista ilman SB203580 hoitoa

P

0,01.

C,

p38 aktiivisuus käsittelyn jälkeen vakioitua elatusainetta MMP-10 yliekspressoivia soluja. Vakioitu väliaine MMP-10 yliekspressoivia HSC2 ja HSC3 solut kerättiin 48 tunnin jälkeen pinnoituksen. Kun on lisätty alustoihin 0, 6, 12 ja 24 h, HSC2 tai HSC3 solut kerättiin. Expression fosfo-p38 ja p38 tutkittiin Western blot-analyysi.

D,

MMP-10 siRNA ylössäätelee p38 aktiivisuutta HNSCC soluissa. Cocktail 3 eri MMP-10 siRNA: t transfektoitiin väliaikaisesti MSCC-INV1 soluja. Salatun sekvenssi, joka ei osoita merkittävää homologiaa rotan, hiiren tai ihmisen geenisekvenssien käytettiin kontrollina. 48 tunnin kuluttua transfektion, MMP-10-proteiini tutkittiin Western-blottauksella. Veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun muotoja p38 tutkittiin myös Western-blottauksella. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin latauskontrollina.

E,

Vastustamisesta hyökkäystä MMP-10 knockdovvn in MSCC-INV1 soluissa. Invasiivisuus tutkittiin

in vitro

invaasiomääritys. Kun 6 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin ja lukumäärä tunkeutuu solujen laskettiin. Kuvassa värjätään alapuolen kalvon, jossa solut tunkeutunut (ylempi paneeli). Kaavio osoittaa määrän hyökkäsi soluja (alempi kuva). Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS kolmen itsenäisen kokeen. * Merkittävästi erilainen valvontaa

P

0,01.

Keskustelu

Invasion ja etäpesäke ovat suuri ongelma ja suurin este hoitoon HNSCC. Sen vuoksi on tärkeää tunnistaa uusia molekyylejä, mukana ja metastaasit ja HNSCC. Olemme tunnistaneet useita invaasiota, jotka liittyvät geenien vertaamalla geeniekspressioprofiilien välillä kantasoluja ja erittäin invasiivinen klooni [8]. Periostin ja IFITM1 tunnistettiin korkein geenien erittäin invasiivisia klooni ja niiden osallistuminen hyökkäystä vahvistettiin

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa [8], [9]. Tässä me osoitimme, että Wnt-5b edisti invaasion HNSCC soluja (kuvio 1). Toistaiseksi on vain yksi raportti, joka Wnt-5b ylössäädellään syöpäsolulinjoissa ja vähän tietoa roolista Wnt-5b syövässä [16].