Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

monosyyttien ja makrofagien voivat soluttautua kasvain mikroympäristön ja säännellä etenemistä kasvaimia. Tutkimuksen tavoitteena oli määrittää taajuudella eri osa verenkierrossa monosyyttien ja kasvaimen soluttautuminen makrofageja (TIMS) potilailla, joilla peräsuolen syöpä (CRC).

Methods

taajuus eri osa kiertävän monosyyttien leimasi 46 CRC potilailla ja 22 terveen kontrollin (HC) virtaussytometrialla. Taajuus eri osa makrofagien analysoitiin vuonna Tims 30 kasvain kudosten ja lamina propria mononukleaarisolut (LPMCs) 12 ei-kasvainkudoksia. Pitoisuudet plasmassa sytokiinien ja karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) määritettiin. Mahdollinen yhdistys nämä toimenpiteet arvoja kliinisten parametrien analysoitiin.

Tulokset

verrattuna, että HC, prosenttiosuudet kiertävän CD14

+ CD169

+ , CD14

+ CD169

+ CD163

+ ja CD14

+ CD169

+ CD206

+ monosyytit ja Tims CD14

+ CD169

+ sekä IL- 10

+ CD14

+ CD169

+, mutta ei IL-12

+ CD14

+ CD169

+ makrofageja suurenivat huomattavasti, mukana korkeampia plasman IL-10 CRC potilailla. Prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyytit ja TIM makrofagit olivat yhteydessä taudin vaiheesta ja korreloi positiivisesti plasman IL-10 ja CEA CRC potilailla.

Johtopäätös

Tuloksemme viittaavat siihen, että kasvu taajuus CD14

+ CD169

+ soluja voi liittyä kehitykseen ja etenemiseen CRC ja on samanaikainen nousu molempien, pro-kasvain (M2 kaltainen IL-10 tuottavat) ja anti-kasvain (M1-like, IL-12 tuottavat) monosyyttien ja tunkeutumisatmosfäärin makrofageissa. Taajuus CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyytit ja soluttautuminen makrofagien voi toimia biomarkkeri arvioidaan patogeenisten astetta CRC.

Citation: Li C, Luo X, Lin Y, Tang X Ling L, Wang L, et ai. (2015) tiheämmin CD14

+ CD169

+ Monosyytit /makrofagit potilailla, joilla on peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (10): e0141817. doi: 10,1371 /journal.pone.0141817

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: toukokuu 22, 2015; Hyväksytty: 13 lokakuu 2015; Julkaistu: 28 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, joilla on korkea kuolleisuus. Sen esiintyvyys on lisääntymässä monissa maissa ja CRC vaikuttaa 1,2 miljoonaa ihmistä vuosittain maailmassa [1]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kehittymistä ja etenemistä CRC liittyy paikallisen tulehduksen [2-5]. Todellakin, erilaisia ​​tulehduksellisten infiltraattien, erityisesti makrofagien, ovat läsnä CRC kudoksissa ja tasapaino protumor ja antitumor tulehduksellisten infiltraatit arvellaan olevan kriittinen kehittämiseen, etenemistä ja hyökkäys CRC [3-4, 6]. Näin ollen kuva eri tulehduksellisten infiltraattien sekä niiden mahdolliset toiminnot on suuri merkitys ymmärtää patogeneesissä CRC.

makrofagit, kuten ammatti-antigeeniä esittelevät solut (APC: t) on luonnollinen immuniteetti, ovat runsain immuuni solupopulaation kasvaimen mikroympäristössä [7, 8], ja keskeisessä asemassa ovat säätelyssä kudosten homeostaasin ja immuniteetti. Makrofagit suolen kudokset voivat olla niiden itseuudistumisen [9] ja voivat myös johtua kulkeutumista monosyyttien suolen lamina propriaa ylläpitää suolen homeostaasiin [10, 11]. Makrofageja voidaan klassisesti aktivoida osaksi M1 ilmentävissä indusoituvaa typpi- oksidaasi (iNOS), IL-12 ja korkea kostimuloija molekyylien asuessaan kudosmakrofagien ja kasvaimeen liittyvät makrofagit todennäköisesti ilmaista CD163, 206, arginase ja IL-10 , M2 fenotyyppi [12-17]. Lisäksi makrofagit, kuten vanhemman monosyytit, ilmaista CD14 co-reseptorin TLR4, jota on yleisesti käytetty tunnistamiseen makrofagien ja monosyyttien suolen limakalvon ja ääreisverenkierron [18, 19]. Monosyytit ja kasvaimen infiltroivia makrofageja (TIM) myös ilmaista CD169, sialoadhesin, soluadheesiomolekyyli [20] ja MAC387, markkeri epäkypsiä makrofageja [21]. CD169

+ makrofagit ovat tärkeitä toimijoita aloittamista ja etenemistä tulehdus- ja autoimmuunisairauksien [22]. Lisäksi CD169

+ makrofagien ja monosyyttien on ajateltu hallitsevat pro-tulehdus immuniteetti [22-25]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että M2-solujen kasvaimen ympäristöön liittyvät etenemisen ja etäpesäkkeiden syövän [15, 26-27]. Lisäksi CD169

+ makrofagien imusolmukkeisiin liittyy suotuisa ennusteen CRC potilaille [28]. Kuitenkin, millaista makrofagien kasvaimen ympäristö liittyy etenemiseen CRC edelleen kiistanalainen. On vahvistettu, että CD169

+ makrofagien exit paksusuolessa lamina propriaa lähinnä ympäröivä kryptissa ja niiden kehitystä tuetaan vitamiini hiirissä [29]. Taajuus verenkierrossa CD169

+ monosyytit ja kasvaimen soluttautuminen makrofagien CRC ja niiden potentiaali yhdessä etenemisen CRC ei ole selvitetty.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme tunnettu taajuus eri osa CD14

+ CD169

+ solujen kiertävien monosyyttien ja Tims virtaussytometrialla ja havaittu plasman IL-10 ja IL-12 sekä karsinoembryoninen antigeeni (CEA), CRC potilailla. Lisäksi olemme analysoineet Tulehdustason prosenttiosuuksien kiertävien CD14

+ CD169

+ monosyyttien ja Tims kanssa tasojen sytokiinien ja CEA sekä kliinisten parametrit CRC potilailla. Löysimme huomattavasti prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ sekä kiertävän monosyyteissä ja Tims CRC potilaista. Lisäksi prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävän monosyyttien ja Tims liittyivät positiivisesti patogeenisen vaiheissa CRC ja korreloi plasman IL-10, ja CEA: CRC potilailla. Siten meidän tiedot tukevat käsitystä, että lisääntynyt esiintymistiheyden CD14

+ CD169

+ soluja voi liittyä kehitykseen ja etenemiseen CRC ja on samanaikainen nousu sekä pro-kasvain (M2 kaltainen, IL -10 tuottavat) sekä anti-kasvain (M1-like, IL-12 tuottavat) monosyyttien ja kasvaimen infiltroivia makrofageissa.

Materiaalit ja menetelmät

aiheet ja näytteet

kirjallisen suostumus saatiin yksittäisten osallistujien. Kokeellinen protokolla on perustettu, mukaan ohjeita Helsingin julistuksen ja hyväksyi Human eettisen komitean Jilin University (Jilin University, Changchun, Kiina). Kaikkiaan 46 potilaalla on CRC rekrytoitiin vuoden sairaalahoidossa palveluksessa Department of peräsuolen Anal Surgery, ensimmäinen sairaala, Jilin University helmikuusta 2013 joulukuuta 2014. Yksittäiset potilaat diagnosoitiin positiivinen ulosteen piilevän veren testi histologinen tutkimus on koepalana otetulle tuumorikudoksista aikana saatujen kolonoskopia, ja tietokonetomografia (CT) skannaus. Yksittäiset kasvainnäytteestä arvioitiin niiden kasvainten luokittelun, histologiset laadut, ja imusolmuke etäpesäke tilan patologia pidennetyn tavalla ja järjestetään, mukaan kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) luokitusjärjestelmän International Union syöpää vastaan ​​(erä 7) [ ,,,0],30]. Ositustarkoituksiin analyysi potilaille, joilla on vaiheen I /II CRC katsottiin varhaisessa vaiheessa, kun taas ne, joilla on vaiheen III /IV CRC katsottiin jo pitkällä. Yksittäisten potilaiden suljettiin jos hän /hän sai sädehoitoa, kemoterapiaa tai immunoterapiaa. Lisäksi potilaat myös suljettu pois, jos hän /hän oli huono fyysinen kunto. Toinen 22 iän ja sukupuolen-terveisiin verrokkeihin ja 12 ei ollut kasvainta koehenkilöille palvelukseen fyysinen tutkiminen Center ja muun osaston samassa sairaalassa. Kaikki osallistujat ei ollut ollut syövän, autoimmuunisairauksien, viime tartuntataudit, tulehduksellinen suolistosairaus ja familiaalinen polypoosi. Verinäytteet saatiin 46 puhkeamista CRC potilaille, ja 22 terveen kontrollin (HC). Kirurginen peräsuolen resektiota kudosnäytteitä saatiin 30 CRC potilaista ja 12 ei-kasvain valvontaa, joka tehtiin kirurginen resektio sekoittaa peräpukamat. Tulehdus voi liittyä kehittämiseen peräpukamat. Kuitenkin aikaisemmassa tutkimuksessa on tunnistettu, että peräpukamat ei näytä liittyvän lisääntyneen riskin peräaukon syöpä [31] ja luonne tulehduksen välillä ympäristöt CRC ja peräpukamat on erilainen. On järkevää käyttää näitä kudoksiin kuin ei-kasvain valvontaa tutkimuksessamme. Väestörakenteen ja kliiniset tiedot yksittäisten osallistujien kerättiin sairaalasta kirjaa ja tarkistaa kokeneet kirurgit. Heidän demografiset ja kliiniset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1.

eristäminen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) B

paasto laskimoverta kerättiin yksittäisten osallistujien, ja yhden osan verta käytettiin valmistamiseksi perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t), jonka tiheys-gradienttisentrifugoinnilla käyttämällä Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Jäljellä olevat verinäytteet sentrifugoitiin valmistamiseksi plasmanäytteistä.

eristäminen lamina propria mononukleaarisolut (LPMCs) ja Tims

lamina propria mononukleaarisolut (LPMCs) eristettiin niitä 12 ei-kasvain potilaiden ja Tims eristettiin 30 vasta resektoitiin kirurginen kasvaimen yksilöitä, kuten aiemmin on kuvattu, joissa on vähäisiä muutoksia [29, 32]. Lyhyesti, juuri resektoitiin limakalvon tai CRC kudoksia käsiteltiin 30 minuutin kuluessa keräämisestä ja inkuboitiin kalsium ja magnesium-vapaa Hanksin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS, Sigma-Aldrich), joka sisältää 2,5% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1 mM ditiotreitolia (Sigma-Aldrich) jäällä. Kudoksia inkuboitiin kalsium ja magnesium-vapaa HBSS, joka sisälsi 5 mM EDTA: ta, 1 mM ditiotreitolia, 2,5% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 0,1% v /v β-merkaptoetanoli (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 37 ° 25 min samalla jatkuvasti sekoittaen poistaa limaa ja epiteelisolujen. Tämän jälkeen jäljellä olevat segmentit leikattiin pieniksi paloiksi ja pilkottiin 250 ug /ml DNAse (Roche) ja 125 ug /ml liberaseTM (Roche) HBSS: ssä 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan jatkuvasti sekoittaen. Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen RPMI-1640 ja suodatettiin 40 uM solusiivilän, jonka jälkeen lastaus pinnalla Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Kun oli sentrifugoitu 800 g: llä 20 minuutin ajan, LPMCs ja Tims otettiin talteen käyttöliittymän ja pestiin kahdesti PBS: llä ja virtaussytometrialla.

Virtaussytometrianalyysi

taajuuden määrittämiseksi eri osajoukkojen CD14

+ soluja, PBMC tai LPMCs (10

6 solua /putki) värjättiin Alexa Fluor 647-anti-CD169 (Biolegend), APC-H7-anti-CD14 (BD PharMingen), BV421-anti- CD163 (BD ​​PharMingen) ja PerCP-Cy5.5-anti-CD206 (Biolegend) 4 ° C: ssa 30 min vastaavasti. Tämän jälkeen solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin käyttämällä läpäiseväksi liuosta (BD Biosciences), jota seurasi solunsisäinen värjäys FITC-konjugoidulla anti-MAC387 (Abcam).

Lipopolysakkaridi (LPS) voidaan aktivoida monosyyttejä tai makrofagit vuorovaikutuksessa jossa TLR4 ja CD14 ja aiheuttavat sukupolven sytokiinien, kuten IL-6, IL-10 ja IL-12 [33-34]. Havaitsemiseksi toiminnon, PBMC: t tai LPMCs (10

6 solua /kuoppa) stimuloitiin in kahtena 50 ng /ml lipopolysakkaridia (LPS) ja forbolimyristaattiasetaatilla (PMA), ja 1,0 ug /ml ionomysiiniä (Sigma-Aldrich ) 10% FBS RPMI-1640-väliaineessa 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan 5% CO

2 ja altistettiin Brefeldin A (GolgiPlug, BD Biosciences) vielä 4 tunnin ajan, kuten on kuvattu aikaisemmin laboratoriossamme (21). Sen jälkeen, kun on pesty, värjättiin Alexa Fluor 647-anti-CD169, APC-H7-anti-CD14: ää, kiinteä, ja läpäiseviksi käyttäen läpäiseväksi liuosta, minkä jälkeen solunsisäinen värjäys PE-CF594-anti-IL-10 (JES3-9D7 , BD Biosciences) tai PE-anti-IL-12 (BD PharMingen). Sovitetun hiiri isotyyppikontrolleja APC-H7-IgG1, FITC-IgG1, PE-Ig2a, PerCP-Cy5.5-IgG1, PE-CF594-IgG1 ja Alexafluor-IgG1 toimi valvontaa. Mononukleaariset solut porteilla mukaan solun koon ja sisäisen rakenteen. Paremmin erottaa positiivisen negatiivisesta väestöstä, suoritimme Fluoresenssi Minus One (FMO), jolla solut inkuboitiin kaikki fluorokromeista lukuunottamatta sitä, joka mitataan (CD14, CD169, CD163). Taajuus eri osa CD14

+ mononukleaarisia soluja määritettiin virtaussytometrialla analyysi BD FACSCalibur (Becton Dickinson) ja analysoitiin käyttäen FlowJo 7.6.2 ohjelmistoa.

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

pitoisuudet plasmassa IL-10 ja IL-12p70 yksittäisten osallistujien määritettiin ELISA: lla käyttäen ihmisen IL-10 ja IL-12p70 ELISA mukaan valmistajan ohjeen (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

karakterisointi kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyttien CRC potilailla

määrittämiseksi mahdollisia rooleja kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyytit kehittämisessä CRC, ryhmä CRC potilaiden ikä ja sukupuoli-Hyväksytty HC rekrytoitiin. Kuten taulukossa 1 esitetään, ei ollut merkittävää eroa jakelu ikä ja sukupuoli, numerot WBC ja monosyyttien potilaiden välillä ja HC. Lisäksi ei ollut merkittävää eroa kasvaimen sijainti ja niiden ero laadut potilaiden välillä varhainen ja kehittynyt CRC. Kuten odotettua, potilailla näkyy huomattavasti korkeampi plasman CEA kuin HC (P 0,05).

Edellinen tutkimus on osoittanut, että CD14

+ monosyyttien osuus 80-90% koko verenkierron monosyyttien [35] . CD14

+, CD169

+ ja CD163

+ solut aidatulla mukaan vastaaviin isotyyppikontrolleja ja FMO valvonta (S1 Kuva). Analysoimme taajuus eri osa kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyteissä CRC potilaiden ja HC virtaussytometrialla (kuvio 1A ja 1 B). Kvantitatiivinen analyysi paljasti, että prosenttiosuudet kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyteissä potilaista olivat huomattavasti korkeampia kuin HC (18,21% vs. 1,42%, P 0,0001; kuvio 1C). Näin ollen huomattavasti prosenttiosuudet kiertävien CD14

+ CD169

+ monosyyttien olemassa CRC potilailla.

Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) saatiin yksittäisiä aineita ja värjättiin anti-CD14 ja anti- CD169. Taajuus kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyttien karakterisoitiin virtaussytometrialla. Solut aidatulla aluksi mononukleaarisissa soluissa ja sitten CD14

+ soluja. Myöhemmin prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ monosyyttejä määritettiin. Luonnehtia eri osa CD14

+ CD169

+ monosyyttejä, PBMC värjättiin fluoresoivalla vasta-aineita CD14, CD169 ja CD163, CD206 tai MAC387. Solut eroteltiin CD14

+ CD169

+ monosyytit ja prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ CD163

+, CD14

+ CD169

+ CD206

+ ja CD14

+ CD169

+ MAC387

+ makrofagien määritettiin. Tiedot edustavat kaavioita virtaussytometrialla ja ilmaistiin arvot yksittäisiä aineita. Vaakasuorat viivat osoittavat mediaani yksittäisille ryhmille. (A) Virtaussytometrianalyysi CD14

+ CD169

+ monosyyteissä /makrofageissa. (B) Virtaussytometrianalyysi eri osajoukkoja kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyteissä /makrofageissa. (C) prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ monosyyteissä. (D) taajuus CD14

+ CD169

+ CD163

+ makrofageja. (E) taajuus CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofageja. (F) taajuus CD14

+ CD169

+ MAC387

+ makrofagien.

Lisäkarakterisointia osoitti, että osuus CD14

+ CD169

+ CD163

+ solujen yhteensä kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyteissä CRC potilaista oli merkittävästi suurempi kuin vuonna HC (74,27% vs. 60.14%, P 0,0001, kuvio 1 D). Lisäksi taajuus kiertävän CD14

+ CD169

+ CD206

+ monosyyttien yhteensä kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyteissä CRC potilaista oli myös huomattavasti korkeampi kuin HC (3,35% vs. 0,82%, P 0,0001; kuvio 1 E). Sen sijaan prosenttiosuudet kiertävän CD14

+ CD169

+ MAC387

+ monosyyttien yhteensä kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyttien CRC potilaat olivat alhaisemmat kuin HC (76,31% vs. 80,15%, P = 0,0041, kuvio 1F). Yhdessä CRC potilaat näkyy epätasapaino eri osa kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyyteissä.

analyysi CD14

+ CD169

+ makrofagien peräsuolen kasvaimet

Oheislaitteet monosyytit kulkeutuvat elinten ja kudosten säännellä tulehdus. Jotta ymmärtää merkityksen eri osa CD14

+ CD169

+ makrofagien kehittämisessä CRC, prosenttiosuudet eri osa CD14

+ CD169

+ makrofagien LPMCs 12 ei-kasvain potilaiden ja Tims 30 CRC potilaista analysoitiin virtaussytometrialla (kuvio 2A). Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että makrofagit suolen lamina propria voi ilmaista eri CD14 [18, 36], joka on osa CD14

+ makrofagien esiteltiin lamina propriassa (S1 kuvio A) ja olemme keskittyneet tässä potilasryhmässä suoliston makrofageissa. CD14

+, CD169

+ ja CD163

+ solujen LPMCs tai Tims saatiin erotettua mukaan FMO ohjaa S1 kuvassa. Prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ makrofagien Tims olivat huomattavasti korkeampi kuin LPMCs ei-kasvain potilailla (25,36% vs. 1,83%, P 0,0001; kuvio 2B). Lisäksi olemme analysoineet prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ CD163

+ tai CD14

+ CD169

+ CD206

+ solujen LPMCs tai Tims virtaussytometrialla (kuvio 2C) . Prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ CD163

+ tai CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofagien Tims oli merkittävästi suurempi kuin vuonna LPMCs (78,05% vs. 64,21 %, P 0,0001; 3,85% vs. 1,63%, P 0,0001, kuvio 2D ja 2E). Kiinnostavaa kyllä, myös havaittiin merkittävästi korkeampia prosenttiosuuksia CD14

+ CD169

+ CD163

+ tai CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofagien Tims kuin verenkierrossa monosyyteistä CRC potilaiden (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että perifeerisen veren CD14

+ CD169

+ monosyyttien saattaa siirtyä lamina propriassa ja tuli M2 kaltaisia ​​soluja.

yhteensä 30 tuoreen kirurgisen CRC kasvaimen kudokset pilkottu karakterisointia kasvaimen soluttautua makrofageja (Tims). Lisäksi 12 lamina propria kudosten ei-kasvain potilaita sulatettiin luonnehdinta makrofagien yhteensä lamina propria mononukleaarisolut (LPMCs). Sen jälkeen solut värjättiin anti-CD14, CD169 ja CD163 tai CD206. Taajuus CD14

+ CD169

+, CD14

+ CD169

+ CD163

+ ja CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofagien LPMCs ja Tims määritettiin virtaussytometrialla. Tiedot edustavat kaavioita tai ilmaistuna arvot yksittäisiä aineita. Vaakasuorat viivat osoittavat mediaani yksittäisille ryhmille. (A) Virtaussytometrianalyysi CD14

+ CD169

+ vuonna LPMCs ja Tims. (B) prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ makrofagien LPMCs ja Tims. (C) Virtaussytometrianalyysi CD14

+ CD169

+ CD163

+ ja CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofagien yhteensä CD14

+ CD169

+ LPMCs ja Tims makrofagit. (D) taajuus CD14

+ CD169

+ CD163

+ makrofagien LPMCs ja Tims. (E) taajuus CD14

+ CD169

+ CD206

+ makrofagien LPMCs ja Tims.

Suurempi taajuus IL-10

+ CD14

+ CD169

+ monosyytit ja makrofagit CRC potilailla

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-10

+ M2 solut liittyvät kehittämiseen CRC [26, 37-38]. Määrittää toiminnon kiertävien CD14

+ CD169

+ monosyyttien ja Tims, eristettyjä soluja stimuloitiin in vitro ja prosenttiosuudet IL-10

+ tai IL-12

+ CD14

+ CD169

+ kiertävän monosyyttien ja Tims määritettiin virtaussytometrialla (kuvio 3A). Prosenttiosuudet IL-10

+ CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien ja Tims yhteensä CD14

+ CD169

+ soluja CRC potilaista oli merkittävästi suurempi kuin ei-kasvain aiheista (3,79% vs. 0,76%, P 0,0001 kierrättämiseksi monosyyttien; 7,12% vs. 1,23%, P 0,0001 Tims. Kuva 3B). Sitä vastoin ei ollut merkittävää eroa taajuus IL-12

+ CD14

+ CD169

+ kiertävän monosyytit ja Tims välillä CRC potilaiden ja ei-kasvain potilailla (0,24% vs. 0,22%, P = 0,2854 kierrättämiseksi monosyyttien; 0,37% vs. 0,36%, P = 0,4729 varten Tims. Kuva 3C). Edelleen analyysi CD14

+ CD169

– soluja paljasti ei ole merkittävää eroa taajuus IL-10

+ tai IL-12

+ CD14

+ CD169

– soluja yhteensä CD14

+ CD169

– solujen välinen CRC potilaiden ja ei-kasvain aiheita tässä potilasryhmässä (IL-10: 0,017% vs. 0,024%, P = 0,6428 kierrättämiseksi monosyyttien; 0,018% vs. 0,014% , P = 0,8125 varten Tims, IL-12: 0,019% vs. 0,013%, P = 0,1628 kierrättämiseksi monosyyttien; 0,015% vs. 0,013%, P = 0,8678 varten Tims. S2 Kuva). Vielä tärkeämpää prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ IL-10

+ solut korreloi positiivisesti prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyytit ja Tims CRC potilailla (R = 0,5375, P = 0,0001 kierrättämiseksi monosyyttien; R = 0,5637, P = 0,0009 varten Tims, kuvio 3D ja 3E). Siksi CRC potilaat näkyy korkeampi taajuus IL-10

+ CD14

+ CD169

+ makrofagien.

PBMC ja Tims eristettiin yksittäisistä aiheista ja stimuloidaan LPS ja PMA /ionomysiini . Solut värjättiin anti-CD169 ja anti-CD14: ssa 30 minuuttia, kiinteä, ja läpäiseviksi, minkä jälkeen solunsisäinen värjäys anti-IL-10 tai anti-IL-12. Solut Ensimmäinen eroteltiin CD14

+ CD169

+ solujen ja prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ IL-12

+ M1 ja CD14

+ CD169

+ IL-10

+ M2 solut PBMC: tai Tims yksittäisistä aiheista määritettiin virtaussytometrialla. Plasman IL-10 ja IL-12 yksittäisiä aineita määritettiin ELISA: lla. Tiedot edustavat kaavioita tai ilmaistuna arvot yksittäisten potilaiden. Vaakasuorat viivat osoittavat mediaani yksittäisille ryhmille. (A) Virtaussytometria-analyysi. (B) prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ IL-10

+ M2 soluja. (C) prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ IL-12

+ M1 soluja. Vaakasuorat viivat osoittavat mediaaniarvot. (D) Mahdollinen yhdistyksen välillä prosenttiosuuksien kiertävän CD14

+ CD169

+ IL-10

+ solujen ja CD14

+ CD169

+ solujen CRC potilailla. (E) Mahdollinen yhdistyksen välillä prosenttiosuuksien Tims CD14

+ CD169

+ IL-10

+ solujen ja CD14

+ CD169

+ solujen CRC kudoksissa. (F) Plasman IL-10. (G) Plasman IL-12. (H) korrelaatio plasman IL-10 tasoilla prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ IL-10

+ monosyyttien PBMC CRC potilaista. (I) välinen korrelaatio plasman IL-10, ja CEA: CRC potilailla.

mitattiin pitoisuuksia plasmassa IL-10 ja IL-12: n yksittäisiä aineita ELISA: lla. Kuten on esitetty kuviossa 3F ja 3G, pitoisuudet plasmassa IL-10, mutta ei IL-12, CRC-potilailla olivat merkittävästi korkeampia kuin että HC (P 0,0001). Pitoisuudet plasmassa IL-10 oli korreloi positiivisesti prosenttiosuudet kiertävän IL-10

+ CD14

+ CD169

+ monosyyteissä (R = 0,6018, P 0,0001; kuvio 3H) ja plasman CEA CRC potilailla (R = 0,413, P = 0,0043; Kuva 3I).

ositus analyysit taajuuden CD14

+ CD169

+ monosyytit ja makrofagit CRC potilailla

Seuraavaksi ositettu potilaat, niiden kasvain patologinen TNM vaiheet ja huomasimme, että prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyytit olivat merkittävästi pienemmät potilailla, joilla alkuvaiheessa CRC kuin ne, joilla on kehittynyt vaiheen CRC (11,81% vs. 15,91%, P = 00003, kuvio 4A). Samoin prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ makrofagien Tims alkaen varhaisvaiheen potilaiden CRC olivat huomattavasti pienempi kuin niillä, joilla pitkälle CRC (22,45% vs. 26,93%, P 0,0001, kuvio 4A). Lisäksi prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyteissä potilaille, joilla on varhaisessa vaiheessa tai pitkälle CRC olivat huomattavasti alhaisemmat kuin Tims samasta potilasryhmälle (P 0,00001, P 0,0001 vastaavasti, kuvio 4A). Prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttejä korreloi positiivisesti prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ makrofagien Tims potilailta varhain (R = 0,4361, P = 0,0073. Fig 4B) tai pitkälle (R = 0,8191, P = 0.0001.Fig 4C) CRC.

CRC potilaat stratifioitiin jo (I /II, n = 21) tai pitkälle (III /IV, n = 25) ja prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien ja Tims yksittäisillä potilailla analysoitiin. Lisäksi mahdolliset yhdistyksen välillä prosenttiosuuksien CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien tai Tims ja plasman CEA yksittäisillä potilasryhmissä analysoitiin. Tiedot ovat keskiarvo yksittäisten aiheista. (A) Prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ monosyyttien PBMC (n = 21 alkuvaiheen, n = 25 edennyt pitkälle CRC potilasta) ja prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ makrofaagien Tims varhaisesta (n = 14) tai edistyneen (n = 16) vaiheessa CRC potilaista. Vaakasuorat viivat osoittavat mediaani yksittäisille ryhmille. (B) välinen korrelaatio prosenttiosuuksien CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien ja Tims varhaisessa vaiheessa CRC potilaista. (C) välinen korrelaatio prosenttiosuuksien CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien ja Tims on edennyt jo pitkälle CRC potilaista. (D) välinen korrelaatio plasman CEA ja prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien CRC potilailla. (E) välinen korrelaatio plasman CEA ja prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ Tims CRC potilailla.

Plasman CEA pysyvät arvokas biomarkkeri arvioimalla CRC etenemistä [39]. Niinpä selvitimme mahdollisia yhteyksiä keskuudessa prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyytit ja Tims kanssa plasman CEA CRC potilailla. Huomasimme, että plasman CEA korreloivat positiivisesti prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien (R = 0,7655, P 0,0001; kuvio 4D) ja CD14

+ CD169

+ makrofaagien Tims (R = 0,5768, P = 0,0009; kuvio 4E) CRC potilailla. Yhdessä prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttejä ja Tims oli positiivisessa yhteydessä patologisen vaiheita CRC tässä potilasryhmässä.

Keskustelu

arvioimiseksi merkki potentiaali CD14

+ CD169

+ solujen patogeenisten etenemistä CRC, tutkimme fenotyyppi ja kliinistä merkitystä kiertävän CD14

+ CD169

+ monosyytit ja Tims CRC potilailla. Tuloksemme osoittivat, että kiertävä CD14

+ CD169

+ M2 kaltainen monosyyttien ja Tims kertynyt kasvaimet ja korreloi plasman IL-10 ja CEA CRC potilailla. On selvää, taajuus CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttejä ja Tims liittyivät patogeeninen vaiheisiin CRC. Parhaan tietomme mukaan tämä oli ensimmäinen raportti, joka merkittävästi korkeammat prosenttiosuudet kiertävän CD14

+ CD169

+ M2 kaltaisia ​​monosyytit tai Tims liittyi patogeenisten etenemiseen CRC ihmisillä.

inflammatorinen infiltraatit kasvaimen mikroympäristössä ovat ratkaisevia etenemisen ja etäpesäkkeiden kasvainten [7, 8]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että vaihtoehtoisesti aktivoitu M2 makrofagit voivat osallistua patogeenisen prosessin eri kiinteiden kasvainten edistämällä angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden ja inhiboimaan tuumorin vastaista aktiivisuutta [16, 40-41]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme huomattavasti tiheämmin verenkierrossa ja kasvaimen soluttautuminen CD14

+ CD169

+ CD163

+ ja CD14

+ CD163

+ CD206

+ M2 kaltainen makrofagien CRC potilailla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että reuna-monosyytit voivat kulkeutua kasvaimeen kudoksiin ja säätelevät kasvaimen kasvua ja immuniteetin. Prosenttiosuudet CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttien ja Tims potilailla, joilla on edennyt pitkälle CRC olivat huomattavasti korkeampia kuin ne, joilla on varhaisessa vaiheessa CRC. Nämä tiedot osoittivat lisäksi, että taajuutta CD14

+ CD169

+ kiertävä monosyyttejä ja Tims liittyivät patogeeninen astetta CRC. Tuloksemme laajennettu edellinen havaintoja tulehdustauti ja viittaavat siihen, että CD169

+ voidaan ilmaista makrofagien kasvaimen kudoksissa [23-25, 42]. Todellakin, CD169

+ makrofagien on havaittu normaalissa paksusuolen lamina propria [29]. Ottaen huomioon, että CD169 on adheesiomolekyyli on mahdollista, että CD14

+ CD169

+ verenkierrossa monosyytit voivat siirtyä ja aktivoidaan kasvain ympäristössä säädellä etenemisen ja etäpesäkkeiden CRC. Tuloksemme erosivat aikaisemman havainnon, että CD169

+ makrofagien imusolmukkeisiin liittyi suotuisa ennusteen CRC potilailla [28].