Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkeatasoinen vakavien munasarjasyöpä (HGSOC) on kaikkein aggressiivinen histologinen tyyppi epiteelin munasarjasyövän, joka on ominaista suuri taajuus somaattisten

TP53

mutaatioita. Suoritimme exome analyysit kasvaimia ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin 34 Japani potilaalla on HGSOC ja havaittiin huomattava määrä potilaita ilman

TP53

mutaatio (24%, 8/34). Yhdessä tulokset kopioluvun vaihtelua analyysit, me jakanut 34 potilaalla HGSOC alatyyppeihin nimetty ST1 ja ST2. ST1 näytti ehjä p53-reitin ja leimasi vähemmän somaattiset mutaatiot ja kopioluvun muutoksia. Sen sijaan p53-reitin oli heikentynyt ST2, joka on ominaista runsas somaattiset mutaatiot ja kopioluvun muutoksia. Geeniekspressioprofiilien yhdistettynä analyysit käyttäen Gene ontologia resurssi osoittaa osallistumista erityisten biologisten prosessien (mitoosi ja DNA helikaasia), jotka ovat merkityksellisiä genomista vakautta ja syövän etiologia. Erityisesti osoitamme, että läsnä on uusi alatyyppi potilaita, joilla HGSOC, joka on tunnettu siitä, että ehjän p53-reitin, rajoitettu genomi-muutokset ja erityisten geenien ilmentyminen.

Citation: Hayano T, Yokota Y, Hosomichi K, Nakaoka H, ​​Yoshihara K, Adachi S, et ai. (2014) Molecular karakterisointi ehjän p53 Pathway alatyyppi High-Grade seroosit munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (12): e114491. doi: 10,1371 /journal.pone.0114491

Editor: Michael Baudis, University of Zurich, Sveitsin Institute of Bioinformatics, Sveitsi

vastaanotettu: toukokuu 16, 2014; Hyväksytty: 10 marraskuu 2014; Julkaistu: 02 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Hayano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että hyväksyttyjä syistä, jotkut pääsy rajoitukset koskevat tietojen taustalla havainnot. Tiedot sisältävät tunnistetietoja eikä niitä voida asettaa saataville. De-tunnistaa minimaalinen aineisto on saatavilla osoitteessa Figshare: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1235612. Muita tietoja on saatavilla pyynnöstä professori Ituro Inoue ([email protected]) B

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) (myöntää Ei . 23791816) alkaen Japan Society for Promotion of Science (https://www.jsps.go.jp/) (KY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

iän huomioon hinnat munasarjojen ja muiden kohdun adnexa syöpiä vuonna 2002 oli 10,6 prosenttia 100000, ja 5,2 per 100000 henkilötyövuotta USA: ssa ja Japanissa, vastaavasti [1]. Epiteelin munasarjasyöpä on heterogeeninen kokonaisuus käsittää useita histologisia tyyppejä, kuten korkea-asteen vakavien, matala-asteista vakavien, kirkas solu, endomet-, ja mucinous syövät [2], [3]. Munasarjasyöpiä jaetaan tyypin I ja tyypin II kasvaimet [2], [4]; Tyypin I kasvaimia ovat huonolaatuista vakavien, matala-asteista endomet-, kirkas-solu, ja mucinous karsinoomat. Nämä kasvaimet huonosti reagoivat platinapohjaisen hoidon satama tiheä mutaatioita geeneissä, jotka koodaavat osat RAS signalointireitin, ja ovat suhteellisen vakaita genomista rakennetta. Tyyppi II kasvaimia ovat korkealaatuisesta serous ja korkea-asteen endomet- karsinoomat ja ovat erittäin aggressiivisia. Mittava tutkimus korkealaatuisesta vakavien munasarjasyöpä (HGSOC) The Cancer Genome Atlas (TCGA) ryhmä ominaista HGSOC kuin

TP53

-mutation rikastettu (96%) kromosomipoikkeavuuksia genominlaajuisten somaattisen geeni- kopio numerot. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin yleisesti muuttunut reittejä kuten RB1, PI3K /RAS, NOTCH, homologinen rekombinaatio, ja FOXM1 polkuja [5]. Mutaatio tila

TP53

liittyy vaiheisiin, geeniekspressiomalleja, ja selviytymisen sairastavien potilaiden vakavien munasarjasyöpä [6].

Yritimme perustaa riskiluokitusjärjestelmä varten serous munasarjojen syöpä käyttäen geeniekspressioprofiilit hankittu käyttäen microarray data [7], [8]. Havaitsimme 88 liittyvistä geeneistä ilman taudin etenemistä 110 Japani potilailla myöhäisvaiheen serous munasarjasyöpään [7], sekä 126 liittyvistä geeneistä yleiseen eloonjäämiseen 260 Japani potilailla myöhäisvaiheen HGSOC [8]. Tarjota parempaa ymmärtämistä molekyylitason mekanismeja patogeneesiin näiden syöpien ja kehittää riskiluokitusjärjestelmä teimme profilointi somaattiset mutaatiot läsnä näissä kasvaimissa.

koottu genomista tietoa potilaille, joilla HGSOC käyttämällä exome sekvensointi ja kopioluvun vaihtelu (CNV) analyysit. Mukaan profiileja somaattisten yhden nukleotidin variantteja (SNVs), pienet lisäykset ja poistot (indeleitä), ja CNVs, me luokitellaan HGSOC alatyyppeihin nimetty ST1 ja ST2, joille ovat ominaisia ​​ehjä tai alentunut p53 signalointireitteihin, vastaavasti. Olemme lisäksi tunnettu molemmat alatyyppiä vertaamalla geeniekspressioprofiilien. Gene ontologia (GO) analyysi osoitti, että ilmennetty eri geenit merkittävästi rikastettu mitoosin ja DNA helikaasia GO ryhmiä, jotka voivat olla mukana genomin epästabiilisuuden ja kasvaimen kehittymisen sekä HGSOC. Nämä havainnot tarjoavat uusia oivalluksia molekyyli- ominaisuudet ja uusia biologisia prosesseja, jotka edistävät patogeneesiin HGSOC, erityisesti potilailla, joilla on ehjä p53-reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

eettisten toimikuntien Niigata University (IRB nro 239, 428, ja 455) ja National Institute of Genetics (IRB nro 23-11) hyväksyi tutkimuksen protokollia, ja jokainen osallistuja edellyttäen kirjallinen lupa varten näytteitä ja myöhemmät analyysit.

Kliiniset näytteet

Pakastemarjat näytettä otettiin primäärikasvain kudoksista ennen kemoterapian. Kaksi patologia arvioi histologista ominaisuudet formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut hematoksyliinillä ja eosiinileikkeissä. Koska selvä histologiset luonnehdinta oli kriittinen tekijä Tutkimuksen keskeinen patologinen tarkastelu suoritettiin kahdella toisistaan ​​riippumattomalla gynekologiset patologeja (HT ja TM) ilman tietoa potilaiden kliininen tila. Histologinen tyypit ja aste histologinen eroavuus määritettiin WHO: n mukaan luokittelu munasarjakasvaimia ja Silverberg luokittelua vastaavasti [8]. Kliiniset tiedot (PT- ja FIGO-vaihe) on esitetty taulukossa S1. Käytimme ääreisverenkierron kuin sovitetun normaalin kudoksen.

Exome sekvensointi

Genominen DNA eristettiin kasvainkudoksista käyttäen fenoli-kloroformilla menetelmä ja perifeerisestä verestä käyttäen QIAamp DNA veren Maxi Kit (QIAGEN ) [8]. Genomi-DNA: ta hybridisoitiin SureSelect Human Kaikki eksoni Kits (Agilent) valmistamiseksi sekvensointi kirjastot, ja kirjastot sekvensoitiin käyttämällä Illumina HiSeq 2000 (Illumina) ja 90 tai 100 base-pariksi lopussa moduulit. Sequence lukee linjattu viittaus genomin (UCSC hg19) käyttämällä BWA [9] ja SAMtools [10]. Picard (https://picard.sourceforge.net) käytettiin poistamalla päällekkäisiä lukee. Paikallinen Uudelleensuuntauksen lukee noin tunnettujen indeleitä ja uudelleenkalibroinnin emästä laadun tehtiin käyttämällä GATK [11]. Heuristinen somaattinen mutaatio soittajan VarScan 2 [12], käytettiin somaattisten mutaation puheluita. Kynnys kriteerit havaitsemiseksi somaattisten mutaatioiden olivat seuraavat: normaali variantti taajuus 0% ja Fisherin testiä p-arvo 0,00001. Toiminnalliset tiedot somaattisten mutaatioiden oli selityksin käyttäen ANNOVAR [13] ja Oncotator (https://www.broadinstitute.org/oncotator/).

Prediction funktionaalisten vaikutusten missensemutaatio yhden nukleotidin variantit

toiminnalliset vaikutukset tunnistettiin somaattisia missensemutaatioita arvioitiin käyttäen MutationAssessor 2 [14], joka ennustaa vaikutus aminohapposubstituutiot mukaan kuvion evoluution säilyttämisen perustuu usean sekvenssin rinnastukset proteiinin perheen. Missensemutaatioita funktionaalisella vaikutus pistemäärä (FIS) on 2,0 määriteltiin vahingollisia.

Detection syövän kuljettajan geenien

havaita mahdolliset syöpää kuljettaja geenien perusteella tunnistettu somaattisten mutaatioiden, me käytetyt OncodriveFM [15], joka arvioi mutaatioiden korkea toiminnallinen vaikutus geenin sisällä, olettaen että syöpä kuljettaja geenit ovat erittäin mutatoitunut ja kohdistaa merkittäviä toiminnallisia vaikutuksia. Kuitenkin seuraukset mutaatiot matkustaja geenit ovat enimmäkseen hyvänlaatuinen. OncodriveFM johtuu FIS päässä MutationAssessor 2 arvioida, mutatoitunut geenit ovat kuljettajia tai matkustajia.

Analyysit CNV ja kasvaimen puhtaus

Yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) array kokeet, joissa käytetään genominlaajuisten Human SNP 6.0 (Affymetrix) aikaisemmin suoritettiin 30 34 HGSOC näytteiden [8], [16]. Koska tekniset ongelmat ja rajoitettu DNA määriä, emme voineet saada SNP array tietoja jäljellä neljä näytettä. Affymetrix CEL tiedostoja SNP array kokeita käyttämällä 30 näytettä käsiteltiin käyttäen CNV havaitseminen ohjelmistopaketti PennCNV [17]. CNVs kutsuttiin käyttäen HMM mallin mukaan laskelmien tukin R suhde ja B-alleelin frekvenssiarvot. CNV taajuus välillä kasvain ja normaali näytteet arvioitiin kullekin SNP Fisherin testi ParseCNV algoritmi [18]. Kynnys kriteerit toistuvia CNV alueille (CNVRs) olivat seuraavat: Fisherin testiä p-arvo 0,0005 eikä päällekkäisyyttä rakennevariaatiot näytteissä terveillä henkilöillä [19]. Lisäksi CEL tiedostot olivat arvioida kasvaimen puhtaus. Käytimme ASCAT (Allele-Specific Kopio määrä Analyysi kasvaimia) algoritmi [20] ja NEXUS kopioluvun ohjelmiston versio 6.0 (BioDiscovery) [21] arvioida, missä määrin tartuntoja normaalien solujen tuumorinäytteissä. MIAME-yhteensopiva SNP array tietoja talletettu Gene Expression Omnibus tietovarasto (hakunumero GSE61237).

Microarray kokeita ja tietojenkäsittely

RNA: n, Cy3 merkintöjä, mikrosirujen hybridisaatio, signaali skannaus, ja piirreirrotuksen tehtiin aiemmissa tutkimuksissa [7], [8]. Tiedot normalisointi suoritettiin käyttäen GeneSpringGX11 (Agilent) asettaminen raaka signaalin kynnyksen 1,0 ja normalisoinnin 75

persentiili.

geeniekspressioanalyysissä

merkitys eroja geenien ilmentymisessä kahden alatyypin arvioitiin käyttämällä

t

-testi. Arvioinnin jälkeen useita testejä korjattiin vääriä löytö määrä (FDR) käyttäen Benjamini-Hochberg menettely [FDR (BH)]. Asetamme FDR (BH) 0,1, kun merkittävä kynnys. Nämä analyysit suoritettiin käyttäen ComparativeMarkerSelection moduuli GenePattern [22].

GO analyysi

GO-analyysi suoritettiin käyttäen Functional Annotation Clustering työkalu sisältyy DAVID bioinformatiikan resurssi [23]. Tämä työkalu arvioi samankaltaisuutta merkintä termejä käyttäen kappa tilastoja ja voimia ryhmät voivat jakaa samankaltaisen merkinnän profiileja käyttämällä sumean heuristista usean sidos osio [24]. Asetukset olivat seuraavat: kahdeksan merkintä luokat (OMIM_Disease, COG_Ontology, SP_PIR_Keywords, GOterm_BP_FAT, GOterm_MF_FAT, BBID, BioCarta, ja KEGG_Pathway), samankaltaisuus aikavälin päällekkäisyys ≧ 3, kappa tilastollinen kynnysarvo 1, ryhmä jäsenyys ≧ 3, ja sumea useita -linkage osio kynnys 1, vastaavasti. Väkevöiminen pisteet laskettiin käyttäen geometrinen keskiarvo modifioidun Fisherin testiä p-arvot (-log asteikko) geenien rikastamista jokaisen GO aikavälin kussakin GO ryhmän ja rikastuminen pisteet 1,3 pidetään merkittävänä [23].

data visualisointi

Somaattiset mutaatiot tietoja näytetään käyttäen Gitools (versio 1.8.4) [25]. Kopioi numero tietoja näytetään käyttäen genomiikkaa Viewer (IGV, versio 2.03.25) [26]. Bee parvi ja rasiakuvaajien luotiin käyttäen beeswarm paketin CRAN arkistoon (https://cran.r-project.org/). Lämpö kartta näkemykset geenien ilmentyminen tietoja näytetään käyttämällä HeatMapViewer moduuli GenePattern [22].

Tulokset

Perimän muutos profilointi

somaattiset mutaatiot tunnistettu näytteissä hankittu 34 Japani potilaille, joilla on HGSOC luetteloitiin mukainen analyysi exome sekvensointi tietoja. Keskimääräinen luku- syvyys oli 91 × ja 84 × kasvaimen ja normaali näytteissä, vastaavasti. Kattavuus ≧ 10 x saavutettiin 89% ja 88% koodaus emäksiä kasvaimen ja normaali näytteet, vastaavasti (taulukko S2). Havaitsimme 1399 somaattisten nonsynonymous (missense ja roskaa) ja silmukointikohtamutaatio (41 mutaatiot per näyte) käyttämällä VarScan 2 [12] kanssa ennalta kuvatut kriteerit Materiaalit ja menetelmät osassa. Näiden somaattisten variantteja, 158 valittiin sattumanvaraisesti ja altistettiin Sanger sekvensointi, ja 143 varianttia validoitu (143/158, 91%). Kaikki

TP53

somaattisten nonsynonymous ja silmukointikohtamutaatio kutsuttiin ja validoitu käyttäen VarScan 2 ja Sanger sekvensoinnin, tässä järjestyksessä. Yhdeksän potilasta, joilla ei ole

TP53

somaattisten nonsynonymous ja silmukointikohtamutaatio, me suoritetaan edelleen Sanger sekvensoinnin kaikkien kymmenen

TP53

koodaavat eksonit, koska vääriä negatiivisia voisi olettaa vuoksi nykyisiä syviä lukee . Olemme havainneet lukukehyksen deleetion eksonissa 3 S022 (taulukko S3). Somaattiset SNVs ja indeleitä oli lisätty huomautusta 1405 vuonna 1159 geenejä.

TP53

oli useimmin mutatoitunut (76%, 26/34) (kuvio 1A), mutta mutaatio taajuus oli alhaisempi kuin aiemmissa raporteissa [5], [27]. Oli 24 erillistä ja monipuolinen

TP53

mutaatiot (taulukko S4). Kaksi potilasta (S066 ja S271) oli sama missense variantti (R273H) ja kaksi muuta potilasta (S009 ja S017) oli sama nonsense variantti (R196 *). Lopuista 22

TP53

variantteja, viisi oli runko-shift deleetioita (A86fs varten S020, P27fs varten S022, F113fs varten S119, S241fs varten S006, ja E286fs varten S118), yksi oli roskaa variantti (Q52 * ja S015), kaksi oli silmu- (Y126splice varten S188 ja S261splice varten S008), ja loput 14 oli missense (taulukko S4). FIS-15

TP53

missensemutaatio variantteja oli 2,0 mukaan MutationAssessor 2 [14] analysointi ja nimettiin vahingollista (taulukko S4).

(A) Somatic mutaatiostatuksesta maisema 34 potilasta kanssa HGSOC. Somaattisista mutaatioista tunnistettu enemmän kuin tai yhtä suuri kuin kolme potilasta näytetään. Potilaat, joilla on mutaatioita saman geenin on esitetty punaisella. (B) Kopioi numero muuttaminen maisema 30 potilaalla on HGSOC. Kopioi numero (CN) muutokset on merkitty seuraavasti: CN = 0, tummansininen; CN = 1, vaaleansininen; CN = 3, vaaleanpunainen; ja CN polt- taa 4, punainen). Sininen rivi poistaminen radan ja punainen viiva Amplification raidan näytä kopiomäärä muutos taajuus. Gray rivit poistetaan ja Amplification kappaleita esittävät -log transformoituja Fisherin testiä p arvot 0,0005.

toiseksi eniten mutatoitunut geenit olivat

BCLAF1

,

CLCNKA

, ja

MAGEC1

(29%, 10/34 kunkin geenin). Mukaan FIS määritetään MutationAssessor 2, kaikki mutaatiot paitsi K911fs on

BCLAF1

arvioitiin hyvänlaatuisia ja katsottiin matkustaja mutaatioita. Yhdeksänkymmentä kaksi prosenttia (1063/1159) geenien mutatoitiin yhdellä potilaalla. Tutkimaan edelleen ehdokas syöpä kuljettajan geenejä mutatoitunut vähintään kahdella potilaalla, OncodriveFM sovellettiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät osassa. Vain

TP53

havaittiin syövän kuljettajan geenin kertyy runsaasti haitallisia mutaatioita meidän HGSOC näytteissä (tuloksia ei ole esitetty).

CNV profilointi 30 ja 34 HGSOC näytteet on esitetty kuvassa 1B ja File S1. Genomin laajuinen kopio numerot 30 HGSOC näytteiden muuttunut. ParseCNV tunnistettu yhdeksän toistuvasti poistettu CNVRs (1p36.11, 4q24, 5q13.1, 5q13.2, 6q22.33-23.1, 15q24.2-24.3, 17q12, 18q21.31, ja 22q12.3) ja neljä monistettiin CNVRs (1p34 0,1-33, 3q27.2, 6p24.2, ja 10p12.31-12.2) kanssa tunnistettu geenejä, tässä järjestyksessä (taulukot S5 ja S6).

poissulkeminen p53-reittiin heikentynyt potilasta mutatoitunut TP53 HGSOC

TP53

mutaatiofrekvenssi oli merkitsevästi pienempi meidän näytteitä verrattuna raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa seuraavasti: 26/34 vs. 301/316; Fisherin testiä p-arvo 0,0060 [5] ja 26/34 vs. 118/126; Fisherin testiä p-arvo 0,0069 [27]. Niistä kahdeksan näytettä kanssa mutatoitunut

TP53

(kuvio 2A), CNV analyysi osoitti heterotsygoottinen kopiomäärä menetys

TP53

näytteen S004 (kuvio 2B). MDM2 on E3 ubikitiinipromoottori proteiini ligaasin, joka kohdistuu p53 proteasomaalisten hajoamista ja pidetään negatiivinen efektori p53 [28]. On yhdistyksen välillä monistaminen

MDM2

ja menetys p53-toiminto tietyissä kasvaimissa [27]. Kahdeksan näytteiden ehjä

TP53

, ei

MDM2

kopioluku vahvistus havaittiin (kuvio 2A). Tutkia tarkemmin, ovatko vaihtoehtoisen mekanismin osuus p53 toimintahäiriö, arvioimme listan suoraan p53 kohdegeenien (taulukko S7) saatu Pathway Interaction Database (PID) [29]. Tunnistimme

IRF5

(interferoni Regulatory Factor 5) silmukointikohtamutaatio (W181splice) näytettä S018. Kaiken kaikkiaan olemme tunnistettu kuusi p53-reitin ehjänä potilaita kahdeksasta sairastavien potilaiden HGSOC kanssa mutatoitunut

TP53

(kuvio 2A). Me määritetty kuusi potilasta ST1 ja loput ST2.

(A) Yhteenveto potilaalla on

TP53

mutaatiot näkyvät vaaleanpunainen

TP53

_mut radalla.

TP53

heterotsygoottinen kopiomäärä poistot esitetään sinisellä

TP53

_Del radalla.

MDM2

kopiomäärä vahvistus näkyy punaisena

MDM2

_amp radalla. Mutaatiot geeneissä, jotka ovat kohdistu suoraa p53 näkyvät vihreän p53_Target_mut radalla. (B) Dot käyrä log R-suhde (LRR) on CHR 17 näytteen S004. Siniset pisteet osoittavat LRR-arvojen. Asema linja LRR = 0 on merkitty 0 oikealla kunkin kaavion.

TP53

(17p13.1) on merkitty sinisellä tähdellä pystysuoralla viivalla.

Perimän muutoksia ST1 ja ST2

Emme havainneet mutaatioita geenejä spesifinen huonolaatuista vakavien tyyppi, kuten

BRAF

,

CTNNB1

,

KRAS

, ja

PIK3CA

[27], joukossa 1159 geenit mutatoitiin 34 HGSOC näytteet (tuloksia ei ole esitetty).

karakterisoimiseksi eroja genomi muutoksiin välillä ST1 ja ST2, vertasimme numerot somaattisten nonsynonymous ja silmukointikohtamutaatio ja todettu määrä somaattisten ST1 mutaatioista oli merkitsevästi pienempi verrattuna ST2 (Wilcoxonin summa testi p-arvo 0,00070) (kuvio 3A).

(A) vertailu lukumäärän somaattisten nonsynonymous ja silmukointikohtamutaatio. (B) vertailu lukumäärän CNV segmenttejä (yläpaneeli) ja CNV profiilit (alapaneeli) kromosomeissa 17 ja 12 välillä ST1 ja ST2. Kopioluku muutokset ovat seuraavat: CN = 0, tummansininen; CN = 1, vaaleansininen; CN = 3, vaaleanpunainen; ja CN polt- taa 4, punainen). ST1 on suljettu vihreä suorakulmio. (C) Kasvain puhtauksia ST1 ja ST2.

Lisäksi vertasimme ST1 ja ST2 suhteen numerot CNV segmenttien tunnistaa PennCNV [17] kussakin autosomaalinen kromosomi (taulukko S8). Tulokset Wilcoxonin summa testi ja useita testi korjaus 22 autosomisten kromosomien mukaan väärien löytö korko (FDR) [30] osoitti merkitsevästi vähemmän CNV segmentit kromosomeja 17 ja 12 (FDR q arvo 0,040 ja 0,047, vastaavasti) ja ST1 (Kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että ST1 säilytti normaali karyotyyppi ja ST2 elätellen genominlaajuisten kopioluvun muutoksia erityisesti rikastettu kromosomien 17 ja 12 (kuvio 3B).

sulje pois sitä mahdollisuutta, että vähäinen määrä mutaatioita ja muutaman CNV segmentit of ST1 johtuivat korkea saastumisen normaalien solujen, kasvain puhtautta arvioitiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät osassa. Keskimääräinen kasvaimen puhtaudeksi olivat 79% ja 73% varten ST1 ja ST2, vastaavasti, ja ei ollut merkittävää eroa kasvaimen puhtaus on alatyyppejä (Wilcoxonin summa testi p-arvo 0,48) (kuvio 3C ja taulukko S9).

geeniekspressioanalyysissä funktionaalisesti luonnehtia ST1 ja ST2

geeniekspressioprofiilien of ST1 ja ST2 määritettiin käyttäen mRNA mikrosirujen [7], [8]. Kahdeksankymmentäyhdeksän koettimet edustavat 70 geenien paljasti eroja ekspressiotasot välillä ST1 ja ST2 klo FDR (BH) 0,1 (taulukot S10 ja S11). Ilmentymistasojen 33 ja 37 geenit olivat korkeampia (taulukko S10) ja alemman (taulukko S11), vastaavasti, ST1 verrattuna, että ST2. 70 geenit osoittivat suhteellisen homogeeninen ja heterogeeninen ilmaisuja ST1 ja ST2, vastaavasti (kuva 4).

Seitsemänkymmentä geenit (89 antureista) osoittaa eroja FDR (BH) 0,1 näytetään. ST1 on suljettu vihreä suorakulmio. Korkea ja Matala osoittavat ekspressiotasot ST1 verrattuna ST2.

arvioimiseksi biologinen ja toiminnallinen seuraukset ilmentymistä näiden 70 geeneistä, GO analyysi sovellettiin käyttäen DAVID. Kolmekymmentäviisi geenejä luokiteltiin 18 GO ryhmiin samankaltaisten GO termejä (taulukko S12). Kaksi 18 GO ryhmät (mitoosi ja DNA helikaasia) osoitti merkittävää rikastumista geenien (Enrichment pisteet 1,3) (kuvio 5 ja taulukko S12).

NEK1

ja

NEK9

että mitoosin ryhmässä oli voimistunut ja

ASPM

,

BIRC5

,

CDCA2

, ja

SKA3

oli vaimentua in ST1 verrattuna ST2.

BLM

,

PIF1

, ja

RECQL4

, jotka koodaavat DNA helikaasit, ilmaistiin suhteellisen alhaisella tasolla ST1. Erot ilmentyminen näiden mitoosin ja DNA helikaasia geenit arvioitiin käyttäen Kolmogorov-Smirnov testi, F-testin, ja

t

-testi R version 3.0.2 (kuvio 6 ja taulukko S13).

Heat-kartta otetaan geeni ontologian (GO) ryhmät. Kaksi GO ryhmää (mitoosi ja DNA helikaasia) merkittäviä geenin rikastamiseen on merkitty GO ryhmät 1 ja 2, vastaavasti. ST1 on suljettu vihreä suorakulmio.

Bee parvi ja rasiakuvaajien näyttää geeniekspressiomalli of ST1 ja ST2 potilaita. Y-akseli osoittaa normalisoitua geeniekspressiota merkit käsiteltynä GeneSpring. Tähdellä (*) ja plusmerkit (+) osoittavat

t

-testi p-arvot seuraavasti: * p 0,05, ** p 0,01 ja ***

(+++) p 0,001.

keskustelu

analyysit somaattisten mutaatioiden HGSOC osoitti rikastumista

TP53

mutaatioita (kuvio 1A). CNV analyysi paljasti muuntunut profiilin genominlaajuisten kopioluvun (kuvio 1 B). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiemman tutkimuksen [5]. Olemme kuitenkin havainneet merkittävää eroa taajuus

TP53

mutaatioita verrattuna raportoitu aiemmissa raporteissa [5], [27]. Erityisesti kahdeksan HGSOC näytteet eivät satama

TP53

mutaatioita, ja mutaatio p53 kohdegeenin

IRF5

todettiin yhdessä näytteessä. Edelleen, yksi oli

TP53

kopioluvun poisto. Yhdessä me määritetty kuusi HGSOC näytteiden ST1 ja loput 28 näytteiden ST2.

Kaikki potilaat, joilla HGSOC tässä tutkimuksessa olivat Japani, kun taas potilaat aiemmissa tutkimuksissa [5], [27] oli pääosin peräisin Euroopan-jälkeläinen populaatiot. Ero on

TP53

mutaatio taajuudet voivat tulla väestön erojen havaittu tapauksessa kasvutekijän reseptorin (

EGFR

) mutaatioita ei-pienisoluinen keuhkosyövässä [31], [ ,,,0],32].

EGFR

mutaationopeudet olivat seuraavat: 11% ja 32% Länsi-Euroopan ja Itä-Aasian lla [31], ja 2% ja 26%: lla potilaista Yhdysvalloissa ja Japanissa, vastaavasti [32] . Alhainen potilaiden määrä nykyisessä tutkimuksessa verrattuna TCGA datajoukon [5] ei ehkä riitä antamaan kiinteitä tekemisestä

TP53

Mutaatiofrekvenssi. Ilmeisesti paljon suuremmassa mittakaavassa tutkimus mukaan lukien Japani ja muut Aasian potilaalla on HGSOC tarvitaan. Toinen mahdollisuus on olemassa pieni osa

TP53

mutatoitunut kasvainsolut koska kasvain heterogeenisyys

TP53

mutatoitunut potilaille. On yleisesti hyväksytty, että somaattiset kuljettaja mutaatiot kuten mutaatioita

TP53

esiintyy varhainen tapahtuma syövän sitten melko usein mutaation olisi noudatettava. Nykyisessä tutkimuksessa olemme todellakin havaittu vähintään 20% kasvaimen variantin taajuuksien

TP53

. Siksi emme luultavasti ei unohtaa kuljettajan mutaatioita

TP53

jonka exome sekvensointi (kuva 1).

vähäinen määrä somaattisten mutaatioiden ja CNV segmentit havaittu ST1 todennäköisesti heijastavat toiminnallisesti ennallaan p53 polku. ST2 rikastettiin varten

TP53

mutaatioita, ja genominlaajuisten kopioluvun profiilit olivat samanlaiset kuin tyypin II kasvaimia. Sen sijaan

TP53

oli mutatoitunut vuonna ST1 ja ilmensivät normaali karyotyyppi on samanlainen kuin tyypin I kasvainten ehdotetun aikaisemmassa tarkastelun [2]. Emme kuitenkaan ole mutaatioiden tunnistamiseksi geeneissä, jotka koodaavat osia RAS signalointireitin in ST1 (tuloksia ei ole esitetty). Suurimmassa aineisto alkaen TCGA [5], 15 316 näytettä potilaista, joilla HGSOC kanna mutatoitunut

TP53

. Kun etsittiin

TP53

poistot,

MDM2

vahvistus, tai p53 kohde-geenin mutaatioita 15 näytettä, vain yksi (TCGA-25-1328) luokiteltiin ST1 (kuva S1) . Hierarkkinen klusterointi käyttäen 45 päällekkäisiä geenien joukossa 70 differentiaalisesti ilmentyvien geenien osoitettu TCGA-25-1328 ST1 (kuva S1, alhaalla). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ST1 on uusi HGSOC alatyyppi perustuen mutaatio ja CNV profiileja.

edelleen karakterisoimiseksi toiminnalliset ominaisuudet ST1 ja ST2, vertasimme niiden geeniekspressioprofiilien (kuva 4). Käyttämällä merkitys kynnys [FDR (BH) 0,1] tunnistimme 70-geenit, jotka olivat homogeenisesti ilmaistaan ​​ST1 microarray ja heterogeenisesti ilmaistaan ​​ST2 microarray (kuvio 4). Heterogeeninen geenin ilmentymistä ST2 voi osoittaa monipuolistaminen molekyylitason alatyyppien toissijaisena tapahtumista arviossa ehdotetut em [2], ja homogeeninen geeniekspressiota ST1 voi heijastaa varhainen tapahtuma syövän synnyn ennen kromatiinin epävakautta esiintyy.

GO-analyysi tunnistaa 18 GO ryhmiä, jotka jakavat hyvin samankaltaisia ​​biologisesti, ja kaksi ryhmää olivat merkittävästi rikastettiin geenien mitoosin ja ne, jotka koodaavat DNA-helikaaseilla (kuviot 5 ja 6). Viat mitoosin johtaa epänormaali kromosomi numeroita, joka liittyy syövän syntymiseen [33]. Kaksi mitoosi geenit, jotka koodaavat kinaasien NEK1 ja NEK9 olivat erittäin ilmaistaan ​​ST1, ja säätelyä näiden kinaasien liittyy genomisen vakautta ja kasvaimen kehittymisen [34] – [37]. Lisäksi muut mitoosi geenit (

ASPM

,

BIRC5

,

CDCA2

, ja

SKA3

) olivat erittäin ilmaistaan ​​ST2, ja poikkeava aktivointi näiden geenien ilmentymistä liittyy oncogenesis [5], [38] – [42].

DNA helikaasit ylläpitää genomin vakautta DNA korjaukseen, rekombinaatio, ja replikointi. DNA helikaasit, BML ja RECQL4, inaktivoituvat syövän altis geneettisiä häiriöitä kuten Bloom ja Rothmund-Thomson oireyhtymät [43], [44]. Voimistumista DNA helikaasin ilmentymisen esiintyy yleisesti useissa syövissä (esim. Hematopoieettiset, eturauhasen, ja maksan) [43] – [48]. Kohonneita ilmentymistä DNA helikaasin geenit

BLM

,

PIF1

, ja

RECQL4

jota yleensä havaitaan syöpiä voidaan selittää toipuminen funktion chromatin epävakauden ST2. Sen sijaan, vähentynyttä ilmentymistä koodaavien geenien DNA helikaaseilla, että tunnettu ST1 osoittaa, että kromatiinin epävakaus ei esiinny ST1. Lisätutkimukset ovat tarpeen selkeyttää suhdetta näiden geenien ilmentymistä ja patogeneesiin HGSOC.

Emme havainneet eroja yleistä tai ilman taudin etenemistä potilaiden luokiteltu joko ST1 tai ST2 (kuva S2). Kaikki näytteet diagnosoitu korkealaatuisesta syöpää patologien, ja näytteet luokitellaan ST1 oli takautuvasti tutkittiin; kuitenkin, niistä puuttui ainutlaatuisia patologisia piirteitä. ST1 leimasi ehjä p53-reitin; kuitenkaan ei ollut eroja potilaiden taudinkuvan löydökset tai kliinisiä seurauksia. Nämä havainnot viittaavat siihen, läsnäolo tunnistamattomien biologisten prosessien ST1 fenotyyppi, mikä osoittaa, että tehokkaampi hoito on kehitettävä näille potilaille.

Yhteenvetona kuvaamme tunnistamisen uusi ehjä p53-reitin alatyyppiä Japani potilaalla on HGSOC. Meidän tulokset lupaavat parantaa ymmärrystämme molekyylimekanismeja syövän synnyn ja pitäisi helpottaa terapeuttisten strategioiden kehittämisen, jotka kohdistuvat mutatoitunut

TP53

potilailla, joilla HGSOC.

tukeminen Information

Kuva S1.

ST1 in TCGA tietoja. (Ylempi paneeli) Yhteenveto mutaatioiden

TP53

ja p53-reitin geenit 15

TP53

mutatoitunut potilaalla on HGSOC in TCGA tietoja.

TP53

homotsygoottinen poisto näkyy tumman sininen ja heterotsygoottinen kopioluvun poistot esitetään vaaleansinisiä

TP53

_Del radalla.

MDM2

kopiomäärä vahvistus näkyy punaisena

MDM2

_amp radalla. Mutaatiot geeneissä, jotka ovat kohdistu suoraa p53 näkyvät vihreän p53_Target_mut radalla. (Pohja paneeli) Hierarkkinen klusterointi TCGA-25-1328 ja 33 HGSOC käyttäen 45 päällekkäisiä geenien joukossa 70 differentiaalisesti ilmentyvien geenien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s001

(PDF) B Kuva S2.

Survival analyysi. (Vasen paneeli) Kokonaiselossaoloaika käyrät ST1 ja ST2. (Oikea paneeli) etenemisestä vapaa elinaika käyrät ST1 ja ST2. Nämä selviytyminen käyrät kuvattiin käyttäen Kaplan-Meier-menetelmällä. p-arvot vastaavat logrank testiä vertaamalla eloonjäämiskäyrien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s002

(PDF) B Taulukko S1.

Kliiniset tiedot. PT- ja FIGO-vaiheissa. Kaksi alatyyppiä (ST1 ja ST2) esitetään alatyyppi sarakkeessa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s003

(XLSX) B Taulukko S2.

syvyys ja kattavuus exome sekvensointi. Syvyys ja kattavuus laskettiin DepthOfCoverage moduulin GATK.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s004

(XLS) B Taulukko S3.

syvyys koodaus eksonien

TP53.

syvyys kymmenen koodaus eksonien

TP53

(NM_001126112.2) laskettiin SAMtools.

doi: 10,1371 /journal.pone. 0114491.s005

(XLSX) B Taulukko S4.

Somaattiset

TP53

mutaatioita. Toiminnalliset vaikutukset missensemutaatio yhden nukleotidin variantit, jotka arvioitiin käyttäen MutationAssessor 2 esitetään FIS sarakkeeseen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s006

(XLS) B Taulukko S5.

Kopioi numero poistetaan alueita. Toistuvat kopiomäärä poistetut alueet näkyvät CNVR (hg18) sarake. Gene sarakkeessa on geenejä, jotka sijaitsevat näiden CNVRs.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s007

(PDF)

Taulukko S6.

Kopioi numero täydennetty alueita. Toistuvat kopiomäärä monistaa alueet näkyvät CNVR (hg18) sarake. Gene sarakkeessa on geenejä, jotka sijaitsevat näiden CNVRs.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s008

(PDF)

Taulukko S7.

Luettelo p53 suoraan kohdegeenien. Luettelo p53 suoraan kohdegeenien olivat peräisin Pathway Interaction Database (PID).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114491.s009

(XLSX)

Taulukko S8.

CNV segmenttejä.