Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nykyinen diagnosointiin ja hoitoon virtsarakon syöpä (BC) on osoittanut suurta edistystä hyödyntäminen mikrosiruja .

Tarkoitus

tavoitteena oli löytää yhteisiä ilmentyvät eri (DE) geenien joukossa kliinisesti merkittävää alaluokkien BC käyttäen mikrosiruja.

Menetelmät /Principal havainnot

BC ja kontrollit, niin kokeellisia julkisesti saatavilla aineistoja, analysoitiin koko genomin mikrosiruja. Ryhmittelimme näytteet niiden histologian ja määritteli DE geenejä kussakin näytteessä erikseen sekä kunkin kasvaimen ryhmässä. Dual-analyysi strategian noudattamisen. Ensinnäkin, kokeellinen Näytteet analysoitiin ja päätelmät muotoiltiin; ja toiseksi, kokeellinen sarjat yhdistettiin yleisesti saatavilla microarray aineistot ja analysoitiin edelleen etsimään yhteistä DE geenejä. Kokeellinen aineisto tunnistettu 831 geenejä, jotka olivat DE kaikissa kasvain näytteissä, samanaikaisesti. Lisäksi 33 geenejä säädellään ylöspäin ja 85 geenit alassäädetty kaikissa 10 BC näytteet verrattuna 5 normaaleissa kudoksissa, samanaikaisesti. Hierarkkinen klusterointi osioitu kasvain ryhmien mukaan niiden histologia. K-means klusterointi kaikkien geenien ja kaikki näytteet, sekä klusterointi kasvaimen ryhmien esitteli 49 klustereita. K-means klusterointi yhteisten DE geenien kaikissa näytteissä paljastui 24 klustereita. Geenit ilmenee eri ero malleja ilmaisun perusteella PCA. YY1 ja NFKB olivat yleisimpiä transkriptiotekijöiden säätelevien ilmentymistä tunnistettu DE geenejä. Kromosomin 1 sisälsi 32 DE geenit, jonka jälkeen kromosomien 2 ja 11, jotka sisälsivät 25 ja 23 DE-geenien, vastaavasti. Kromosomi 21 oli vähiten DE geenejä. GO analyysi paljasti esiintyvyys liikenteen ja sitovien geenien yhteiseen alassäädetty DE geenien; esiintyvyys RNA aineenvaihduntaa ja käsittely geenien säädelty DE geenien; sekä esiintyvyys geenien vastuussa solujen viestintää ja signaalitransduktion DE geenit, jotka säädellä vähentävästi T1-luokka III kasvaimet ja säädellään ylöspäin T2 /T3-luokka III kasvaimia. Yhdistelmä näytteet kaikista microarray alustoille paljasti 17 yhteinen DE geenejä, (BMP4, CRYGD, DBH, GJB1, KRT83, MPZ, NHLH1, TACR3, ACTC1, MFAP4, SPARCL1, TAGLN, TPM2, CDC20, LHCGR, TM9SF1 ja HCCS) 4 joka osallistuu lukuisia reittejä.

Johtopäätökset /merkitys

tunnistaminen yhteisen DE geenien joukossa BC näytteitä eri histologia voi tarjota lisää tietoa löytämään uusia otaksuttu markkereita.

Citation: Zaravinos A, Lambrou GI, Boulalas I Delakas D, Spandidos DA (2011) tunnistaminen yhteisen ilmentyvät eri geenien Virtsarakon syövän. PLoS ONE 6 (4): e18135. doi: 10,1371 /journal.pone.0018135

Editor: Michael Polymenis, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 syyskuu 2010; Hyväksytty: 26 helmikuu 2011; Julkaistu: 04 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Department of Urology, Asklipieío General Hospital, 16673 Voula, Ateena, Kreikka rahoitetaan tässä tutkimuksessa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä virtsarakon (BC) on viidenneksi yleisin syöpä miehillä. Huippu esiintymiseen on potilaiden keskuudessa 60-70 vuotta ikää. BC on parannettavissa, jos diagnosoitu alkuvaiheessa sairauden. Kasvaimet Virtsarakon kehittää kautta kahta erillistä mutta jonkin verran päällekkäisyyttä reittejä: papillaarilihaksessa ja ei-papillaarisen. Noin 80% tasapainotusliivit koostuvat pinnallinen exophytic papillaarisen vaurioita, jotka ovat peräisin urothelial liikakasvua. Nämä tyypillisesti matala-asteista papillaarinen kasvaimet voivat uusiutua, mutta harvoin hyökätä virtsarakon seinämään tai etäispesäkkeitä. Loput 15-20% kasvaimista ovat laadukkaat kiinteät ei-papillaarisen tasapainotusliivit jotka syntyvät korkealaatuisesta intraurothelial neoplasia. Nämä kasvaimet aggressiivisesti hyökätä virtsarakon seinämän ja on suuri alttius etäpesäkkeiden [1].

Parallel geenien ilmentyminen valvonta on tehokas työkalu analysointiin välisiä suhteita rakkokasvaimista, löytää uusia kasvain alaryhmiä, määrittämällä kasvaimet pre -defined luokat, tunnistaa yhteistyön säännellä tai kasvain vaihe-geenejä ja ennustamaan sairauden tulos [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Tähän mennessä paljon vaivaa on käytetty, jotta voidaan tunnistaa geenejä, jotka näytetään differentiaalikaavojen (DE) eri kasvaintyypeille vs. muut kudosryhmien, kuten fenotyypiltään normaali kudos. Kuitenkin raportoitu DE geenien vaihtelevat eri tutkimusryhmissä riippuen microarray perustuva menetelmä ja tapausten määrä. Yksi kiehtova asia, joka ei vielä ole tarkasteltu sisältää mahdollisesti tietoja, jotka voidaan kerätä suhteen geenit ilmentyvät differentiaalisesti samanaikaisesti kaikilla tutkimuksessa kasvaimen tapauksissa.

Tässä tutkimuksessa, suoritimme cDNA mikrosiruanalyysi, joka sisältää in- house kokeellinen sekä julkisesti saatavilla, analysoida geeniekspressioprofiili BC ja määrittää DE geenejä syövän ja tervettä kudosta. Havaitseminen DE geenien suoritettiin kunkin näytteen erikseen sekä kunkin kasvaimen ryhmässä, jotka on määritelty histologinen tutkimus ja raportoitujen tietojen. Tiedot koottiin eri algoritmeja, ja toiminnot tunnetaan DE geenit määritellään edelleen Gene ontologia. Lisäksi etsittiin ei vain eroja kasvaimen tyyppejä, vaan yhtäläisyyksiä. Syynä tähän lähestymistapa oli, että vaikka eri kasvaintyyppeihin odotetaan olevan eroja niiden ekspressioprofiileja vaikka yksilöiden välillä, joilla on sama kasvain alatyypin, me arveltu, että kasvaimia on samanlaisia ​​ominaisuuksia, jotka voivat lopulta johtaa tietoa etiologies syövän. Vuonna merkittävä työ

Goldstein et al.

Yritetään havaita yhteinen solu alkuperän eturauhasen syöpiä oli raportoitu. He ymmärtää, että huolimatta eroista, että kasvainsolut eivät jaa, on mahdollista yhteinen alkuperä [9]. Samaan suuntaan yritimme tunnistaa yhteisiä geeniekspressioprofiilit eri kasvainkudoksista. Tässä vaiheessa meidän pitäisi mainita, että geenien ilmentyminen, erityisesti kasvainbiopsioissa edustaa kirjaimellisesti ”snap-shot” valtion-avaruus muuten dynaamisen käyttäytymisen taudin. Silti tämä ”snap-shot” saattaa olla riittävä saadakseen hyödyllistä tietoa dynamiikkaan järjestelmän tutkimuksen. Etenkin kasvainten, se on ainoa väline meillä jotta saadaan tietoa

ex vivo

tasolla.

Tämä tiedot tukevat arvon microarray-pohjainen geeniekspression allekirjoitukset koska nämä tunnistaa kliinisesti tärkeisiin solun ominaisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Tuumorikudoksen Näytteenotto ja Kirurginen toimenpide

Ten virtsarakon syöpä näytteitä, joilla on vasta diagnosoitu tasapainotusliivit olevien virtsaputken virtsarakkokasvain resektio laitoksella urologian, ”Asklipieío” General Hospital, Athens, sekä viisi normaalia kudosnäytteitä, hankittiin jälkeen määrä kudosta tarpeen rutiini patologian tutkimus oli poistettu. Potilaat tutkittiin olivat iäkkäitä (73,9 ± 12,0 vuotta). Valtaosa (6/10, 60%) oli tupakoitsijoita tai entisiä tupakoimattomilla, kun taas neljä (40%) oli tunnusomaista jonkin verran työperäisen liittyvien toimijoiden BC (maalit, kemikaalit, jne.). Kaikki kasvain näytteet luokiteltiin ja luokitellaan samalla patologi. Histologinen luokittelu suoritettiin käyttäen sekä 1973 Maailman terveysjärjestö (WHO) ja 2004 WHO /International Society of Urologiset patologia (ISUP) Luokitusten [1]. Kasvaimen vaiheessa arvioitiin mukaan vuonna 2002 Yhdysvaltain sekakomitean Cancer pysähdyspaikan järjestelmä [10]. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta mukana tässä tutkimuksessa. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea Kreetan yliopiston. Kelpoisuusvaatimukset olivat electively leikeltiin ensisijainen tasapainotusliivit ja saatavuus DNA normaalista ja kasvainkudoksen varten biomolekyylitason analyysejä. Hylkäämisperusteet olivat aiemmat kasvaimet ja kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta.

otettiin kudosnäytteet leikkauksen kasvain ja seuraavat kolme selvästi normaalia valittu sivustoja (kylmä cup koepaloja): takaseinän, trigone ja viereistä kasvain. Osat leikeltiin normaali näytteet lähetettiin histopatologista analyysiä. Kasvain ja normaalit kudokset pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä, kuljetetaan ja säilytetään -80 ° C: ssa, kunnes DNA: n uuttaminen.

Potilaat, joilla on ei-lihas-invasiivisia tasapainotusliivit seurattiin määräajoin kystoskopialaitteita tutkimukset ja rakkoon hoito kuten. Potilaat, joilla on invasiivisia tasapainotusliivit tarjottiin radikaali cystectomy tai ilman systeemistä kemoterapiaa.

immunohistokemia

§, 3 mm paksu, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudos leikattiin ja asetettiin dioja päällystetty 3-aminopropyltriethoxysilone. Dioja kuivattiin 56 ° C: ssa 1 tunnin ajan ennen immunohistokemiallista värjäystä. Kudosleikkeet parafiini ksyleenillä ennen rehydratoitu arvostellaan alkoholeja, ja endogeenisen peroksidaasin estettiin käsittelemällä 3% H

2O

2 huoneenlämpötilassa 15 min. Antigeeni peittymisen suoritettiin 30 min inkubaation 80 ° C: ssa 10 mM trinatriumsitraatti (pH 6,1). Immunovärjäys ja ilmoituksen tehtiin Dako automatisoida. Laseja inkuboitiin huoneenlämpötilassa ensisijainen polyklonaalisia vuohen vasta-aineita anti-ErbB2 (1:800, Dako), sykliini D1 (1:100, SP4, Epitomics), monoklonaalinen vasta-aine anti-p53 (1:250; E26; Epitomics) ja monoklonaalinen vasta-aine anti-Ki-67 (1:100, SP6, Epitomics). Epitoopit primaarista vasta-ainetta olivat paikallisia immunoperoksidaasivärjäyksellä tekniikalla käyttäen sekundääristä vasta-ainetta avidiini-biotiini monimutkainen ja peroksidaasisubstraattia (Kit 5001, Dako), mukaisesti valmistajan protokollaa. Sitten leikkeitä käsiteltiin kromogeenina 30-30 diaminobenzidene tetrahydrochloride kohtien identifioimiseksi immunosaostus valomikroskoopilla. Lopuksi leikkeet pestiin, vastavärjättiin hematoksyliinillä ja asennettu varjolla venynyt. Ei spesifistä värjäytymistä ei havaittu, kun primaarinen vasta-aine jätettiin pois protokollan (negatiivinen kontrolli). Erityisyys Immunovärjäyksen oli lisäksi ohjataan samanaikaisesti värjäämällä rintasyövän näytteitä, joilla tiedetään ErbB2, sykliini D1, p53 ja Ki67 ekspressiokuvioiden. Kokenut patologi teki värjäytymisintensiteettiä neljällä tasolla (negatiivinen, heikko, kohtalainen ja vahva), kun otetaan huomioon sekä värin intensiteetin ja lukumäärä värjäytyneiden solujen.

Microarray Kokeilut ja sisällyttäminen Julkisesti saatavilla Microarray Tietoaineistot

oligot microarray sirut (~57 k geenit) saatiin GE Healthcare (IL) ja AppliedMicroarrays (MA) (entinen Amersham Biosciences) (CodeLink 57 k Human Whole Genome) [11], [12], [13]. Hybridisaatio suoritettiin CodeLink RNA vahvistusta ja Labeling Kit kuten valmistaja on kuvannut hyödyntäen Cy5 fluoresoiva väriaine. Objektilasit skannattiin microarray skanneri (ScanArray 4000XL). Kuvat otettiin generoidaan ScanArray mikrosiru hankinnan ohjelmistot (GSI Lumonics, USA). cRNA kolmesta kokeellisia asetelmia käytettiin yhden kokeissa sisäinen piikkejä verrokkeina. Kokeellinen asetelmia koostui 10 virtsan BC näytteitä eri histologia (ks Tissue Näytteenotto ja Kirurginen toimenpide jakso) ja 5 kontrollinäytteitä. Skannatut kuvat jatkokäsitteli kanssa CodeLink Expression Analysis Software v5.0 Amersham Biosciences (nykyisin GE Health Care Inc.). Kokeellinen setup analysoitiin perustuu viite suunnittelun kuten aiemmin on kuvattu [14], [15], [16] kuten esitetään kuviossa S1A. Kaikki tuumorinäytteet verrataan keskiarvon kontrollinäytteistä. Raaka microarray tiedot ovat saatavilla GEO microarray tietokanta. Kaikki microarray tiedot ovat MIAME yhteensopivia.

Jotta laajentaa määrän BC näytteitä tutkitaan, me mukana seuraavat julkisesti saatavilla microarray aineistot meidän analyysi: 1) GSE89 aineisto (GDS183) [17], joka koostuu 40 BC näytteitä; 2) GSE3167 aineisto (GDS1479) [18], joka koostuu 60 näytettä (9 valvonta ja 51 BC näytettä); 3) GSE7476 aineisto [19], joka koostuu 12 näytettä (3 valvontaa ja 9 BC näytettä) ja 4) GSE12630 aineisto [20], joka koostuu 19 BC näytteitä. Kaikkiaan meidän yhdistettiin mikrosiruanalyysi koostui 17 kontrollinäytteitä (n = 5, että CodeLink alustaan ​​ja n = 12, jäljellä microarray alustoilla) ja 129 BC näytteitä (n = 10, että CodeLink alustaan ​​ja n = 119, jäljellä mikrosiru alustoilla). Julkinen tietoja käytettiin niiden käytettävissä normalisoitu muodossa, koska taustakorjausta ja normalisoituminen oli jo suoritettu.

Microarray Tietojenkäsittely

Microarray Tietojen suodatus ja taustaa korjaaminen CodeLink Platform.

suodatus suoritetaan perustuu signaalin voimakkuus ja kriteeri, onko tämä signaali on tietyn tason yläpuolella. Meidän analyysi, suodatus suoritettiin käyttäen yhtälöä:, missä S on mitattu signaalin intensiteettiä, B

L on paikallinen tausta mitataan ja σ

BL on keskihajonta paikallisen taustan. Signaalit intensiteetti pienempi kuin edellä mitattuna, saatu lippu. Taustakorjaus suoritettiin vähentämällä mediaani maailmanlaajuinen tausta mediaani paikallisen taustan signaalista intensiteettiä. Kynnys 2 asetettiin cut-off, mikä tarkoittaa, että paikka-intensiteetti ainakin yhden kanavan pitäisi olla kaksi kertaa niin paljon kuin taustalla.

Microarray Data normalisointi CodeLink Platform.

Microarray data normalisoitiin oletus menettely CodeLink ohjelmisto, eli spot intensiteetit jaettiin globaalin mediaani (maailmanlaajuinen mediaani normalisointi) [13]. Normalisoitu data poimittiin, esikäsiteltyjä ja lajitella Microsoft Excel ®. Lisätietoja tietojen analysointi Matlab ® (MathWorks Inc.) lasketaan ympäristön käytettiin. Tiedot tutkittiin niiden leviämisreiteistä edelleen valinnasta tilastollisen testimenetelmän.

Microarray Data Cross-normalisoituminen.

Microarray tiedot olivat rajat normalisoitu käyttämällä kvantiili algoritmia, jotta tilille bias, joka sisältyi vuoksi kokeilua, eri alustoilla ja eri näytteenottoa (kuva S2). Normalisoituminen cross-platform data on kuvattu aiemmin [21], [22], [23] erittäin hyvä korrelaatioita ja johdonmukaisuus CodeLink ja Affymetrix alustojen [24], [25].

luominen yhteisen Gene List ja BC Ryhmät

sen varmistamiseksi, että tulokset analyysimme olivat vertailukelpoisia, loimme yhteisen geenin listan kaikkien microarray alustoille. Tätä tarkoitusta varten NCBI Gene henkilötunnus käytettiin yhteisenä viitteenä. Kun verrataan DE geenit kaikkien aineistoja, vain ne läsnä kaikilla alustoilla valittiin lisäanalyysiä. Yhteensä tämä suodatus lähestymistapa tuotti geenin joukon 11837 ainutlaatuinen kirjaa, samanaikaisesti läsnä kaikissa microarray alustoille. Aineistot käytettiin yksittäisiä näytteitä sekä kasvaimen ryhmissä. Ryhmä jakauma on esitetty taulukossa S1.

Microarray Data Tilastot varten CodeLink Platform ja julkisesti saatavilla Microarray Tietoaineistot

Suhteen CodeLink alustan, lähestymistapamme koostui seuraavista menetelmistä. Kukin geeni testattiin sen merkitys erilainen ekspressio käyttäen z-testi. Geenit katsottiin merkittävästi ilmentyvät eri, jos ne on saatu p-arvo 0,05. Vertailuja tehtiin sekä joukossa kokeita sekä sisällä kokeiluja. Aseta manipulointi käytettiin sitten, jotta löytää uusia alaryhmiä, jotka luonnehtivat mahdollisuuksien mukaan kaikki kasvain näytteissä. Tarkempia analysoi käytimme geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti keskuudessa kasvain näytteissä.

Mitä vertailun kesken geenien kaikkien käytettävissä microarray aineistoja, käytimme seuraavaa menetelmää:

Ensin etsitään eroja, verrataan kaikkia vertailunäytteet (pidetään yhtenä ryhmänä), vastaan ​​kaikki kasvain näytteissä (katsotaan toinen ryhmä), käyttäen kaksisuuntainen kahden otoksen T-testi. Koska nämä ryhmät sisälsivät näytteitä, jotka vaihtelivat etnisyyden ja kasvaimen, me ohjataan kaikki harhaa vertaamalla niitä yhtenäistetään ryhmiä.

Toiseksi meidän erottaa näytteet ryhmiksi (11 ryhmässä yhteensä) (taulukko S1), ja kukin ryhmä verrattiin kaikkien kontrollinäytteiden, käyttäen kaksisuuntainen kahden otoksen T-testi.

Kolmanneksi, vertasimme näytteitä erikseen merkittävä geenien joukossa kutakin koetta, käyttäen kaksisuuntaista z-testi, joka on nimitystä ”sisäisen kokeellinen”. Tämäntyyppinen vertailu oli erityispiirre. Koska geenien ilmentymistä verrattiin keskimääräiseen geenin ilmentymisen samassa kokeessa, DE geenit merkitsisi sillä erolla, että jokainen kudoksen näytteellä verrattuna normaaleihin kudoksiin. Tämä tarkoittaa sitä, että yhteisten geenien joukossa olisivat ne geenit, jotka ovat yhteisiä kasvainkudokseen.

Vertasimme näytteet erikseen merkittävä geenien eli geenin suhde, joukossa kokeellisia asetelmia, käyttäen kaksisuuntaista z-testi, jota me kutsumme nimellä ”inter-kokeellinen”. Toisin sanoen, etsittiin geenit, jotka osoittivat eri ilmentymisen yhdestä näytteestä seuraavaan, mutta ei vastaan ​​kontrollinäytteistä. Mielenkiintoista, merkittävää geenit johdettu näistä sisältyvät geenit, jotka eivät olleet DE. Toisin sanoen, nämä geenit tunnistettiin joukkoon, joiden ilmentymistä pysyi samana kaikissa näytteissä.

Jotta voitaisiin tunnistaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien, käytimme kahta menetelmää. Geenit katsottiin merkittävästi ilmentyvät eri, jos ne on saatu p-arvo 0,05. Vertailuja tehtiin sekä joukossa kokeita sekä sisällä kokeiluja. Aseta manipulointi käytettiin sitten, jotta löytää uusia alaryhmiä, jotka luonnehtivat mahdollisuuksien mukaan kaikki kasvain näytteissä. Jatkotutkimuksiin käytimme geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti keskuudessa kasvain näytteet, on tarpeen saada käyttöön pohjalta. Siinä tapauksessa, että näytteen ryhmiä verrattiin, keskiarvo kunkin geenin otettiin vastaan ​​keskiarvo kaikista kontrollinäytteistä. Jos kyseessä on yksittäinen vertailuja näytteiden, geeni suhteet laskettiin vastaan ​​keskiarvo kaikkien kontrollinäytteistä.

False Discovery Rate (FDR) B

False Discovery laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [26 ], [27], [28].

Clustering Analysis

Clustering analyysi suoritettiin k-means algoritmi. Kaikkiaan 81 klustereita täydellisen aineisto on CodeLink alustan ja 100 klustereita kaikkien saatavilla aineistoja, muodostettiin ja DE geenit edelleen luokitella käyttämällä kaksisuuntaista (geenien-vastaan-näytteet) keskiarvo-sidoksen hierarkkinen klusterointi kanssa euklidinen etäisyys [29 ]. Klusterointi analyysi ja kromosomin kartoitus olivat osittain suoritettiin Genesis 1.7.2 (Technische Universität-Graz, Itävalta) käyttäen Pearsonin korrelaatiota (

r

) ja Spearmanin rho korrelaatio (

ρ

) [30 ], [31], [32].

TFBM Analysis

jotta voitaisiin tunnistaa transkription tekijöitä havaitut muutokset geenien ilmentyminen, tutkimme transkriptiotekijä sidosmotiivien (TFBMs) että Transcription Element kuuntelu System Database (Telis) (www.telis.ucla.edu) [33]. Transfac transkriptiotekijä tietokanta käytettiin tunnistamiseen geenin transkriptiotekijän sitoutumiskohtia [34].

Kromosomikartoitus

Kromosomikartoitus näyttää olevan lupaava menetelmä tunnistaa kuvioita keskuudessa geenejä. Keskeisenä ajatuksena raportoitiin aluksi

Cohen et al

. on geenien kartoittamiseen kromosomaalisia alueita ja tällä tavalla, jos korrelaatioita, niissä näkyvät läpi sijainnin geenit kromosomi alueisiin, koska peräkkäisiä geenit ovat usein samalla ilmaistaan ​​[30]. Kromosomikartoitus- analyysi, käytimme Gene ontologia Tree Machine, WebGestalt web-työkalu (Vanderbilt University, Alankomaat, https://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35] ja Matlab ® (MathWorks Inc.) tietokoneilla.

Gene ontologia (GO) Analysis

Gene ontologia (GO) analyysi alun perin suoritettiin käyttäen Egon online-työkalu Gene ontologia (sen Norja University of Science and Technology, Trondheim, Norja , https://www.genetools.microarray.ntnu.no/egon/) jotta löydettäisiin puuttuu geeni symbolia [36]. WebGestalt web-työkalu (Vanderbilt University, Alankomaat, https://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35], [37] käytettiin geenien toiminnan luokituksia. Suhteet differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja transkriptiotekijää sitovia motiiveja tutkittiin tarkemmin käyttäen Pubgene ontologia Database (www.pubgene.org). Gene määritelmät ja toiminnot perustuvat National Institute of Health tietokantojen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/).

GEO liittymisen numerot

Array tiedot talletettiin Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) kanssa liittymiseen numerot GSM678186 kautta GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448).

Results

Immunohistochemistry

Tumor Näytteet värjättiin vasta-ErbB2, sykliini D1, p53 ja Ki-67. Mikäli läsnä, anti-ErbB2-värjäys Tuumorinäytteissä on kalvon värjäytyminen, diffuusi in uroteelin (kuvio 1). Kaikki TCC näytettä (100%) osoittivat kohtalaista /strong (++, +++) Immuunivärjäystä taas ei TCC näyte ei osoittanut /heikkoa Immunovärjäyksen (0, +). Kynnysarvot korkean merkintöjä indeksit asetettiin Ki-67 ≥10% kasvain ytimiä ja p53 10 ja 20%. T1 /2-luokka III kasvaimia esiintyi voimakkain Immunovärjäyksen (+++, 70%). T1-luokan I /II kasvaimet osoittivat heikkoa värjäytymistä anti-Ki-67 (40% ja 7,5%, vastaavasti), kun taas T1 /2-Grade III kasvaimia esiintyi voimakkain immunovärjäyksellä (54%). Samoin, T1-luokan I /II kasvaimet osoittivat heikkoa värjäytymistä anti-p53 (10% ja 35%, vastaavasti), kun taas T1 /2-Grade III kasvaimia esiintyi voimakkain immunovärjäyksellä (53%). Toisaalta, T1-luokan I /II kasvaimia osoitti voimakasta värjäytymistä anti-sykliini D1 (80% ja 80%, tässä järjestyksessä), kun taas T1 /2-luokka III kasvaimia esiintyi heikko immuunivärjäysmenetelmällä (31,8%).

Toisaalta, T1-luokan II kasvaimia osoitti voimakasta värjäytymistä anti-sykliini D1 (80%), kun taas T1-luokka III kasvaimia esiintyi heikko immunovärjäyksen. Edustavia H 0,05 katsottiin ilmentyvät differentiaalisesti. Kuviossa S3A-C jakauman p-arvot on esitetty. FDR laskettiin aiemmin raportoitu [27], [28]. FDR laskettiin olevan 9,3%, kun p-arvo 0,05 kasvainten T1-luokan II ryhmässä, 8,6% p-arvo 0,05 kasvainten T1-luokka III ryhmässä ja 11,03% p-arvo 0,05 kasvainten T2 ja T3-luokka III ryhmä (Kuva S3D-F). Samaa menettelyä seurattiin kullekin näytteelle erikseen. Geenit piirrettiin kohtaan-tonttien tutkiakseen ilmaisun jakaumat tarkemmin. Box-käyrät kasvain ryhmien samoin kuin yksittäisille näytteille kuvataan kuviossa S4A ja Kuva S4b, vastaavasti.

analyysi yhteisen ilmentyvät eri Genes: CodeLink Platform

Jotta voitaisiin tunnistaa geeni ekspressiokuvioita virtsan BC, me analysoitiin edelleen myös microarray tiedot siten, että yhteisen ekspressiokuviot eri näyttei- den havaittiin. Olemme keskittäneet analyysi, paitsi eroista kasvain näytteet, mutta myös niiden yhtäläisyyksiä. Ei ollut yllättävää, että tällainen yhtäläisyyksiä oli olemassa. Risteyksiä yksittäisen kasvaimen näytteistä löytyi 831 geeniä, jotka ovat samanaikaisesti eri tavoin ilmentyy kaikissa kasvaimen näytteistä (joko ylös- tai alaspäin-säännelty). Näistä DE geeneistä, tunnistimme 33 geenejä samanaikaisesti lisääntynyt ilmentyminen ja 85 geenien samanaikaisella vähentynyttä ilmentymistä kaikissa BC näytteissä, verrattuna normaaliin kudokseen.

joukossa ylös geenien, ne muodostavat suurimman kertaiseksi lauseke ( keskiarvo ± SD) olivat: hypoksia-indusoituvaa proteiinia 2 (HIG2; NM_013332.1) (2,70 ± 0,54); APC11 Anaphase edistäminen monimutkainen alayksikköä 11 (ANAPC11; NM_001002245.1) (2,50 ± 0,60); zo54e12s1 Stratagene haima (# 937208) cDNA-klooni KUVA: 590734 3 ’samankaltainen TR: G1022718 G1022718 tumareseptorin CO-repressori (NCOR1; AA156336.1) (2,01 ± 1,13); UI-1-BB1p-ATP-e-01-0-UIs1 NCI_CGAP_Pl6 cDNA-kloonin UI-1-BB1p-ATP-e-01-0-UI 3 ’, (BU754189, BU754189.1) (1,89 ± 0,56). Samoin geenit, jotka osoittivat alin kertainen ekspressionopeuksia (keskiarvo ± SD) olivat: tn52a12.x1 NCI_CGAP_Kid11 cDNA-kloonin KUVA: 2171998 3 ’samankaltainen sisältää PTR5.b2 MER22 toistuva elementti (AI565993; AI565993.1) (-3,13 ± 0,66 ); zx51b02r1 Soares_testis_NHT cDNA-klooni IMAGE: 795723 5 ’(AA461577, AA461577.1) (-2,75 ± 0,86); lactotransferrin (LTF) (ANKRD29, NM_173505.2) (-2,28 ± 1,17); HUMNK566 Ihmisen orvaskeden keratinosyyttien cDNA-klooni 566 (ODZ2, D29453.1) (-2,15 ± 1,02); tuumorinekroositekijän reseptoreiden superperheen jäsen 17 (TNFRSF17) (TNFRSF17, NM_001192.2) (-2,07 ± 0,73); ja luustolihasten LIM-proteiini FHL1 mRNA (FHL1; U60115.1) (-2,06 ± 0,87).

Mitä kolmesta kasvain ryhmään (T1-luokan II, T1-luokan III ja T2 /T3-luokka III ), meidän analyysi ei näytä osajoukko geenien yhteinen kaikille ryhmille. Siksi tutkimme yhteisen DE geenit parien välillä kasvaimen ryhmien (taulukot S2, S3, S4). DE geenien yhteistä kaikille yksilöille riippumatta kasvainten ryhmään, olivat edelleen ryhmittyneet käyttäen hierarkkinen klusterointi kanssa Euklidinen etäisyys. Ryhmät yhteisten geenien useita yhdistelmiä on esitetty taulukossa S5.

Hierarkkinen klusterointi kanssa euklidinen Etäisyys: CodeLink Platform.

Me tehdään kaksisuuntainen keskiarvo-sidos hierarkkinen klusterointi kanssa euklidinen etäisyys ~57 k geenejä. Yksityiskohtainen näkymä Näytteen klusterin dendrogram- näkyy kuvassa 2. Me osioitu kasvaimet kahteen pääryhmään ja useita alaryhmiä perustuen ero mielipiteenilmaisun genomin. Ensimmäinen haara sisälsi T1-luokan II kasvaimeen ja toinen sisälsi kasvaimia T1-3-luokan II /III, joka oli edelleen ryhmittyneet ylimääräisiä alaryhmiin.

K-means klusterointi: CodeLink Platform.

K-means klusterointi algoritmi on toinen tapa luokitella tietoa, jotta löydettäisiin malleja ilmaisun. Analyysimme järjestettiin seuraavasti:

k-means kaikkien geenien ja kaikista näytteistä. Tuloksena k-means klusterointi kaikkien geenien ja kaikki näytteet on esitetty kuvassa 3A. Olemme ryhmitelty tiedot 49 klustereiden yhdessä niiden centroids (kuvio 3B). Jokaiselle klusterin ryhmässä oli useita geenejä, jotka ominaista klusterin eli tunnettu näyte, että geenit kuului.

k-yhteisillä DE geenien kaikissa näytteissä. Yhteisen DE-geenien joukossa kaikki näytteet on edistänyt ryhmittyneet (kuvio 4A ja 4B).

k-means kasvaimen ryhmiä. Lopuksi perustuvan analyysin k-means klusterointi kasvaimen ryhmät analysoitiin kuten edellä on määritelty. Tulokset on esitetty kuviossa 5A ja 5B klusterin ja centroids, vastaavasti. Klustereita kasvain ryhmien paljasti molemmat eroja sekä yhtäläisyyksiä eri ryhmien välillä. Esimerkiksi tietyt geeni luokat paljasti konstitutiiviset alassäätöä yhdessä kasvaimen ryhmässä vs. ryhmä korkeamman vaiheen /laatu, kun taas muut geeni luokat näytteillä konstitutiiviset ylössäätö välillä vastaavien ryhmien (klustereita 11, 24, 27, 30, 33, 41, 46). Samalla useat klustereita sisältyvät geenit, jotka pysyivät muuttumattomina kasvaimen ryhmien (klustereita 21, 26, 35, 37, 45, 47, 48).

K-means klusteri antoi joitakin erillisiä malleja joukossa näytteitä , kuten klustereita 1, 3, 4, 5, jne

klusterit (A) ja centroids (B) esitetään, joissa ei ole selvää eroa välillä voidaan tehdä yksittäisten näytteiden.

Principal Component Analysis (PCA): CodeLink Platform.

PCA kaikkien geenien kaikissa näytteissä. PCA-analyysi meidän tietojen edelleen suoritettiin, jotta etsiä muita mahdollisia kuvioita keskuudessa geenejä. Alkuperäinen analyysi suoritettiin geenejä, joilla yleensä de kaikkien näytteiden. Laskettu pääkomponentit piirrettiin toisiaan sirontakuvaajiin kuten esitetään kuviossa 6. PCA analyysi geenien suoritettiin, jotta löydettäisiin uusia kuvioita ekspressiotietojen. Suorittamaan tämän analyysin kaikkien geenien ja kaikissa näytteissä, ensimmäinen askel oli juoni sirontakuvaajiin kaikista yhdistelmistä pääkomponenttien (Kuva 6A, B). Geenit ilmenee useita malleja, kuten edellä ympyröityä alueilla kuvassa 6B. Sitten näytteet tutkittiin prosenttiosuus varianssi ne johtuvan pääkomponentit (kuvio 6C, D). Lopuksi biplot rakennettiin voidakseen tarkastella näyte luokituksen suhteessa koko geenin ilmentymistä (kuvio 6E). Kuten esitetty ympyröity alueilla kuviossa 6E, näytteet jaettiin kahteen pääryhmään: näytteet 22A (T2 /T3-luokka III), 27A (T1-luokka III) ja 29A (T2 /T3-luokka III) toisaalta, ja loput näytteet ryhmiteltiin. Jotta edelleen ratkaista erot perustuvat PCA analyysiin vertasimme geeniekspressiota seuraavasti.

PCA yhteisten DE geenien kaikissa näytteissä. PCA-analyysi yhteisen DE geenit on esitetty kuvassa 7. ryhmittely näytteiden perustuu pääkomponentit osoitti eri luokituksia. Kasvain näytteitä 2A, 3A ja 4A ryhmiteltiin leimallisesti kohti kolmen ensimmäisen pääkomponentit (Kuva 7E). Nämä kolme näytettä ryhmiteltiin kun kokonaisen tietoaineiston pidettiin. Ratkaisemisessa tulos yhteismarkkinoille DE geenit osoittivat eron kasvain ryhmiä. Vastaavasti useat eri ryhmittymiä saatiin PCA analyysi yhteisen DE geenit kaikkien näytteiden, kuten joukossa kasvain näytteet 22A, 10A, näytteitä 2A, 4A, 16A, jotka muodostavat erillisen ryhmän ja näytteiden 3A, 17A, 26A, 27A, 29A että muodostunut toinen (kuvio 7F). Samoin piirtämällä komponenteista ryhmitelty näytteiden 3A ja 16A, sekä näytteet 2A, 4A ja 10A erillisessä ryhmässä.

PCA kasvaimen ryhmistä.