Krooninen sairaus

tiivistelmä

sykliiniriippuvaisen kinaasiestäjän 1B (p27Kip1) on keskeinen proteiini päätöksessä välillä leviämisen ja solusyklin poistu. Lepotilassa olevat solut osoittavat ydinvoiman p27Kip1, mutta tämä proteiini viedään sytoplasmaan vastauksena lisääntyvissä signaaleja. Me raportoi äskettäin, että katalaasi hoito lisää tasoja p27Kip1

in vitro

ja

in vivo

hiirimallissa. Karakterisoimiseksi ja laajentaa näitä havaintoja, arvioimme sääntelyn p27Kip1 vetyperoksidilla (H

2O

2) ihmisen melanoomasolujen ja melanosyyttien. Havaitsimme, että suuri osa p27Kip1 positiivinen ydinten melanooman yli-ilmentäviä soluja tai käsitelty eksogeenisen katalaasi, kun taas ei-käsiteltyihin kontrolleihin osoitti soluliman lokalisoinnin p27Kip1. Sitten tutkittiin tasot p27Kip1 fosforyloidun (p27p) seriinin 10 (S10) ja treoniini 198 (T198), koska fosforylaatio näillä paikoilla mahdollistaa ydin- vietäessä tämän proteiinin, joka johtaa kertyminen ja vakauttamiseen p27pT198 sytoplasmassa. Osoitimme Western blot lasku p27pS10 ja p27pT198 tasolla vastauksena H

2O

2 poistaminen melanooman soluissa, jotka liittyvät ydin- p27Kip1. Melanosyyttien myös näytteillä ydin- p27Kip1 alentavat p27pS10 ja p27pT198 kuin melanoomasoluja, joka osoitti soluliman p27Kip1. Osoitimme myös, että lisäys H

2O

2 (0,1 uM) ja melanoomasoluja pidätettiin G1 seerumistarvaatio indusoi ja lisää tasoja p27pS10 ja p27pT198 johtaa sytoplasmisen lokalisoinnin p27Kip1. Ydinvoiman lokalisointi ja translaation jälkeiset modifikaatiot p27Kip1 osoitettiin myös katalaasin kolorektaalisen karsinooman ja neuroblastoomasoluja, joka ulottuu myös havainnot näihin muihin ihmisen syövän tyypit. Lopuksi osoitimme olevassa työssä, että H

2O

2 puhdistusjärjestelmä estää ydinaseiden viennin p27Kip1, jolloin solusyklin pysähtymisen, mikä viittaa siihen, että syöpäsolut hyödyntää niiden luontaisten pro-hapetin valtion suosimaan sytoplasman lokalisoinnin p27Kip1 .

Citation: Ibañez IL, Bracalente C, Notcovich C, Tropper I Molinari BL, Policastro LL, et al. (2012) fosforylaatio ja solunosasijaintia p27Kip1 säätelemä Hydrogen Peroxide Modulation syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (9): e44502. doi: 10,1371 /journal.pone.0044502

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 08 elokuu 2012; Julkaistu: 06 syyskuu 2012

Copyright: © Ibañez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustuksia kansallisen viraston tieteellistä ja teknologista Promotion (ANPCyT), Argentiina (PICT 2007-01628 ja PICT 05-14330) ja voittoa tavoittelematon järjestö Fundación Florencio Fiorini. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solusyklin etenemisen reittejä ovat päätepiste signa- osallisena solujen kasvua ja solujen lisääntymistä. Solusyklin on tiukasti koordinoi peräkkäisellä kokoonpano ja aktivointi vaiheittain proteiinikinaasin kompleksit [1], [2], muodostuu sykliinejä ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK), joka myös sääntelee INK4 proteiinit ja CDK-inhibiittorit ( CDKIs). D-tyypin sykliinien ilmaistaan ​​koko ajan vasteena mitogeenistimulaation [2]. Sykliini D-CDK4 ja sykliini E-CDK2: n kompleksit ovat tarpeen kulkua G1: stä S-vaiheeseen. CDKI 1B (CDKN1B), joka tunnetaan myös nimellä p27Kip1, tunnistettiin ensin kriittinen negatiivinen säätelijä CDK2 ja G1 /S solusyklin etenemistä [2], [3]. Tasot Tämän CDKI ovat korkeat lepotilassa olevat solut, laskee vasteena mitogeenisesta stimulaatiota pysyvän kynnysarvoja lisääntyvien solujen ja lisätä uudelleen, kun mitogeeneja peruutetaan [2].

Viime vuosina todettiin että p27Kip1 on mukana sääntelyn muiden prosessien, kuten solujen vaeltamiseen [4] yhdessä solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia [5]. Kiinnostavaa kyllä, tämä proteiini voi käyttää sekä positiivisia että negatiivisia toimintoja näihin prosesseihin [5]. Toiminta p27Kip1 ohjataan sen pitoisuus, solunosasijaintia ja fosforylaatio tila [5]. Esimerkiksi fosforylaation p27Kip1 seriinin 10 (S10) välittää p27Kip1 vientiä sytoplasmaan [6] – [9], fosforylaatio treoniini 198 (T198) stabiloi proteiinin sytoplasmassa ja lisää p27Kip1-riippuvaista solun liikkuvuus [4 ] ja fosforylaatiota treoniini 187 (T187) osoittaa p27Kip1 kuin kohteena proteolyysi polyubiquitination [9] – [11]. Fosforylaatiota muita sivustoja proteiinin heikentää ydinvoiman tuonnin p27Kip1 ja parantaa kokoonpano sykliini D1-CDK4 kompleksi [9], [12] – [15] tai aloittaa siirtyminen p27Kip1 peräisin estäjä sykliini E-CDK2 alustaan ​​varten proteolyysiä [16], [17]. Muutoksia p27Kip1 fosforylaatioon voi johtaa menetykseen vakauden, poikkeava toiminta tai mislocalization proteiinin, joka puolestaan ​​voisi edistää kasvaimen synnyssä [5], [9]. Tässä mielessä molemmat menetys ydin- p27Kip1 ja sen sytoplasman lokalisointi on ehdotettu ennustetekijöitä merkkiaineena melanooman etenemisen ja huonompi kliiniseen tulokseen [18].

solun ulkopuolelle voi aloittaa Cell Cycle Division tai pidätys aktivoimalla tai deaktivointi sykliini -CDK Complexes läpi erilaisia ​​reittejä

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) pystyvät kohdistamaan erilaisia ​​vaikutuksia soluihin niiden luonteen, lokalisointi ja tasot [19]. Erityisesti monenlaisia ​​nisäkkäiden solut voivat lisätä kasvua, kun se altistetaan kohtuullisesti vetyperoksidia (H

2O

2) ja voivat aiheuttaa apoptoosin [20], terminaali eriyttäminen [21] tai sytotoksisuuden [20], jos se altistetaan korkeille H

2O

2. Huuhteluilman H

2O

2 kasvainsoluissa joko käsitellään eksogeeniset katalaasin tai ilmentävät transfektoitu katalaasin estää soluproliferaatiota [22] – [25]. On hyvin dokumentoitu, että H

2O

2 osallistuu signaalitransduktioreitteihin [26], [27], esim. kohonnut H

2O

2 aiheuttaa mitogeenisestä signaaleja, kuten ne, jotka liittyvät Ras /ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasien 1 ja 2 (ERK1 /2) reitin, ja stressi-reagoiva signaaleja, kuten ne, jotka liittyvät C -Jun N-terminaalinen kinaasien (JNK: t) ja p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) polkuja [26] – [28]. Lisäksi ROS, ja erityisesti H

2O

2, myös hiljaista moduloinnissa reseptorityrosiinikinaaseja (RTK) [29] ja fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT [30] polkuja.

on raportoitu, että vaihtelut havaittu solunsisäinen redoksitilassa aikana solusyklin etenemistä voitaisiin kytkeä oksidatiivisen aineenvaihdunnan prosesseja solukierron säätelyssä [31], [32]. H

2O

2 vaihtelut pitkin solusyklin liittyi säätelyyn sykliini D1 ilmaisun [33]. Sen sijaan poistamalla endogeenisten H

2O

2 yliekspressio katalaasin ja glutationiperoksidaasin indusoi G0 /G1 pidätys [25] ja vähentää solujen DNA-synteesi [34]. Tuoreessa tutkimuksessa laboratoriossamme osoitti kohonneeseen p27Kip1 vastauksena katalaasin hoitoa hiirimallissa okasolusyöpä

in vitro

ja

in vivo

[35]. Kuitenkin mekanismit mukana tässä solukierron proteiinin sääntelyä H

2O

2 ei ole täysin ymmärretty. Ottaen huomioon, että p27Kip1 ehdotettiin ennustetyövälineenä biomarkkeri ihmisen melanooman [18] ja että nämä kasvaimet näytteillä esihapetinta käyttäytyminen johtuu epätasapaino antioksidantti järjestelmä [36], [37] sekä melaniinia purkamista [38], ihmisen melanoomasoluja tullut mielenkiintoinen malli laajentaakseen edellisessä tuloksia H

2O

2 sääntelyn p27Kip1.

tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida vaikutuksia modulaatio H

2O

2 tasossa G1 /S siirtymävaiheen ja erityisesti sen sääntely CDKI proteiinin, p27Kip1, ihmisen melanooman ja melanosyyttien solulinjoissa. Osoitimme solunsisäistä relocalization on p27Kip1 jälkeen katalaasia tai H

2O

2 hoitoja. Tähän liittyi muunnelmia tasot fosforyloitu p27Kip1 at S10 (p27pS10) ja T198 (p27pT198), joilla on tärkeä rooli sääntelyn solunosasijaintia tämän proteiinin. Tuloksia p27Kip1 modulaatio laajennettiin muihin ihmisen syöpäsolutyyppien, peräsuolen syöpä ja neuroblastoomasoluilla. Meidän havainnot voivat antaa vihjeen ymmärtää vaikutuksen H

2O

2 modulointiin keskeinen sääntelyn proteiinin G1 /S siirtymä kanssa tämän vaikutusta solusyklin ja solujen lisääntymistä.

tulokset

Catalase Treatment Estää Melanooma soluproliferaatiota G1 pidätys

on ehdotettu, että solut pysyvä oksidatiivisen muutos redox tila voi käydä läpi jatkuvaa lisääntymistä, jotka voivat puolestaan ​​olla ratkaiseva tapahtuma ulkonäkö pahanlaatuisten fenotyypin [23], [39]. Tässä mielessä, tuotannon suuria määriä ROS ja erityisesti, H

2O

2, on raportoitu kasvainsolulinjoissa [23], [40]. Katalaasi on antioksidantti entsyymi, joka hajottaa H

2O

2 veteen ja happea. Ottaen huomioon, että H

2O

2 voi diffundoitua yli kalvoja, lisäämällä katalaasia viljelyväliaineeseen voisi tuottaa lasku solunsisäisessä taso H

2O

2 päästäisiin vastaavaa alempaa vakaassa tilassa pitoisuus ja sen ulkopuolella solun [26], [33], [35]. Olemme validoitu myös mallin melanoomasolujen käsiteltiin katalaasilla lisättiin viljelyalustaan ​​mittaamalla lasku tasot ROS kautta 2 ’, 7’-dichlorodihydro-fluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA) määritys (kuviot 1A ja 1B). Tämä lasku ROS tasoilla aiheuttama katalaasin johti merkitsevän eston (p 0,01) soluproliferaation (kuvio 2A). Lisäksi A375-solut yli-ilmentävät katalaasi (A375-CAT-E9) näkyy alhaisesta soluproliferaatiota verrattuna kontrolli soluja (kuvio 2B). Tämä klooni, A375-CAT-E9, osoitti alimman solunsisäisten ROS tasojen stabiilin genetisiiniä-resistenttien kloonien tuotettu (kuvio S1A) ja merkittävä lasku näiden tasojen verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä plasmidilla (A375-pcDNA3) tai ei -transfected (A375 kontrolli) (kuviot 1C ja 1D). Nämä tulokset samaa mieltä korkeampia katalaasin ilmaisun ja toimintaa havaitaan A375-CAT-E9 verrattuna säätökennoja (kuvio S1B ja S1C).

(A-D) Solunsisäiset ROS pinnat laskivat melanoomasolujen joko hoidetuilla katalaasin tai yli-ilmentämään sen. (A) edustaja histogrammit DCF fluoresenssin melanoomasolujen käsiteltiin 500 (sininen viiva) ja 1000 (oranssi linja) U /ml katalaasia tai jätetään käsittelemättä (vihreä viiva) 24 tuntia. Ohjaus solut eivät altistu DCFH-DA (musta viiva) ja valvonta-solut käsiteltiin katalaasin juuri ennen DCFH-DA inkubaation (punainen viiva). (B) DCF keskifluoresenssi (mielivaltaisina yksikköinä) vs. katalaasin (CAT) annos. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. käsittelemättömien solujen (0 U /ml katalaasin). (C) edustaja histogrammit DCF fluoresenssin melanoomasolujen yliekspressoivien katalaasi (A375-CAT-E9) ja sen valvonta (A375-pcDNA3 ja käsittelemättömän A375-solut). Ohjaus solut eivät altistu DCFH-DA (musta viiva), ohjaus solut käsiteltiin katalaasin juuri ennen DCFH-DA inkubaation (punainen viiva) ja soluja inkuboitiin DCFH-DA (vihreä viiva). (D) DCF fluoresenssikeskiarvo (mielivaltaisina yksikköinä) A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 ja A375-ohjaus soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. A375 ohjaus. (E-F) Melanoomasolut (A375) oli korkeampi Solunsisäiset ROS kuin niiden ei-kasvain vastine (PIG-1 melanosyyttejä). (E) edustaja histogrammit DCF fluoresenssin PIG-1 ja A375-solut: ohjaus solut eivät altistu DCFH-DA (mustat viivat), ohjaus solut käsiteltiin katalaasin juuri ennen DCFH-DA inkubaation (punainen viiva) ja soluja inkuboitiin DCFH- DA (vihreä viiva). (F) DCF keskifluoresenssi (mielivaltainen yksikköä) PIG-1 melanosyyttejä ja A375-melanoomasoluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. PIG-1.

(A) Solujen proliferaatio määrä melanoomasolujen käsiteltiin katalaasia 24 h, suhteessa kontrollisoluihin, arvioitiin MTT-määritystä. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. kontrolli. (B) leviämisen korko A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 ja A375-ohjaus soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. * P 0,05 vs. A375 ohjaus. (C) leviämisen nopeus ei ollut kasvainta (PIG-1) ja kasvaimen (A375) soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. A375. (D-I) Solusyklianalyysiä arvioitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla. (D) edustaja histogrammit DNA sisällöstä A375-melanoomasoluja käsiteltiin 1000 U /ml katalaasin (CAT) aikana 24 h ja A375-ohjaus soluja. (E) prosenttiosuus melanoomasolujen eri vaiheissa solusyklin vasteena CAT hoitoon. FBS nälkään soluja käytettiin kontrollina G1 pidätys. (□) Käsittelemättömät säätökennoja, () 500 U /ml ja (■) 1000 U /ml CAT ja () FBS nälkään soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. * P 0,05 ** p 0,01 vs. käsittelemätön kontrolli. (F) edustaja histogrammit DNA sisällön A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 ja A375-ohjaus soluja. (G) Prosenttia A375-CAT-E9 (■), A375-pcDNA3 () ja A375 kontrollisoluja (□) eri vaiheissa solusyklin. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. A375 ohjaus. (H) edustaja histogrammit DNA sisältö PIG-1 melanosyyttejä ja A375-melanoomasoluja. (I) Prosenttia (■) ei ollut kasvainta (PIG-1) ja (□) kasvain (A375) solujen eri vaiheissa solusyklin. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01 vs. PIG-1-soluissa.

Jotta voidaan arvioida ei-kasvain ja kasvainsolujen yhdessä niiden solunsisäisten ROS tasoilla, analysoimme melanosyyttien vs. melanoomasoluja. Kuvio 2C esittää leviämisen nopeus PIG-1 melanosyyttien verrattuna A375-melanoomasoluja. Olemme vahvistaneet, että kasvainsolut oli korkeampi solunsisäisiä tasoja ROS kuin niiden ei-kasvain vastine tässä melanooman /melanosyyttien malli (kuviot 1E ja 1F). Mitään merkittäviä eroja tasot ROS ja leviämisen nopeus (kuva S2) ei havaittu ei käsitelty ja lämpöinaktivoitua katalaasia käsiteltyjen solujen melanoomamalii. Näin ollen, lämmöllä inaktivoitua katalaasia käytettiin kontrollina.

Merkittävä G1 solusyklin pysähtymisen havaittiin liittyvät soluproliferaation inhibointi melanooman soluissa, joita käsiteltiin katalaasia 24 h (kuviot 2D ja 2E). Vastaavia tuloksia havaittiin A375-CAT-E9 vs. A375-pcDNA3 tai A375 säätökennoja (kuviot 2F ja 2G). Melanosyyttien osoitti suurempi osuus solujen G1 vaiheessa ja alhaisempi S-vaiheessa kuin melanoomasoluja (kuviot 2 H ja 2I).

Mitä tasot Sykliinien ja CDK mukana G1 /S siirtymä, sykliini D1, sykliini E, CDK4 ja CDK2, arvioitiin western blot, merkittävä lasku sykliini D1 tasojen jälkeen havaittiin H

2O

2 poisto katalaasin hoitoon tai katalaasin yliekspressio (kuva S3), yhteisymmärryksessä aiempien havaintojen [35 ], [41].

Lisäksi signaali sykliini D1 havaita immunofluoresenssilla oli erittäin alhainen tumassa käsiteltyjen solujen katalaasin ja merkittävä prosenttiosuus pieneni positiivisten tumien havaittiin näissä soluissa verrattuna ohjaus- soluja (kuvio S4). Melanoomasoluja oli korkeampi määrä kummankin sykliini D1 tasoilla ja prosenttiosuuden positiivisten tumien sykliini D1, arvioitiin western blot ja immunofluoresenssilla kuin niiden ei-kasvain vastine PIG-1 (kuvio S3 ja S4), jotka liittyä kohonneeseen ROS ja prosenttiosuus A375-solujen S-vaiheessa. Mitään merkittäviä eroja sykliini E CDK2 ja CDK4 tasot havaittiin välillä katalaasi-käsiteltyjen ja kontrolli solujen ja muiden kuin kasvaimen ja kasvaimen soluihin (kuvio S3). Täten lasku sykliini D1 havaittujen tasojen olisi mukana G1 /S pidätyksen aiheuttama katalaasin A375-soluissa.

Catalase indusoi Nuclear sijainnilla p27Kip1

Kun otetaan huomioon G1 pidätyksen aiheuttama katalaasin ja tärkeyttä solunosasijaintia estävää proteiinia p27Kip1 sen säätelyaktiivisuuteen vaikutus H

2O

2 huuhtelu sijaintia tämän proteiinin tutkittiin immunofluoresenssilla. Merkillistä, p27Kip1 paikallistettiin ensisijaisesti tumassa melanoomasoluissa käsitelty tai yli-ilmentämään katalaasin verrattuna kontrolleihin, joissa p27Kip1 jakelu oli pääasiassa sytoplasmista (kuviot 3A-3D). Lisäksi, melanosyyttien esillä suurempi osuus positiivisia p27Kip1 soluja kuin A375-melanoomasoluja (kuviot 3E ja 3F). Tämä proteiini pääasiassa tumassa ei-tuumorisoluissa ja solulimassa tuumorisoluissa (kuviot 3E ja 3F).

(A-F) solunosasijaintia p27Kip1 arvioitiin immunocytofluorescence. (A-B) Melanoomasolut käsiteltiin 500 ja 1000 U /ml katalaasin (CAT) ajalta 6 tai 24 tuntia tai jätettiin käsittelemättä. FBS nälkään soluja käytettiin kontrollina G1 pidätys. (C-D) Katalaasi yliekspressio malli (A375-CAT-E9-solut) kontrolleja (A375-pcDNA3 ja A375 kontrollisolut). (E-F) Ei-kasvain (PIG-1) vs. kasvain (A375) soluja. (A, C ja E) edustaja kuvia p27Kip1 immunocytofluorescence osoittaa solunosasijaintia proteiinin. DAPI: värjäys tuman DNA; p27Kip1: FITC-värjäys p27Kip1 proteiinia. (B, D ja F) Suhteellinen positiivinen (□) cytoplasms ja positiivinen (■) ytimiä p27Kip1 suhteessa kokonaismäärään lasketaan solujen. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. (B) ** p 0,01 vs. kontrolli. (D) * p 0,05 ** p 0,01 vs. A375 ohjaus. (F) * p 0,05 ** p 0,01 vs. ei-kasvainsoluja. (G-H) lisääntynyt ilmentyminen ydin- p27Kip1 A375-soluissa sen jälkeen, kun 1000 U /ml katalaasin (CAT) käsittely verrattuna kontrolli A375-soluja (käsitelty 1000 U /ml lämpöinaktivoitua katalaasi, IN-CAT) 24 tuntia, havaittiin western blot ydin- ja sytosolin otteet (katso menetelmät). (G) edustaja immunoblot kuvia näytetään. C: Sytoplasmiset uutteet; N: Tumauutteita. Actin ja Ku-70 densitometristä arvoja käytettiin standardoida sytoplasmaan ja tumaproteiinin lastaus, vastaavasti. (H) Suhteellinen densitometristä arvot (□) soluliman ja (■) ydin- p27Kip1 tasoilla. Tulokset on tarkoitettu ohjaamaan soluihin. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. * P 0,05 vs. kontrolli.

Jotta voitaisiin vahvistaa vaikutusten H

2O

2 puhdistusjärjestelmä on p27Kip1 lokalisointi havaittu immunofluoresenssilla, tasot tämän proteiinin ydin- ja sytosolin uutteita melanoomasolujen käsitelty katalaasin arvioitiin western blot. Osoitimme merkittävää lisäystä p27Kip1 tasojen tumauutteita käsiteltyjen solujen katalaasin verrattuna ohjaus (kuvio 3G ja 3H).

Nämä tulokset osoittavat modulaatio solunsisäisen lokalisaation p27Kip1 säätelyssä soluproliferaation katalaasi ja vahvistavat aikaisemmat havainnot [35], joka ulottuu näiden tulosten ihmisen A375-soluihin. Pysyvyys p27Kip1 tumassa aiheuttama H

2O

2 poistaminen suosisi tukkiminen solukierrossa G1 /S siirtyminen.

H

2O

2 Modulation Johtaa translaation jälkeinen modifikaatiot p27Kip1

Osoitimme myös merkittävän kasvun koko tasoilla p27Kip1 vasteena katalaasia hoitoon tai yliekspressio arvioida western blot (kuvio 4). Tämä voi liittyä korkea p27Kip1 havaittiin tumassa katalaasin käsiteltyjen solujen (kuvio 3E). Lisäksi melanoomasoluja esillä alemmilla tasoilla tämän inhiboivan proteiinin verrattuna melanosyyttien (kuvio 4). Mitä tulee western blot (kuvio 4) ja immunofluoresenssilla (kuvio 3), tulokset ja ottaen huomioon, että p27Kip1 tasoilla, funktio ja sijainti säätelee fosforylaatiot, tasot p27Kip1 fosforyloitiin S10 (p27pS10), T198 (p27pT198) ja T187 (p27pT187) vastauksena H

2O

2 puhdistusjärjestelmä arvioitiin western blot. Fosforylaatio p27Kip1 at S10 ja T198 on keskeinen tapahtuma ydinalan vientiä tämän proteiinin ja etenemistä solusyklin ja osoitimme merkittävä lasku tasot p27pS10 ja p27pT198 soluissa yli-ilmentävät tai käsitelty katalaasin verrattuna kontrolleihin (Kuva 4 ). Lisäksi PIG-1 melanosyyttien paljasti alhaisempi p27pS10 ja p27pT198 kuin kasvaimen vastine (kuvio 4).

ilmentyminen p27Kip1 ja p27Kip1 fosforyloitiin S10 (p27pS10) ja T198 (p27pT198) analysoitiin Western blot . (A-B) A375-melanoomasoluja käsiteltiin katalaasin (CAT) 6 ja 24 tuntia. FBS nälkään soluja käytettiin kontrollina G1 pidätys. (C-D) Katalaasi yliekspressio malli (A375-CAT-E9-solut) kontrolleja (A375-pcDNA3 ja A375 kontrollisolut). (E-F) Ei-kasvain (PIG-1) vs. kasvain (A375) soluja. (A, C ja E) edustaja immunoblot kuvia. (B, D ja F) Suhteellinen densitometristä arvot () p27Kip1 tasot, (□) p27pS10 ja (■) p27pT198. Actin densitometristä arvoja käytettiin standardoida Proteiinilisäyksen. Tulokset viitataan hallita ilman hoitoa (B ja D) ja ei-kasvain (PIG-1) solujen (F). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. (B) * p 0,05 ** p 0,01 vs. käsittelemätön kontrolli. (D) ** p 0,01 vs. A375 ohjaus. (F) ** p 0,01 vs. ei-kasvainsoluja.

Nämä havainnot viittaavat siihen, että kevyemmästä H

2O

2 katalaasi estää fosforylaatiota tiettyjä sivustoja of p27Kip1 siis välttää ydinvoiman vienti proteiinin ja johtaa solusyklin pysähtymiseen läpi kertymistä p27Kip1 tumassa. Lisäksi, fosforylaatio p27Kip1 on T187, joka on mukana liipaisu proteolyysiä tämän proteiinin, arvioitiin katalaasi-käsiteltyjen melanoomasolujen eikä merkittäviä eroja havaittu vs. käsittelemättömiin kontrolleihin (kuvio S5).

Ottaen että kasvutekijät käynnistävät H

2O

2 tuotantoa, joka johtaa aktivoitumiseen signalointipolkujen säätelevät solujen lisääntymistä [27], arvioimme kuinka H

2O

2 on mukana modulaatio p27Kip1 vuonna G1 pidätti A375-soluissa FBS nälkään inkuboitiin eri H

2O

2 24 tuntia. Kuvio 5A esittää lisääntynyt solunsisäisiä tasoja ROS annoksesta riippuvalla tavalla käsitellyissä soluissa 0,1-10 uM H

2O

2 verrattuna FBS nälkään soluihin. Se on ollut aiemmin raportoitu, että soveltaminen 0,1-7 uM H

2O

2 viljeltyjen solujen tuloksia solunsisäisen H

2O

2 tasossa noin +0,01-0,07 uM ja sitä stimuloi solujen lisääntymistä. Toisaalta, kasvavia määriä solukuoleman ilmaantua soveltavan pitoisuuksia H

2O

2≥10 uM [tarkistetaan 26]. Meidän solu malli, inkubointi FBS nälkään solujen 0,1pM H

2O

2 indusoi kasvua proliferaationopeus verrattuna hoitamattomiin FBS nälkään soluja. Toisaalta, mitään vaikutusta proliferaatiota havaittiin muiden annoksilla H

2O

2 käyttää (kuva 5B). Solut käsiteltiin 0,1 uM H

2O

2 näytteillä pääasiassa sytoplasmista p27Kip1 jakelu; samanlainen soluja inkuboitiin 10% FBS kun p27Kip1 havaittiin pääasiassa tumassa käsittelemättömästä FBS nälkään solujen (kuviot 5C ja 5D). Sijainti solussa Tämän proteiinin soluissa käsiteltiin 0,01 uM H

2O

2 oli verrattavissa kuvion havaittu FBS nälkään soluissa ja lisäksi 1-10 uM H

2O

2 että A375 FBS nälkään solujen johti samankaltaiseen prosenttiosuuden ydin- ja sytoplasman p27Kip1 (kuviot 5C ja 5D). Western blotit osoittivat alentuneet p27Kip1 soluissa käsiteltiin 0,01 uM H

2O

2 verrattuna FBS ruokittu soluja ja soluja käsiteltiin 0,1-10 uM H

2O

2 (kuviot 5E ja 5F). Tasot p27pS10 ja p27pT198 soluissa käsiteltiin 0,1 uM H

2O

2 kasvoi soluissa inkuboitiin 10% FBS kun FBS nälässä solut osoittivat vähäistä p27pS10 ja p27pT198 (kuviot 5E ja 5F). Päinvastoin, ei havaittu merkittäviä eroja tasojen p27pT187 käsitellyissä soluissa eksogeenisen H

2O

2 (0,1 ja 10 uM) verrattuna sekä FBS ruokittu ja 10% FBS: ää inkuboitiin kontrollisoluja (kuvio S5 ). Nämä havainnot viittaavat siihen, että H

2O

2 at mitogeenisella tasolla 0,1 uM meidän solumallissa säätelee p27Kip1 fosforylaation johtaa sytoplasmisen lokalisointi tämän proteiinin ja suosimalla solujen lisääntymistä.

Melanooma (A375) solut kasvatettiin täydellisessä väliaineessa 10% FBS pidättivät FBS nälkään (0% FBS) ajaksi 24 tuntia ja sen jälkeen soluja inkuboitiin eri pitoisuuksia H

2O

2 (0,01-10 uM) tai 10% FBS: ää. (A) Solunsisäiset ROS tasoilla mitattuna DCFH-DA määrityksessä. (B) Solulisääntyminen korko arvioi MTT-määritystä. (C) edustaja kuvia p27Kip1 immunocytofluorescence osoittaa solunosasijaintia proteiinin. DAPI: värjäys tuman DNA; p27Kip1: FITC-värjäys p27Kip1 proteiinia. (D) Suhteellinen positiivinen (□) cytoplasms ja positiivinen (■) ytimiä p27Kip1 suhteessa kokonaismäärään lasketaan soluja. (E): n ekspressio p27Kip1, p27pS10 ja p27pT198 analysoitiin Western blot. (F) Suhteellinen densitometrisellä arvot () p27Kip1 tasot, (□) p27pS10 ja (■) p27pT198. Actin densitometristä arvoja käytettiin standardoida Proteiinilisäyksen. Tulokset on tarkoitettu määräysvalta inkuboitiin 10% FBS: ää. (A, B, D ja F) Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. * P 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001 vs. soluja inkuboitiin 10% FBS: ää;

# p 0,05,

## p 0,01 ja

### p 0,001 vs. FBS-ruokittu soluja ei altistettu H

2O

2.

Näin osoitimme, että H

2O

2 voisi olettaa, että modulaatio keskeisten sääntelyn translaation jälkeiset modifikaatiot p27Kip1 proteiinin melanoomasolujen.

Catalase myös Moduloi Cell Proliferation ja solunosasijaintia p27Kip1 vuonna kolorektaalikarsinoomasta ja neuroblastoomasoluilla

jotta laajentaa tulokset havaittiin melanoomasoluja käsiteltiin katalaasia muiden ihmisen syövän solutyyppejä, arvioimme soluproliferaatiota, solusyklin ja p27Kip1 solunsisäinen jakelu kolorektaalisyövän karsinooma (LoVo) ja neuroblastooma (Paju) soluja. Luonnehdinta meidän solu malleja ROS tasolla osoitti LoVo solut osoittivat alhaisemmat solunsisäiset ROS tasoilla kuin Paju ja A375-solut (kuva S6). Mielenkiintoista on, havaitsimme alhaisen lisääntymisnopeus (p 0,01) sekä LoVo ja Paju soluja (kuvio 6) vastauksena alentuneiden tasojen ROS indusoitiin lisäämällä katalaasia soluviljelmiin (kuvio 6). LoVo ja Paju soluja käsiteltiin katalaasia 24 h osoittivat merkittävää G1 solusyklin pysähtymisen (kuvio 6), joka liittyy lasku sykliini D1 tasoilla (kuvio S7). Suostumuksella Näiden tulosten signaali sykliini D1 havaita immunofluoresenssilla oli erittäin alhainen tumassa käsiteltyjen solujen katalaasin ja merkittävä prosenttiosuus pieneni positiivisten tumien havaittiin näissä soluissa verrattuna kontrolli soluja (kuvio S8). Ei merkittäviä eroja sykliini E CDK2 ja CDK4: n tasoja on havaittu välillä katalaasi-käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen solujen (kuvio S7).

LoVo ja Paju soluja käsiteltiin 0-1000 U /ml katalaasin (CAT) 24 h. (A-B) Solunsisäiset ROS tasot määritettiin DCFH-DA määrityksessä. (A) edustaja histogrammit DCF fluoresenssin käsiteltyjen solujen 500 (sininen viiva) ja 1000 (oranssi linja) U /ml katalaasia tai jätetään käsittelemättä (vihreä viiva) 24 tuntia. Ohjaus solut eivät altistu DCFH-DA (musta viiva) ja valvonta-solut käsiteltiin katalaasin juuri ennen DCFH-DA inkubaation (punainen viiva). (B) DCF keskifluoresenssi (mielivaltaisina yksikköinä) vs. katalaasi annoksen. (C) Solujen proliferaatio määrä LoVo ja Paju soluja käsiteltiin katalaasia 24 h, suhteessa kontrollisoluihin, arvioitiin MTT-määritystä. (D-E) Solusyklianalyysiä arvioitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla. (D) edustaja histogrammit DNA sisällöstä solujen käsitelty katalaasin (CAT). (E) prosenttiosuus solujen eri vaiheissa solusyklin vasteena CAT hoitoon. FBS nälkään soluja käytettiin kontrollina G1 pidätys. (□) Käsittelemättömät säätökennoja, () 500 U /ml ja (■) 1000 U /ml CAT ja () FBS nälkään soluja. (B, C ja E) Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. * P 0,05 ja ** p 0,01 vs. kontrolli.

(A ja B) Nuclear paikallistaminen p27Kip1 kanssa katalaasin (CAT) havaittiin immunocytofluorescence. (A) edustavat kuvat p27Kip1 immunocytofluorescence osoittaa solunosasijaintia proteiinin. DAPI: värjäys tuman DNA; p27Kip1: FITC-värjäys p27Kip1 proteiinia. (B) Prosenttia positiivisen cytoplasms (□) ja positiiviset ytimet (■) ja p27Kip1 suhteessa kokonaismäärään lasketaan solujen. (C ja D) lisäys p27Kip1 tasoilla ja lasku p27Kip1 fosforyloitiin S10 (p27pS10) ja T198 (p27pT198) vastauksena H

2O

2 puhdistusjärjestelmä, analysoitiin Western blot. (C) edustaja immunoblot kuvia. (D) Suhteellinen densitometrisellä arvot () p27Kip1 tasot, (□) p27pS10 ja (■) p27pT198. Actin densitometristä arvoja käytettiin standardoida Proteiinilisäyksen. Tulokset viitataan hallita ilman hoitoa. (B ja D) Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. * P 0,05 ** p 0,01 vs. käsittelemätön kontrolli. (A-D) FBS nälkään soluja käytettiin kontrollina G1 pidätyksestä.

peräsuolen syöpä ja neuroblastoomasoluilla käsiteltiin katalaasin osoitti myös p27Kip1 lokalisoitu ensisijaisesti tumassa verrattuna kontrolleihin, joissa p27Kip1 jakelu oli pääasiassa sytoplasmista (kuviot 7A ja 7B esittävät hoitoja 24 tuntia ja kuviot S9A ja S9B osoittavat hoitoja 6h). Lisäksi olemme osoittaneet Western blot merkittävä kasvu tasot p27Kip1 vastauksena katalaasia hoitoon sekä LoVo ja Paju solujen (kuviot 7C ja 7D hoitoja 24 h ja kuviot S9C ja S9D hoitoja 6 h). Lopuksi me jäljentää merkittävä lasku tasot p27pS10 ja p27pT198 peräsuolen syöpä ja neuroblastoomasoluilla käsiteltiin katalaasin verrattuna kontrolleihin (kuvat 7C ja 7D hoitoja 24 tuntia ja kuviot S9C ja S9D hoitoja 6 h).

Nämä tulokset vahvistivat ja laajentaneet aiempia havaintoja. Ehdotamme, että ROS vähentää eri ihmisen syöpäsoluja katalaasi säätelee solunosasijaintia p27Kip1 välttää fosforylaatiota proteiinin keskeisiä alueita (S10 ja T198), jotka johtavat kertyminen p27Kip1 tumassa, joka suosii solusyklin pysähtymisen.