Krooninen sairaus

tiivistelmä

ERG, jäsen ETS transkriptiotekijän perhe, usein yli-ilmentynyt eturauhassyövässä seurauksena sen fuusio androgeenisäädellyn reagoiva TMPRSS2-geenin. Erilaiset genomista uudelleenjärjestelyt ja vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumia ympäri liitosalue johtaa useisiin yhdistelmä TMPRSS2: ERG fuusio selostukset, jotka korreloivat eri kasvaimen aggressiivisuus, mutta niiden toimintoja ja biologisia vaikutuksia ovat vielä epäselviä. Monimutkaisuus ERG ekspressiomallin pahentaa vaihtoehtoisten promoottorien, liitos, polyadenylaatiokohtia ja kääntäminen aloituskohdat sekä natiivi ja fuusio yhteyksissä. Systemaattinen luonnehdinta natiivi ERG ja TMPRSS2: ERG variantteja paljastaa, että niiden eri onkogeeninen potentiaali vaikuttaa tilan Ets domain ja konfiguraatio 5 ’UTR alue. Erityisesti ilmentyminen ja toiminta toiminnallisten ERG ja TMPRSS2: ERG variantit vaikuttavat sekä translaation aloitus- signaaleja eri isoformeja ja estävän ylävirran avointa lukukehystä (uORF) niiden 5 ’UTR. Pysyvää ilmentymistä ERG ja TMPRSS2: ERG variantteja edistänyt solumigraatio /invaasio, indusoi lohko leviämisen ja aiheutti vanhenemista kaltaiseen tilaan, mikä viittaa rooli näiden varianttien eturauhasen kasvainten synnyssä prosessi. Lisäksi TMPRSS2: ERG fuusio tuotteiden ryhmä liittyvien natiivi ERG isomuodot on myös erittäin yliekspressoitu fuusio kuljettavien eturauhasen syöpiä, ja samaa translaation aloituskohdan (in ERG eksoni 4) kanssa yleisesti havaittu TMPRSS2 exon1 liittynyt ERG eksonin 4 (T1: E4) fuusio-johdettu variantti. Käyttö Tämän ATG voi olla valikoivasti alas-säädellä suunnatun antisense-yhdisteitä, mahdollisesti edustaa perusteella kohdennettua lähestymistapaa, joka erottelee kasvaimeen liittyviä ja normaali ERG.

Citation: Zammarchi F, Boutsalis G, Cartegni L (2013) 5 ’UTR ohjaus Native ERG ja TMPRSS2: ERG vaihtoehdot Aktiivisuus eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (3): e49721. doi: 10,1371 /journal.pone.0049721

Editor: Bin Tian, ​​UMDNJ-New Jersey Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 19 syyskuu 2012; Julkaistu 5 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Zammarchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Work oli tukee DOD apurahan PC081477. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kromosomitranslokaation ovat vakiintuneita tärkeimmistä tapahtumista kehittämisessä hematologisten maligniteettien ja sarkoomat [1]. Tunnistaminen toistuva translokaatioita välillä androgeenisäädellyn reagoiva TMPRSS2-geenin ja jäsenten Ets perheen transkriptiotekijöitä eturauhassyöpä (PCA) on muuttanut panorama Eturauhassyövän biology [2].

Yli 80% Eturauhassyövän näytteet satama onkogeeniset fuusiot, yleisimmin johon 5 ’alueen TMPRSS2-lokuksen (sen promoottorin) liittyi Open Reading Frame (ORF) eri Ets geenien [3], vaikka muut yhdistelmät on kuvattu [4], [5] , [6]. Yleisin yksittäinen uudelleenjärjestely, TMPRSS2 exon1 liittyneet ERG eksonia 4 (T1: E4, tai variantti III) esiintyy -50% Eturauhassyövän tapauksista [3].

Ets geenifuusioissa osansa siirtymistä alkaen eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN) adenokarsinooma ja jotka ovat aggressiivisia vaurioita ja huonon ennusteen [7], [8], [9], [10], [11]. N yli-ilmentyminen ERG eturauhasen solulinjoissa aktivoi solujen invaasiota ohjelmia ja johtaa kehitystä PIN hiirissä, mutta ei voi ajaa syövän synnyn [5], [8], [10], [12], koska yhteistyö on erillinen geneettinen vaurioita, esimerkiksi PTEN menetys, tarvitaan laukaista etenemiseen edenneen taudin [7], [13], [14].

Useat variantit normaalin ERG geenituotteen on kuvattu, jotka johtuvat yhdistelmä vaihtoehtoisen silmukoinnin, polyadenylaatio ja transkription aloittamista [15], [16], [17], [18]. Erityispiirteet Genomisen uudelleenjärjestelyjen käyttöön myös huomattavia rakenteellisia heterogeenisuus 5′-alue. Sen lisäksi, että yhteisen T1: E4 transkriptin TMPRSS2 eksonit 1, 2 ja 3 voidaan yhdistää ERG eksonit 2, 3, 4, 5 ja 6 eri vaihtoehtoisen silmukoinnin kuvioita, jotka voivat tuottaa vähintään 17 erillistä TMPRSS2: ERG transkriptien [2 ], [19], [20], [21]. Nämä voivat toimia markkereina taudin etenemistä ja korreloi aggressiivisuus kasvainten [8], [9], [19]. Erityisesti T2: E4 variantti (TMPRSS2-exon2: ERG-exon4 tai variantti VI), jossa natiivi ATG TMPRSS2 eksoni 2 on runko ERG ORF, liittyy patologinen ja kliininen näkökohtia aggressiivinen tauti [19] .

mekanistinen perusta eri onkogeeninen fuusio isoformien on vielä selvittämättä, ja se voi liittyä luontaisia ​​eroja N-pään alueisiin tai vaikutus (t), joka vaihtelee 5 ”alue mRNA voi olla RNA vakauteen tai lauseke.

voit testata tätä hypoteesia, arvioimme käyttö 3 vaihtoehtoisten promoottorien, 2 yhteinen vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumia ja 3 polyadenylointikohdan (PAS) normaaleissa kudoksissa verrattuna TMPRSS2: ERG ilmentäviä eturauhasen kasvaimia. Nämä itsenäisesti säännelty tapahtumia yhdistyvät tuottamaan 30 ’main’ native isoformeja, joista löysimme olevan myös erittäin yli-ilmentynyt kasvaimia. Luonnehdinta Käännöksen aloittamista sivustoja käyttää yleisimpiä natiivi ERG ja fuusio variantit paljastaa, että tietty organisaatio 5 ’UTR alue on yksi tärkeimmistä tekijöitä niiden biologista aktiivisuutta ja tunnistaa ATG eksonissa 4 otaksutuksi tavoitteeksi antisense-pohjainen käännös esto eturauhassyövän.

tulokset ja keskustelu

rakenne ERG Gene

Useita native ERG isoformit voivat aiheutua yhdistelmän vaihtoehtoisten promoottorien, silmukoinnin ja polyadenylaatio. Nämä isoformit voivat puolestaan ​​yhdistää TMPRSS2 ja muut 5 ’kumppanit tuottaa lukuisia ERG johdettuja variantteja, vaihtelevalla ennustetekijöiden arvot [8], [9], [19]. Jotta ymmärtää paremmin toiminnan ERG johdettujen onkogeenisiä tuotteita, pyrimme aluksi selventää ERG-geenin rakenne ja luonnehtia sen ilme kuvio.

on huomattavia epäjohdonmukaisuuksia julkaistu ERG nimikkeistöä, jossa on vähintään neljä erilaista luokitusta järjestelmät, joissa ilmeinen seuraus aiheuttaa sekaannusta ymmärtämistä ja vertailua eri tutkimuksista (esim: suuri terminaali eksoni, joka sisältää Ets ja transaktivointidomainien on vaihtelevasti kutsutaan eksoni 11 [2], [22], 12 [3] 16 [18], [23], 17 [24]).

Raportoimme kuviossa 1A up-to-date näkymä eksoni-introni rakenne -300 Kb ERG lokus (ENSG000000157554) ja ehdottaa yhtenäinen, järkevä nimikkeistön RNA: n ja proteiinin variantit, jonka tavoitteena on sisällyttää kaikkein perustettu yleissopimukset. Rakenne perustuu pääasiassa 11 eksonia Refseq tulon NM_004449.4 (UniProt merkintä P11308 varten ERG2), ja se sisältää eksoni käytetyn numeroinnin siemen Tomlins paperin [2], [22] Ensimmäisessä luetellaan TMPRSS2: ERG fuusio. Lyhyesti sanottuna säilytettävä ”eksoni 4,” 218nt eksoni, joka on tärkein kumppani TMPRSS2 ja ”eksoni 11” suuri 3897nt eksoni, joka koodaa Ets verkkotunnuksen; nimesimme eksoni 1a, 1b, 1c kolme toisensa poissulkevia ”ensimmäinen” eksonia seuraavien kolmen validoitu promoottorit P

A, P

B ja P

C. Varmistaakseen järkevä sisällyttetty eksonien jotka saatettaisiin tulevaisuudessa, me erottaa kirjaimet vaihtoehtoinen eksonit eivät kuulu 11 viittaus niitä. Esimerkiksi 72 nt vaihtoehtoinen eksoni on välillä eksonien 7 ja 8 on nimeltään ”eksoni 7b ’.

(A) ylhäällä: -300 Kb ihmisen ERG locus, piirretty karkeasti mittakaavassa. Arvioitu introni koot on merkitty yhdessä eksonit asentoon (palkit). Punainen osoittaa ensimmäistä eksonia, sininen yhteiset vaihtoehtoiset ykkösiä ja harmaan harvinaista niistä. Keskellä: Exon rakenne, jossa eksoni koot alareunassa. Sininen ruutu osoittaa tärkein ennustettu ORF, valkoiset laatikot transloimattomassa alueet ja harmaa harvinaista eksonit. Punaiset ympyrät osoittavat polyA sivustoja. Pohja: linjaus eksonien muodostavien tärkeimpien ORF (ERG-1b) ja proteiinin verkkotunnuksia. Numerot osoittavat koko aminohappoja. PNT = terävä domain, AD = vaihtoehtoinen domain, Ets = Ets domain, TAD = transaktivaatiodomeenin. Asterisk ja ympyrä osoittaa asennon ensimmäisen ja toisen ATG. (B) Ihmisen ERG tärkeimmät variantteja. Tasaus eksonien muodostavien 30 tärkein RNA variantteja ihmisen ERG. Sininen merkitsee ORF, vaaleansininen ylimääräinen alue ATG eksonissa 3. Jokaisesta variantti, ehdotettu nimi mainitaan vieressä edelliseen nimikkeistön (jos käytettävissä). Ehdotettu proteiini nimi raportoidaan pitkin ennustettu koko aa ja kD. Vaihtoehdot johdettu vaihtoehtoisten käyttötapojen promoottorin 1a ja 1b ovat pareittain, koska ne johtavat liittyvien mRNA: iden ja identtisiä proteiineja.

jälkeen tunnistetaan tärkeimmät vaihtoehto sääntelyn tapahtumia Pääosa ERG vaihtelua: 3 vaihtoehtoista promoottorit (P

A, P

B ja P

C); kaksi yhteistä vaihtoehtoista silmukointitapahtumia (sisällyttäminen /eksonin 4 tai 7b); kolme erillistä polyA-signaalit (PAS 7bpA, 11LpA ja 12pA). Kombinatorisista käyttö vaihtoehtoisen tapahtumista synnyttää 30 mahdollista suuriksi ERG transkriptivariantissa (kuvio 1 B), joka voi koodata 15 erilaista ennusti ERG liittyviä polypeptidejä, 3 eri N-terminaalit, 3 erilaista C-päätteiden ja 1 mahdollinen sisäinen vaihtelu (osallisuus tai ohitus 24 aa Alternative Domain koodaama eksoni 7b).

lisäksi 30 suuriksi variantteja on kuvattu kuviossa 1, lukuisia ”pieniä” isomuodot on raportoitu kirjallisuudessa tai ovat esittää tietokantoihin. Luettelo sisältää variantteja osoittaa ohitus eksonien 2, 5, 7 ja 8; käyttö proksimaalisen (Short) polyA eksonissa 11 (11SpA) tai ylimääräisen introni yksi alavirtaan eksonin 8 (8pA); ja sisällyttäminen täydentävien vaihtoehtoisten eksonien 7c, 10b ja useiden vaihtoehtoisten eksonien johdettu introni 3 (eksonit 3b-h), merkitty harmaalla kuviossa 1A. Isoformit ERG4, ERG6 ja ERG9 edellisestä Owczarek tutkimuksen [18] ovat vähäisiä muunnelmia ja on ryhmitelty uudelleen tässä ryhmässä.

Koska mitään näistä ylimääräisistä harmittomia tapahtumia voisi yhdistää itsenäisesti kaikkien rakenteellisesti yhteensopiva suurten isomuotojen, satoja varianttien voisi mahdollisesti syntyä. Kuitenkin nämä tapahtumat näyttävät esiintyvän satunnaisesti, ja niiden fysiologista merkitystä ei tunneta.

ERG Expression: syöpään liittyvän Kytkin Promoottori Käyttö

Lähdimme tutkimaan käytön promoottorien, PAS tai pujontasignaalit by qPCR analyysi ERG sen erilaisissa normaaleissa kudoksissa, kasvaimet ja solulinjoissa (kuvio 2). Vaikka jonkin verran kudosta-to-kudos vaihtelua havaitaan (Fig. S1A), yleensä promoottori P

C (keskiarvo ACk (t) = 10,2) näyttää olevan kaikkein aktiivisimpia normaalissa kudoksessa (mukaan lukien eturauhasen), -25-kertainen ja -10 kertaa aktiivisempi keskimäärin kuin promoottorit P

A (ACk (t) = 14,9) ja P

B (ACk (t) = 13,4), vastaavasti (kuvio 2A). Toisaalta, paneelissa 8 ensisijainen PCa näytettä ilmentävät TMPRSS2-ERG fuusiot, promoottori P

B (keskiarvo ACk (t) = 5,4) osuus useimpien natiivi ERG otteen ja on läsnä tasoilla verrattavissa fuusioproteiinin itse (ACk (t) = 6), yli 100-kertaisesti runsaammin kuin sama transkriptin normaalissa eturauhasessa (ACk (t) = 12,8) (kuvio 2B ja kuvio. S1A). Itse asiassa useita TMPRSS2: ERG-kuljettavat näytettä natiivi P

B promoottori, eikä fuusio geeni, on pääasiallinen lähde ERG transkriptin (Fig. S1B). Verrattuna normaaliin eturauhasen, promoottorit P

A (ACk (t) = 9) ja P

C (ACk (t) = 8) on myös käytössä, mutta ei siinä määrin P

B. PCA solulinjoissa, P

B on ainoa aktiivinen natiivi ERG promoottori, jossa on havaittavissa signaaleja P

A- tai P

C (kuvio 2C). Kaksi testatuista PCa solulinjat, Vcap ja NCI-H660, ilmaista TMPRSS2: ERG fuusio (kuvio 2C, täysi symbolit), joka on sen sijaan esiinny PCa solulinjoissa, jotka eivät sisällä TMPRSS2: ERG fuusio (LNCap, DU145, C4- 2, avoimet symbolit ja Fig. S1C). Kuten odotettua, ei ilmentyminen mistä tahansa natiivi promoottorien havaittiin NCI-H660 solulinjaa, joka kuljettaa fuusio molemmissa alleeleissa ja menetti kaikki endogeenisten promoottorit [25].

kvantifiointi mukaan qPCR vaihtoehtoisia ERG varianttien normaalissa kudoksessa (A, D), ensisijainen PCa näytteitä (B, E) ja PCa solulinjat. (C, F). (A-C) kvantifiointi promoottorin käyttö. Alukesarjat spesifinen 3 eri ERG promoottorit sekä TMPRSS2: ERG fuusio, jossa käytetään yhdessä alukesarja ulottuu eksonien 5-7 määrällisesti koko ERG. Normaalit kudokset eivät ekspressoi fuusio tuotteen. Expression varianttien 1a ja 1c on lähes huomaamaton PCA solulinjoissa analysoitiin. Sillä paneeli C, avoimet symbolit osoittavat LNCaP, DU145 ja C4-2 (jotka eivät ilmennä TMPRSS2: ERG fuusio), täydellinen symbolit osoittavat VCAP ja NCI-H660 (ilmentävien TMPRSS2: ERG fuusio). Katso myös kuvio. S1 A-C. (D-F) kvantifiointi mukaan qPCR vaihtoehtoisen polyadenylaation käyttö. Alukesarjat spesifinen 3 eri polyA sivustoja, joissa käytetään yhdessä alukesarja määrällisesti koko ERG ja yhdet määrällisesti yhteensä eksonin 11 tasoilla, jotta päätellä 11SpA käyttö. Katso myös kuvio. S1 D-F. Kaikissa tapauksissa kukin osoitettu arvo edustaa keskiarvoja ≥3 riippumattomasta kokeesta ja esitetään ACk (t) normalisoitu taloudenhoito geeni GAPDH, siis ”korkea” ACk (t) arvo tarkoittaa alhainen ilmaisun ja ”matala” arvo tarkoittaa korkeaa ilmaisua. Rekit osoittavat keskiarvon. Tähdellä osoittavat, että tuote ei havaittu näytteen ja olisi siten vastaa kokeellinen pisteen taulukon yläosassa, mutta se ei heijastu keskiarvolla.

Tästä ensimmäiset kokeita päättelemme, että promoottori kytkin esiintyy PCa kasvaimia ja solulinjoissa ja että lisääntynyt käyttö natiivin promoottorin P

B on assosioituvat (ja mahdollisesti edistää) kasvaimen fenotyypin.

yli-ilmentyminen ERG PCA oli aiemmin kuvattu [23], mutta seuraava löytö TMPRSS2: ERG fuusio, se on tyypillisesti katsoneet tätä tapahtumaa. Kuitenkin meidän havainto, että sen lisäksi, että fuusio-johdettu selostukset, joidenkin oman ERG variantteja voidaan myös erittäin yli-ilmennetään PCa ehdottaa suurempaa roolia syntyperäinen ERG PCA kehittämiseen. Tätä tukee havainto, että endogeeninen hiiren

Erg

selostukset yliekspressoituvat kasvaimissa eturauhasen ehdollisesta

PTEN

– /-;

Trp53

– /- hiirillä verrattuna

PTEN

– /-;

Trp53

+ /+ hiirillä [7]. Tärkeää on, kun taas jälkimmäinen malli johtaa veltto muodossa PCA entisen tuottaa aggressiivinen fenotyyppi [7].

ero aktivointi kolme natiivin promoottorit fuusio kuljettavien PCa näytteet osoittavat, että tämä poikkeava ilmaisu on kopiointia ajatellen säännelty. Kiehtova mahdollisuus on, että aktivointi natiivin P

B promoottori voi ajaa suoraan tai välillisesti ERG itsensä osana positiivista sääntelyn silmukka. Esimerkiksi useat otaksuttu c-Myc reagoivat elementit tunnistettiin välittömästi ennen ERG P

B promoottori [18]. Koska c-Myc on keskeinen alavirtaan tavoite ERG [26] androgeeniriippuvainen aktivointi ERG fuusio, tai erillinen PTEN riippuvaisen Myc aktivointi [27] voisi laukaista omavaraista ERG /Myc kasvaimia synnyttävän silmukka, joka voi lopulta tulla androgen riippumaton. Todellakin, johdonmukaisesti tämän mallin, myötäkytkentärakenne mekanismi, jossa endogeenistä ERG ohjataan yli-ilmentyminen fuusio tuote on äskettäin kuvattu [28].

ERG Expression: Alternative Polyadenylaatio ja Jatkaminen

Analogisesti mitä teimme tutkimaan promoottori n käyttö, me sitten tutkitaan rooli vaihtoehtoisten polyadenylaatio- ja silmukoinnin ilmaisussa ERG variantteja. Kolmen pääasiallisen PAS kuvattu (kuvio 1) 11L-pA tarvitaan täysin toimiva ERG proteiinia, kun taas PAS intronissa 7b (7b-pA) ja eksonin 12 (12-pA) tuottaa C-terminaalisesti typistetyn ERG isoformeja josta puuttui Ets DNA: ta sitova domeeni ja transaktivaatiodomeenin (TAD).

11L-pA PAS oli yleisimmin käytetty normaaleissa kudoksissa (keskiarvo, ACk (t) = 10,8), noin 8-kertaisesti enemmän kuin 7b-pA (ACk (t) = 13,8) ja 50-kertaisesti enemmän kuin 12-pA (ACk (t) = 16,6) (Fig. 2D). Kuitenkin TMPRSS2: ERG ilmentävien PCa näytteistä (ACk (t) = 5,2), käyttö 7b-pA on voimakkaasti aktivoitunut, ja tulee suunnilleen yhtä yleisiä kuin 11L-pA (ACk (t) = 5,8) (kuvio 2E) . Sama pätee PCA jotka ilmentävät fuusio (kuva 2F) viittaa siihen, että siirtyminen tähän kuvioon ilmaisun voisi korreloida syövän etenemiseen. On tärkeää huomata, että vaikka tämä muunnos puuttuu Ets ja TAD verkkotunnuksia, se säilyttää dimerointi- vaikuttavia tekijöitä ja siten sen ilmentymisen saattavat vaikuttaa toimintaan muiden täyspitkän variantteja läsnä. Läheisin PAS eksonissa 11 (11 S-pA) [15], [18] oli välillisesti arvioitiin vertaamalla qPCR alueiden kummallakin puolella se (E11 ja 11L-pA), ja niiden kaltaiset ekspressiotasot havaittiin, mikä viittaa siihen, että käyttö of 11S-pA on marginaalinen useimmissa normaaleissa ja patologisissa tiloissa (kuvio 2D-F ja kuvio S1D-F).

Koska vaihtoehtoisen silmukoinnin variantteja voi vaikuttaa ERG tai TMPRSS2: ERG fuusio toiminnot [24], analysoimme alueet noin eksonin 7b ja eksonin 4 normaaleissa kudoksissa, PCa näytteitä ja solulinjoissa semikvantitatiivinen PCR. Molemmat vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumat olivat helposti havaittavissa, jolla on selkeä esiintyvyys eksonin 4 ja eksonin 7b osallisuutta variantteja. Emme kuitenkaan eivät havainneet mitään merkittävää rikastumista suhteellinen määrä joko silmukointivariantit PCA näytteissä, mikä viittaa siihen, että modulaatio näiden kahden erityisen silmukointitapahtumilla ei saa olla merkittävä asema PCA.

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että täyspitkä tuotteita, jotka sisältävät eksonin 7b ja Ets ja TAD verkkotunnuksia, ovat runsain ERG variantteja riippumatta tilan ylävirran alueiden sekä normaaleissa kudoksissa ja kasvaimia. Voimakas kasvu katkaistun TE: 7bpA isoformin suhteen täyspitkän variantti voi yksinkertaisesti heijastaa muutoksia silmukoinnin /polyadenylaatio- koneet syöpäsolujen, mutta se voi merkitä myös sen (vielä tutkimaton) rooli ERG biologian kasvaimissa.

N-terminaalista heterogeenisyys ERG isoformien

Sen arvioimiseksi, onko kuvatun heterogeenisuus 5′-alue vaikuttaa ERG ilmaisun ja toimintaa, me subkloonattuja natiivi variantit ERG-1a, ERG-1b, ERG -1, ERG-1b.Δ4, ERG-1c.Δ4, ja yhteinen fuusio variantti T1: E4, niiden täydellinen 5 ’UTR ja eksonin 7b mukana (Kuva. 3A). Kun lyhytaikaista transfektiota HeLa-soluissa, ERG-1c cDNA tehokkaasti ilmaistu odotettu 54 kDa: n tuotteen (kuvio. 3B, kaista 4). Päinvastoin, ilmaus natiivin ERG-1a ja ERG-1b variantteja oli tehotonta, jolloin peptidit pienempi kuin noin 55 kDa odotettavissa, jos ensimmäinen lukukehyksessä ATG eksonissa 3, käytettiin (Fig. 3B, kaistat 2-3 ). Mielenkiintoista on, että tämä peptidi liikkui yhdessä, että syntyy ohimenevä yli-ilmentyminen T1: E4 fuusio variantti, ~ 50 kDa: n (kaista 5). Muihin vaihtelu N-terminaalinen alue on peräisin eksonin 4 ohitusta, joka muuttaa ERG: n tärkein ORF siten, että ennustettu alkaa ATGs eksonissa 1 c tai eksonin 3 eivät pysty tuottamaan ERG liittyvän peptidin (kuvio 3A). Ohimenevä yli-ilmentymisen ERG-1b.Δ4 tai ERG-1c.Δ4 molemmat johti ERG liittyvät peptidit liikkuivat ~44 kD, sopusoinnussa käyttö in-frame M5 ATG eksonissa 5 (kuvio 3B, kaistat 7,9) . Tämä on ilmeisintä, kun käytetään ERG-vasta-ainetta C-17, joka helposti tunnistaa yhdistelmä-ERG, mutta ei endogeenisen proteiineja. Erilainen ERG vasta-aine (C-20) tunnistaa edullisesti endogeeninen vyöhyke, joka vastaa kooltaan ERGΔ4 (kaistat 1-5), jolloin kytkin M5 käyttö vaikeampi havaita.

(A) N-pään heterogeenisuus ihmisen natiivi ERG variantteja. 5’alueet osoitettuun varianttien toistetaan. Laatikot ovat eksonit kanssa ORF sinisellä. Punainen punkkien alle eksonit osoittavat lukukehyksessä ATGs eksoneissa 1c ja eksonit 3 5 out-of-frame tuotteiden aiheuttama eksonin ohittamisen, mistä muuten kehyksessä ATGs on merkitty punaisella. (B) Western blot (WB) ohimenevän ilmentymisen varianttien HeLa-soluissa. Vasta-aine C20 tunnistaa eksogeenista proteiinia ja endogeeninen bändi ~44 kD, joka vastaa kooltaan Δ4 variantteja. Vasta-aine C17 tunnistaa edullisesti eksogeenista ERG bändejä. (C) Mutaatiot että itsenäisesti poistaa 3 in-frame ATGs eksonin 4 tuotu cDNA T1: E4 ja analysoitiin kuten edellä. (D), Samoin mutaatioita tuotiin poistamiseksi ATGs eksonissa 3 (ERG-1b) tai eksonissa 1 c (ERG-1c) yksinään tai yhdistettynä mutaatioita ensimmäisen lukukehyksessä ATG (M4a) eksonissa 4 (ERG-1b ja ERG-1 c).

Koska T1: E4 puuttuu ennustettu aloituskodonit sekä TMPRSS2 ja ERG selostukset, vaihtoehtoisena sisäisenä ATG sisällä ERG: n avoimen lukukehyksen on käytettävä ilmaisemaan ERG liittyvän tuotteen fuusio mRNA, todennäköisesti eksonista 4. tunnistaa T1: E4 aloituskodonista, sarja metioniini-to-alaniinia pistemutaatioiden kertyi kolmen in-frame ATG kodonia läsnä ERG eksonissa 4 ( kuva 3A). Mutaatio nukleotidin 79 (M4a), mutta ei 121 (m4b) ja 184 (M4c) eksonin 4 poistetaan T1: E4: n ilmentyminen (kuvio 3C), mikä osoittaa, että fuusio-transkriptin käyttää ensimmäistä lukukehyksen ATG ilmentämiseen ERG peptidin .

kartoittamiseksi alkaen ATGs natiivista ERG isoformit samanlaisia ​​mutaatioita missä myös käyttöön yksinään tai yhdessä ensimmäisen lukukehyksessä ATGs eksonissa 3, 1 c ja 4 (kuvio 3D). Mutaatio ATG eksonissa 3 (M3) ei ollut mitään vaikutusta ekspression -50 kDa tuote (kuvio 3d, kaistat 2 vs. 4), kun taas mutaatio seuraavan ATG eksonissa 4 (M4a) kumosi se sekä p- ja M3 yhteydessä (kuvio 3D, kaistat 3 ja 5), ​​mikä osoittaa, että ERG-1b (ja ERG-1a) eivät käytä ensimmäinen lukukehyksessä ATG, kuten voidaan ennustaa jonka 5’cap riippuva skannaus malli käännöksen aloittamista [29]. Sen sijaan käyttö seuraavien ATG eksonissa 4 generoi peptidi identtinen koodaama T1: E4 fuusio. Sitä vastoin, kun aloituskodonin eksonissa 1 c on mutatoitu (M1C), ERG-1c liikkuvuus on vähentynyt ~54 kDa ja -50 kDa (kuvio 3D, kaistat 6 vs. 8), kuten T1: E4 ja ERG-1b- (kaista 1 ja 2), sopusoinnussa kytkin M4a ATG. Todellakin, mutaatio Tämän ATG johtaa kumoamisesta -50 kDa tuote kannattaa vielä pienemmän tuote.

Biologinen karakterisointi ERG isoformien

Sen arvioimiseksi, onko rakenteellinen N-terminaalista erot syöpään liittyvän ERG-1b /T1: E4 ja normaali ERG-1c vaikuttaa olennaisesti niiden biologista aktiivisuutta, me aluksi ekspressoida pysyvästi niiden vastaavien cDNA: iden NIH-3T3-soluissa (kuvio 4A) ja valitaan kloonit, joissa vahva ilmentyminen. Suostumuksella aikaisempien raporttien, havaitsimme edistäminen soluinvaasiota ja muuttoliike sekä ERG variantteja, analysoituna laajuisten hyvin maahanmuuton matrigeelin (kuva 4B) ja tyhjästä haava määritys (kuvio 4C-D). Laajuus vaikutuksen muuttoliikettä /invaasio oli verrattavissa ERG-1b ja ERG-1c osoittaa, että ne ovat samalla tavalla aktiivisia ainakin joitakin osa heidän biologian.

(A) NIH-3T3-soluissa stabiilisti ilmentävät korkean tason ERG-1b ja ERG-1c analysoitiin kuten kuviossa 3. (B-C) jälkeen lääkkeen valinta, ERG-yliekspressoivia klooneja (1b ja 1c), tyhjät-vektorisäätö (pLPC) ja käsittelemättömän NIH-3T3 solut (NT) analysoitiin niiden hyökkäystä potentiaaliset Matrigel invaasiomääritys (B), ja standardin haavan naarmu määritys mittaamaan niiden liikkuvuutta (C). (D) kvantifiointi (C), käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Pylväät osoittavat keskihajonnan. (E): n kasvu- käyrä NIH-3T3-stabiilien kloonien. Valinnan jälkeen solut kiinnitettiin 48 tunnin väliajoin aikana 8 päivää ja värjättiin kristallivioletilla. (F) jälkeen lääkkeen valinta, NIH-3T3 stabiileja klooneja maljattiin ja seerumia, ja solukuolema mitattiin trypansininen menetelmällä. (G) 5 päivää sen jälkeen, kun lääkkeen valinnan NIH-3T3, stabiilien kloonien värjättiin SA-β-galaktosidaasi. (H) kasvukäyrän IMR90 soluista jotka ilmentävät pysyvästi korkean tason ERG1b /T1: E4 tai tyhjän vektorin. Kuluttua lääkkeen valinta, solut kiinnitettiin 48 tunnin väliajoin aikana 8 päivää ja värjättiin kristallivioletilla. (I) 5 päivää sen jälkeen, kun lääkkeen valinnan IMR90, stabiilien kloonien värjättiin SA-β-galaktosidaasi. Punaiset nuolet osoittavat bi-tumallisia soluja. Kuvat ovat näkyvät B, C, G ja I.

Yllättäen ilmentyminen ERG varianttien tässä yhteydessä alensivat soluproliferaatiokokeessa (kuvio 4E). Tämä ei liittynyt solukuolemaan. Päinvastoin, ilmaus ERG-1b ja erityisesti ERG-1c johti suojaa solukuolemaa seuraavista seerumistarvaatio (kuvio 4F). Tämä ongelma saattaa heijastaa aktivaation onkogeenin riippuvaisen vanhenemista kaltainen tila ERG ilmaisu kuten aiemmin kuvattu muille onkogeenien [30]. Todellakin, ERG-ilmentäviä soluja, mutta ei valvontaa, värjättiin positiivinen vanhenemista biomarker (beta) galaktosidaasia (Kuva 4G). Kiehtoi Näistä tuloksista myöhemmin vakaasti yli-ilmentyy ERG-1b /T1: E4 isoformia ja vastaavan tyhjän vektorin normaalissa ihmisen fibroblastisolulinjan IMR90, hyvin tunnettu solu malli matkapuhelinjärjestelmän vanhenemista. Kuten NIH-3T3-soluissa, yli-ilmentyminen ERG-1b /T1: E4 isoformi lisännyt solujen kulkeutumista ja solujen invaasiota, (kuva S2). Lisäksi IMR90-solut yli-ilmentävät ERG-1b /T1: E4 isoformi osoitti vanhenemista-like fenotyyppejä, kuten solun proliferaation inhibitio (kuvio 4H), kertyminen bi-tumalliset solut ja kohonnut SA-β-gal-aktiivisuuden, klassinen biomarkkereiden vanhenemisen (kuva 4I).

Tämä tulos on erityisen jännittävä, kun otetaan huomioon se, että Vanheneminen on aktivoitu, kun solu on havainnut kriittisen tason vahinkoa tai toimintahäiriö, osoittaen kriittinen rooli ERG -1 b /T1: E4 yliekspressio alustavana johtava tapahtuma PCa. Lisäksi on tärkeää huomata, että solujen vanhenemista voidaan havaita aikaisen vaiheen ihmisen PCa näytteitä ja voivat laukaista akuutti menetys PTEN on p53-riippuvaisella tavalla hiiren PCa mallit [31], mikä viittaa siihen, että ERG aktivaatio saattaa johtaa alustava senescent fenotyyppi, joka vaatii myöhemmin ympäristö- tai geneettisistä muutoksista edetä maligniteetti.

ATG Context ja uORFs vaikuttaa ERG Translation Tehokkuus ja toiminnot

Tehokas käännetty eukaryoottisten mRNA: t vaativat optimaalisesti yhteydessä ympärille aloituskodonin, tukiin tunnistamalla se ribosomin (Kozak sekvenssi: GCCRCCATGG) [32]. Kuitenkin, tämä ei aina riitä selittämään käännös tehokkuutta. Esimerkiksi, vaikka ERG-1 a /b, ja T1: E4 on sama ATG eksonissa 4 (M4a) translaation aloittamiseen, niiden ekspressiotasot ovat erilaisia ​​(kuvio 3B kaistat 2,3, ja 5), ​​mikä viittaa rooli niiden erilaisten 5 ’ UTR. Itse asiassa, korvaaminen luonnon 5 ’UTR: t, joissa toinen sisältää konsensuksen Kozak (kuvio 5A-B) johti aktivointi ilmentymisen M3 ATG ERG-1b variantti, synteesin alun perin ennustettu 55 kDa: n peptidi (kuva 5C, kaistat 1-2). Tämä vahvistaa sen, että elementit 5’UTR ERG-1b estävät sen kääntäminen ja se sulkee pois että matalan ERG-1b (M3) runsaus johtuu luontainen epävakaus sen N-terminaalinen domeeni.

( A) natiivi 5’UTR ERG-1b, ERG-1 c ja T1: E4 korvattiin yhteisen yksi ekspressiovektorin (oranssi), ja optimoitu Kozak-sekvenssi. Vaihdetun ATGs ovat eksonissa 3 (M3), 1 c (M1C) ja 4 (M4a) (B) Context useita lukukehyksessä ATG käytetään aloituskodoneja erilaisissa ERG ja TMPRSS2: ERG variantit. Sekvenssi ympärillä ATG on kohdistettu konsensus Kozak, jonka tärkeänä säilytetty tehtävissä -3 (R) ja +4 (G) korostettu punaisella (laskemalla A + 1). Konteksti on arvioitu ”vahva” (S), jos molemmat asemat säilytetään, ja ”heikoksi” (W), jos ne eivät ole. Laajennettu analyysi ATGs että 5’UTR alueella ERG ja TMPRSS2: ERG on esitetty taulukossa S1. (C) WB analyysi variantit ja mutantit edustettuina (A). Parantaminen M3 yhteydessä suositaan sen käyttöön vuoden kulut M4a ATG. (D) uORFs jotka voisivat vaikuttaa käännös tehokkuutta ERG varianttien 5’UTR ERG-1b ja useita yhteisiä TMPRSS2: ERG variantit. Red punkit osoittavat ATGs, laatikot alla osoittavat oletetun uORF syntyy ja niiden kestot (piirustus ei mittakaavassa). Punainen laatikot osoittavat vahvaa ATG yhteyksissä ja vihreät heikot (määritelty (B)). Tarkempaa tietoa uORFs ovat taulukossa S1. (E) vaikutus itsenäisesti muuntuva uORFs ’ATG ERG-1b: mutaatio ensimmäisen ATG eksonissa 2 releases tukahduttaminen käännös- ja kasvaa tasojen ERG ATG eksonissa 4 (F) Expression of ERG ja TMPRSS2: ERG variantit . Täyspitkät cDNA: t varianttien, mukaan lukien koko 5’-UTR-alueet, ilmennettiin ja lysaatit transfektoitiin ohimenevästi HeLa-solut analysoitiin Western blotilla.

Upstream avointa lukukehystä (uORFs) ovat yleensä lyhyitä ORF: että alku sisällä 5’UTR, ovat pois runko tärkeimpien alavirran koodaavan sekvenssin ja voi vähentää ilmaisun [33], [34]. Vaikka mikään uORFs ovat läsnä ERG-1 c tai T1: E4, kolme uORFs olemassa ERG-1b 5’UTR- (kuvio 5D, ylhäällä), joka voisi häiritä tunnustamista ennustetun ATG ERG-1b (taulukko S1) . Kumoamisen uORF alkaen uM2a mutatoimalla ATG GCG lisännyt ERG-1b ilmentymistä (kuvio 5E, kaista 2), mikä osoittaa, että sitoutuminen skannauksen ribosomin ensimmäisen havainnut ATG, tuottaa lyhyen 29 aa uM2a peptidi, on rajoittava tekijä ERG-1b-ilmentymisen alavirran ATG.

läsnäolo uORFs voisi myös vastaavasti vaikuttaa ekspressiotasot eri androgeenin ajettu TMPRSS2: ERG-fuusioproteiineja, joissa prognostisia vaikutuksia, koska 5 ’heterogeenisyys fuusio liittyy erilaisia ​​kliinisiä tuloksia [19], [20]. Eri patologinen profiilit voi johtua muutoksista biologinen aktiivisuus riippuu ensisijaisesti proteiinisekvenssin tai eroista sen runsaus,

kautta

modulaatio käännös. Tällaiset vaihtelut voisi selittää, miten esimerkiksi T2: E4 fuusio liittyy aggressiivisemman fenotyypin [19], [20].

Sen tutkimiseksi, käännös hyötysuhde on merkitystä aktiivisuuden fuusio varianttien