Krooninen sairaus

tiivistelmä

XB130 on hiljattain tunnettu adapteri proteiini, joka oli raportoitu edistää kilpirauhasen kasvaimen kasvua, mutta sen rooli etenemistä muut syöpätyypit, kuten mahasyövän (GC) on edelleen tuntematon. Näin ollen tutkimme yhdistyksen välillä XB130 ilmaisun ja ennusteen GC potilaista. Tutkittavat olivat 411 potilaalla on GC vaiheittain I-IV. XB130 ilmentyminen tutkittiin kirurgisista näytteistä GC. Kaplan-Meier-analyysi ja Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin arvioimaan ennustetekijöiden merkitystä XB130 selviytymisen ja uusiutumisen. Lisäksi GC pysyvästi transfektoitujen solujen XB130 lyhyt hiusneula-RNA perustettiin analysoimaan vaikutuksen XB130 herkkyydestä kemoterapiaa. Tulokset osoittavat, että sekä XB130 mRNA ja proteiinin ilmentyminen oli havaittavissa normaaleissa mahan kudoksissa. Yleinen elinaika vaiheen IV potilaiden ja taudista vapaan ajan jälkeen radikaali resektio GC vaiheessa I-III potilaista oli huomattavasti lyhyempi, kun immunohistokemiallisella värjäyksellä XB130 oli alhainen kuin silloin värjäämällä oli korkea (sekä

p

Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 23 elokuu 2012

Copyright: © Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Program Key Basic Research Project (2012CB945100, WL ja YL), Team Program of Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (S2011030003134, WL ja YL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

onkogeenit ja anti-onkogeenien on tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen Mahasyöpää (GC), ja geneettinen heterogeenisyys on osoittautunut vaikuttaa ennustetta merkittävästi. Siksi metsästys uusia geenejä ja proteiineja, joilla mahdollisesti arvoa diagnostisia tai prognostisia työkaluja on tärkeää, ja kohdistaminen uusi oncogenes on toinen lupaava lähestymistapa syövän hoidossa.

XB130 on äskettäin tunnistettu sovitin proteiini, joka on voimakkaasti ilmaistu perna ja kilpirauhasen ihmisten, kun se osoittaa heikkoa ilmentymistä munuaisissa, aivoissa, keuhkoissa, ja haiman [1]. XB130 on havaittu follikulaarinen ja papillaarinen kilpirauhasen karsinooma, sekä ihmisen keuhkokarsinooma solulinjat [2]. Vaikka sen ilmentyminen väheni kilpirauhassyöpä, XB130 havaittiin olevan kasvain promoottori [2]. On raportoitu, että XB130 on paitsi rooli solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, liikkuvuuteen, ja hyökkäys [2], [3], [4], mutta on mukana myös signaalin siirtoon [1]. XB130 säätelee Rac ja solun tukirangan [3], ja se osallistuu aktivointi c-Src [1] ja fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitin [4], joka puolestaan ​​säätelevät cytoskeletal toiminto [3]. Nämä signalointipolkujen on myös osoitettu olevan keskeinen rooli kehityksen ja etenemisen GC [5], [6], [7]. Näin ollen voisi olla rooli XB130 GC liikaa. Kuitenkaan mitään tutkimusta tästä äskettäin löydetty sovitin proteiini on tehty alalla gastroenterologian toistaiseksi. Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että XB130 ilmaisu saattaa liittyä eloonjääminen ja /tai kasvaimen uusiutumisen sekä kanssa kemosensitiivisyys GC.

Tulokset

XB130 ilmentymistä normaaleissa mahan kudoksissa ja GC

Eri aiemmista selvityksistä, olemme vahvistaneet XB130 ilmentyy normaaleissa kudoksissa ihmisen maksan, paksusuolen, perna ja vatsa (kuva 1a). Immunohistokemia suoritettiin arvioimaan XB130 ilmentymistä kaikissa 411 paria parafiiniin upotetut leikkeet GC ja niiden vieressä ei-kasvainkudoksia. Olemme havainneet, että XB130 on ekspressoituu pääasiassa sytoplasmassa normaalissa mahalaukun kudosta, kun se oli merkittävästi vaimentua kudoksissa GC. Olemme edelleen luokitteli GC osaksi XB130 positiivisia (korkea ilmaisutapoja pisteet ≥3) ja negatiivit (matala ilmaisutapoja pisteet 3) jonka värjäyksen tulokset (kuva 1b). Ilmaantuvuus XB130 positiivisten ja negatiivisten vaiheen I-III GC ei ollut mitään eroa, mutta osa XB130 negatiivit oli korkeampi vaiheen IV ja leikkauksen jälkeisen uusiutumisen ryhmät (kuva 1c). Määrälliset mRNA taso XB130 havaittiin vaiheessa IV lievittävä resektion näytteitä ja vähensi pitkälle GC (kuvio 1 d). Vastaavasti, vähentää proteiinin ilmentymistä XB130 pitkälle GC varmennettiin myös Western blot (kuvio 1e).

(a) XB130 geeni ilmentyy ihmisen maksassa, pernassa, paksusuoli ja vatsa. (B) edustavat kuvat XB130 proteiinin immunovärjääminen GC kudosten ja viereisen ei-kasvainkudoksessa. (C) esiintymistiheys XB130-negatiivisten ja XB130-positiivisia GC vaiheittain I-III (n = 263) ja vaihe IV (n = 148). (D) Vaiheessa I-III GC jälkeen radikaali resektio, XB130 mRNA ilmaisu oli merkitsevästi pienempi kasvainkudoksessa kuin vastaavassa viereisten ei-kasvainkudoksessa kvantifioidaan fluoresenssi PCR

(p

0,01, n = 9 ryhmää kohti

)

. (E) Expression of XB130 proteiinin vaiheen I-III GC (T) on merkittävästi vähentynyt verrattuna normaalin mahalaukun kudoksesta (N) western-blottauksella (

p

0,01, n = 6 per ryhmä) . Näytteet (a), (d) ja (e) oli tuoreita kudoksissa potilailla, joilla on vaiheen I-III GC jotka saivat radikaaleja resektio leikkaus, kun taas näytteet (b) ja (c) olivat potilailta vaiheen I-IV GC kuvattu menetelmässä osiossa.

Alhainen ilmentyminen XB130 korreloi huonon ennusteen

analyysissä yleinen 411 tapausta GC vaiheessa I-IV, kumuloitunut eloonjäämisaste potilaiden jossa XB130 negatiivinen värjäytyminen oli merkittävästi pienempi kuin niitä, joilla positiivista värjäytymistä (kuva 2a). Potilailla, joilla on vaiheen IV GC, joka menetti leikkaus paranna mahdollisuutta, se osoitti huomattavasti alemman eloonjääntiaste XB130 negatiivinen ryhmässä (kuva 2b). Mediaani elinaika potilaiden pitkälle oli pidempi XB130 positiivisia ryhmässä kuin negatiivinen ryhmässä (16,7 vs. 8,5 kuukautta, HR negatiivisten ryhmässä oli 1,72, p = 0,011; taulukko 1). Niillä potilailla vaiheessa I-III GC jotka saivat radikaaleja resect leikkaus, taudista vapaa eloonjääminen XB130 positiivisia ryhmässä oli suurempi kuin negatiivinen (p 0,05; kuva 2c), kun taas keskimääräinen aika uusiutumisen oli 36 ja 24 kuukauden kohdalla positiivisen ja negatiivisen ryhmiä, vastaavasti (taulukko 1, HR negatiivisten potilaiden oli 1,2, p = 0.022). Nämä havainnot osoittavat, että alhainen ilmentyminen XB130 liittyy lyhyempi selviytymisen ja korkeampi uusiutumisen GC potilailla.

(a) Kaikissa 411 potilaalla on GC (vaiheet I-IV), kumulatiivinen eloonjäämisaste XB130- negatiivinen ryhmä oli merkittävästi pienempi kuin positiivisen ryhmän (

p

0,0001). (B) 148 potilasta, joilla on vaiheen IV GC, The XB130-negatiivinen ryhmä oli huomattavasti alhaisempi kumulatiivinen eloonjäämisaste kuin positiivinen ryhmä (

p

= 0,01). (C) Jos potilaalla on vaiheen I-III GC käsitelty radikaali resektio, kumulatiivinen taudista vapaa elinaika oli huomattavasti alhaisempi varten XB130-negatiivinen ryhmä kuin positiivinen ryhmä (

p

= 0,019).

Prognostic arvo muiden kliinis parametrien

Muutkin kliinis parametrien eloonjäämiseen ja tautivapaan elinajan oli lueteltu taulukossa 1 ja kuvassa 3. sen lisäksi, XB130, tulokset Kaplan-Meier selviytymisen funktioanalyysivalikko potilailla IV vaiheessa ryhmitellään tunnettuja tekijöitä, kuten syöpä -antigeeni (CEA) pitoisuus, ero aste, etäpesäke, vatsaonteloon sekä kemoterapiaa osoittivat merkittävää vaikutusta kumuloitunut selviytyminen (kuva 3 a-e ). Vuonna univariate Coxin regressioanalyysiä potilailla saivat radikaali hoito, olemme huomanneet, että vaihe oli myös merkittävä ennustetekijä varten uusiutuminen (taulukko 1).

Luvut on merkitty seuraavasti: kumulatiivinen potilaiden selviytymiseen GC kanssa ( a) Karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) ≤5 ug /L tai 5 mikrog /l, (b) eri ero (DIF.) asteen, (c) (M

1) tai ilman (M

0 ) etäpesäke, (d) kanssa tai ilman askitesta, (e) tai ilman kemoterapiaa.

monimuuttuja-analyysissä käyttäen Cox mallia, totesimme, että XB130, CEA, kemoterapiaa ja askites (kaikki p 0.01) olivat riippumattomia tekijöitä ennustaa HR kuolemalle potilailla vaiheessa IV, kun taas XB130 (p = 0,044) ja vaihe (p 0,000) olivat riippumattomia tekijöitä ennustaa HR uusiutumisen jälkeen radikaali resektio GC potilailla vaiheessa I-III (taulukko 2).

Chemotherapeutics herkkyys vastauksena XB130 hiljentäminen

jotta selvittää terapeuttista potentiaalia kohdistaminen XB130, arvioimme solujen elinkelpoisuutta sh-XB130 vastauksena 5-FU, sisplatiini ja irinotekaani. Solun elinkelpoisuuden sh-XB130 ja villityypin ryhmät sekä vaimentaa kaikki kolme kemoterapeuttisten aineiden annoksesta riippuvaisella tavalla. Vastaavasti, vertaa sh-XB130, villityyppisen valvonta osoitti herkempi 5-FU ilmenee merkittävä alempi solujen elinkykyä (kuva 4a), kun taas sisplatiinia (kuvio 4b) ja irinotekaanin (kuvio 4c) on osoitettu olevan tehokkaampi SH- XB130 ryhmässä kuin villityypin kontrolli.

(a) solut altistettiin 5-FU osoittivat parempaa elinkelpoisuus sh-XB130 ryhmässä kuin ryntäily ryhmässä (n = 3-4 kussakin pitoisuudessa kussakin ryhmässä). (B) Solujen elinkelpoisuus on sh-XB130 ryhmä on vähentää dramaattisesti altistumista sisplatiinin (n = 5-10 kutakin pitoisuutta kussakin ryhmässä). (C) Irinotekaani myös vähensi solujen elinkelpoisuuden sh-XB130 (n = 3-4 kussakin pitoisuudessa kussakin ryhmässä).

*

p

0,05,

†

p

0,01,

‡

p

0,001 vs. villityyppisoluilla vastaavana pitoisuutena. (D) XB130-negatiivinen potilailla oli merkitsevästi vähemmän eloonjäämisaste, kun käsitellään 5-FU (Fu = 1).

Survival analyysi GC saavilla potilailla 5-FU-hoidon

Lajittelu by XB130 negatiivisia ja positiivisia, arvioimme 5-FU-hoidon vaiheessa IV GC potilaista retrospektiivinen tutkimus. Käsitelty 5-FU, potilailla, joilla on XB130 positiivista värjäytymistä nauttia suhteellisen korkea eloonjäämisaste kuin negatiivinen ryhmä (kuvio 4d). Vastaavasti XB130 positiiviset 5-FU-hoidon ollut enää mediaani elinaika (kuvio 4d). Koska oli vähän potilaita sisplatiinia tai irinotekaania vaikutus XB130 ekspressiotason kliinisiin terapeuttisia vaikutuksia ei verrattu nykyisessä tutkimuksessa.

Keskustelu

XB130 on äskettäin kloonattu 130 kDa-sovitin proteiinia ja on raportoitu pääasiassa ilmaistaan ​​kilpirauhanen ja perna kudosten validoitu northern blot ja sillä on monimuotoinen rooli solujen selviytymistä, proliferaatiota, invaasio kilpirauhasen kasvain [2], [3], [4], mutta sen mRNA ja proteiinin ilmentymistä muissa kudoksissa ei ole vahvistettu reaaliaikainen PCR, western blot tai immunohistokemia. Tässä artikkelissa, me ensinnäkin antoi todisteita siitä, että XB130 mRNA ja proteiini myös konstitutiivisesti normaalissa mahalaukun kudosten ja suhteellisesti pienempi ilmaisun GC soluissa. Nämä havainnot ovat ristiriidassa aikaisempien raporttien että XB130 mRNA oli tuskin havaittavissa muissa kudoksissa paitsi kilpirauhasen ja pernan [1], [4], osittain koska ne vain käytetään Northern blot vahvistusta. XB130 ilmentyminen on vähentynyt kilpirauhasen kasvain, mutta se on täysin epäselvää, onko XB130 on ennusteen biomarkkeri muiden pahanlaatuisten kasvainten, kuten mahasyövän (GC) [2]. Sen varmistamiseksi, että XB130 osallistuu GC etenemistä, meillä oli analysoida selviytymisen tai toistumisen 411 potilaalla on GC ja totesi, että XB130 heikkoa ilmentymistä ennusti alempaa selviytymisen ja korkeampi toistumisen. Lisäksi kemoterapeuttisia herkkyys perustaen XB130 lauseke arvioitiin ensimmäistä kertaa, ja solujen kokeita ja kliinisiä retrospektiivinen tutkimus osoitti, että downregulation XB130 kasvaa lääkeaineen herkkyyttä sisplatiinin ja irinotekaanin ja vähentää huumeiden herkkyys 5-fluorourasiilin kanssa.

Koska syöpää aiheuttava aiemmissa raporteissa [2], [8], [9], XB130 olisi pidettävä onkogeenisessä muuta kuin kasvaimen esti proteiini, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan testata onko myös tapaus GC. Sitten, miten selittää kliinistä merkitystä kliinisen havainnon, että XB130 downregulation ennustaa alhainen eloonjäämisaste pitkälle GC ja uusii saavilla potilailla radikaali resektio leikkauksen? Itse asiassa on tunnettua, että kasvaimien synnyn voi johtua muutoksia useiden geenien ja proteiinien, kun taas XB130, sovitin-proteiini, joissa on enemmän kuin yksi funktionaalinen domeeni, voidaan vaikuttaa useita ylävirtaan ja alavirtaan tekijät. Siksi on ennenaikaista arvioida, onko geeni tai proteiini ei kasvaimia synnyttävän vai ei pelkästään sen pohjalta sen ilmentymistä kliinisissä näytteissä, vaikka jälkimmäinen ei vihjaavat joitakin johtolankoja. Oikeastaan ​​downregulation XB130 GC voidaan pitää hyvitysjärjestelyjä, koska jotkut tuumorisuppressorit olisi saatava liikkeelle vastustamaan XB130 etenemisen aikana GC. Samoin todettiin, että kasvain p53 ilmentymistä oli suurempi huonosti erilaistunut GC kuin hyvin erilaistuneet [10], kun taas alussa mahasyövistä heikosti apoptoosin, lisääntynyt ilmentyminen Bcl-2 ja p53 oli todennäköisempää edistää etäpesäkkeiden [11], [12].

XB130 voi olla esikasvaintekijän, joka säilyttää normaalissa kudoksessa. Tällaiset esikasvaintekijät voi osaltaan ylläpitää fyysistä toimintoja solujen uusiutumista ja ylöspäin muuttoliike normaalissa vatsaan. Samaan aikaan, on toinen joukko säännellä geenejä, jotka estävät normaalin solun liiallinen proliferaatio ja metaplasiaa. Kuitenkin, kun probioottien tasapaino disequilibrated, solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden on käsistä siten johtaa syövän synnyn [13]. Tämä klassinen teoria esikasvaintekijän voi antaa hyväksyttävää selitystä miksi normaali kudos näin suuri XB130 ilmaisu vielä ”terve”. Tiedetään, että monet geenit ja signalointireitteihin pelata pro-onkogeenisiä tai anti-onkogeenisten roolit on kontekstisidonnaisia ​​tavalla, joten se ei ole harvinaista, että sama geeni voi käyttää erilaista vaikutusta eri vaiheissa tai eri kudosten syöpien kehitystä [ ,,,0],14], [15], [16]. Esillä olevassa tutkimuksessa, vaikka emme puututa toiminnot XB130 normaalissa mahan kudoksessa, tämä aihe on mielenkiintoinen myös ja tarvitsevat lisätutkimuksia.

Jos XB130 ekspressiokuviota voi toimia korvikemarkkerina ennakoivaa kemoterapiaa vastaus, se tarjoaisi myös selitys ennusteeseen. Tällä hetkellä fluoropyrimidiinijohdannaiselta-pohjainen ja platinayhdisteenä perustuva yhdistelmä hoito on hyväksytty tavanomainen ensisijaisena hoitona GC [17], kun taas irinotekaani, topoisomeraasi I: n estäjä, käytetään toisena hoitona [18], ja sisplatiini on suurelta osin käytetty hoidossa edennyt, leikkaushoitoon GC [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kemoterapeuttinen-herkkyys tutkimukset perustaen XB130 ilmentymisen tasolla tehtiin. GC soluissa, XB130 knockdown osoitti parempaa reagointikykyä sisplatiini ja irinotekaani, mutta vähemmän herkkä 5-FU. Meidän kliiniset tiedot osoittivat lyhyemmän eloonjäämisaste kerran 5-FU-hoitoa saaneilla potilailla, joilla on alhainen ilmaus XB130, mikä viittaa siihen, että XB130 downregulation vähentää reagointikykyä 5-FU, joka voi olla toinen selitys huonon ennusteen potilailla, joilla on alhainen ilmaus XB130 tässä tutkimuksessa. Meidän havainnot GC solulinjassa sotkea että pitkälle GC, joista suurin osa on esillä on XB130 heikkoa ilmentymistä, voivat hyötyä enemmän sisplatiini ja irinotekaani muut kuin 5-FU. Koska heterogeeninen genomista tausta kuten eri ilmentymistä XB130 GC, on mahdollista, että jotkut seurauksiin hyötyä irinotekaanin ja /tai sisplatiinia kuin se ehdotettu meidän solujen kokeilu, ja kannattaa lisätutkimuksia varten. Edelleen mahdollinen tutkimukset voivat selvittää XB130 ilmaisua kuvioita voidaan käyttää auttamaan kerrostuvat potilaita eri multimodaalinen hoito-ohjelmille.

Yhteenvetona tämänhetkisiin tutkimus on antanut ensimmäiset todisteet että XB130 olemassaolon mahalaukun kudosten ja GC ensimmäistä kertaa . Olemme varmistaneet, että kemoterapia-herkkyys arviointi Perustamalla XB130 ilmentyminen ensiksi suunnattu, mikä osoittaa, että XB130 heikkoa ilmentymistä potilaat saattavat olla herkkiä sisplatiini ja irinotekaani, mutta vanhempi todisteita vaatii. Kliininen mahdollisille Tämän tutkimuksen sisältää (1) XB130 voivat toimia GC ennustetekijöitä biomarkkerina sen heikkoa ilmentymistä syytetään epäsuotuisia tuloksia; (2) Koska XB130 alhainen ilmaistuna GC reagoivat sisplatiinin ja irinotekaanin ylivoimainen 5-fluorourasiilin meidän kemoterapeuttisten herkkyyden tutkimus, arviointi XB130 ilmentyminen voi auttaa ohjaamaan kliinistä lääkityksen GC.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat ja kudosnäytteiden

Kaikki 411 potilasta histologisesti diagnosoitu Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kiina) vuodesta 2000 vuoteen 2011. Kasvaimen vaiheessa määriteltiin mukaan 7. painos AJCC syöpä lavastus käsikirja 2010. näytteitä diagnoosia varten otettu suostumuksella kustakin potilaasta. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Nanfang sairaala, Southern Medical University. Keskimääräinen seuranta-ajan kaikille potilaille oli 59,5 (95% CI: 55,5-63,5) kuukautta. Kliiniset ominaisuudet ja XB130 ilmaus kaikki GC potilailla on kuvattu taulukossa 1. Potilaat I-III vaiheessa GC suoritettiin radikaali resektio, kun taas potilailla, joilla on vaiheen IV sai lievittävä toimintaa.

Ennen immunohistokemia analyysi, parafinoidut ensisijainen kudosnäytteet leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä, ja asetettiin lasilevyille. Yhdeksän paria kasvain ja syövän läheisen normaaleissa kudoksissa vaiheesta IV GC potilaat satunnaistettiin kerättiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR ja kuusi paria western blot analyysiä.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttämällä Dako Kuvitella System (Dako, Carpinteria, CA) ja kanin anti-XB130 Ab (1:100; Abnove) seuraten valmistajan suosittelemaa menetelmää. Sillä XB130 arviointi, kudosleikkeestä skannattiin kokonaan määrittää tulokset. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (medium), tai 3 (voimakas). Laajuus värjäytyminen pisteytettiin 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), tai 4 (76% -100%), mukaan prosenttiosuudet positiivisesti värjättyä alueilla suhteessa koko karsinooma alueella (tai koko osio normaalia näytettä). Summa värjäytymisen voimakkuus ja laajuus tulokset käytettiin lopullisessa värjäyksen tulokset (0-7) ja XB130. Varten selviytymisen arviointi, kasvaimet, joissa lopullinen värjäys pistemäärä ≥3 katsottiin olevan positiivinen. XB130 immunovärjäyksellä arvioitiin itsenäisesti kaksi yksilöä sokkoutettu kliinisten parametrien.

Fluoresenssi kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Käänteinen transkriptio cDNA: n jälkeen saatu iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA tiedot esitettiin suhteessa taloudenhoito geeni β-aktiini käyttäen ΔΔCt menetelmällä. Rutiini PCR suoritettiin myös ekspression tutkimiseksi XB130 eri elinten ihmisen ja hiiren (alukesekvenssit taulukossa S1).

Western blotting

Kudokset pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ( PBS) ja lysoitiin proteiinin hajotuspuskuria 30 min. Sentrifugointi suoritettiin, ja proteiinia sisältävä supernatantti säilytettiin. Proteiini lysaatit erotettiin electrophorectically 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA). Sitten, immunoblottaus suoritettiin käyttämällä kanin anti-XB130-vasta-ainetta (PradoWalnut, CA, USA) ja β-aktiini (Santa Cruz, CA). Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi-menetelmällä (Amersham), jossa on western blotting tunnistusjärjestelmä (Kodak Digital Science, Rochester, NY, USA) ja kvantitoitiin Image ohjelmisto QuantityOne v4.6.2.

Soluviljely

Solut SGC7901 solulinja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Hyclone)]. Stabiilisti transfektoidut solut ylläpidettiin median läsnäolon kanssa puromysiinin (Sigma-Aldrich). Soluja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Vakaasti-transfektoituja solulinjoja laitoksessa

kolme eri shRNA sekvenssit XB130 kloonattiin pSuper-Rretro-puromysiini plasmidi restriktioentsyymillä Bgl II, Hind III (New England Biolabs) ja T4-DNA-ligaasia (Takara). Sekä pSuper-Rretro-puro-shXB130 ja pSuper-Rretro-puro rakennettiin. pSuper-Rretro-puromysiini-shXB130 yhdistettynä pakkaus plasmidivektori tai sekoituskoodin vektori negatiivisena kontrollina pakattiin virus käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää. SGC7901 solut transfektoitiin shRNA plasmideilla käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), toistettiin kolme kertaa. Soluja viljeltiin, kuten edellä mainittiin, ja yksittäiset pesäkkeet valittiin western-blottauksella ja fluoresenssia kvantitatiivisella PCR: llä ja käytetään edelleen kokeita. Kolme shRNA kohdistaminen XB130 ja yksi scramble suunniteltiin (taulukko S2). Sekä mRNA ja proteiini ilmentymistä XB130 (alukesekvenssin taulukossa S1, ilmaisun tulokset kuvassa S1A, B) vahvistettiin reaaliaikainen PCR ja western blot. Adenovirusinfektion tehokkuus oli osoitti kuviossa S1C ja D.

Solujen elinkelpoisuus analyysi

trypsinoitiin ja ympättiin 96-kuoppalevyille alkutiheydellä 0,2 x 10

4 /kuoppa, solut viljellään ja havaittiin 1, 3, 5 ja 7 päivää. Solujen elinkyky määritettiin metyyli thiazolyltetrazolium (MTT) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä, jossa on 655 nm, kun viittaus aallonpituus. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Chemotherapeutics-herkkyyden arviointi GC soluissa

Solut Villityypin ohjaus ja sh-XB130 viljeltiin keskipitkällä 5-fluorourasiilin (5-FU), sisplatiinin tai irinotekaanin eri pitoisuuksilla. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solujen elinkelpoisuus arvioitiin.

Tilastollinen analyysi

Tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM tai mediaani. Chi-neliö testi kategorinen muuttujien ja Studentin t-testi jatkuvien muuttujien käytettiin. Survival ja uusiutuminen laskettiin Kaplan-Meier-menetelmällä. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin klo

p

arvo on alle 0,05.

tukeminen Information

Kuva S1.

validointi geenien vaikutus pienten hiusneula-RNA: t XB130 (sh-XB130) ja tartunnan tehokkuutta adenoviruksen. XB130 vaimentua solut linja malleja varmistettiin reaaliaikainen PCR (a) ja Western blot (b). Solut transfektoitiin scramble vektori toimi negatiivisena kontrollina ja ei-transfektoituja MOCK kontrollina. Tartunnan tehokkuus adenoviruksen 293FT viljellyissä soluissa varmistettiin normaali (c) ja fluoresenssi (d) microscopies. Inset A on vahvistus käyrä reaaliaikaisen PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0041660.s001

(PPT) B Taulukko S1.

Alukesekvenssit reaaliaikainen tai rutiini PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041660.s002

(DOC) B Taulukko S2.

XB130 Sh-RNA-sekvenssejä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041660.s003

(DOC) B