Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ainoa hoitovaihtoehtoja, että on olemassa okasolusyöpä keuhkosyöpä (SCC) ovat vakiona säteilyn solunsalpaajahoitoa. Syöpä kantasolut (CSCS) on arveltu tilille terapeuttiseen vastus, mikä viittaa siihen, että CSCS on erityisesti suunnattu. Täällä analysoimme transcriptome CSC ja ei-CSC alapopulaatiot RNA-seq tunnistamaan uusia potentiaalisia terapeuttisia strategioita SCC.

Methods

lajitellaan SCC osaksi CD133- ja CD133 + -alapopulaatioiksi ja sitten tarkasteltiin sekä kopiomäärä analyysi (CNA) ja koko genomin ja transcriptome sekvensointi. Analysoimme Cancer Genome Atlas (TCGA) transcriptome data 221 SCC määrittää yleisyyttä havaintojemme.

Tulokset

Molemmat osapopulaatioiden erittäin ilmaisseet lukuisia mRNA isoformeja, joiden proteiini tuotteet ovat aktiivista lääkettä tavoitteet muut syövät; 31 (25%) vastaavat 18 geenejä aktiivisesti tutkintaan mAb tavoitteet ja lisäksi 4 (3%) on terapeuttista etua. Lisäksi olemme löytäneet todisteita siitä, että molemmat osapopulaatioiden olivat proliferatively vetämänä hyvin korkea c-Myc ja TRAIL pitkä isoformin (TRAIL

L) ja että normaali apoptoottista vastauksia korkea näiden geenien ilmentymistä estyi läpi korkeat Mcl- 1

L ja Bcl-x

L ja c-Flip

L-isoformeja, joille lääkkeet ovat nyt kliinisessä kehityksessä. SCC RNA-seq data (n = 221) välillä TCGA tukivat havaintoja. Analyysimme on ristiriidassa CSC konseptin, että useimmat solut syöpä ovat menettäneet proliferaatiopotentiaali. Lisäksi meidän tutkimus viittaa siihen, miten kohdistaa sekä CSC ja ei-CSC osapopulaatioiden yhdellä hoitostrategia.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme on merkitystä SCC erityisesti se esittää lukuisia mahdollisia vaihtoehtoja standardin hoito, joka kohdistaa koko kasvain. Näin se osoittaa, miten transcriptome sekvensointi tarjoaa oivalluksia molekyylitasolla perustan syövän etenevän soluja, jotka, tärkeintä, voidaan hyödyntää tunnistamaan uusia potentiaalisia terapeuttisia vaihtoehtoja syövät sitä, mikä on mahdollista DNA-sekvensoinnilla.

Citation: Barrett CL, Schwab RB, Jung H, Crain B, Goff DJ, Jamieson CHM, et al. (2013) transcriptome sekvensointi Kasvain alapopulaatioita paljastaa Taajuudet terapeuttinen Vaihtoehdot Okasolusyöpä Lung Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58714. doi: 10,1371 /journal.pone.0058714

Editor: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 17. lokakuuta 2012 Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 20 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Barrett et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Center for Translational tiedepalkinto (UL1RR031980 ja UL1TR000100) National Center for Research Resources, kolme apurahat (1R21CA152613-01, 1R21CA155615-01A1, CA69375) National Cancer Institute, neljä avustuksia California Institute regeneratiivisen hoidon (CL1-00502, RT1-01108, TR1-01250, TR2-01789) ja avustusta National Institute of Allergy and Infectious Diseases (P30 AI036214). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä osuus 28% kaikista syöpäkuolemista-korkein osa syövistä [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus ~85-90% keuhkosyövässä, joista adenokarsinooma ja okasolusyöpä ovat yleisimpiä alatyyppejä [1]. Vaikka ylöspäin 70% NSCLC potilaista on edennyt sairaus, joka on harvoin parannettavissa, kun todetaan, uusia ennakoiden subsets keuhkojen adenokarsinooman että satama EGFR mutaatioita tai EML4-ALK geenifuusioissa kannustaa kehittämään kohdennettuja hoitoja, jotka voivat muuttaa tätä vaikeaan tilanteeseen [2] . Nämä geneettiset muutokset tapahtuvat pääosin adenokarsinoomissa potilaiden koskaan tupakoineet, ja ovat harvinaisia ​​SCC joka on pääasiallisesti liittyy tupakoinnin [3] – [5]. Vaikka FGFR1 [6] ja DDR2 [7] ovat äskettäin nousseet mahdollisia terapeuttisia kohteita joidenkin SCC potilaille, inhibiittorit eivät ole vielä saavuttaneet kliinisissä tutkimuksissa. Viimeaikaiset NSCLC suurikapasiteettisten sekvensointi tutkimuksia ensisijaisesti keskittynyt DNA-analyysi ovat osoittaneet, että harvat geenit mutatoitunut riittävän korkealla taajuudella olevan käyttökelpoisia täsmähoitoihin; mutta nämä tutkimukset eivät ennustaa DNA muutoksia, jotka ovat usein ryhmittyneet rajoitettu määrä tärkeitä molekyyli polkuja viittaa siihen, että kohdentamalla reitit saattavat olla kannattava terapeuttinen strategia [8] – [12]. Deep transcriptome (RNA-seq) profilointi NSCLC geenien tunnistamiseen säätelemättömään lauseke, joka on yhteinen välinen kasvaimia ei ole vielä raportoitu, vaikka tällaiset raportit on oletaa suuren RNA-seq aineistot on tuotettu TCGA [13] ja muiden yhteenliittymiä.

Syöpäsolut sisällä yksittäisen kasvaimen olemassa selvä fenotyypin todetaan, että usein esiintyy merkittäviä toiminnallisia eroja. Alapopulaation solut itseuudistuvien ja kasvaimen aloittamisen ominaisuuksia, kutsutaan yleisesti syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCS), on tunnistettu eri kasvaintyypeissä, mukaan lukien NSCLC [14]. Asennus todisteet osoittavat, että CSCS ovat vastustuskykyisiä syöpähoitoihin ja taustalla etäpesäke [15], [16], ja siten ovat ensisijaisen syöpäsolun tyyppi vastaa uusiutumisen ja etenemistä pahanlaatuisia kasvaimia. Välitön seuraus on se, että kohdistamalla CSCS pitäisi olla mahdollista hävittää lääkeaineille ja metastaattisen alaryhmästä syövän [14]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CSC fenotyyppi on muovia, ja ne voidaan rekonstituoida muita kuin CSC, kasvainsoluja [17], [18]; Näin ei vain CSCS vaan kaikki kasvain osapopulaatioiden jotka ovat ”potentiaalisia CSCS” on kohdistettava. Transcriptome sekvensointi CSC ja ei-CSC osajoukkojen NSCLC antaisi oivalluksia molekyylitasolla taustalla niiden fenotyyppisten yhtäläisyydet ja erot sekä helpottaa tunnistamista uusia terapeuttisia kohteita. Tällainen analyysi on tärkeä ja välttämätön täydennys suurimman kasvaimen transcriptome profilointia ollessa suoritettu TCGA ym.

havainnot, että ei-CSCS voi muodostaa uudelleen CSCS, ja päinvastoin, viittaavat siihen, että fenotyyppisen erot näiden -alapopulaatioiksi johtuvat epigeneettiset sijaan geneettisiä eroja. Siksi exome ja Genomikartoituksen kokeita, joilla pyritään tunnistamaan somaattiset mutaatiot ei odoteta paljastaa eroja lajitellut CSC ja ei-CSC osapopulaatioiden. Toisaalta, transcriptome profilointi, joka on lukeman epigenome (ts histonimerkkien ja DNA: n metylaatio, jotka säätelevät ilmentymistä), pitäisi olla erinomainen menetelmä profiloinnin CSCS ja ei-CSCS paljastaa mekanistisen eroja. Etuna RNA-seq datan mikrosiruja on kyky analysoida isoformin ilmentyminen eroja [19]. Syöpäsoluissa, vaihtoehtoisia mRNA isoformit voivat tuottaa proteiini-isoformit hallitseva negatiivinen aktiivisuus. Patogeeninen rooli syövän erityinen isoformit on laajasti osoitettu, kaikilla osa solujen fysiologiaa, mukaan lukien soluadheesion ja etäpesäkkeiden (CD44 ja RON), solujen kasvua ja kasvaimen kehittymisen (PKM2, MDM2, FGFR2, CRK, NRON), solusyklin (PYK ), angiogeneesi (VEGF), apoptoosin (GS3KB, CD95, Bcl-X, kaspaasi-2, kaspaasi-9), aineenvaihdunta (PK), ja lääkeresistenssin (AR ja MRP-1) [20] – [24]. Nämä esimerkit korostavat etu isomuodon tason transcriptome informaatiota koko geenin ilmentymisen saamassa oivalluksia molekyylitason mekanismit CSC ja ei-CSC fenotyyppisiä eroja.

Kirjoittajat raportoivat genomiikan teknologiaa on SCC ksenografti joka on järjestetty osaksi CSC ja ei-CSC alapopulaatioita perustuu CD133 markkeri (kuvio 1). CD133 (PROM1, Prominin-1) on 5-transmembraaninen glykoproteiini, joka pidetään merkkiaine alapopulaatio CSCS sekä alatyyppejä NSCLC [15], [25] – [27]. NSCLC CD133 + alapopulaatio on osoitettu olevan suurempi Tuumorigeenisuustutkimuksissa SCID-hiirissä, ilmaista korkeampi stemness geenien ja olla vastustuskykyisiä tavanomaisen kemoterapian kuin CD133- alaryhmästä [15]. Tärkeää on, että SCC ksenograftissa olisi edustava primaarituumorin, se oli suoraan Siirto tehty kuten jauhelihaa primaarikasvaimen osaksi NSG hiirillä ja ei koskaan kasvatettiin

in vitro

. Koko genomin DNA-analyysi osoitti, että kromosomit CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi olivat erittäin häiriintynyt hyvin samalla tavalla; kuitenkin odotetusti kasvainta ei satama kliinisen toiminnan mutaatioita. Analyysi mRNA jatkos isoformin ilmentyminen profiilit CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi johti tunnistamiseen SCC mahdollisena uusi osoitus lukuisia lääkkeitä parhaillaan ja ehdottaa useita muita uusia lupaavia kohteita. Lopuksi analyysi Cancer Genome Atlas (TCGA) julkisesti saatavilla transcriptome RNA-seq tietoja 221 SCC [28] tuetaan yleispätevyyttä meidän transcriptome havaintoja tähän tautiin. Kaikkiaan meidän tutkimus osoittaa kyky transcriptome sekvensointi Lajiteltujen syövän solualapopulaatioiden ilmoittaa kliinistä kehitystä tavoilla, jotka eivät ole mahdollisia DNA-sekvensoinnilla.

lajiteltu ihmisen tuumorisolujen okasolusyöpä keuhkosyöpä ksenografti- osaksi CD133 + ja CD133- osapopulaatioiden. Sitten suoritetaan CNA-analyysillä käyttäen genotyypin paneelit perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) sekä niin CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi. Vertasimme genomit on CD133 + väestön ja PBMC näytteen tunnistamiseen somaattisten mutaatioiden. Lopuksi suoritetaan koko transcriptome sekvensointi (RNA-kohdat) on CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi arvioida niiden mRNA isoformin ilmentyminen eroja ja yhtäläisyyksiä.

Methods

ksenografti

UCSD Human Research Suojaukset Program Institutional Review Board (IRB) hyväksyi tutkimus ennen tutkimusta liittyvää toimintaa. Kaikki eläinkokeiden menettelyjä noudatettiin Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) ja hyväksyi ne Pfizer globaalin tutkimus- ja tuotekehityksen Institutional Animal Care ja käyttö komitea. 75-vuotta vanha mies, jolla on 30-pack-vuotisen historian tupakoinnin ja muuten löytyy keuhko- kyhmy kirjallisia dokumentoitu suostumus mukaan tämä IRB hyväksytyn tutkimussuunnitelman ennen leikkausta. Resektio paljasti T1 kohtuullisesti erilaistunut okasolusyöpä. Osa hänen resektoidun tuoretta kasvain otettiin ksenografti osaksi NSG (tarkka kanta nimi NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ) hiiriä (The Jackson Laboratory). Myöhemmät kohdat tehtiin CB17.Cg-PrkdcscidLystbg /Crl hiiriä Charles River. Jauhettu tuore kasvain sekoitettiin matrigeelin (BD Biosciences) ja asetettu ihon alle. Hiiriä tarkkailtiin kunnes palpoitavissa kasvaimet kasvoivat ja nämä kerättiin sarja- istutusta ja tutkimus. Kahden vuoden seurannan kohteena jäi ilman kliinisiä tai röntgenkuvissa nähtävien uusiutumisen.

n eristäminen RNA ja DNA

lysaatit päässä CD133- /EpCAM + ja CD133 + /EpCAM + lajiteltu näytteitä prosessoitiin RNA ja DNA: n eristys käyttämällä Qiagen All Prep Mini Kit (Valencia, CA). Näytteet käsiteltiin valmistajan suositusten mukaisesti. Enintään neljä tilavuudet lastata yhteen RNeasy Mini Spin sarakkeeseen. Yhteensä RNA-näytteet arvioitiin puhtauden ja pitoisuuden käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer klo GeneChip- Microarray Core.

RNA sekvensoinnilla

kokonais-RNA sekä CD133- /EpCAM + ja CD133 + /EpCAM + kasvaimen -alapopulaatioiksi ( ~230 ng kutakin) käytettiin tuottamaan koko transcriptome kirjastot sekvensointia kiinteälle alustalle seuraavien valmistajan suosituksesta (Life Technologies, Carlsbad CA, USA). RNA-näytteet pilkottiin RNAasi III ja konsentroitiin käyttämällä RiboMinus pitoisuus Module (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). RNA-fragmentit ligoitiin Solid sovitin seokset ja käänteinen transkriptio suoritettiin. Puhdistettu cDNA valikoitiin koon (150-250 bp) käyttämällä MinElute PCR-puhdistuskittiä (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), ja monistettiin sitten 15 sykliä käyttäen kiinteän 3 ’ja KIINTEIDEN 5’ alukkeita. Amplified cDNA puhdistettiin käyttäen PureLink PCR-Micro (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), QC’ed jonka Bioanalyzer 2100 DNA 1000-kittiä (Agilent, Santa Clara, CA, USA), ja niiden määrä käyttäen Qubit 2,0-fluorometri (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Koko transcriptome kirjastoja käytettiin tekemään Solid malleihin helmiä seuraavan kiinteän Mallipohjiin Bead valmistautumisopas ja sekvensoitiin käyttämällä 50 x 25 pariksi-end-protokollaa, kunkin näytteen tuottaa yli 500 M lukea paria näytettä kohti.

Computational analyysi RNA-seq data

transcriptome sekvensointi CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi tuotti 529 M ja 531 M 50 x 25 lukea paria, vastaavasti. Ensin linjassa koko transcriptome pariksi lopussa lukee rRNA ja tRNA geenit käyttäen versiota 0.6.4 f bfast + bwa [29] ja säilytti ainoastaan ​​ne parit, joissa ei luettu oli kohdistettu, jolloin tietokokonaisuuksia sisältää 77 M ja 79 M lukea paria. Sitten linjassa jokaisen sarjan säilytettyjen luetaan pareittain bfast + bwa muokattuun kuin tarpeeton tietokanta mRNA isomuotojen rakennettava ”cuffcompare” -ohjelman versiosta 0.9.3 on Cufflinks ohjelmistopaketti (79) ja kaikki isoformin mallien RefSeq [30], UCSC tunnettuja geenejä [31], ja Ensembl [32] tietokantoja. Me seuraavaksi muuntaa luetun linjaus koordinaatit mRNA isoformit tietokannan hg19 genomista koordinaattien avulla skripti. Näistä rinnastukset me lasketaan ilmaisun ja differentiaalikaavojen tilastojen kanssa ”kalvosinnapit” ja ”cuffdiff” ohjelmat kalvosinnapit, vastaavasti. Jos molempia ohjelmia käytimme yläkvartiili normalisointi ja hg19 ihmisen genomin referenssijaksoa bias korjaus. Olemme laskettu, että 13612-geenit ja 43120-geenin isoformeja oli joitakin ei-nolla-ilmentymisen taso on ainakin yksi kahdesta alapopulaatioiden. Kuva S1 Information S1 esittää histogrammin näistä esisuodatettu isoformi ilmentymisen arvot molemmissa solualipopulaatioissa. Suurin osa näistä tapauksista johtui lukea kartoitus melua tai ”vuotavat” geenien ilmentyminen, joka on tuntematonta fysiologista merkitystä [33], joten haimme vähintään ilmaisun ja lukea kattavuus kriteerit ( 1 FPKM ja 60%: n peitto), jolloin saatiin alustava isoformi ilmaus arvioi kahden alapopulaatioiden. Havaitsimme, että 3844-geenien 7558 mRNA isomuotoja täytti minimikriteeriä. Olevan erittäin luottavainen ilme ja differentiaalikaavojen tuloksia, haimme tiukkoja suodatus alkuperäiseen isoformin ilmentyminen arvioista; rajoitimme analyysimme mRNA isoformit, jotka ilmaistiin tasolla vähintään 30 FPKM yhdessä alapopulaatioiden ja jotka kuuluivat vähintään 60% niiden pituudesta sekvensoimalla lukee. Lisäksi sellaisilta isomuotoa kutsua differentiaalisesti ilmaisi, sen differentiaalikaavojen oli kutsuttava merkittävää klo FDR 0,01 ja muuttuneen vähintään nelinkertainen kahden osapopulaatioiden. Näiden perusteiden soveltamisesta tuotti 572 geenit oli ainakin yksi isoformi, joka oli merkittävästi ilmentyvät eri. Lopputuloksena olemme lasketaan 671 43120 isoformien (1,6%), jolloin voidaan merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti. Taulukko S1 Information S1 osoittaa, kuinka nämä numerot muuttuvat eri FPKM ja taita muutoksen kriteerit.

Tulokset

eristäminen CSC ja ei-CSC osapopulaatioiden

eristetty ihmisen CSCS ( CD133 + /EpCAM +) ja ei-CSCS (CD133- /EpCAM +) peräisin levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä ksenografti fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) ja vastaavasti talteen yhteensä 9,19 x 10

4 (3,4%) ja 2,18 x 10

6 (96,6%) elävien solujen, jotka vastaavat kahta alapopulaatioiden (kuvio 2). Laadun arvioimiseksi meidän lajitella mittasimme ekspressiotasot CD133 isoformeja (kuva S2 Information S1) koko transcriptome data (kuvattu alla) ja havaittiin kohtalainen ilmentyminen kolme isoformia että CD133 + alaryhmässä ja havaittavaa tasoa ilmaisun CD133 – alaryhmästä. Suoritimme toisen FACS samasta ksenograftissa eristettiin eri eläin ja saadaan samanlainen määrä ja osuus CD133 + ja CD133- soluja (kuvio S3 Information S1). Tuloksemme osoittavat, että pystymme järjestellä puhtaaksi CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi ja että CD133 + alaryhmästä muodostaa pieni osa syöpäsolujen okasolukarsi- keuhkojen kasvain, joka on sopusoinnussa aiemmin julkaistujen tutkimusten [15], [26] .

(A) Elävät solut näkyvät erilliset populaatiot joko hiiren CD45 /MHC I tai ihmisen EpCAM ilme. (B): n eristäminen ihmisen CD133 + -soluja (punainen) ihmisen CD133- solut (vihreä) ja hiiren positiiviset solut (sininen). (C) uudelleenanalysoinnissa solupopulaatioiden paneeli B osoittaa, että C133 + solut (punainen) ovat 3,4% EpCAM + väestöstä.

Mutaatioiden maisema okasolusyöpä keuhkojen kasvain alapopulaatiot

suoritimme kopiomäärän muuttaminen (CNA) analyysi microarray (katso tulokset ja menetelmät Information S1) ituradan, CD133 +, ja CD133- DNA ja totesi, että noin puolet koko genomin sekä CD133- ja CD133 + -alapopulaatioiksi oli mukana suuri CNAs (kuva S4 Information S1). Päällekkäisyys analyysi paljasti toimenpiteisiin mahdollisesti CNAs kunkin alaryhmässä, mutta kun manuaalinen tarkastus kaikille CNAs ja ottaen huomioon tarkkuus mikrosiruja [34], emme voineet luottavaisesti tunnistaa eroja. Niinpä päädyimme siihen, että kromosomit CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi olivat erittäin muuttuneet pitkälti erottaa tavalla. Lisäksi olemme analysoineet koko genomisekvenssitiedosta että CD133 + alaryhmässä ja vastaavat ituradan DNA: n ja totesi, että kasvain tutkittu eivät sisältäneet kliinisen toiminnan mutaatioita (taulukot S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10 , S11, S12 Information S2 ja kuvio S8 Information S1).

Arviointi mRNA isoformien geenejä, jotka koodaavat solun pinnan proteiineja

sääntelemättömään ilmentymiseen mRNA: n isoformien voi johtaa sukupolven syöpää liittyvä solun pinnan proteiineja, jotka ovat mahdollisia antigeenisiä kohteita terapeuttiselle monoklonaalisia vasta-aineita. Tunnistamaan tällaiset tavoitteet, mittasimme ilmentymistä 1191-mRNA: n isomuotojen 426 CD Molecule [35], 354 GPCR [36], ja 212 ionikanavan [36] geenit (992 yhteensä geenejä). Me rajoitettu analyysimme sen isoformit, jotka ainakin kohtalaisen ilmaistaan ​​(30 FPKM) ja peitetään vähintään 60% niiden pituudesta sekvensoimalla lukee joko tai molemmat CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi, jolloin saadaan arvio joukko 124 isoformeja edustavat 80 geenit (10,4%: n 1191-isoformien ja 8,0%: n 992 geeneistä) (kuva 3, kuviot S5a, S5B Information S1). 124 ilmentyy suuresti isoformeja, 43 (25-geenit) on ainakin nelinkertainen ilmentymisen eroja (FDR 0,01), ja 24 osoittaa vähentynyt ja 19 osoittaa kohonneen ekspression CD133 + -solujen suhteen CD133- soluihin (kuvio 3). Mielenkiintoista, 31 (25%) ja 124 korkeasti ilmaisi isoformit vastaavat 18 geenejä parhaillaan aktiivisesti tutkintaan lääkekohteita lukuisia syöpiä (erityisesti ABCG2 [37], ADAM10 [38], ALCAM [39], [40], BSG [ ,,,0],41], CD151 [42], CD44 [43], CD47 [44], [45], CD9 [46] – [50], CEACAM5 [51], [52], CEACAM6 [52], CXCR4 [53], EPCAM [54], erbB2 [55], ICAM1 [56], IGF1 R [57], NRP1 [58], NT5E [59], TRPM7 [60]. on huomioitava, että ABCG2 isoformin (16X korkeampi ilmaisun CD133 + alaryhmästä) ja CXCR4 isoformin (4X korkeampi ilmaisun CD133 + alaryhmästä) on aikaisemmin tunnistettu biomarkkerit keuhkosyöpään kasvain aloittamista solujen säästyneet sisplatiinihoitoon [15]. näiden lisäksi 18 geenit aktiivisesti tutkintaan lääkekohteita kaksi muuta erittäin ilmentyvien geenien -CD97 [61], ja IFITM1 [62] -on ehdotettu, mutta ei aktiivisesti terapeuttisina vasta-aineen tavoitteet ensisijainen tai etäpesäkkeitä. Uskomme, että muita ilmentyy voimakkaasti solun pinnan geenit esitetään kuviossa 3 voivat myös olla mahdollisia lääkkeiden kohteita. Esimerkiksi isoformi DDR1, homologia DDR2, joka on lupaava kohde SCC [7], ilmentyy vahvasti CD133 + -solujen. ICAM4, joka on osoitettu rooli syövän synnyssä ja sijaitsee 19p13.2 herkkyys lokus useita syöpiä [63], [64], on myös hyvin ilmaistaan. Koska nämä 22 solupinnan geenien terapeuttista hyötyä koodaavat proteiineja, jotka liittyvät solu-solu-vuorovaikutuksia, soluadheesiota, muuttoliike, ja chemoresistance, niiden ilmaisua yhtäläisyydet ja erot tunnistetaan tässä havainnollistaa isoformi tason analyysejä voi tarjota uuden tason tietoja sekä ymmärrystä fysiologian, ja kohdentaminen, tietyn kasvaimen alapopulaatiot.

Näkyy ovat ekspressiotasot 1191 isomuotojen 426 CD Molecule, 354 GPCR ja 212 ionikanavan geenejä. Harmaa piireissä vastaavat isomuotoja, jotka eivät täytä vähimmäisvaatimukset ekspressiotason kriteerit ja sinisiä ympyröitä isoformeja että ei, mutta eivät olleet merkitsevästi ilmentyvät eri. Värilliset kolmiot osoittavat merkittävästi ilmentyvät eri isoformeja; vihreä alaspäin osoittava kolmio osoittavat vähenevää ilmaisun ja punainen ylös osoittava kolmiot osoittavat lisääntynyt ilmentyminen CD133 + solut. Diagonaalinen harmaat viivat ovat kertaluokkamuutos Clines. Isoformit käsitellään tekstissä on nimetty. Huomaa, että CD133 /PROM1 ei täytä ilmaisua kriteeri, taustalla tiukkuutta meidän tietojen suodatus; mutta on esitetty vertailun vuoksi. Täällä käytämme HGNC-hyväksytty geeni symbolia [96] ja UCSC isoformin nimitykset [31].

arvioimiseksi, missä määrin korkea ilmentymisen terapeuttisesti houkuttelevia solunpintaproteiinit kuvattu edellä tutkittu kasvain on yleinen ilmiö SCC tarkastelimme TCGA transcriptome tiedot 221 okasolusyöpä keuhkosyövässä [28], [65]. Tärkeää on, TCGA sekvensointi suoritetaan irtotavarana kasvain, joten alaryhmästä koostumus odotetaan olevan aivan erilainen kuin CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi on okasolusyöpä tutkimuksessamme. Julkisesti saatavilla TCGA ilmaisu dataa analysoidaan exon-, liitos junction-, ja geeni-tasolla. Koska ei ole olemassa vakiintunutta tapaa päätellä isoformia tason ilmentymisen eksonista ja -silmukointikohdan ilmaisun, päätimme vertaamme isoformin ilmentymistä arvioi kanssa TCGA geenin ilmentymistä arvioita. Perustuu siihen, että analyysimme keskittyy isoformeja korkean ilme, päättelimme, että jos tulokset ovat yleisesti SCC niin olisimme tarkkailla korkea ilmentymistä vastaava koko geenien poikki enemmistö 221 kasvain näytteissä. Kuten kuviossa 4A, 4C, suurin osa 22 solupinnan geenien terapeuttisen mielenkiinnon voimakkaasti ilmaistu kaikissa 221 näytettä 12 saattaminen alkuun 10% (mediaani lauseke 31 RPKM) pisimmälle ilmaisi geenejä. Mielenkiintoista on, ABCG2 ja ICAM4, joilla on kaksi alinta ekspressiotasot 22 geenit olivat pääasiassa ilmaistu CD133 + alaryhmästä. Tämä tilanne heijastaa että CD133 /PROM1 (kuvio 3), joten spekuloida, että ilmeisen vähän kasvaimen koko ilmentymisen ABCG2 ja ICAM4 on, koska ne ovat voimakkaasti ilmaista ainoastaan ​​CD133 + soluja, jotka ovat ainoastaan ​​vähäinen osa kasvainsolujen. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että meidän havainnot ovat yleisiä SCC ja niin voisi vaikuttaa kliiniseen kehitykseen, koska ne tunnistaa tämän taudin mahdollisen uuden merkinnän lukuisia lääkkeitä parhaillaan ja ehdottaa useita muita uusia lupaavia kohteita.

A) solun pinnalla ja B) apoptoosin liittyvät koko geenin ilmentymisen arvioiden 221 keuhkojen okasolusyöpä näytteitä. C) jako ekspressiotasoja arvioitu 20533 geenien näytettä kohti, keskimäärin kaikissa 221 näytettä. Katkoviivoja vaakasuora viiva osoittaa top 5% geenien, kun paremmuusjärjestykseen ilme.

Arviointi mRNA isoformit liittyvien geenien apoptoosin

Koska laajuus genomista muutoksia havaittiin CNA analyysi tutkittu SCC ja lukuisia tunnettuja solukuoleman mekanismeja, jotka vastaavat DNA-vaurioita, me epäillään, että syöpäsolut on täytynyt muuttaa ilmentyminen apoptoosin liittyvien geenien selviytyäkseen alle niin suuri mutaatiostatuksesta kuormitus. Saada tietoa selviytymisen kapasiteettia CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi, teimme keskittynyt ilme analyysi joukko 106 apoptoosin liittyvien geenien (taulukko S2 Information S2), joka kokonaan oli 434 mRNA isoformeja. Kuten edellä, me rajoitettu analyysimme sen isoformit, jotka ilmaistiin tasolla vähintään 30 FPKM ja jotka kuuluivat vähintään 60% niiden pituudesta sekvensoimalla lukee jompikumpi tai molemmat alapopulaatioiden. Kolmekymmentä 106 geenien (28%) ja 37 434 isoformia (9%) täyttivät nämä kriteerit (kuva 5, kuva S6 Information S1). Mielenkiintoista on, että vain 9 isoformit 6 geenien merkittävästi differentiaalisesti ilmaistaan ​​ainakin nelinkertaista eroa näiden kahden välillä alapopulaatioiden (FDR 0,01). Huomionarvoista on korkea ilmentymä L-Myc isoformin (MYCL1, uc001cer) ja XIAP isoformi (XIAP, ucoo4etx) molemmissa alapopulaatioiden, nelinkertaisella kiihdytyssäätely on CD133 + ja CD133- alapopulaatioiden, vastaavasti. L-Myc on maailmanlaajuisesti toimiva transkriptiotekijän ja kaikkien proteiinien Myc perhe (N-Myc, c-Myc, ja L-Myc) sillä on vahvin ja spesifinen aktiivisuus edistämisessä ihmisen iPSC sukupolvi-oletettavasti kautta kyky tukahduttaa erilaistumiseen liittyvien geenien [66]. XIAP on tunnettu vaimennin apoptoosin lisäksi muita fysiologisia rooleja liittyvät sen E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla toimintaa [67]. Huomion arvoinen on muutamia isoformeja (eli BCLAF1 ja BFAR isoformit) kanssa 16x differentiaalikaavojen. BCLAF1, joka on isoformi erittäin ilmaistu vain CD133- alaryhmästä, pelaa kriittinen rooli monissa prosesseissa [68], mukaan lukien keuhkojen kehitystä [69]. BFAR, E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla että todennäköisesti välittää välistä ylikuulumista ulkoisen ja sisäisen apoptoottisten reittien [70], on yksi isoformi ilmaistu yksinomaan CD133 + ja toinen yksinomaan CD133-. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka yleisesti ottaen CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi samalla ilmaista apoptoosiin liittyvien geenien ilmentymisen eroja isoformien keskeisten apoptoosin geenit voivat osittain myötävaikuttaa itseuudistumiseen ja selviytymisen eroja näiden syöpäsolutyyppien.

Näkyy ovat ekspressiotasot 434 isomuotoja 106 apoptoosiin liittyviä geenejä. Harmaa piireissä vastaavat isomuotoja, jotka eivät täytä vähimmäisvaatimukset ekspressiotason kriteerit ja sinisiä ympyröitä isoformeja että ei, mutta eivät olleet merkitsevästi ilmentyvät eri. Värilliset kolmiot osoittavat merkittävästi ilmentyvät eri isoformeja; vihreä alaspäin osoittava kolmio osoittavat vähenevää ilmaisun ja punainen ylös osoittava kolmiot osoittavat lisääntynyt ilmentyminen CD133 + solut. Diagonaalinen harmaat viivat ovat kertaluokkamuutos Clines. Isoformit käsitellään tekstissä on nimetty. Isoformit käsitellään tekstissä on nimetty. Täällä käytämme HGNC-hyväksytty geeni symbolia [96] ja UCSC isoformin nimitykset [31].

seuraavaksi keskittyneet korkeimmin ilmaistu apoptoosiin liittyvien geenien sekä CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi saada oivalluksia selviytymisen mekanismeja yhteiseen näiden syöpäsolutyyppien. Tämä keskittyy analyysi paljasti c-Myc (MYC, uc003ysi), ja pitkä isoformeja TRAIL /TNFSF10 (TNFSF10, uc003fid), Mcl-1 (MCL1, uc010pch) ja Bcl-x (BCL2L1, uc002wwl) on kaikkein ilmentyy voimakkaasti apoptoosiin liittyvien geenien (kuvio 5). Me varmistettiin RT-qPCR korkea ilmentyminen c-Myc, Mcl-1

L, ja Bcl-x

L sekä CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi (Kuva S7 Information S1). Se on vakiintunut, että korkea c-Myc ilmentymisen voimakkaasti indusoi luontaista (mitokondrioita välittämä) solukuolemareittiin; kuitenkin samanaikaisesti korkea ilmentyminen Mcl-1

L ja Bcl-x

L voidaan eristää mitokondrion ulkokalvon proteiineja Bak ja Bax [71], [72], ja siten estää apoptoottisen vaikutuksia c-Myc. Tällainen rooli Mcl-1

L ja Bcl-x

L on äskettäin osoitettu 14 c-Myc-ajettu ei-okasolusyöpä keuhkosyöpä ihmisen solulinjoja [73], hiiren malleissa adenokarsinooma keuhkosyöpään [74] ja muissa maligniteetin yhteyksissä [75]. Tuloksemme syytöstä Mcl-1

L ja Bcl-x

L estää apoptoottista vaikutusta c-Myc sekä CSC ja ei-CSC subpopulaatio tutkituista okasolusyöpä. Toteamme, että kun pitkän isoformeja Mcl-1: n ja Bcl-x ovat osoittaneet, pro-selviytymisen toimintoja, lyhyt isomuotoja näiden geenien, joita ei ole ilmaistu, ovat pro-apoptoottisia [76]. Korkea ekspressio pitkän isoformin TRAIL (TRAIL

L) sekä alapopulaatioiden on merkittävä, koska tämä sytokiini on tutkittavana kuin solunsalpaajaksi [77], koska se voi tappaa selektiivisesti kasvainsoluja kautta reseptorivälitteistä apoptoosia. Kuitenkin pitkäaikainen altistuminen korkeille TRAIL

L voi aiheuttaa TRAIL

L vastus, jonka jälkeen TRAIL

L tulee vahva induktori leviämisen ja etäpesäkkeiden [78]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet sekä Mcl-1

L, ja Bcl-x

L olevan vastuussa hankitun TRAIL

L vastus ei-levyepiteelikarsinooma keuhkosyövän solulinjat [79] ja muissa syöpäsolulinjoissa [ ,,,0],80] – [83]. Huomattavaa on, että toinen merkittävä tekijä TRAIL vastus, c-Flip

L (CFLAR, uc002uxb) -the pitkä isoformin Flip /CFLAR joka on katalyyttisesti aktiivinen homologi kaspaasin 8-on myös hyvin ilmaistu molemmissa alaryhmien meidän tutkittu SCC (kuvio 5) [79], [84] – [87]. Lyhyen isoformit Sekä TRAIL ja c-Flip on myös vastakkaisia ​​proapoptoottisten roolit verrattuna pitkä isoformit [79], [88]. Kaikkiaan meidän isoformi tason geenin ilmentymisen analyysi viittaa siihen, että tutkittu SCC sekä CD133 + ja CD133- -alapopulaatioiksi ajettiin erittäin korkeat c-Myc ja TRAIL

L ja että normaali apoptoottista vastaus korkea näiden geenien ilmentymistä estyi läpi erittäin korkeita Mcl-1

L ja Bcl-x

L ja c-Flip

L.

Jälleen käytetään TCGA transcriptome tiedot 221 okasolusyöpä keuhkojen syöpiä määrittää yleisyyttä meidän apoptoosigeenin isoformin analyysitulokset. Kuten edellä ABCG2 ja ICAM4, me ominaisuus ilmeisesti pieni kasvain laajuinen ilmentymistä L-Myc (MYCL1) (kuvio 4B, 4C) mahdollisuutta, että SCC se on voimakkaasti ilmaistu ainoastaan ​​CD133 + soluja, jotka ovat ainoastaan ​​vähäinen osa kasvainsoluja.