Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Twist2 on osoitettu edistävän ihmisen kasvaimen invaasion kuten rintasyövän ja kohdunkaulan syövän. Kuitenkin myös Twist2 edistää ihmisen munasarjasyöpä eteneminen on vielä selvittämättä. Täällä me tutkia roolia Twist2 munasarjasyövän invaasiota ja etäpesäkkeiden sekä taustalla molekyylitason mekanismit.

Methods

Twist2 ilmentymistä havaittiin immunohistokemia (IHC) kudoksen microarray ihmisen munasarjan syöpiä pisteytys menettelyn mukaisesti värjäytymisen intensiteettiä ja kuvio. Twist2 geeni stabiilisti tuotu SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja tutkia muutoksia solun morfologiassa, liikkuvuuteen, invasiivisuus ja EMT molekyylimarkkereita.

Tulokset

Twist2 ilmentyminen lisääntyy merkittävästi munasarjasyöpiä yhdessä FIGO taudin vaiheessa, mikä osoittaa, että Twist2 voi liittyä munasarjasyöpä etäpesäkkeitä. Yliekspressio Twist2 indusoi EMT fenotyyppi, mukaan lukien downregulation E-kadheriinin ja säätelyä N-kadheriinin ja β-kateniinin ihmisen munasarjasyövän soluja, mikä viittaa siihen, että Twist2 voitaisiin edistää β-kateniinin vapautumisen E-kadheriinin /β-kateniinin kompleksia inhibition E-kadheriinin. Siten β-kateniinin hajoaminen estyi estämällä APC, ja Wnt /β-kateniinin polku sitten aktivoitiin ydin- β-kateniinin kerääntyminen, joka voi aktivoida transkriptio loppupään kohdegeenien edistää kasvaimen invaasion ja metastaasin. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että β-kateniinin on mukana Twist2 aiheuttaman EMT munasarjasyövän.

Johtopäätös

Tuloksemme osoittavat, että säätelyä Twist2 korreloi FIGO vaihe ihmisen munasarjasyöpiä . Tässä raportissa, osoitimme, että ydinvoiman β-kateniinin on kertynyt Twist2 aiheuttama EMT solujen helpottaa munasarjasyöpä invaasiota ja etäpesäkkeiden.

Citation: Mao Y, Xu J, Li Z, Zhang N, Yin H, Liu Z (2013) The Role of Nuclear β-kateniinin kerääntyminen Twist2 aiheuttama munasarjasyöpä EMT. PLoS ONE 8 (11): e78200. doi: 10,1371 /journal.pone.0078200

Editor: Mechthild Hatzfeld, Martin-Luther-yliopistossa Halle, Saksa

vastaanotettu: 15 tammikuu 2013; Hyväksytty 10 syyskuuta 2013 Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Mao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn, nro 30872515, YB Mao) ja perustutkimus rahastoja Keski yliopistojen Kiinassa (nro 2011121062, YB Mao), ja Natural Science Foundation of Fujian, Kiina (No. 2012J01417, YB Mao). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta viimeaikaisista etukäteen ymmärrystä munasarjasyöpä kehittymistä ja etenemistä, munasarjasyöpä edelleen on korkein liittyvä kuolleisuus Gynekologiasairauksien pahanlaatuisen enimmäkseen länsimaissa johtuen pitkälle taudin diagnoosin (vaiheiden III-IV) . Valtaosa naisista diagnosoitu Disseminated vatsaonteloon carcinomatosis [1], [2]. Viimeaikaiset kirjallisuus viittaa siihen, että epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeisessä asemassa etenemisessä munasarjakarsinoomat [3], [4]. EMT on määritelty monimutkainen molekyyli- ja solutason ohjelma jolla epiteelisolujen menettävät eriytetyn ominaisuudet kuten solu- soluadheesiota, apikaalisella-pohjapinta polariteetin puute soluliikkuvuus ja voitto mesenkymaalisten ominaisuuksia, kuten liikkuvuutta, invasiivisuus ja lisääntynyt resistenssi apoptoosia [5 ]. Samanlainen solu remodeling ja signalointi verkot näyttävät olevan aktiivisia aikana syövän etäpesäkkeiden [6], [7]. On ehdotettu, että ensisijainen EOC voi käydä läpi EMT prosessi aikana paikallinen hyökkäyksen vatsakalvon ja säilyttää mesenkymaalisten ominaisuuksia kehittynyt kasvaimia.

transkriptio tekijät Twist perhe (Twist1, Twist2), etana perhe (SNAI1 /etana , SNAI2 /etana), sekä ZEB perhe (ZEB1, ZEB2), ohjaus EMT prosessi syövän [5], [8], [9]. Twist2 on osoitettu edistävän kasvaimen etenemistä läpi EMT rintasyövässä [10]. Twist2 on potentiaalinen prognostinen kohdunkaulan syövälle [11], rauhasmainen kystinen karsinooma [12], ja kielen okasolusyöpä [13]. Twist2 on myös korreloi huonon erilaistumista laatu ja lyhyet eloonjäämisen pään ja kaulan okasolusyöpää [14]. Kuitenkin myös Twist2 edistää ihmisen munasarjasyöpä etenemisen edelleen huonosti. Täällä roolin tutkimiseksi Twist2 munasarjasyövän etenemiseen ja mahdolliset molekyylitason mekanismeista Twist2 aiheuttama syöpä ja metastaasit. Osoitimme Twist2 ilmentyy voimakkaasti munasarjasyövän kudoksissa. Kohdunulkoinen ilmentyminen Twist2 vuonna munasarjasyöpäsoluja antaa EMT fenotyypin. Lisäksi β-kateniinin aktivaatio voi osallistua näihin Twist2 aiheuttama EMT ominaisuuksia.

Tulokset

1. Lisääntynyt Twist2 ilmentyminen korreloi FIGO vaiheessa ensisijainen munasarjasyöpä

IHC osoittivat, kun läsnä on suuria määriä Twist2 syöpäsoluissa on primääri munasarjojen kasvaimia kudoksen array (kuvio 1). Twist2 ilmentyminen oli lisääntynyt munasarjasyövän (70,24%, 59 84 tapauksessa) suhteessa normaaliin munasarjakudoksen (P 0,05, kuvio 1, taulukko 1). Positiivinen värjäytyminen Twist2 havaittiin sekä tumassa ja sytoplasmassa.

Kudosleikkeet munasarjojen karsinoomien ja normaalin munasarjat analysoitiin IHC värjäys spesifisen monoklonaalinen vasta-aine ihmisen Twist2. Positiivinen värjäytyminen Twist2 osoitettiin ruskea väri. Leikkeet vastavärjättiin hemotoksyliini- näyttää ytimiä. Edustavat kuvat Twist2 värjäyksen pariksi normaalissa munasarjassa ja munasarjan epiteelin karsinoomien näkyvät. Ei ilmaus Twist2 voisi nähty normaalin aikuisen munasarjassa kudoksissa, kun taas positiivinen ilmauksia Twist2 pääasiassa lokalisoitu sytoplasmassa tai tumassa vakavien adenokarsinooma ja mucinous adenokarsinooma munasarjojen syöpäsoluja. Suuruus × 200, × 400.

mukaan histologinen luokittelu, vahva ilmaus Twist2 havaittiin 19 69 vakavien karsinoomien (27,54%), 1 8 mucinous karsinoomien (12,5% ), yksikään 4 endometriod karsinoomien (0%), ja 2 5 Clear solukarsinoomat (40%). Ei merkittävää eroa voitu havaita eri kasvaimen histologinen tyyppi (P 0,05). Ilmentyminen Twist2 nostettiin yhdessä FIGO vaiheessa (P 0,05), esimerkkeinä seuraavat: 22.73% vaiheessa I (10 44 tapauksessa), kun taas 53,85% vaiheessa IV (7 13 tapauksessa). Kaiken vaiheessa I, 31.82% (14/44) tapaukset osoittivat Twist2 negatiivinen ilmaus, 45,45% (20/44) tapaukset osoittivat heikkoa ilmaisun, ja 22.73% (10/44) tapaukset näkyvät vahva ilmaisu; vaiheessa II, Twist2 negatiivinen 7,69% (1/13); heikko ilmaus: 61.54% (8/13), ja vahva positiivinen: 30,77% (4/13); vaiheessa III, Twist2 negatiivinen ilmaus: 57.14% (8/14), heikko ilme: 35.71% (5/14), ja voimakas ilmaus: 7,14% (1/14); vaiheessa IV, negatiivinen ilmaus: 15,38% (2/13), heikko ilme: 30,77% (4/13), vahva ilmaus: 53,85% (7/13).

Nämä tiedot osoittivat, että Twist2 proteiini on merkittävästi lisääntynyt munasarjasyövän kudoksissa ja korkea Twist2 korreloi FIGO sairauden vaiheessa, mikä viittaa siihen, että Twist2 voidaan käyttää indikaattorina korkealuokkaisesta maligniteetin ja huonon ennusteen ihmisen munasarja- syöpiä. Ei ole kuitenkaan mitään korrelaatiota Twist2 ilmaisun ja kasvaimen histologinen tyyppi.

2. Twist2 ilmaisu vaikutti solun muotoon, mutta ei solujen lisääntymistä SKOV-3-solujen

in vitro

Voit tarkistaa, onko Twist2 on ratkaiseva välittäjäaine munasarjasyöpä, eteneminen, loimme solulinjat vakaasti yli-ilmentävät Twist2 (Fig. 2A). Sitten analysoimme Twist2 /SKOV-3-soluissa ja niiden vanhempien soluihin solujen morfologisia havainto, virtaussytometria (FCM), ja MTT-analyysi.

. Ektooppinen ilmentyminen Flag-taggedTwist2 in SKOV-3 (Twist2 /SKOV-3) munasarjasyöpäsoluja varmistettiin Western blot. Twist2 /SKOV-3 solut ilmensivät sekä Twist2 ja lippu-tag verrattuna vektorisäädön soluihin. B. Twist2 värjäytyminen havaittiin käyttäen laserkeilauksen konfokaalimikroskopia (Olympus) in SKOV-3-soluissa. Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Immunofluoresenssivärjäyksellä of Twist2 in Twist2 /SKOV-3-soluissa osoittaa solujen Twist2 (vihreä) solutumissa verrattuna Vektorisäätö SKOV-3-soluissa. Solut olivat peräisin stabiilisti transfektoiduista näytteitä. C. Solujen morfologiset muodot havaittiin käyttämällä vaiheen mikroskopia (Olympus). Twist2 /SKOV-3-solujen otti fibroblastien kaltainen morfologinen muoto, kun taas Vector /SKOV-3 ohjaus solut näyttivät epiteelisolujen muoto.

ominaispiirteiden näiden solujen, havaitsimme selvä elimellisen muutoksen soluissa, jotka yliekspressoivat Twist2 (Fig. 2B). SKOV-3-solut ilmentävät Twist2 koki fenotyypin muutoksen ja näyttävät fibroblastin kaltaisen mesenkymaalisten morfologinen muoto, kun taas kontrolli SKOV-3-soluissa (Vector /SKOV-3) näkyvät Planar epiteelisolujen morfologinen muoto (Fig. 2B). Immuno-fluoresoiva värjäys osoitti, että Twist2 on lokalisoitu ytimet, jotka oli yhdenmukainen sen kanssa, että Twist2 on transkriptiotekijä (Fig. 2C).

arvioitiin sitten leviämisen SKOV-3-soluja ilmentävät Twist2through analyysit solusyklin jakelu ja solujen kasvu. Tulokset osoittivat, mitään selvää vaikutusta Twist2 ilmentymisen soluproliferaatioon (Fig. 3A, 3B). Kuten Akt ja Erk1 /2 ovat tärkeitä indikaattoreita osallistuvat solujen lisääntymistä, ilmaisuja näiden proteiinien ja niiden fosforylaatiota tutkittiin Western blot-analyysi. Johdonmukaisesti, emme muutosten havaitsemiseksi Akt, Erk1 /2, ja niiden fosforylaatio lomakkeiden Twist2 /SKOV-3 solujen realtive on Vector /SKOV-3 ohjaus soluja (Fig. 3C).

. Virtaussytometrillä analyysi ei osoittanut mitään eroa solusyklin jakautumista SKOV-3 syöpäsolujen kanssa tai ilman Twist2 ektooppinen ekspressoituminen. B. leviämisen nopeus transfektoitujen solujen havaittiin ja verrattiin vektorin ohjaus elinkykyisten solujen määrää käyttämällä trypaanisininen-värjäystä. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kunkin ryhmän soluista. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD. Ei selvää vaikutusta Twist2 havaittiin solujen kasvua. C. Expressions of Akt, Erk1 /2, ja niiden phosphoralation muodoista ilmoitetaan Twist2 ei vaikuttanut leviämisen Western blotilla. Verrattuna Vector /SKOV-3-solut, mitään ilmeistä muutoksia Akt, Erk1 /2, ja niiden fosforylaatio muodot löytyivät Twist2 /SKOV-3-soluissa.

3. Twist2 Expression Tehostettu Muuttoliike ja invaasiota SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja

Twist2 on osoitettu olevan tärkeä indusoija EMT rintasyövän ja kohdunkaulan syövän. EMT prosessi edistää epiteelisolujen näkyvän fibroblasti muoto, jolle on ominaista lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisuus [15]. Sen määrittämiseksi, onko Twist2 /SKOV-3-soluja ovat saaneet kasvanut kyky siirtyä, teimme haavan paranemista määritystä, jossa motiliteettia sijaitsevien solujen reunalla haavan arvioitiin sen perusteella, niiden kyvystä kolonisoida haavoittuneen alueen. Kun läsnä on seerumia (10% FBS), haavan havaittiin nopeammin Twist2 /SKOV-3-soluja kuin kontrollisolut ryhmä 24 h (Fig. 4A). Koska ei ollut lisäystä leviämisen aiheuttama Twist2 (Fig. 3C), The Twist2 /SKOV-3-soluissa saattaa olla suurempi solu muuttopotentiaalia

in vitro

in ”haavan paranemista” määritys (Fig. 4A, 4B ). Nämä tulokset varmistettiin siirtokuoppaan kammio määritys sisältää soluväliaineen kerros (matrigeeliä). Kuten on esitetty kuviossa 4C, määrä Twist2 /SKOV-3 vaeltaneet solut huokosten läpi on enemmän kuin kontrolli solut teki.

. In vitro haavojen määrityksessä SKOV-3 syöpäsolujen kanssa tai ilman Twist2 kohdunulkoinen ilmaisua. Edustavat kuvat solujen ”parantava” sivustoja 12 ja 24 tunnin kuluttua kaapimalla näkyvät lisääntynyt soluvaelluksen Twist2 /SKOV-3-soluissa. B. analysoidaan muuttoliikettä tuloksia yksi tapa ANNOVA testi (Graphpad Prism5 ohjelmisto). P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Twist2-ilmentävät SKOV-3-soluja siirretty nopeammin kuin vektori transfektoitiin kontrolli-soluissa. C. In vitro Matrigel invaasiomääritys of SKOV-3-solujen kanssa tai ilman ektooppinen ilmaus Twist2. Kvantifiointi osoitti, että Twist2-ilmentävät solut ovat 8-9 taittuu invasiivisia kuin vektorisäätö solujen in vitro Matrigel invaasiomääritys. *,

p

0,005.

4. Nuclear β-kateniinin on kertynyt munasarjakarsinoomasolut, kun Twist2 indusoi EMT fenotyyppi

Kun Twist2 yli-ilmentää munasarjasyöpä solut, syöpäsolut morfologia muuttui fibroblastin kaltainen muoto sekä lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisuus, vaikka mitään muutosta ei havaittu solujen lisääntymisen. Tuloksemme osoittivat, että koneellinen ilmentyminen Twist2 voisi työntää nämä EOCs läpikäymään epiteelin-mesenkymaalitransitioon.

EMT edellyttää yleensä häiriöitä tiukka liittymissä, vyöliitos, jotka edistävät erottaminen yksittäisiin soluihin [16], [17]. Edelleen onko ilmaus Twist2 todellakin edistää EMT näissä munasarjasyöpäsoluja selvitimme ilmentyminen E-kadheriinin ja N-kadheriinin, kaksi vakiintunut epiteelin ja mesenkymaaliset päättäjille, in Twist2 ilmentäviä ja vektori transfektoitiin SKOV-3 solut. Olemme havainneet, että ilmentyminen E-kadheriinin (epiteelin maker) on huomattavasti vähennetty Twist2-ilmentävissä soluissa suhteessa kontrollisoluihin, mutta ekspressio N-kadheriinin (mesenkymaalisten valmistaja) kasvoi soluissa, jotka ilmentävät Twist2 reaaliaikaisella PCR: llä ( Fig. 5A, 5B). Olemme edelleen vahvisti ilmentymisen tulokset E-kadheriinin, N-kadheriinin Western Blot (Fig. 5C).

A ja B. Reaaliaikainen PCR tulokset Twist2, E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja APC mRNA ilmentävät tasot Twist2 ilmentävien solujen ja vektorin-transfektoidut säätökennoja (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001). C. Western Blot tulokset Twist2, E-kadheriinin, N-kadheriinin, β-kateniinin ilmentymistä Twist2 /SKOV-3-soluissa verrattuna Vector /SKOV-3 ohjaus soluissa. D. jakautuminen β-kateniinin sytoplasmassa ja tumassa havaita solufraktioinnin menetelmällä. P-vanhempien SKOV-3 syöpäsolujen, V-vektori-transfektoitujen ohjaus solujen, T-Twist2 ilmentävien SKOV-3-soluissa.

Koska Twist2 /SKOV-3 soluilla morfologiset muutokset (Kuva. 2B), parannettu mahdollisuus siirtää (Fig. 4), ja EMT merkkiaineiden ilmaisun, olemme tulleet siihen tulokseen, että ektooppinen ekspressio Twist2 edistää EMT fenotyyppi epiteeli- munasarjakarsinoomasolut.

on hyvin tunnettua, että β-kateniinin -E-kadheriinin kompleksi muodostaa rakenteellisen ytimen adherens kontakteja, ja vaikeuttaa β-kateniinin siirto tumaan ja sen transkriptioaktiviteettia [18]. β-kateniinin myös ajan säännelty Twist2 ilmentävien solujen suhteessa kontrolliin solujen vähentynyt E-kadheriinin (kuvio. 5C). Kuva 5D osoittivat β-kateniinin jakautuminen solufraktioinnin menetelmällä. Nuclear β-kateniinin lisääntyi Twist2 /SKOV-3-soluissa. Lisäksi APC mRNA väheni (kuvio. 5B).

5. TOPflash transkription analyysi 293FT solujen

Jotta voidaan havaita vaikutuksen Twist2 aiheuttama tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin geenien ilmentymisen, tarkastetaan alavirran kohdegeenien, kuten c-Myc, sykliini-D1 Wnt signaalireitin . Sekä c-Myc ja sykliini-D1 nostettaisiin Twist2 yli-ilmentyminen (kuvio 6). Sitten mitataan TCF /LEF-riippuvaisen transkription aktiivisuus käyttäen TOP /FOP flash toimittaja plasmideja. Jälkeen reportterigeenit vietiin 293FT soluja 48 h, transkriptionaalista aktiivisuutta arvioitiin lusiferaasi ja renilla toimintaa. 293FT solut osoittivat merkitsevästi koholla LEF /TCF-riippuvaisen transkription kanssa Twist2 kotransfektiolla (suhteessa vektorisäätö, N = 3, P 0,001; kuvio 7).

c-Myc ja sykliini-D1 useimmiten katsotaan kuten Wnt kohdegeenien, me tutkittava tarkemmin niiden ilmaisuja western blot toistetaan kolme kertaa. Immunoblot analyysi, joka osoittaa, että molemmat c-Myc ja sykliini-D1 lisätään vastaavasti Twist2 /SKOV-3 ryhmässä verrattuna Vector /SKOV-3 ryhmä edustava.

mittaamiseksi TCF4 /LEF1 riippuvainen transkriptionaalista aktiivisuutta 293FT solulinjojen solut transfektoitiin TOP /FOP flash toimittaja plasmideja. Sen jälkeen, kun geenit transfektion 48 tuntia, transkriptionaalista aktiivisuutta mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay System. Solut FOP salamaryhmää osoitti vähäistä tasoja transkriptioaktiivisuuden. Sitä vastoin solut TOPflash ryhmien yhdessä transfektoitiin Twist2 osoitti merkittävää kasvua signaalin. Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. kolmesta kokeesta (N = 3; P 0,001).

Ota yhdessä, nämä tulokset osoittavat, että Twist2 yli-ilmentymisen SKOV-3-solujen häiritsee solu-solu adherens kontakteja ja edistää solujen vaeltamiseen. Alenemisen kanssa E-kadheriinin, β-kateniinin vapautuu E-kadheriinin /β-kateniinin monimutkainen. Samaan aikaan, β-kateniinin hajoamiseen edelleen pienentää mukana laski APC, joka johti kerääntymisen β-kateniinin sytoplasmassa ja aiheutti β-kateniinin siirtoa tumaan lisäämiseksi sen transkriptionaalista aktiivisuutta. Nämä tulokset osoittivat, että ydin- β-kateniinin oli mukana Twist2 aiheuttama EMT munasarjasyövän.

Keskustelu

Munasarjasyöpä on erittäin etäpesäkkeitä ja tunnistamisen molekyylien ja /tai signalointireitteihin osallistuvien syövän eteneminen ja metastaasit on erittäin tärkeää, jossa alkuvaiheen tunnistaminen on edelleen este [4]. Munasarjasyöpäsoluja ovat alttiita etäpesäkkeitä koko vatsaonteloon pääasiassa vatsaontelon sisäisen levittämistä ja lymfaattisilla levittämiseen. Etäpesäke on monimutkainen prosessi, jossa muutoksia soluväliaineen ja solu-solu liittymissä. Epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on välttämätön askel kohti etäpesäkekasvainten etenemistä aikana irronnut syöpäsolujen primaarikasvaimen sivusto ja kiinnityksen metastaasien. Harvat tutkimuksissa on tarkasteltu tekijöitä, jotka edistävät EMT epiteelin munasarjasyöpä (EOC) solut [4], [19].

Useat EMT-asiakkuutta sääntelyviranomaisten tukahduttavat E-kadheriinin transkriptio,

kautta

vuorovaikutuksen erityisiä E-laatikot proksimaalisen E-kadheriinipromoottorin [20]. Tärkeimmät näistä ovat Snail (SNAI1 ja SLUG) [21], [22], ZEB (ZEB1 ja ZEB2) [23] ja perus helixloop kierteen (bHLH) (Twist1 [24]) transkriptiotekijän perheitä. Vasta äskettäin, vakuuttavaa näyttöä osoitti Twist2 yliekspressio oli merkittävästi sidoksissa kohdunkaulan syövän etenemistä [25], [26]. Twist2 aktivoi EMT ohjelmia ja edistää syövän kantasolujen fenotyyppi rintasyövän [10]. Kuitenkin biologisen toiminnan Twist2 tuumorin on pysynyt pääosin tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa, tarjoamme ensimmäinen näyttö siitä, että Twist2 ilmentyminen liittyy korkea FIGO vaiheessa munasarjasyöpä. Voidaan olettaa, että Twist2 soittaa samanlaisia ​​EMT toimintoja munasarjasyöpä. Tämän vuoksi toimme

twist2

osaksi SKOV-3 munasarjasyövän solulinjan ja tutkittiin solujen biologista käyttäytymistä kuten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen Twist2 ei ollut vaikutusta solujen kasvuun ja Akt, Erk1 /2 aktivointi. Mielenkiintoista, The Twist2 /SKOV-3-solujen määrä nousi migraation ja invaasion munasarjasyöpäsoluja, arvioituna scratch-haavan määritys ja invaasiomääritys. Kuten EMT johtaa tehostetun solun liikkuvuus ja invaasio, me edelleen tarkistanut EMT markkereita. Siirtyminen E-kadheriinin N-kadheriinin on myös keskeinen piirre EMT munasarjasyövän [4]. Yliekspressio Twist2 merkittävästi vähentynyt E-kadheriinin ja lisäsi N-kadheriiniekspressiota sekä mRNA ja proteiini tasoilla vastaavasti.

E-kadheriinin on läpäisevä glykoproteiini tyypin I kadheriinin Yläheimo. Sen sytoplasminen osa on yhteydessä aktiinitukirankaan kautta catenins [27]. Canonical Wnt /β-kateniinin signalointi on suuri vaikutus EMT aikana syövän etenemisen [28], [29]. Wnt signaaleja estävät GSK3p kinaasiaktiivisuutta pysähtyä hajoamista ja pakottaa nopea kasvu tasojen vapaa, sytosolin β-kateniinin, ja hyvin pian sen jälkeen, translokoituu tumaan, jossa se sitoutuu TCF /Lef transkriptiotekijöiden [30], [31] . Vähentäminen E-kadheriinin tasot julkaisee usein β-kateniinin päässä adheren risteyksestä, jolloin ydin- β-kateniinin kerääntyminen, ja siitä seuraava transaktivaatiota paneelin kohdegeenien, joukossa ne määritellään useita EMT aiheuttavia tekijöitä [18], [28 ].

äskettäin julkaistu tutkimus varhaisen kallon ihon kehitys osoitti johdonmukaisesti rooli Wnt /β-kateniinin signaloinnin kautta Twist2 ihoaltistumisessa selityksessä eri alueilla alkion [32]. Twist2 voi olla suora transkription kohde- ja voivat välittää toiminnallista roolia Wnt signalointia ihoaltistumisessa esiasteita. Meidän kokeessa Twist2 lisääntynyt ydinvoiman β-kateniinin. Lisäksi liukeneva ja liukenemattomia sytosolin muotoja β-kateniinin tiukasti säännellään proteosomin /ubikinaa- joka koostuu GSK3p, ak- siini, ja adenomatoottisen polypoosin coli (APC) proteiini [25]. Johtuen downregulation APC, β-kateniinin hajoamiseen myös tukahdutettu. Kun tumassa, β-kateniinin olisi välittävät aktivoimalla tiettyjä mesenkymaalisten geenejä. Me kasvoi c-Myc ja sykliini-D1 Wnt /β-kateniinin signaalireitin (Fig. 6). Koska β-kateniinin tarvittiin ilmaus mesenkymaalisten geenien, tarkastetaan, onko transkriptionaalista aktiivisuutta tämän proteiinin vaikutti ectopic Twist2. Kuten on esitetty kuviossa. 7, aktiivisuus TCF4 /LEF1-promoottoriin (TOP) oli voimistunut (kaksi taittuu) soluissa, jotka on transfektoitu Twist2. Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen mesenkymaalisten geenien valvonnassa β-kateniinin kautta TCF4 /LEF1 riippuvainen komplekseja. Vahvistettu tulos on esitetty kuviossa. 5D, ydin- β-kateniinin jakelu lisääntyi Twist2 /SKOV-3-soluissa. Siten Twist2 saattaa lisätä TCF4 /LEF1 riippuvia β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta.

Tässä tutkimuksessa, tarjoamme todisteita siitä, että Twist2 vaikuttaa solujen käyttäytymistä SKOV-3-soluissa, mukaan lukien muutokset morfologiassa ja liikkuvuuteen. Molekyylitasolla, Twist2 indusoi merkitseviä muutoksia EMT markkereita. Lisäksi Twist2 edistänyt Solujen migraation ja invaasion SKOV-3-soluissa. Näin ollen, Twist2 edistää β-kateniinin vapautumisen E-kadheriinin /β-kateniinin kompleksin estämällä E-kadheriinin. Ydinalan β-kateniinin kerääntyminen, Wnt /β-kateniinin reitin aktivoitiin sitten edistämään EMT fenotyyppi.

parhaan tietomme, osoitamme ensimmäistä kertaa, että Wnt aktivaation Twist2 aiheuttamaa EMT edistystä munasarjasyövän, joka tarjoaa uusia oivalluksia niiden etäpesäkkeitä.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että säätelyä Twist2 korreloi FIGO vaihe ihmisen munasarja- syöpiä. Vaikka ei ole korrelaatiota Twist2 ilmaisun ja kasvaimen histologinen tyyppi, Twist2 on mahdollisena indikaattorina korkealuokkaisesta maligniteetin ja huonon ennusteen kliinisissä munasarjasyöpä. Yli-ilmentyminen Twist2 aiheuttama EMT fenotyyppejä ihmisen munasarjasyöpäsoluja

in vitro

. Downregulation E-kadheriinin ja APC sekä ylössäätely N-kadheriinin ja β-kateniinin (in solun tumassa), viittaavat siihen, että Twist2 edistää β-kateniinin vapautumisen E-kadheriinin /β-kateniinin estämällä E-kadheriinin. Lisäksi johtuen downregulation APC, β-kateniinin hajoamiseen tukahdutettiin. Siksi kanoninen Wnt /β-kateniinin polku sitten aktivoitiin ydin- β-kateniinin kerääntyminen, mikä herätti transkription alavirtaan kohdegeenien edistää kasvaimen invaasion ja metastaasin. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että β-kateniinin on mukana Twist2 aiheuttaman EMT munasarjasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Hiiren anti-Twist2 vasta-aine hankittiin Abnova Biotechnology. Hiiren anti-Flag, anti-β-aktiini, ja anti-Akt vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA). Kanin anti-E-kadheriinin, vuohen anti-N-kadheriinin, kanin anti-IKB-α, kanin anti-β-kateniinin, Mouse anti-Oct-1, kanin anti-sykliini-D1, kanin anti-c-Myc, Mouse anti-kani-IgG, anti-hiiri-IgG-vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

kanin anti-fosfo-Akt (Ser 473) vasta-aine hankittiin R 10%, 0, 10% -20%, 1 ; 20% -50%, 2, 50%, 3. intensiteetti päätettiin vertaamalla värjäyksen syöpäsolujen: mitään värjäytymistä tai epäselviä värjäys, 0; heikkoa värjäytymistä, 1; keskipitkän värjäys, 2; vahva värjäytyminen, 3. kaksi tulokset kerrottiin kategorisoida värjäys: 0-1, negatiivinen (-), 2-4, positiivinen (+); ≥5, vahva positiivinen (++).

Generation of Twist2-yli-ilmentymisen Stable munasarjasyöpäsoluja

ihmisen munasarjasyövän solulinja SKOV-3 saatiin ATCC. Soluja ylläpidettiin McCoyn 5A-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Lippu-Twist2 ilmentävä plasmidi oli rakennettu edellisessä tutkimuksessa [25]. Flag-Twist2 ilmentävien plasmidi ja pBabe-puromysiini vektori kotransfektoitiin osaksi SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja käyttämällä Iipofectamine2000

TM transfektioreagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden. Twist2 ilmentäviä stabiileja klooneja ja vektorisäätö klooneja saatiin vastaavasti läpi valinta puromysiini. Twist2 ekspressiotasot valitussa Sitten stabiileja klooneja todentaa immuuni-blot analyysin kanssa Twist2 ja lippu vasta-aineet.

Solun Morfologiset havainnointi ja konfokaali immunofluoresenssivärjäyksellä

Cell morfologisia muotoja havaittiin käyttämällä vaiheen mikroskopia (Olympus). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin Twist2 /SKOV-3 ja Vector /SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja kuten aiemmin on kuvattu [25]. Värjäytymistä Twist2- ja vektori transfektoitiin SKOV-3-soluja havaittiin ja analysoitiin käyttäen laser skannaus konfokaalimikroskopialla (Olympus).

Cell Growth määritys

Solut siirrostettiin normaalissa väliaineessa, kunnes korjattu. Solujen kasvua arvioitiin kautta MTT-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lisääntyminen nopeus transfektoitujen solujen havaittiin ja verrattiin vektorin ohjaus elinkykyisten solujen määrää käyttämällä trypaanisininen-värjäystä. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kunkin ryhmän soluista. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD. Soluproliferaatioon määrä (%) laskettiin seuraavasti: solujen lukumäärä että koeryhmän /numero kontrolliryhmän x 100%.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut ympättiin kuusi- kuoppalevyille (1 x 10

5 solua /malja), ja kun he saavuttivat yli 90% konfluenssiin, naarmu tehtiin poikki yksisolukerros kärki. Solut pestiin varovaisesti PBS 3 kertaa ja säilytetään tuoretta alustaa. Soluja inkuboitiin 24 tuntia ja valokuvattiin käyttäen käänteisen kudosviljelmässä mikroskoopilla x 100 suurennuksella. Määritykset suoritettiin vähintään kolme kertaa ja tiedot esitettiin keskiarvoja ± SD. Siirtyminen potentiaali välillä Twist2-ilmentävien solujen ja kontrollisolujen verrattiin suhteellinen rako etäisyyden. Ja analysoimme tuloksia yksi tapa ANNOVA testi (Prism5 ohjelmisto). P-arvo p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Cell invaasiomääritys

invaasiomääritys, 5 x 10

3-solut ympättiin Matrigel päällystetyn kalvon insertit (BD Bioscience). Alaosaan sisälsi 0,75 ml McCoyn 5A täydennetty 10% naudan sikiön seerumia kemoattraktantti. Soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan, solut jäljellä insertin sisään poistettiin pumpulipuikolla ja solut, jotka oli tunkeutunut Matrigel hyökätä alapintaan kalvon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin H & E. Sen jälkeen, kun ilma on kuivattu kalvo, solut laskettiin x 100 suurennus 10 satunnaisesti näkökentät mikroskoopilla. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kussakin tapauksessa.

Cell pyöräily analyysin kautta virtaussytometria

Cell pyöräily tunnistettiin kautta virtaussytometria-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 24 tuntia, sitten kerättiin, pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Solupelletit suspendoitiin propidiumjodidivärjäys liuosta (20 ug /ml propidiumjodidia ja 0,2 mg /ml RNaasi PBS: ssä) ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Sitten näytteet analysoitiin virtaussytometrialla.

eristäminen Subsellulaariset Fraktiot, ja Western blot -analyysi

Cell fraktiointi ja Western blot -analyysi suoritettiin, kuten edellisessä julkaisuissa [34], [35]. Tiedot solufraktioinnin on seuraava: Koko-solu-uutteet valmistettiin kaapimalla solut pois petrimaljoja, pesu solujen pelletit kahdesti PBS: ssä, ja sitten suspendoimalla pellettiä kahden pakattu solujen määriä RIPA puskuria [150 mM NaCl /50 mM Tris · HCl, pH 7,5 /0,25% (paino /umol) deoksikolaattia /1% Nonidet P-40/5 mM natriumortovanadaattia /2 mM natriumfluoridi /proteaasi-inhibiittorin seoksen]. Nuclear ja sytoplasminen uutteet eristettiin pesemällä solupellettien puskurissa A (10 mM Hepes, pH 7,5 /10 mM KCI /1,5 mM Mg

2CI /0,5 mM NaF /1 mM glyserolia fosfaatti /proteaasin seos), hajotus puskurissa A + B (puskuri A plus 0,5% Nonidet P-40) 02:01 sekoitus.