Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on ratkaiseva tapahtuma kasvaimen invaasion ja metastaasin. Kuitenkin suurin osa aiemmin EMT tutkimuksia on tehty tavanomaisessa kaksiulotteinen (2D) yksikerrosviljelmän. Siksi on epäselvää, mitä invasiivisia fenotyypit hankitaan EMT aiheuttama syöpäsoluja. Tilanteen korjaamiseksi Tässä vaiheessa yritimme luonnehtia EMT solujen useamman fysiologisen, kolmiulotteisia (3D) kollageeni geeli kulttuuriin. EMT aiheutettiin käsittelemällä kolme ihmisen sinoomasolulinjoja (A549, Panc-1 ja MKN-1) TGF-ß. TGF-ß hoito stimuloi näiden solujen yli-ilmentävät hyökkäyksen markkereita laminiinin γ2 ja MT1-MMP 2D kulttuurin lisäksi induktioon tunnettu elimellisen muutoksen ja EMT merkki ilme. EMT induktio tehostettu soluliikkuvuus ja tarttuvuus fibronektiiniin ja kollageeni 2D kulttuuriin. Vaikka EMT solut osoittivat verrattavissa solujen kasvua kontrolloida solujen 2D kulttuurinsa, kasvulukuja erittäin tukahdutettiin pehmeä agar ja kollageenin geeli kulttuureissa. Useimmat tyypillisesti, EMT aiheuttama syöpäsolujen yleisesti ja merkittävästi laajennettu invasiivisia ulkonemien kollageenigeelissä. Nämä ulokkeet pääosin tuettu mikrotubuleiksi sijaan aktiinisytoskeletonin. Snail-esitteli, vakaa EMT solut osoittivat samanlaisia ​​ulokkeita 3D olosuhteissa ilman TGF-ß. Lisäksi nämä ulkonemat ovat tukahdutettiin kolkisiinin tai inhibiittorit lämpöshokkiproteiini 90 (HSP-90) ja proteiini fosfataasi 2A. Kuitenkin MMP-estäjien ei tukahduttaa ulokkeen muodostumisen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että EMT parantaa kasvainsolujen tunkeutuminen interstitiaalinen strooman laajentamalla mikrotubulusten-pohjainen ulkonemia ja tukahduttaa solujen kasvua. Kohonnut soluadheesion fibronektiiniin ja kollageenin ja korkea soluliikkuvuus näyttävät myös tärkeää kasvaimen invaasio.

Citation: Oyanagi J, Ogawa T, Sato H, Higashi S, Miyazaki K (2012) epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon stimuloi ihmisen syöpäsoluja Laajennetaan Microtubule perustuvia invasiivinen ulkonemat ja vaimentaa solukasvua Kollageeni Gel. PLoS ONE 7 (12): e53209. doi: 10,1371 /journal.pone.0053209

Leikkaus: Olivier de Wever, Gentin yliopisto, Belgia

vastaanotettu: 23 elokuu 2012; Hyväksytty: 27 marraskuu 2012; Julkaistu: 31 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Oyanagi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-Aid (23112517 ja 23300351) tieteellisen tutkimuksen alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kuten normaali epiteelisolujen, duktaalikarsinooma solut

in situ

ylläpitää solun polariteetti, joka tukee solu-solu yhteyttä ja soluadheesiota tyvikalvon. Aikana syövän etenemisessä, jotkut kohdunkaulan soluissa menettää solun polariteetti ja hyökätä tyvikalvon läpi ja sitten sidekudosta. Tätä ilmiötä kutsutaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja ajatellaan olevan ratkaiseva tapahtuma syövän etenemisen [1] – [3]. EMT on kriittinen paitsi monia kehitysvaiheita, kuten gastrulaation ja hermostopienan muodostumista vaan myös patologisten tapahtumien, kuten haavan paranemisessa ja kudoksen fibroosi [1], [3], [4]. EMT on yleensä ominaista menetys epiteelin merkki E-kadheriinin, ylössäätöä mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin ja vimentiinista, ja hankkiminen fibroblastien kaltainen kara solujen muoto yksikerrosviljelmissä [4].

EMT syöpäsolujen indusoi tyypillisesti TGF-ß [5], mutta muut kasvutekijät ja microenvironmental tekijät, kuten HGF, EGF: ää ja FGF, voivat myös aiheuttaa tai edistää vastaavia fenotyyppisiä muutoksia riippuen solutyypeissä [1] , [3], [6]. TGF-ß kohdistaa useita biologisia vaikutuksia kehitykseen ja kasvuun, erilaistumiseen, soluväliaineen tuotanto ja apoptoosin normaalien ja syöpäsolujen [7]. TGF-ß on negatiivinen kasvua säätelevää normaalien epiteelisolujen. Kun taas TGF-ß estää kasvainsolujen kasvua alkuvaiheessa Karsinogeneesin se edistää syövän etenemisen myöhemmissä vaiheissa [7]. Jo kauan on tiedetty, että TGF-ß yhdistelmänä muiden tekijöiden kanssa, kuten TGF-α ja EGF, edistää kiinnittymisestä riippumatonta kasvua normaalien fibroblastien [8]. EMT-indusoivaa aktiivisuutta TGF-ß pääasiassa välittyy Smad reitin, merkittävä reitti monimutkaisia ​​TGF-ß-signaalit, joka edistää ilmentymistä EMT liittyvien transkriptiotekijöiden mukaan lukien Snail, Slug, Twist, ja ZEB puoli [ ,,,0],6]. Nämä transkriptiotekijät sitoutuvat E-box sitova elementtejä promoottorisekvenssejä ja tukahduttaa ilmentyminen E-kadheriinin at transkription tasolla [9], [10].

EMT syöpäsoluissa parantaa ilmentymistä invasion- tai etäpesäkkeiden -aiheiset geenejä, kuten matriksin metalloproteinaasien (MMP: t). Meidän tuore tutkimus osoitti, että kasvaimen invaasio merkki laminiini γ2 sekä MMP-9 indusoi EMT induktion mahasyövän solujen [11]. Muut viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että EMT aiheuttama syöpäsolut ovat vastustuskykyä syöpälääkkeet ja radioaktiivisuus [12] ja on syöpä kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia [13]. Huolimatta useista ohi tutkimuksia EMT syöpäsolujen, on kuitenkin epäselvää, miten EMT vaikuttaa kasvaimen invaasion ja metastaasin ja mitä invasiivisia fenotyypit hankitaan EMT aiheuttama syöpäsoluja. Tämä on ainakin osittain johtuu siitä, että useimmat EMT ole tehty tavanomaisessa kaksiulotteinen (2D) kulttuuri järjestelmä. On käynyt selväksi, että soluja kasvatetaan tasainen 2D kulttuuri poikkeavat kasvatettu kolmiulotteisia (3D) kulttuurin solujen morfologia, lisääntymistä, erilaistumista, solu-solu vuorovaikutus, soluväliaineen vuorovaikutuksen ja geenien ilmentymisen [14], [15 ]. Jotta ymmärtää patologinen seuraus EMT syöpäsolujen näyttäisi olevan tärkeää luonnehtia EMT aiheuttamaa solujen useamman fysiologisen 3D kulttuurin järjestelmä.

Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu EMT aiheuttama syöpäsoluja sekä 2D yksikerrosviljelmään ja 3D kollageeni geeli kulttuuri, kolmella solulinjoja. Huomasimme, että EMT aiheuttama solut osoittivat merkittävä laajentaminen mikrotubulia perustuvien invasiivisia ulokkeita ja kasvun hidastuminen 3D kollageenigeelissä kulttuuriin.

Tulokset

EMT induktio Kolme Human Cancer Cell Lines

tutkimiseksi fenotyyppisten muutosten aiheuttama EMT syöpäsolujen, käytimme malleja kolmen ihmisen syöpäsolulinjoja. Olemme aiemmin raportoitu, että TGF-ß ja TNF-a synergistisesti aiheuttaa EMT seerumittomassa kulttuuri MKN-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja [11]. On raportoitu, että keuhkoadenokarsinooma A549 [17] ja haimasyövän solulinjaa Pancin-1 [16] tehdään EMT käsittelemällä TGF-ß. Tässä tutkimuksessa ensin testattiin kolme sytokiinien (TGF-ß, TNF-α, ja EGR) varten EMT induktion A549 ja Panc-1-solut, analysoidaan kuvaamaan joitakin syövän leviämisen markkereita sekä EMT markkereita. Molemmissa solulinjoissa, vain TGF-ß tarvittiin indusoimaan EMT arvioituna mesenkymaaliset elimellisen muutoksen (Fig. S1), sekä vähentäminen E-kadheriinin ilmentymisen ja induktio vimentiinista (Fig. 1A ja B). TGF-ß simuloitiin ilmaus kaksi kasvaimen invaasio markkereita, MT1-MMP ja laminiini γ2 ketju, molemmissa solulinjoissa. Kuitenkin yhdistelmä TNF-α TGF-ß entisestään tasot laminiinin γ2 ketjun ja MMP-9: A549-solut (Fig. 1A). Laminiinin γ2 ketju ja MT1-MMP myös indusoi TNF-α ja /tai EGF in Pancin-1-solut (Fig. 1 B). Lisäksi olemme havainneet, että vaikka sekä TNF-α: n ja TGF-ß tarvittiin EMT induktio MKN-1-soluja seerumittomassa kulttuuri ainoastaan ​​TGF-ß oli tarpeen seerumin läsnä ollessa (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että TGF-ß on yleisin ja indusoi EMT kolmen syöpäsolulinjoissa, mutta TNF-α tarvitaan myös tehokasta ekspressiota noin hyökkäyksen markkereita riippuen solutyypeissä.

A549 (A) ja Panc-1 (B) soluja inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa 10 ng /ml EGF: ää, 10 ng /ml TNF-α, 10 ng /ml TGF-ß, tai TNF-α + TGF-ß . Sen jälkeen, kun 48-tunnin inkuboinnin väliaine (CMS) ja solulysaatit valmistettiin ja alistettiin immunoblottaus EMT markkereita (E-kadheriinin ja vimentiinin solulysaateissa), invaasio markkeri laminiini γ2 (CMS), MT1-MMP (solulysaateista ), ja aktiini sisäisenä latauskontrollina (solulysaateista). Pienin paneelit osoittavat gelatiinitsymografialla MMP-9: n ja MMP-2 CMS. Suluissa olevat arvot osoittavat likimääräinen molekyyli- koko kDa. Muut koeolosuhteet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

vaikutus EMT induktio soluadheesiota ja Migration yksikerrosviljelmässä

Kuten edellä on esitetty, TGF-SS tehokkaasti aiheuttama EMT kolmessa eri sinoomasolulinjoja. Seuraavaksi tutkimme mitä fenotyypit hankittiin EMT induktion syöpäsolujen niiden invasiivisia kasvua. Ensinnäkin soluadheesiota aktiivisuus A549-solut tutkittiin jälkeen EMT induktion, kolmella soluadheesiota alustoille, laminiini-332, fibronektiini ja tyypin I kollageenin. Soluja esikäsiteltiin TGF-ß 24 tuntia ja sitten ympättiin näiden substraattien. Kuten kuvioissa. 2A ja 2B, käsittelemätön kontrolli solut tehokkaimmin kiinni laminiinin-332. TGF-ß hoitoon vain hieman vähensi soluadheesiota laminiinin-332. Sen sijaan, se lisäsi merkittävästi soluadheesiota tehokkuutta strooman substraattien fibronektiini ja tyypin I kollageenin. Sähköinen Aikaintervallitallennuksen soluadheesioanalyysin osoitti selvästi EMT-aiheuttamiin muutoksiin soluadheesiota aktiivisuus A549-solujen fibronektiiniin ja tyypin I kollageenin (Fig. 2C). Nämä muutokset havaittiin myös Panc-1 ja MKN-1-soluissa (tietoja ei esitetty).

(A ja B) yhdeksänkymmentäkuusi-kuoppainen levy päällystettiin 2 ug /ml laminiinia-332 (Lm332 ), 5 ug /ml fibronektiiniä (FN), ja 2 ug /ml kollageeni I (Col I) 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten blokattiin 1,2% BSA: ta, 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. A549-soluja inkuboitiin 10 ng /ml TGF-ß seerumittomassa väliaineessa 24 tunnin ajan. TGF-ß-käsiteltyjä soluja (TGF-ß) ja käsittelemättömät solut (Control) keskeytettiin ja ympättiin levylle. Kun oli inkuboitu 30 min, vaihekontrasti kuvat on otettu (A) ja soluadheesiota aktiivisuus mitattiin (B). Asteikko palkki osoittaa 50 pm. Suhteellinen määrä kiinnittyneitä soluja määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kukin pylväs osoittaa keskiarvoja ± SD tarttuvien solujen kolmena rinnakkaisena. (C) Sähkö nopeutus soluadheesioanalyysin E-levyillä. Levy esipäällystetty fibronektiinin (○, •) ja kollageeni I (□, ▪) kuten edellä on esitetty, ja tarttuvuus TGF-ß-käsiteltyjä soluja (TGF-ß: •, ▪) ja käsittelemättömien solujen (Ohjaus: ○, □) levylle seurattiin 5 minuutin välein. Cell-indeksi osoittaa mielivaltaista yksikköä heijastaa kiinnitys ja leviäminen solujen mikroelektrodi array pohjalle kuoppiin. Muut koeolosuhteet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

Toiseksi, solumigraatiota aktiivisuus tutkittiin käyttämällä kahta eri määrityksiä. In

in vitro

haavan paranemiseen määritys, TGF-ß merkittävästi edistänyt solujen migraation A549 ja Panc-1-soluja ilman TNF-α nojalla seerumia täydennettynä olosuhteissa (Fig. 3A ja B). TNF-α ei ole ylimääräistä vaikutusta solujen vaeltamiseen aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty). Kun solumigraation määritettiin viiveen video mikroskopia, solun liikkuvuus parantaa TGF-ß hoidon selvemmin esitetty kahdessa solulinjassa (kuvio. 3C). Meillä on myös vahvistanut, että TGF-ß käsittely lisäsi motiliteettia MKN-1-solujen haavan paranemista määrityksessä (tuloksia ei ole esitetty).

(A ja B) mittaamiseksi solumigraation aktiivisuutta, A549 (vasemmanpuoleiset paneelit) ja Panc-1 (oikea paneeli) solut altistettiin

in vitro

haavan paranemista määritys läsnä ollessa tai puuttuessa (kontrolli) ja TGF-ß, kuten tekstissä on kuvattu. Faasikontrasti- micrographs viljelmistä otettiin sen jälkeen, kun 16-tunnin inkuboinnin. Musta katkoviivat osoittavat alkuperäisen haavan reunat. Mittakaava, 50 pm. B) Solujen muuttoaluetta arvioitiin analysoimalla pikselin Image J. Kukin pylväs osoittaa keskiarvo ± SD aloilla siirtynyt solujen 3 eri aloilla (oikea paneeli). (C) Solut, jotka oli esikäsitelty ilman tai TGF-ß 24 tuntia inkuboitiin 1% FBS-sisältävä väliaine ilman tai TGF-ß päälle 24-kuoppaisen levyn 6 h ajan 37 ° C: ssa. Solu muuttoliike seurattiin Aikakierrosvideo järjestelmä 12 tuntia. Solujen migraation etäisyys mitattiin 15 satunnaisesti valittua solua. Kukin pylväs osoittaa keskiarvo ± SD solun vaellusnopeus 15 solua. Muut koeolosuhteet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

vaikutus EMT induktio on Anchorage riippuvaisia ​​ja riippumattaman Cell Growth

Kolmanneksi, solujen kasvua aktiivisuus EMT-indusoidun solujen tutkittiin kolmen eri olosuhteissa. 2D yksikerrosviljelmään, TGF-ß hoito ei vaikuta kasvua MKN-1-soluja ja mitättömän tai vain hieman tukahdutetaan, että A549 ja Panc-1-solut (Fig. 4A). Kun pesäkkeenmuodostus tutkittiin harva 2D viljelmät (500 solua /35 mm: n malja) A549 ja Panc-1-soluissa, ei ollut merkittävää eroa TGF-ß-käsiteltyjen ja ei-käsitellyissä viljelmissä (tuloksia ei ole esitetty). Suspensioviljelmässä ei-liima levyt, kolme solulinjojen kasvoi hitaasti muodostavien solujen aggregaatteja tai sferoideina levyille. Tällaisissa olosuhteissa, TGF-ß hoito tukahdutti kasvua MKN-1-soluissa, mutta ei ollut vaikutusta, että A549 ja Panc-1-solut (Fig. 4B). Sen sijaan pesäkkeiden muodostumista kolme solulinjojen pehmeässä agarissa viljelmä voimakkaasti tukahdutti TGF-ß hoitoon. Sekä kokonaismäärän pesäkkeiden ja koko siirtomaa-ala oli erittäin vähäinen TGF-ß-käsitellyn solulinjojen kuin ei-käsiteltyjen näytteiden (Fig. 4C, 4D ja S2). Kuitenkin, TGF-ß-käsitelty Panc-1-soluissa muodostaa suhteellisen suuria pesäkkeitä verrattuna ei-käsiteltyjen solujen (kuvio. S2). Puute E-kadheriinin välittämiä solun-soluadheesion TGF-ß-käsitellyistä soluista saattaisi tukahduttaa potentiaalit solujen selviytymisen ja proliferaation ankkurointi-riippumaton kunnossa.

(A) MKN-1 (1,0 × 10

4-solut), A549 (0,5 x 10

4-solut) ja Panc-1 (1,0 x 10

4-soluja) inkuboitiin kussakin kuopassa, joka sisälsi 1% FBS: ää sisältävässä väliaineessa ilman (kontrolli) tai TGF-ß 24. viljelylevyille 7 päivänä yksikerrosviljelmän. Inkubaation jälkeen solujen lukumäärä mitattiin solulaskijalla. Kukin pylväs osoittaa keskiarvo ± SD, että solujen määrä kolmena rinnakkaisena. (B) Soluja viljeltiin tiheydellä 1 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppaisille suspensioviljelmässä maljoilla, jotka sisälsivät 1% FBS: ää sisältävässä väliaineessa ilman (kontrolli) tai TGF-ß varten 7 päivää. Suhteellinen solujen lukumäärä mitattiin käyttämällä Dojindo solulaskennalla kit 8. Kukin pylväs osoittaa keskiarvo ± SD absorbanssiarvot 485 nm kolmena rinnakkaisena. (C ja D) Solut siirrostettiin tiheydellä 7000 solua per 35 mm malja 10% FBS: ää sisältävästä pehmeästä agarväliaine ilman (kontrolli) tai TGF-ß ja inkuboitiin 10 (MKN-1) tai 14 (A549 ja Pancin-1) päivää. Inkuboinnin jälkeen solut värjättiin

p

-iodonitrotetrazolium violetti, ja kokonaismäärän pesäkkeiden (C) ja yhteensä pesäkkeiden pinta-ala (D) määritettiin Image J ja esitetty suhteellisen määrän kontrolliin ( 100%). Kukin pylväs osoittaa keskiarvo ± SD kolmesta kaivosta. Muut koeolosuhteet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

Behavior EMT aiheuttaman syöpäsoluja 3D Kollageeni Gel Culture

Geenien ilmentyminen

in vivo

poikkeaa että yksikerrosviljelmässä järjestelmä (15). Koska kulttuuri, joka jäljittelee

in vivo

olosuhteissa, käytimme 3D kollageenigeelissä kulttuuri edelleen luonnehtia EMT aiheuttama syöpäsoluja. Syövän soluja viljeltiin sisällä kollageenia geelikerros TGF-ß ja /tai muihin tekijöihin 7 päivää. 3D-kollageeni geeli, MKN-1-solut osoittivat näkyvä kalvo laajennuksia tai ulkonemia, kun käsitelty TGF-ß (Fig. 5A ja B). Samanlainen elimellisen muutoksen havaittiin A549- ja Panc-1 solulinjoissa (kuvio. S3). Lisäämällä TNF-α TGF-ß-sisältävien kulttuuri edelleen edistää tämän elimellisen muutoksen ainoastaan ​​siinä tapauksessa, MKN-1-soluissa (kuvio. 5B). EGF yksin, joka indusoi EMT in MKN-1-solut, myös indusoi ulokkeen muodostuminen tässä solulinjassa, mutta tätä vaikutusta ei havaittu A549- ja Panc-1-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että morfologinen muutos on spesifinen EMT induktioon sijaan TGF-ß stimulaatiota.

(A) MKN-1 soluja inkuboitiin 3D kollageenia tai ilman merkitty sytokiinien 3-Kaivokammio diat 7 päivää. Viljelyväliaine vaihdettiin joka 3. päivä. Mittakaava, 50 pm. (B) jälkeen 5 päivän inkubaation, numerot solun koko möhkäleitä, ja niitä, joilla ulkonemat laskettiin keskellä alalla mikroskoopilla, ja prosenttiosuus ulokkeen-positiivinen solu möhkäleitä laskettiin. Kukin pylväs osoittaa keskiarvo ± SD suhteellisen määrän ulokkeen-positiivinen solu möhkäleitä kolmena rinnakkaisena. (C) jälkeen 7 päivän inkuboinnin jälkeen solut kollageenigeelissä värjättiin Dojindo solulaskennalla kit 8: ssa 4 tuntia, ja absorbanssi 485 nm: ssä kunkin viljelyalustaa mitattiin. Kukin pylväs osoittaa keskiarvoja ± SD absorbanssiarvot kolmena rinnakkaisena. Muut koeolosuhteet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

seuraava tutki EMT induktio tukahdutetaan solujen kasvua kollageenin geeli. Kuten todettu pehmeä agar, TGF-ß voimakkaasti tukahdutti kasvua kaikissa solulinjoissa tutkittu kollageenigeelissä (Fig. 5C). EGF ei koskaan tai vain heikosti esti kasvua kolmen solulinjojen 3D kollageenigeeli. TNF-α ei ollut mitään merkittävää lisävaikutusta näissä kulttuureissa. Nämä tiedot osoittavat, että EMT induktio edistää näkyvästi laajentaminen ulokkeita mutta estää solujen kasvua 3D kollageenigeelissä viljelmiä kolmesta syöpäsolun riviä.

Microtubule perustuva rakenne EMT aiheuttaman Ulokkeet 3D Kollageeni Gel

luonnehtia EMT aiheuttama ulokkeita, analysoimme cytoskeletal muutosten jälkeen EMT induktion TGF-ß. Rihmamaiset aktiini (F-aktiini) ja mikrotubulusten solun tukirankojen EMT-indusoidun solut värjättiin fluoresenssilla rodamiini phalloidine ja tubuliinin-spesifinen vasta-aine, vastaavasti. MKN-1-soluja stimuloitiin TGF-ß 2D- ja 3D-kulttuureista ja sitten värjättiin solun tukirankojen (6A ja B). 2D-kulttuuri EMT-indusoidun solujen, karkeita rasitukseen kuidut F-aktiini, sekä mikrotubulukset, tukee ainutlaatuinen solun muoto (Fig. 6A). 3D-kollageeni geeli, F-aktiini filamentit voimakkaasti havaittaviin pinnalla pallomaisten rakenteen stimuloimattomissa soluissa (Fig. 6B). TGF-ß-käsiteltyjä soluja, perifeerinen aktiinisäikeiden löydettiin ympäri solun elin ja ulokkeita, mutta stressi kuidut harvoin löytyy ulokkeet. Sen sijaan monet mikrotubuluskimppujen oli näkyvästi havaittiin keskellä ulkonemiin EMT-indusoidun solujen. Kontrollisoluissa, mikrotubulusten oli jakautunut tasaisesti sytoplasmassa. Nämä kuviot solun tukirankojen olivat yleisesti todettu MKN-1 ja Panc-1-soluissa (tietoja ei esitetty).

MKN-1-soluja inkuboitiin ilman (kontrolli) tai 10 ng /ml TGF-ß in serum- sisältävä väliaine 2D kulttuuri (A) tai 3D-kollageenigeelissä kulttuuri (B) 3 päivää. Nämä solut olivat fluoresenssi-värjätty α-tubuliinin (vihreä) käyttäen spesifistä vasta-ainetta, F-aktiini, jonka rodamiinifalloidiinia (punainen), ja DAPI (sininen). Fluoresenssikuvat saatiin konfokaalisella fluoresenssimikroskoopilla. Muut koeolosuhteet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

tutkia mikrotubulusten on periaatteessa tukirangan tukee EMT-indusoidun ulkonemia, tutkimme vaikutuksia joidenkin solun tukirangan estäjien EMT-indusoidun solun laajennus kollageenin geeli. Sytokalasiini B ja kolkisiini tiedetään estävän sekä polymeroinnin ja stabiloinnin F-aktiini ja mikrotubulusten, vastaavasti. Kun soluja käsiteltiin nämä inhibiittorit samaan aikaan kuin TGF-ß hoitoa, solun pidennys inhiboi osittain 1 uM sytokalasiini B, mutta täysin 10 nM kolkisiinia (Fig. 7A). Kun nämä inhibiittorit lisättiin 24 tunnin kuluttua TGF-ß stimulaatio, ulokkeet merkittävästi peruuttaa ne kolkisiinin jälkeen 3-h hoito, mutta ei Sytokalasiini B (Fig. 7B). Myös kaksi muuta mikrotubulusten estäjiä vinblastiinin ja taksolin (paklitakseli) annosriippuvaisesti esti solun laajennuksen kun lisätään yhdessä TGF-ß 3D-kulttuuri (Fig. S4). Analysoimme myös vaikutuksia joidenkin signaalin estäjien EMT aiheuttaman solun laajennus kollageenigeelissä. Proteiinifosfataasiin 2A (PP2A) estäjä cantharidin ja lämpösokkiproteiini-90 (HSP-90) estäjä radicicol, jotka molemmat estävät vakauttamiseen mikrotubulusten, heikosti inhiboi solun laajennus (Fig. 7C). Kun molemmat cantharidin ja radicicol lisättiin yhdessä, solussa laajennusta additiivisesti tukahdutetaan. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ulokkeet EMT-indusoidun syövän solujen 3D kollageenin geelin tuetaan pääasiassa mikrotubuluksiin ja molemmat PP2A ja HSP-90 toiminta ovat välttämättömiä, jotta ulokkeen muodostuminen. Vaikka aktiinisytoskeletonin tarvitaan laajentamaan ulokkeita, ei ilmeisesti ole tarpeen säilyttää ulokkeen rakenteita.

MKN-1-soluja inkuboitiin 10 ng /ml TGF-ß seerumia sisältävässä väliaineessa 3D kollageenigeeli kulttuuri , kuten on kuvattu kuvioissa 5 ja 6. kollageenin kulttuuri lisättiin eri inhibiittorit, ja ulokkeen muodostuminen kvantitoitiin 24 tuntia myöhemmin (A, C ja D) tai 3 tuntia myöhemmin (B). (A) Ilmoitetut pitoisuudet sytokalasiini B ja kolkisiini lisättiin elatusaineeseen samaan aikaan kuin TGF-ß lisäksi. (B) Sytokalasiini B (5 uM) ja kolkisiini (1 uM) lisättiin elatusaineeseen inkubaation jälkeen TGF-ß 24 tuntia. (C) MKN-1-soluja käsiteltiin ilman (kontrolli) tai cantharidin (1 uM) ja /tai radicicol (1 uM), kuten on kuvattu (A). (D) MKN-1-soluja esikäsiteltiin 10 ug /ml kumpaakin neutraali vasta-aineen 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja esikäsitellään solut upotetaan kollageeni geeli, joka sisälsi 10 ug /ml, osoitti anti-integriini-vasta-aine ja 10 ng /ml TGF-ß. Kaikki nämä inhibiittorit eivät olleet sytotoksisia edes edellä mainituissa koeolosuhteissa, kuten analysoitiin trypaanisinisellä värjäystä. Kuitenkin sytotoksisia vaikutuksia tuli esille, kun soluja inkuboitiin 5 uM sytokalasiini B tai 1 uM kolkisiinia 24 tuntia.

Ulkonemat muodostetaan EMT aiheuttama syöpä solujen kollageenigeelissä suuresti erosivat ulkonäöltään solun morfologian yksikerrosviljelmän. Tämä merkitsee sitä, että vuorovaikutus solujen kollageenin kanssa 3D-ympäristö on mukana uloke muodostumista. Tätä mahdollisuutta tutkittiin käyttämällä anti-integriini, neutraali vasta-aineita. Kuten odotettua, anti-integriini-α2 ja anti-integriini-SS1 vasta esti tehokkaasti laajentamiseen ulokkeita (Fig. 7D). Yhdistelmä kahden vasta-aineita esti voimakkaasti ulokkeen muodostuminen kuin kullekin vasta-aineelle. Nämä tulokset osoittavat, että muodostumista mikrotubuluksen-pohjainen ulkonemat edellyttää sekä EMT-indusoiva sytokiini, ja kollageeni /integriini signaaleja.

Erot muiden kirurgisten ulokkeita.

On hyvin tunnettua, että pahanlaatuisia syöpäsoluja hyökätä 3D-soluväliaineen laajentamalla joitakin erilaisia ​​pullistuma tai projektio. Invadopodium on aktiini-pohjainen, tyypillinen uloke on tuotettu invasiivisen syövän soluihin [18]. MT1-MMP uskotaan olevan markkeri invadopodia ja sen aktiivisuutta tarvitaan invadopodium muodostumista. Sen testaamiseksi, ulkonemat havaittu EMT aiheuttama syöpä solujen sisällä kollageenin geelin ovat identtisiä invadopodia, tutkimme vaikutus laaja MMP-estäjä (TAPI) ulkonemaan laajennus. Kun TAPI lisättiin samanaikaisesti TGF-ß osaksi kollageenia kulttuuriin, on vain vähän tai hyvin heikko vaikutus ulokkeen laajennus saatiin kolme testatut solulinjat (Fig. S5, A-C). Olennaisesti samat tulokset saatiin, kun TIMP-2, luonnollinen MMP-estäjä, käytettiin sijasta TAPI (tietoja ei esitetty).

Koska Src-kinaasiaktiivisuuden liittyy myös invadopodium muodostumista, tutkimme seuraavaksi vaikutuksia kolmenlaisia ​​Src estäjät, PP1 analoginen, SU6656 ja lavendustiinia C, on ulokkeen muodostumiseen 3D kollageenigeelissä. Kaikentyyppisiä estäjien ei tukahduttaa ulokkeen muodostumisen MKN-1-soluissa (kuvio. S5, D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EMT aiheuttama uloke on erilainen solurakenne päässä invadopodium.

Microtubule-pohjainen ulkonemiin Snail aiheuttama EMT solujen Kollageeni Gel

Kuten edellä on esitetty, TGF-p- stimuloi syöpäsolujen yleisesti ulottaa mikrotubulia perustuva invasiivisia ulkonemiin 3D kollageenigeelissä kulttuuriin. Jotta enemmän yleistää tätä ilmiötä, perustimme vakaasti EMT aiheuttamaa solujen käyttöön etana cDNA ekspressiovektori Pancin-1-solut (Snail-Panc-l). Kuten TGF-ß-stimuloitujen solujen Snail-Panc-l-solut osoittivat hajallaan solujen morfologia verrattuna tyhjän vektorin-transfektoidut, kontrollisolut (Mock-Panc-1) (Fig. 8A). Mukaisesti elimellisen muutoksen, E-kadheriinin ilmentyminen tukahdutetaan ja vimentiinin n ekspressio oli lisääntynyt Snail-Panc-l-soluissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 8A). Kun nämä transfektoidut solut ympättiin 3D kollageenigeeli, Snail-Panc-l, mutta ei mock-Panc-1-soluja laajennettiin mikrotubulusten-pohjainen, kestävä ulkonemat ilman TGF-ß (Fig. 8B). Laajentamalla ulkonemia Snail-Panc-l-soluissa voimakkaasti inhiboi kolkisiinin mutta tuskin by sytokalasiini B (Kuva. 8C ja D). Nämä tiedot tukevat myös, että mikrotubuleihin perustuu ulokkeen muodostuminen heijastaa EMT 3D kollageenigeelissä.

Panc-1-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (vale-Panc-1) tai etana ekspressiovektoriin (Snail-Panc -1), ja niiden vakaa transfektantit perustettiin. Näitä soluja viljeltiin ilman TGF-ß 2D yksikerrosviljelmässä tai 3D kollageenin geeli kulttuuriin. (A) morfologia Mock-Pancin-1 (ylempi paneeli) ja Snail-Pancin-1 (alempi paneeli) soluja inkuboitiin 2 päivää 2D yksikerrosviljelmässä, ja ilmentyminen E-kadheriinin, vimentiinistä ja etana näissä soluissa (oikea paneeli ). Katso kuva 1 koeolosuhteissa. Mittakaava, 50 pm. (B) morfologia Mock-Pancin-1 (ylempi paneeli) ja Snail-Pancin-1 (alempi paneeli) soluja inkuboitiin 3D kollageenigeelissä kulttuuri 3 päivää, ja niiden uloke muodostumiseen (oikea kuva). Katso Kuva 5. koeolosuhteissa. Mittakaava, 50 pm. (C ja D) vaikutukset 1 uM cholchicine (C) ja 5 uM sytokalasiini B (D) pullistuma muodostumiseen 3D kollageenigeelissä kulttuuriin. Nämä inhibiittorit lisättiin elatusaineeseen 24-tunnin inkuboinnin TGF-ß. Muut koeolosuhteet ovat samat kuin kuvioissa 5 ja 7B.

Vertasimme myös kasvun potentiaalit kiinnittymisestä riippuvaisten ja riippumattomien olosuhteet välillä Mock-Pancin-1 ja Snail-Panc-l-soluissa. Ei ollut merkittävää eroa kasvu kahden eri solujen yksikerrosviljelmässä (kuvio. 9A). Pehmeässä agar, molemmat kokonaismäärä pesäkkeiden lukumäärä ja koko pesäkkeiden ala oli selvästi pienempi Snail-Panc-l-soluissa kuin Mock-Pancin-1-soluissa (kuvio. 9B ja C), mutta suuria pesäkkeitä oli runsaampaa Snail-Panc-l solut kuin kontrollisolut (kuvio. 9D). Solu lisääntymistä kollageenin geeli oli hiukan, mutta merkitsevästi vähemmän Snail-Panc-l-soluissa kuin kontrolli solut (

p

0,05) (kuvio. 9E).

(A) Yksikerroksinen kulttuuri. Mock-Panc-1 (avoin pylväs) ja Snail-Panc-1 (suljettu pylväs) ympättiin tiheydellä 1,0 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille 10% FBS: ää sisältävää väliainetta ja inkuboitiin 7 päivää. Inkubaation jälkeen solujen lukumäärä mitattiin solulaskijalla. (B-D) Pehmeä agar. Mock-Pancin-1 ja Snail-Pancin-1 soluja viljeltiin pehmeässä agarissa väliaineessa 14 päivää. Inkubaation jälkeen kokonaismäärän pesäkkeiden (B) ja koko siirtomaa-ala (C) analysoitiin Image J. pehmytagar Viljelmät valokuvattiin ja jokainen tyypillinen kuva näytetään (D). Mittakaava, 500 um. Muut koeolosuhteet olivat samat kuin on kuvattu kuviossa 4. (E) Kollageeni kulttuuriin. Mock-Panc-1 ja Snail-Panc-1-soluja viljeltiin 3D kollageenin geelin 7 päivää, kuten on kuvattu kuviossa 5. Inkubaation jälkeen suhteellinen solujen lukumäärä mitattiin käyttämällä Dojindo solulaskennalla kit 8.

keskustelu

tässä tutkimuksessa käytimme EMT malleja kolmen ihmisen sinoomasolulinjoja (A549, Panc-1 ja MKN-1) kuvaamaan EMT aiheuttama solujen sekä 2D- että 3D-kulttuuri järjestelmät . Yhteisymmärryksessä muiden tutkimusten [16], [17], A549- ja Panc-1-solut osoittivat tyypillisiä EMT fenotyyppejä hoidon jälkeen TGF-ß yksin 2D yksikerrosviljelmissä. MKN-1-soluja tarvitaan TGF-ß plus TNF-α seerumivapaassa väliaineessa EMT induktion kuten on raportoitu aiemmin [11], mutta vain TGF-ß tarvittiin seerumia sisältävässä väliaineessa. Expression kahden hyökkäyksen markkereita laminiinin γ2 ja MT1-MMP liittyi EMT induktion näistä solulinjoista. Kuitenkin MMP-9 ja laminiinin γ2 oli paljon suurempi TGF-ß plus TNF-α kuin TGF-ß yksinään [11]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hankinta invasiivisen fenotyyppien syöpäsolujen edellyttää TNF-α ja /tai muut tekijät kuin TGF-ß, vaikka TGF-ß yksin riittää morfologisiin EMT induktio.

Tämä tutkimus osoitti, että EMT aiheuttama A549-solut tehokkaammin kiinni peruskudoksen soluadheesion substraatteja fibronektiinin ja tyypin I kollageenin yli indusoimatonta kontrollisolut, vaikka soluadheesiota tyvikalvon substraatin laminiinin-332 ei ole muuttanut EMT induktion. Tämä on yhdenmukaista sen kanssa, että ilmaus strooman soluväliaineen proteiineihin, kuten fibronektiiniin, ja tyypin I kollageeni on parannettu EMT induktion [16]. Olemme myös vahvistanut lisääntynyt fibronektiinin tuotanto EMT-indusoidun solujen 2D-viljelmässä (tuloksia ei ole esitetty). On erittäin todennäköistä, että EMT aiheuttama muutos soluadheesion aktiivisuuden riippuu että integriini ilmaisua. Lisäksi osoitimme, että solu muuttoliike potentiaalit kolme solulinjojen 2D kulttuurin kasvatti merkittävästi EMT induktio, yhteisymmärryksessä tulokset Pancin-1-soluissa raportoineet Horiguchi et al. [17]. Nämä fenotyyppisiä muutoksia, jotka ovat yhdenmukaisia ​​yleisten käsitteen EMT, näyttävät vaaditaan syöpäsoluinvaasiota kautta interstitiaalinen strooman kudoksiin.

Tämä tutkimus paljasti suuria eroja fenotyypit EMT aiheuttama syöpäsolujen 2D- ja 3D kulttuureissa. Ensinnäkin solujen kasvua vastauksena TGF-ß oli täysin erilainen kahden kulttuurin järjestelmiä.