Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

parantamiseksi elämänlaatua peräsuolen syöpäpotilailla, on tärkeää luoda uusia seulontamenetelmiä varhaisen diagnoosin kolorektaalisyövän.

Menetelmät /Principal havainnot

Me tehdään seerumin Metabolomi analyysi käyttäen kaasukromatografia /massaspektrometrialla (GC /MS). Ensinnäkin, tarkkuutta meidän GC /MS-pohjainen seerumin metabolomic analyysimenetelmä arvioitiin laskemalla RSD% arvot seerumin eri aineenvaihduntatuotteiden. Toiseksi päivän sisäinen (aamulla, päivällä ja yöllä) ja inter-päivä (joukossa 3 päivää) varianssit seerumin metaboliittitasoihin tutkittiin. Sitten seerumi metaboliittitasoihin verrattiin toisiinsa peräsuolen syövän potilaiden (N = 60, N = 12 kussakin vaiheessa 0-4) ja iän ja sukupuolen sovitettu terveillä vapaaehtoisilla (n = 60) kuin koulutus asetettu. Metaboliitit joiden tasot näkyvissä merkittäviä muutoksia tehtiin useita logistisen regressioanalyysin avulla portaittain muuttuva valintatapa ja peräsuolen syöpä ennustemalli perustettiin. Ennustemalli koostui 2-hydroksibutyraatti, asparagiinihappo, kynureniini, ja kystamiini, ja sen AUC, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus olivat 0,9097, 85,0%, 85,0%, ja 85,0%: lla, mukaan opetusjoukolla tiedot. Sen sijaan, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus CEA olivat 35,0%, 96,7%, ja 65,8%, vastaavasti, ja niille CA19-9 oli 16,7%, 100%, ja 58,3%, vastaavasti. Voimassaolo ennustemallissa varmistettiin käyttämällä peräsuolen syövän potilaista (N = 59) ja terveillä vapaaehtoisilla (n = 63) kuin validointi asetettu. Tällä validointi asetettu, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus ennustemallissa olivat 83,1%, 81,0%, ja 82,0%, tässä järjestyksessä, ja nämä arvot olivat lähes samat kuin ne, jotka saatiin koulutusta asetettu. Lisäksi mallissa erityisen suuri havaitsemiseksi vaiheessa 0-2 peräsuolen syöpä (82,8%).

Johtopäätökset /merkitys

ennustemalli perustettu GC /MS-pohjainen seerumi metabolomic analyysi on arvokasta varhaisen havaitsemisen peräsuolen syövän ja on potentiaalia tulla uusi seulontatesti peräsuolen syövän.

Citation: Nishiumi S, Kobayashi T, Ikeda A, Yoshie T, Kibi M, Izumi Y, et al. (2012) romaani Seerumin Metabolomiikka-Based Diagnostic toimintamalli peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (7): e40459. doi: 10,1371 /journal.pone.0040459

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 7 kesäkuu 2012; Julkaistu: 11 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Nishiumi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Global COE Program, Global Center of Excellence for koulutus ja tutkimus Signaalinvälittyrnismääritykset Medicine tulevina Generation opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology (MEXT) Japanin (TK, TY, MK, TA, ja MY); Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia alueita päässä MEXT Japanin (SN ja TA); Education Program Erikoistunut kliinikoille Support Program for parantaminen Graduate School Education päässä MEXT Japanin (AI); ja avustukset projektitutkimusta (Perustietämyksen teknologian analysointia ja arviointia toiminnallisten maataloustuotteiden ja funktionaalisia elintarvikkeita) alkaen maa-, metsä- ja kalatalouden (MAFF) Japanin (MY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpäkuolemien kehittyneissä maissa [1]. Hoitomenetelmät perustuvat kolonoskopia ja leikkaus ovat kehittyneet nopeasti, ja suuri määrä potilaita, joilla peräsuolen syöpä aikaan parannuksia hoidon jälkeen. Kuitenkin pitkälle peräsuolen syövän heikentää elämänlaatua potilailla, jotka saavat operatiivista hoitoa tai kemoterapiaa. Siksi, jotka mahdollistavat varhaisen havaitsemisen ja diagnoosi paksusuolisyövän parhaillaan etsitään. Ulosteen piilevän veren testi (FOBT) on yleisimmin käytetty seulontamenetelmä diagnosointiin peräsuolen syövän ja on noninvasive ja edullinen menetelmä. Kuitenkin FOBT on alhainen herkkyys, varsinkin alkuvaiheessa peräsuolen syöpä. Kolonoskopia on tarkempi ja luotettavampi lähestymistapa diagnosointiin peräsuolen syöpä, mutta se on vaikeaa vanhuksille tai vakavasti sairailla potilailla tehdään kolonoskopia, ja sen korkea hinta on myös ongelma. Näin ollen, tutkimukset, joihin liittyy yhdistelmä tavanomaisten seulontamenetelmiä on käytetty diagnosointiin peräsuolen syövän; kuitenkin, näitä tutkimuksia havaita vain noin 40% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [2]. Siksi on tarpeen vahvistaa uusia seulontamenetelmiä varhaistoteamiseen paksusuolen syövän, jotka ovat erittäin herkkiä, erityisiä, helppo, ja noninvasive.

Ihmisen genomin oli täysin tunnistettu loppuun mennessä 2003. Sen jälkeen , proteomiikka, joka on kattava tutkimus koko joukko proteiineja ilmaistaan ​​genomi, on tutkittu laajasti, ja monet tutkijat ovat yrittäneet soveltaa proteomiikka analyysin lääketieteen alalla, jotta löydettäisiin tehokkaita diagnostisia markkereita ja selventämään tuntematon patologisten tilojen [ ,,,0],3]. Äskettäin metabolomiikan, joka on kattava tutkimus pienimolekyylisten aineenvaihduntatuotteiden, on myös kehitetty. Kliinisissä tutkimuksessa mukana Metabolomi analyysi yhdistämällä suurikapasiteettisten neste-kromatografia /massaspektrometrialla (LC /MS) ja kaasukromatografia /massaspektrometrialla (GC /MS), Sreekumar et al. osoittivat, että sarkosiini on potentiaalisesti tärkeä metabolinen välittäjänä eturauhasen syöpäsoluinvaasiota ja aggressiivisuuden [4]. Lisäksi kattavan ja kvantitatiivinen analyysi varautuneiden metaboliittien kasvain ja normaaleissa kudoksissa saatu peräsuolen ja mahasyöpäpotilaista suoritettiin käyttäen kapillaarielektroforeesijärjestelmiä-massaspektrometriaa (CE /MS) [5]. Näin ollen eri kliinisistä näytteistä on analysoitu Metabolomi analyysi käyttäen ydinmagneettisen resonanssin (NMR), GC /MS, LC /MS, CE /MS, ja /tai matriisin laserdesorptio-ionisaatio-massaspektrometrialla (MALDI-MS) selventämiseksi sairauden puhkeamista mekanismeja ja löytää uusien biomarkkereiden [6]. Näistä tekniikoista, GC /MS: llä on pitkä historia ja se on helpompi käyttää kuin CE /MS tai MALDI-MS, vaikka GC /MS: llä on alhainen herkkyys verrattuna LC /MS: llä. Lisäksi on olemassa lisää tietokantoja GC /MS-pohjainen metaboliitti seerumissa analyysin tulokset kuin LC /MS-pohjainen metaboliitti seerumissa analyysitulokset. Lisäksi GC /MS voidaan soveltaa suuren mittakaavan tutkimuksia suhteellisen helposti, koska sen korkea toistettavuus. Siksi tässä tutkimuksessa seerumin metaboliittitasoihin paksusuolisyövän potilaiden ja terveiden vapaaehtoisten analysoitiin GC /MS-analyysi luoda uusia diagnostisia työkaluja ja peräsuolen syövän sekä vakautta ja toisiinsa päivän ja päivän sisäinen varianssien näiden seerumin metaboliittitasoihin arvioitiin myös. Käyttämällä koulutus muodostuu enintään kolorektaalisyövän potilaista (N = 60) ja terveillä vapaaehtoisilla (n = 60), peräsuolen syöpä-ennustemalli perustettiin kautta useita logistisen regressioanalyysin avulla portaittain muuttuva valintatapa. Sitten pätevyyttä ennustemallissa arvioitiin käyttäen validointi joukko koostuu kolorektaalisyövän potilaista (N = 59) ja terveillä vapaaehtoisilla (n = 63).

Methods

Etiikka ja Osallistujat

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettinen komitea Kobe University Graduate School of Medicine, ja suoritetaan välillä helmikuu 2009 ja joulukuu 2011. ihmisen näytteitä käytettiin ohjeiden mukaisesti Kobe University Hospital, ja kirjallinen ilmoitti suostumus saatiin kaikissa aineissa. Laskea suhteellinen keskihajonta (RSD)% ja seerumin Metabolomi analyysitulokset saatiin GC /MS, verinäytteet kerättiin yksi terve 30-vuotias mies vapaaehtoinen paaston jälkeen aikaisin aamulla, ja seerumi erotettiin sentrifugoimalla 3000 xg 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Seerumi siirrettiin puhtaaseen putkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Arvioidaan päivän sisäinen vaihtelu seerumissa metaboliittitasoihin, koko verinäytteet kerättiin terveillä vapaaehtoisilla (n = 16) klo 8.00-9: keskiyö ennen aamiaista, 12:00-1: kaksikymmentäneljä ennen lounasta, ja 18:00-7: kaksikymmentäneljä ennen illallista. Arvioimaan muun päivän vaihtelu seerumissa metaboliittitasoihin, kokoverinäytteistä (n = 16) kerättiin 08:00-9: keskiyö ennen aamiaista kerran päivässä yhteensä 3 päivää. Koulutusta asetettu, 60 seeruminäytteet kukin saatiin kolorektaalisyövän potilaille ja terveille paaston jälkeen varhain aamulla. Validointia asetettu, 59 ja 63 seerumi kerättiin peräsuolen syöpäpotilaiden ja terveillä vapaaehtoisilla. Seerumi näytteitä peräsuolen syöpäpotilaiden kerättiin Koben yliopistollisessa sairaalassa. Mikään syöpäpotilaiden ollut monimutkaistaa sairauksia. Potilaat diagnosoitiin mikroskoopilla, koepala, tai kirurginen resektio ja luokitellaan joko kuudes painos International Union Against Cancer luokitus (UICC). Seerumi näytteitä terveillä vapaaehtoisilla saatiin Koben yliopistollisen sairaalan ja kaksi muuta tilat. Kobe University Hospital, vahvistettiin, että ei ole poikkeavuutta verikokeita, endoskooppinen tutkimukset, kuvantamisen, ja /tai lääkärin haastattelussa. Kahden muut tilat, terveitä vapaaehtoisia valittiin kautta terveystarkastuksista verikokeita, endoskooppinen tutkimukset, kuvantamisen, ja /tai lääketieteelliset haastatteluja. Yksilöt, jotka oli diagnosoitu hoitoa vaativa, yksityiskohtaiset tutkimukset, ja /tai havaintoja ei pidetty terveillä vapaaehtoisilla. Ominaisuudet kaikkien aineiden on esitetty taulukossa 1, taulukossa S1, ja taulukossa S2.

Kokeelliset menetelmät

uutto alhaisen molekyylipainon metaboliitteja suoritettiin kuvatulla menetelmällä edellisessä raportissa [7]. Lyhyesti, 50 ui seerumia sekoitettiin 250 ul: aan liuotinseosta, (MeOH: H

2O: CHCl

3 = 2,5: 1: 1), joka sisälsi 10 ui 0,5 mg /ml 2-isopropylmalic happoa (Sigma -Aldrich, Tokio, Japani) liuotettiin tislattuun veteen sisäisenä standardina, ja sitten liuosta sekoitettiin 1200 rpm: llä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ennen kuin sentrifugoitiin 16000 x g: ssä 3 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kaksisataa ja kaksikymmentä viisi ui tuloksena supernatantti siirrettiin puhtaaseen putkeen, ja 200 ui tislattua vettä lisättiin putkeen. Sen jälkeen, kun on sekoitettu liuos sentrifugoitiin 16000 x g 3 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja 250 ui tuloksena supernatantti siirrettiin puhtaaseen putkeen, ennen kuin kylmäkuivattiin käyttäen kylmäkuivaimella. Sillä oksiimin, 40 ui 20 mg /ml metoksiamiinihydrokloridia (Sigma-Aldrich, Tokio, Japani) liuotettiin pyridiiniin sekoitettiin lyofilisoitu näyte, ennen kuin se sekoitettiin 1200 rpm: llä 90 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Seuraavaksi 20 ui N-metyyli-N-trimetyylisilyyli-trifluoriasetamidia (MSTFA) (GL Science, Tokio, Japani) lisättiin johdannaisen, ja seosta inkuboitiin 1200 rpm 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten seosta sentrifugoitiin 16000 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja tuloksena supernatantti alistettiin GC /MS-mittaus.

menetelmän mukaisesti kuvataan aiemmassa raportissa [8], GC /MS analyysi suoritettiin käyttäen GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Co., Kioto, Japani), jossa on kvartsilasikapillaarikolonnissa (CP-SIL 8 CB pieni vuoto /MS; 30 m × 0,25 mm sisähalkaisija, kalvon paksuus: 0,25 pm; Agilent Co., Palo Alto, CA). Edessä sisääntulo lämpötila oli 230 ° C. Virtausnopeus heliumin pylvään läpi oli 39,0 cm /s. Pylvään lämpötila pidettiin 80 ° C: ssa 2 min ajan ja sitten se nostettiin 15 ° C /min 330 ° C: seen ja pidettiin siinä 6 min. Siirtolinja ja ioni-lähteen lämpötilat olivat 250 ° C ja 200 ° C: ssa, vastaavasti. Kaksikymmentä skannausta sekunnissa kirjattiin yli massa-alueella 85-500 m /z käyttämällä Advanced Skannausnopeus Protocol (ASSP, Shimadzu Co.). Tässä tutkimuksessa havaitseminen jännite vahvistettiin päivittäin ennen GC /MS-analyysi, koska tämä arvo heijastuu likaisuudesta instrumentissa. Lisäksi nollanäytteet mitattiin ennen mittausta seeruminäytteistä. Aikana GC /MS-analyysi, 20 näytettä per 1 päivä mitattiin, ja väliseinän ja lasiputkeen GC tulo- vaihdettiin joka 100 injektioita pylvääseen.

Tietojenkäsittely suoritettiin kuvattujen menetelmien Aiempien raporttien [8], [9]. Lyhyesti, MS data vietiin netCDF muodossa. Huippu havaitseminen ja linjaus suoritettiin käyttäen MetAlign ohjelmistoa (Wageningenissa UR, Alankomaat). Tuloksena tiedot vietiin CSV-muodossa ja sitten analysoitiin in-house analyyttinen ohjelmisto (AIoutput). Tämä ohjelmisto mahdollistaa piikin tunnistamisen ja semi-kvantifiointiin käyttämällä in-house metaboliitin kirjasto. Semi-määrän, piikin korkeus kunkin ionin laskettiin ja normalisoitiin huipun korkeus 2-isopropylmalic happoa sisäisenä standardina. Nimet oli kullekin metaboliitille piikin perustuen kuvattua aiemman raportin [9]. Kaikki saadut seerumin näytteet altistettiin MetAlign ohjelmisto kerralla, koska sama suuntaus tarvittavat edellytykset voidaan suorittaa kaikissa data-analyysi. GC /MS-analyysi, useita huippuja joskus havaitaan tietyn metaboliitin vuoksi TMS-johdannaisten, isomeerimuodossa, jne. Tällaisissa tapauksissa, huippu, että suurin osa heijastuu taso metaboliitin hyväksyttiin semi-kvantitatiivinen arviointi.

tilastollinen analyysi

potilaat (N = 119) on kohdistettu koulutukseen ja validointi sarjoiksi seuraavasti. Kolorektaalikarsi- syöpäpotilaan näytteitä harjoitussarjassa kerättiin ilman ennalta valintakriteerit, ja 12 peräsuolen syövän potilasta valittiin kunkin taudin vaiheessa (N = 60). Mitä terveiden vapaaehtoisten koulutuksessa käytettävien asetettu, ikä ja sukupuoli-ohjattu näytteet valmistettiin (N = 60). Vuonna harjoitussetti tutkimuksessa tasot aineenvaihduntatuotteiden verrattiin toisiinsa peräsuolen syövän potilaiden ja terveiden vapaaehtoisten avulla U-testi. Niistä aineenvaihduntatuotteiden että näytössä merkittävästi eri ryhmien kesken (

p

0,05), valitsimme aineenvaihduntatuotteiden kanssa RSD% arvoista enintään 20% ja joka ei näy merkittäviä sisäisiä päivä tai kansainvälisten päivä vaihtelut mukaan Wilcoxonin rank testi ja Steel-Dwass testi, vastaavasti. Valitut aineenvaihduntatuotteet tehtiin vaiheittaista muuttuja valintatapa seurasi useita logistista regressioanalyysiä, ja nämä analyysit suoritettiin käyttäen oletuksena ehdot JMP9 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Multikollineaarisuus metaboliittien valitun kautta portaittain muuttuva valintatapa vahvistettiin laskemalla varianssiensa Inflaatiotekijöiden (VIF). AICC, joka on Akaike Information Criterion (AIC) ja korjausta rajallinen otoskoot, laskettiin valaista optimaalinen määrä tekijöitä sisällyttää ennustemallien. Nagelkerke R

2 laskettiin myös arvioida kunnon monimuuttujatestauksen logistinen malli. Vastaanotin toimii (ROC) analyysi suoritettiin käyttäen JMP9 (SAS Institute Inc.), ja optimaalinen raja-arvo ja AUC, spesifisyys, herkkyys ja tarkkuus laskettiin. Vuonna validointi asetettu tutkimuksen, ennustemallissa arvioitiin uudelleen käyttäen eri näytettä, ja spesifisyys, herkkyys ja tarkkuus mallin tutkittiin käyttäen cut-off-arvo on saatu opetusjoukolla.

p

arvot alle 0,05 katsottiin osoittavan merkittävä ero.

Tulokset

Meidän GC /MS-pohjainen metabolomic analyysijärjestelmä, joka pääasiassa suunnattu vesiliukoisia aineenvaihduntatuotteiden, 132 metaboliitteja todettiin koehenkilöiden seerumit (taulukko S3). Niistä 132 aineenvaihduntatuotteita, 1 metaboliitti; eli 2-isopropylmalic happoa, käytettiin sisäisenä standardina, ja 5 metaboliitteja olivat luultavasti uutettiin ei-seerumista, esimerkiksi, ne, jotka ovat peräisin eppendorfputkiin. Siksi nämä 6 aineenvaihduntatuotteiden jätettiin myöhemmin analyysit. Koska oxalacetic happo muutettiin pyruvaatti edeltävässä hoitotoimenpide, oxalacetic happo havaittiin kuten pyruvaattia järjestelmäämme. Siksi on kuvattu ”pyruvaatti + oxalacetic hapon” in Laatikostot ja ”pyruvaatti”, joka oli juuri havaittua GC /MS-analyysia tässä käsikirjoitus. Koska niiden vastaavia rakenteita, sitruunahappo ja isositruunahappo havaittiin samalla retentioajalla meidän järjestelmän. Tämän vuoksi niitä kuvataan ”sitruunahappo + isositruunahappo”. Koska kysteamiini muutettiin Kystamiini edeltävässä hoitotoimenpide, kysteamiini detektoitiin Kystamiini järjestelmämme. Siksi on kuvattu ”kysteamiini + Kystamiini” in Laatikostot ja ”kystamiini”, joka oli juuri havaittua GC /MS-analyysia tässä käsikirjoitus. Koska kysteiini muunnettiin kystiini edeltävässä hoitotoimenpide, kysteiini detektoitiin kystiiniksi järjestelmämme. Näin ollen on kuvattu ”kysteiini + kystiini” in tukeminen taulukoissa ja ”kystiini”, joka on itse asiassa havaittu GC /MS-analyysi, tässä käsikirjoitus.

stabiilius arvioitiin tämän järjestelmän käyttäen ihmisen seerumi, seerumin eri metaboliittia erikseen analysoitiin seeruminäytteistä (N = 10) saatu 1 terveillä vapaaehtoisilla (mies, 30-vuotias), ja sen jälkeen RSD% arvot aineenvaihduntatuotteiden laskettiin (taulukko S3). Prosenttiosuus metaboliittien RSD% arvoista on alle 20% ja 30% oli 68,5% ja 86,5%, vastaavasti. Seuraavaksi inter-päivä (joukossa 3 päivää) ja päivän sisäinen (aamulla, päivällä ja yöllä) varianssit seerumin aineenvaihduntatuotteiden arvioitiin käyttäen Wilcoxonin rank testi ja Steel-Dwass testissä (taulukko S3), koska merkittävän päivän sisäinen ja /tai muun päivän varianssi todennäköisesti johtaa alhainen herkkyys ja spesifisyys on kliinisessä käytössä. Monet aineenvaihduntatuotteita ei näy merkittävää sisäistä päivä ja päivän sisäinen varianssiin mutta 30 aineenvaihduntatuotteita, esimerkiksi dihydroksiasetonia ja tryptofaania, osoittivat merkittäviä eroja. GC /MS-analyysi, useita huippuja joskus havaitaan tietyn metaboliitin vuoksi TMS-johdannaisten, isomeerimuodossa, jne. Tällaisissa tapauksissa, huippu, että suurin osa heijastaa taso metaboliitin annettiin myöhempää arviointia. Näiden metaboliittien termit ”_1”, ”_2”, ja ”(TMS) lisättiin päihin nimensä menetelmän mukaisesti edellisen raportin [9]. Ekskluusiohuippu huiput on merkitty termillä ”Minor” taulukossa S4, ja sen jälkeen ilman ”Minor” huiput yhteensä 107 aineenvaihduntatuotteiden olivat niiden tasoa verrataan peräsuolen syövän potilaiden ja terveiden vapaaehtoisten (kuvio 1, taulukko S4).

keskimääräinen kertamuutoksia tasojen 107 aineenvaihduntatuotteiden havaittiin vertailun peräsuolen syövän potilaiden (N = 60) ja terveillä vapaaehtoisilla (n = 60) (koulutus sarja) on esitetty kuviossa 1. GC /MS-analyysia useita piikkejä joskus havaitaan tietyn metaboliitin vuoksi tMS-johdannaisten, isomeerimuodossa jne Tällöin huippu että suurin heijastunut taso metaboliitin hyväksyttiin myöhempää arviointia. Lisäksi kukin aineenvaihduntatuotteen oli termi ”_1”, ”_2”, tai ”(TMS) lisätään loppuun nimensä, kuten kuvattu aiemmassa raportissa [7]. Tämä luku ei sisällä tausta aineenvaihduntatuotteiden tai pieni piikki johdettujen metaboliittien.

harjoitussetti tutkimuksessa seerumin metaboliittitasoihin että peräsuolen syövän potilaiden ja terveydenhuollon vapaaehtoisilla verrattiin käyttäen U-testi (Taulukko S4). Harjoitussarjassa koostui paksusuolisyövän potilaista (N = 60) ja iän ja sukupuolen sovitettu terveillä vapaaehtoisilla (n = 60) (taulukko 1, taulukko S1). Ei ollut merkittävää eroa keski-ikä tai BMI arvojen kaksi ryhmää (taulukko 1). Tässä tutkimuksessa peräsuolen syöpä oli myös luokiteltu 2 ryhmään; so ryhmä 1 sisältyy vaihe 0, 1, ja 2 sairaus (puuttuminen ja metastaasit) ja ryhmä 2 sisältyvät vaiheen 3 ja 4 sairaus (läsnäolo ja metastaasit). Tuloksista on GC /MS-analyysi, 27 aineenvaihduntatuotteet, jotka täyttivät seuraavat ehdot valittiin biologisten merkkiaineiden ehdokkaille: an RSD% arvosta 20%; mitään merkittävää (p≥0.05) päivän sisäinen tai useamman päivän varianssien mukaan Wilcoxonin rank testi ja Steel-Dwass testi; ja, kun läsnä on merkitsevä ero (p 0,05) välillä tasojen peräsuolen syövän potilaille ja terveille mukaan Mann-Whitneyn U-testi. ROC käyrät tuotettiin käyttäen tietoja näitä 27 aineenvaihduntatuotteiden (kuva S1), ja cut-off-arvo, AUC, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus kunkin metaboliitin laskettiin (taulukko 2). Tämän seurauksena, nonaanihappo (C9) ja p-hydroksibentsoehapon näkyy suhteellisen suuri herkkyys, joiden arvot 86,7% ja 90%, vastaavasti. Erityisyydestä, Kystamiini ja kystiini molemmat osoittivat arvoja 90%, ja ornitiinin (86,7%), sitrulliini (85,0%), ja palmitoleate (85,0%) osoitti myös suhteellisen korkea spesifisyys. Kuitenkin, ei ollut aineenvaihduntatuotteita tarkkuustasot yli 80%, mikä viittaa siihen, että on välttämätöntä suorittaa arviointeja käyttämällä useita aineenvaihduntatuotteen biomarkkereita.

Koska uusi arviointimenetelmä, sovellettavuutta useita logistisen regressiomallin mukana useiden aineenvaihduntatuote biomarkkerit tutkittiin. Niistä 27 aineenvaihduntatuotteet, 10 aineenvaihduntatuotteet että näytössä suurimmat erot niiden tasojen peräsuolen syövän potilaiden ja ne, jotka ovat terveillä vapaaehtoisilla ja oli korkeammalla tasolla peräsuolen syöpäpotilailla verrattuna terveiden vapaaehtoisten valittiin: kystamiini, kystiini, asparagiinihappo happo, arabinoosi, p-hydroksibentsoehappo, glutamiinihappo, 2-hydroksibutyraatti, kynureniini, meso-erytritoli, laktitoli (taulukko 3). Useimmat näistä metaboliiteista näkyy huomattavasti-muuttuneita tasoja vaiheessa 0-4 (N = 60), vaiheessa 0-2 (N = 36), ja vaihe 3-4 (N = 24) ryhmät. Näistä aineenvaihduntatuotteita, arabinoosi, meso-erytritoli, laktitoli usein kulutetaan ruokavalion. Näin ollen, loput 7 aineenvaihduntatuotteiden alistettiin portaittain muuttuva valintatapa. Tämän seurauksena 2-hydroksibutyraatti, asparagiinihappo, kynureniini, ja kystamiini valittiin. Nämä 4 metaboliitit eivät näytä multikollineaarisuus (tuloksia ei ole esitetty). Sitten useita logistinen regressiomalli ennustamiseen ja peräsuolen syövän määritettiin tietojen perusteella näiden aineenvaihduntatuotteiden (taulukko 4).

Ennustemalli on seuraava:

p = 1 /[1 + e – {- 8,32 + 286,59 (2-hydroksibutyraatti) 33,87 (asparagiinihappo) 1634,96 (kynurenine) 78,78 (kystamiini)}].

Nagelkerke R

2-arvo oli 0,4533. AUC, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus tässä mallissa oli 0,9097 {95%: n luottamusväli (95% CI): 0,8438-0,9495}, 85,0%, 85,0%, ja 85,0%, tässä järjestyksessä (taulukko 5, kuva 2). Vaikka me valittu 2, 3, 5 tai 6 aineenvaihduntatuotteet kautta portaittain muuttuva valintatapa ja sitten suorittaa edelleen useita logistinen regressio analyysejä, emme voineet luoda parempi malli (tuloksia ei ole esitetty). Päinvastoin, kun koulutus joukko tietoja käytettiin, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus CEA oli 35,0%, 96,7%, ja 65,8%, tässä järjestyksessä, ja niille CA19-9 oli 16,7%, 100%, ja 58,3% vastaavasti. Meidän ennustemallin osoitti myös suurta herkkyyttä (83,3%) kun vaiheessa 0-2 peräsuolen syöpä potilaan ryhmä, kun taas CEA ja CA19-9 näytetään herkkyydet 30,6% ja 5,6%, vastaavasti.

Kiinteä käyrä on ROC-käyrä ennustemallin perusteella koulutuksen asetettu. AUC ja cut-off-arvot olivat 0,9097 {95%: n luottamusväli (95% CI): 0,8438-0,9495} ja 0,4945, vastaavasti. Herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus tämän mallin on koottu taulukkoon 5.

27 aineenvaihduntatuotteet valittu harjoitussarjassa (taulukko 2) ja vakiintuneiden ennustemallin tutkittiin käyttäen validointi asetettu, joka koostui kolorektaalisyövän potilaista (N = 59) ja terveillä vapaaehtoisilla (n = 63) (taulukko 1, taulukko S2). Mitä tulee 27 aineenvaihduntatuotteet, herkkyys, spesifisyys, ja tarkkuus opetusjoukolla olivat osittain korreloivat kuin validointi asetettu, ja korrelaatiokertoimet näiden parametrien olivat 0,425, 0,655 ja 0,587, tässä järjestyksessä (kuva S2). Kuitenkaan yksikään aineenvaihduntatuotteiden erityisen suuri, spesifisyys ja tarkkuus arvot (taulukko 2). Päinvastoin, kun validointi asetettu käytettiin herkkyyttä, spesifisyyttä ja tarkkuus ennustemallissa olivat 83,1%, 81,0%, ja 82,0%, tässä järjestyksessä, ja nämä arvot olivat lähes samat kuin ne, jotka saatiin harjoitussarjassa (taulukko 5). Lisäksi mallissa myös erityisen suuri havaitsemiseksi vaiheessa 0-2 peräsuolen syöpä (82,8%).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitettiin uusi seulontamenetelmä varhaiseen toteamiseen kolorektaalisyöpä perustuvat GC /MS metabolomiikka. Vaikka koulutus joukko potilaita, joilla oli varhaisessa vaiheessa peräsuolen syöpä, kuten vaiheessa 0 tai vaiheessa 1, ennustemallissa näkyy korkea AUC (0,9097), herkkyys (85,0%), ja tarkkuus (85,0%) arvoja, jotka olivat korkeampia kuin seerumin kasvainmerkkiaineet (CA19-9 ja CEA). Lisäksi kun validointi asetettu käytettiin mallia myös näytteillä korkea herkkyys alkuvaiheessa peräsuolen syöpä (83,1%). Yhdessä patogeneesin peräsuolen syöpä näyttää johtavan tasojen muutokset erilaisia ​​seerumin aineenvaihduntatuotteiden, vaikka nämä vaihtelut vaihtelevat pienistä suuriin.

arvioinnit saatuja tietoja metabolomiikan tulisi käsitellä huolellisesti. Esimerkiksi joukossa seerumi aineenvaihduntatuotteiden havaita meidän GC /MS-pohjainen metabolomic järjestelmä, päivän sisäinen ja välinen päivä vaihtelut havaittiin. Esimerkiksi tryptofaani havaitut pitoisuudet iltapäivällä ja illalla oli merkittävästi vähentynyt verrattuna niihin havaittu aamulla (taulukko S3 ja kuvio S3), ja nämä erot saattavat johtua vaikutuksille ruokavaliota ja /tai päivittäistä toimintaa. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet päivän sisäinen ja välinen päivän varianssi tasojen joitakin aminohappoja [10], [11], [12]. Siksi on tärkeää arvioida muun päivän ja päivän sisäinen varianssien seerumin metaboliittitasoihin vuonna metabolomic tutkimukseen, ja verinäytteet kerättiin ennen aamiaista käytettiin tässä tutkimuksessa. Lisäksi tietojen tarkkuus on saatu laiteanalytiikan seeruminäytteiden olisi arvioitava huolellisesti, koska se voi vaikuttaa käytetyllä menetelmällä. Siksi löytää luotettava uutta metaboliittia biomarkkereiden, laskimme RSD% arvot seerumin metaboliittitasoihin saadaan GC /MS-analyysi ja sitten arvioitiin välisten päivän ja päivän sisäinen vaihtelut pitoisuuden kunkin seerumin aineenvaihduntatuotteen. GC /MS-analyysia useita piikkejä joskus havaitaan tietyn metaboliitin. Esimerkiksi, on olemassa variaatioita määrä TMS molekyylejä, jotka sitoutuvat tiettyihin molekyyleihin, ja siten, suuret ja pienet piikit havaitaan. Vähäinen huiput voi olla epävakaa, mikä voi johtaa virheelliseen tulkintaan tiedot. Oikeastaan ​​tässä tutkimuksessa RSD% saadut arvot jätetään pois tulokset pieni piikki johdettujen metaboliittien olivat parempia kuin ne, jotka saadaan käyttäen kaikki data: kun kaikki tietoja käytettiin prosenttiosuus aineenvaihduntatuotteiden kanssa RSD% arvojen alle 20 % ja 30% oli 68,5% ja 86,5%, vastaavasti. Sen sijaan, kun tulokset pieni piikki johdettuja aineenvaihduntatuotteita jätettiin pois, ne olivat 72,0% ja 90,0%, tässä järjestyksessä. Siten tarkka arviointi saatujen tietojen mukaan metabolomiikan odotetaan tuottavan hyödyllistä tietoa. Perustuen näiden arviointien, 27 aineenvaihduntatuotteiden valittiin metaboliittina biomarkkerina ehdokkaita, mutta nämä metaboliitit näkyvät yksittäiset AUC-arvot 0,6-0,8 ja suhteellisen alhainen herkkyys tai spesifisyys (taulukko 2), mikä osoittaa, että yksittäinen aineenvaihduntatuotteen biomarkkerit eivät ole käytännöllisiä seulonta ja /tai diagnoosi ja että käyttää useita biomarkkereita ehkä parempi tutustumiseen ehdokkaita, joilla on korkea herkkyys ja spesifisyys, vaikka metabolomic lähestymistapoja on laajalti käytetty löytää yhden taudin biomarkkereita. Sitten, jonka tavoitteena on arvioida hyödyllisyys useiden biomarkkereita diagnosointiin peräsuolen syöpä, useita logistisen regressioanalyysin avulla portaittain muuttuva valintatapa (tässä tutkimuksessa) ja pääkomponenttianalyysi (PCA) (tuloksia ei ole esitetty) tehtiin. Kuitenkin, PCA ei tuottanut arvokkaita tuloksia. PCA on analyyttinen analysointimenettely pienempi määrä muuttujia; eli se on mitta vähentäminen tekniikkaa, ja ei ole riippuvainen muuttujia. Päinvastoin, useita Logistisen regressioanalyysin kanssa portaittain muuttuva valinta menetelmää voidaan käyttää valitsemaan optimaalinen tiettyjen muuttujien ja vaatii riippuvaisia ​​muuttujia. Siten PCA ehkä sovi suuren mittakaavan tutkimuksia, koska se voi tuottaa odottamattomia eroja ryhmien vertailtavien, vaikka valvottu PCA, osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA), ja ortogonaaliset PLS-DA (OPLS-DA) voi olla sovellettavat vahvistaa diagnoosin malleja, koska syrjiä peräsuolen syövän potilaiden ja verrokkien osoitettiin kautta OPLS-DA [13].

perustettu ennustemallin koostui 4 aineenvaihduntatuotteiden; siis 2-hydroksibutyraatti, asparagiinihappo, kynureniini, ja Kystamiini (kysteamiini + kystamiini). 2-hydroksibutyraatti muodostuu sivutuotteena muodostumisen aikana α-ketobutyrate kautta katalysoi laktaattidehydrogenaasi tai α-hydroksibutyraatti dehydrogenaasi. Aikaisemmassa tutkimuksessa [13], tehostetun 2-hydroxibutyrsyra seerumeissa paksusuolen syövän potilaiden havaittiin, kun noudatetaan tuloksemme. Seerumin α-hydroksibutyraatti dehydrogenaasi ja yhteensä laktaattidehydrogenaasi toimintaan munasarjasyöpä potilaat olivat huomattavasti korkeammat kuin potilailla, joilla on hyvänlaatuinen munasarjakasvain [14], mutta taso maitohapon kolorektaalisyövässä oli alhaisempi kuin terveillä vapaaehtoisilla (taulukko S4) . Näin ollen, 2-hydroksibutyraatti ei olisi tuotettu veren laktaattidehydrogenaasin, mutta entsymaattinen tuottaminen 2-hydroksibutyraatti, jonka α-hydroksibutyraatti dehydrogenaasi voisi aiheuttaa veressä ja /tai 2-hydroksibutyraatti olisi erittyy soluista.