Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagy on kriittinen soluprosessia ylläpitoon tarvittavat solujen homeostaasin terveys- ja sairaustiloissa, mutta molekyylitason mekanismit ja vaikutukset autophagy syövän ei ole täysin ymmärretty. Täällä, huomasimme, että Sox2 keskeinen transkriptiotekijän sääntelyn ”stemness” Alkion kantasolujen ja indusoi-pluripotenttien kantasolujen, voimakkaasti aiheuttama autophagic ilmiöitä, myös solunsisäinen vakuolien muodostumista ja lysosomaalisen aktivaatio koolonkarsinoomasoluissa. Aktivointi tapahtui kautta Sox2 välittämää

ATG10

geenien ilmentyminen ja johti soluproliferaation inhibointi ja ankkurista riippumaton pesäkekasvun

ex vivo

ja kasvaimen kasvu

in vivo.

lisäksi huomasimme, että Sox2 aiheuttama-autophagy tehostaa solujen vanhenemista jopa säätelevä tuumorisuppressoreilla tai Vanheneminen tekijöistä, mukaan lukien p16

INK4a, p21 ja fosforyloitu p53 (Ser15). Erityisesti knockdovvn

ATG10

in

Sox2

ilmentävillä koolonkarsinoomasoluissa palautettu syöpäsolun ominaisuudet. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että sääntely autophagy välittämä Sox2 on mekanismi perustuva uusi strategia hoitoon ihmisen paksusuolen syöpiin.

Citation: Cho YY, Kim DJ, Lee HS, Jeong CH, Cho EJ, Kim MO, et ai. (2013) Autophagy ja Cellular Vanheneminen Tukena Sox2 Suppress Maligniteetti syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (2): e57172. doi: 10,1371 /journal.pone.0057172

Editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2012 Hyväksytty: 18 tammikuu 2013; Julkaistu: 25 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Cho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Hormel Foundation ja National Institutes of Health myöntää CA111536, CA120388, CA077646, R37CA081064 ja ES016548, ja jonka Research Fund, M-2011-B0002-00025 The Catholic University of Korea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut, mutta ei normaaleissa soluissa, hankkia kuolemattomaksi pakenemalla solujen vanhenemista [1]. Verrattuna normaaleihin soluihin, syöpäsolut yleensä vaativat enemmän ravintoa tuottaa proteiineja ja entsyymejä niiden nopeamman leviämisen, mikä johtaa ravintoarvon riippuvuuden syöpäsolujen [2]. Survival tuetaan ravinteet saadaan verenkiertoa ja itsenäisten ruoansulatusta solunsisäisen soluelimiin prosessissa kutsutaan autophagy [3].

Autophagy on säilynyt catabolic prosessin eukaryooteissa joka huonontaa pitkäikäiset proteiineja, soluelimiin ja bulk solulimassa [4] kautta lysosomaalisen järjestelmä säilyttää homeostaasiin aikana nälkään ja normaalin kasvun säätelyssä [3]. Autophagy edistää solujen eloonjäämistä huuhtelemalla solut vahingoittuneen soluelimiin, aineenvaihduntatuotteita sekä solunsisäisiä taudinaiheuttajia ja tuottamalla solunsisäinen rakennuspalikat tarvitaan ylläpitämään elintoimintoja aikana ravintoaine-rajoitettu olosuhteissa [5]. Kuitenkin autophagy voi myös käsittää tärkeä strategia syövän hoitoon, koska autophagy voi myös edistää solukuolemaa läpi liiallinen itsensä ruoansulatusta ja hajoaminen olennaisten soluaineksista [5]. Autophagy on eri apoptoosin, prosessi, joka ei ole autophagosomes ja autolysosomes kuolevissa soluissa [6]. Erityisesti tukkeutuminen autophagy tyrmäämällä beclin indusoi kasvainten kehittymiseen [7] ja asiakkuutta autophagy käsittelemällä luonnollisten yhdisteiden, kuten resveratroli, tukahduttaa syöpäsolujen lisääntymistä ja maligniteetin [2]. Autophagy on tiettävästi liittyy läheisesti solujen vanhenemista ja esto autophagy viiveitä solujen vanhenemista mitoosi ihmisen diploidisoluissa [8]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että autophagy saattavat aiheuttaa vanhenemista syöpäsoluja, koska esto autophagy parantaa kasvaimia aiheuttavasta ominaisuudet MCF-7-solut [9]. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit eivät ole selvästi selvitetty.

Lisäksi, tamoksifeeni, antagonisti estrogeenireseptorin rintakudoksessa, indusoi autophagy ihmisen MCF-7-rintasyöpäsolujen [10]: n kautta välittyvän sfingolipidi aineenvaihduntatuotteiden [11] . Erityisesti arseenitrioksidi, imatinibi (Gleevec) ja rapamysiini ovat yhdisteitä, joiden tiedetään kiihdyttävän autophagic solukuoleman monissa ihmisen syövän solulinjoissa [12], [13], [14]. Tärkeää on, munasarja-, rinta- ja eturauhasen syövät liittyy monoallelic menetys beclin1 ihmisillä. Lisäksi induktio autophagy mukaan beclin yli-ilmentyminen estää ankkurista riippumaton pesäkkeen kasvu MCF-7-solujen [15] ja lisääntymistä negatiivinen esto p70S6 kinaasin [16], [17].

Sekä klassinen ja modernisoitu solujen uudelleenohjelmointi stressaavat prosesseja, jotka aktivoivat apoptoosin ja solujen vanhenemista, jotka ovat kaksi tärkeimmät esteet syövän kehitystä ja somaattisten uudelleenohjelmointi [18]. MTOR signalointireitin osakkeita uudelleenohjelmointi somaattisten solujen, solujen vanhenemista ja autophagy muodostumisen [18]. Esimerkiksi hyvin tunnettu mTOR-inhibiittorit ja autophagy aktivaattorit, kuten PP242, rapamysiini ja resveratrol, erityisesti parantaa nopeutta ja tehokkuutta iPS solujen kehittymistä [19]. Sox2, transkriptiotekijä, joka kuuluu HMG (High Mobility Group) superperheen on rooli määritettäessä solun kohtalon, erilaistumista ja lisääntymistä [20]. Se on myös keskeinen säätelijä alkion kantasoluja (ES) solujen uusiutumiskyvyn ja uudelleenohjelmointi terminaalisesti erilaistuneita soluja iPS-solujen [21]. Vaikka onkogeeninen kantasolujen tekijöistä, kuten Sox2, on oletettu perustuu ”stemness” samankaltaisuuden kantasolut ja syöpäsolut, Sox2 tehtävänä syöpäsoluissa ei ole selkeästi ymmärretty. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Sox2 proteiini tasolla voimakkaasti vastaa vähemmän eriytetty tyvisolusyöpä kaltainen rintakarsinoomista [22], ja Sox2 proteiini usein todettu olevan säädellä vähentävästi mahakarsinoomat [23]. Tämäntyyppiset tutkimukset ovat aiheuttaneet enemmän kiistaa koskien normaali toiminta ja onkogeeninen kantasolujen tekijöistä. Täällä esittää näyttöä siitä, että ekspressio Sox2 syöpäsoluissa indusoi autophagy syöpäsolujen säätelystä

ATG10

geenin ilmentymisen ja indusoivan solun vanhenemista, mikä vähentää pahanlaatuisuuden syöpäsolujen ja kasvaimen kasvun inhibitiota

ex vivo

ja

in vivo

.

tulokset

Kohdunulkoinen ilmentäminen

Sox2

indusoi Autophagy

Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat että ektooppinen ekspressio

Sox2

retroviruksen infektion osaksi MCF-7-rintasyöpäsolujen lisäsi sekä koko ja muodostuneiden pesäkkeiden määrästä pehmeässä agarissa [24]. Kuitenkin Sox2 usein säädellä vähentävästi syöpien ja estää solujen kasvua solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [23]. Siksi rooli Sox2 syövässä on kiistanalainen. Tutkia roolia Sox2 ja muiden iPS tekijöiden syövän, me ektooppisesti ilmaistuna nämä tekijät HCT116 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja ja totesi, että Sox2, mutta ei Nanog, Lin28 tai Oct4, aiheuttama vakava vakuoliin muodostumisen sytoplasmassa, mikä on tärkeä merkki ja macroautophagy [25] (Fig. 1A). Olemme havainneet, että yli 90% infektoituja soluja muodostuu erikokoisia vacuoles niiden sytoplasmassa ja Western-blottauksella ja immunocytofluorescence määrityksen tulokset osoittivat, että kaikki solut ekspressoivat ektooppinen Sox2-proteiinin (Fig. 1 B). Lisäksi vahvistimme, että vakavia vacuole muodostuminen tapahtui samanaikaisesti happamia lysosomaalisten aktivaatio HCT116 koolonkarsinoomasoluissa (Fig. 1 C). Tärkeää on, Sox2 yli-ilmentyminen indusoi LC3 (tunnetaan myös nimellä ATG8b) pesäkkeitä muodostuminen, joka on keskeinen biomarkkeri autophagy (Fig. 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että Sox2 yliekspressio indusoi autophagy.

(

) vertailu morfologisia muutoksia aiheuttamien ektooppinen ilmentyminen iPS tekijöistä.

(ylempi paneeli)

HCT116-soluja erikseen transdusoitiin iPS tekijät, kuten Sox2, Nanog, Lin28 ja Oct4. Soluja viljeltiin 5 päivää ja muutoksia havaittiin valomikroskoopilla (X200).

(Lower paneelit)

HCT116-solut kerättiin 5 päivää transduktion iPS tekijöitä ja proteiineja uutetaan. Proteiinin tasot Sox2, Nanog, Lin28 ja Oct4 analysoitiin Western-blottauksella, jossa spesifisiä vasta-aineita, kuten on ilmoitettu. ß-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen. (

B

) HCT116-solut muodostavat onteloita 5 päivää transduktion havaittu valomikroskoopilla, laskettiin ja verrattiin. Sox2 yliekspressio analysoitiin Western-blottauksella ja immunocytofluorescence määritys (X200) käyttäen spesifisiä vasta-aineita, kuten on ilmoitettu. ß-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen. Solut visualisoitiin valomikroskoopilla (L.M .; X200). (

C

) Lysosomaalinen aktivointi analyysi. HCT116-solut infektoitiin

mock

tai

Sox2

värjättiin lisäämällä lysotracker (50 nM) kasvualustaan ​​5 min 37

oC, 5% CO

2 yrityshautomo. Soluja kiinnitettiin 4% formaliinilla, pestiin PBS: llä ja lysosomaalisen aktivaatio havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (X200). (

D

) immunofluoresenssimäärityksellä of LC3b (ts ATG8b). HCT116-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti

mock

tai

Sox2

alistettiin fluoresenssimääritys havaita LC3b. Solujen havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (X200). Tumat värjättiin DAPI; LM osoittaa valomikroskoopilla (X200).

Sox2 indusoi Autophagy syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa soluissa

Sen tutkimiseksi, Sox2 yliekspressio voi aiheuttaa ontelon muodostumista eri koolonsyöpäsolulinjaa meidän transdusoidut lenti-Sox2 viruspartikkelien osaksi CCD-18Co normaalit paksusuolen solut ja HCT116, HT29 ja WiDr ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Olemme havainneet, että kaikki koolonsyöpäsolulinjoissa muodostettu ontelot niiden sytoplasmassa (Fig. 2A, nuolet). Vaikka CCD8-18Co normaalit paksusuolen solut osoittivat hyvää ilmentymistä Sox2 transduktion jälkeen lenti-Sox2, solut eivät muodosta onteloita tai näyttää morfologisia muutoksia (Fig. 2A, B). Lisäksi, muita Tulokset vahvistivat, että onteloiden muodostuminen ja happaman lysosomaalisen aktivaatiota havaittiin HCT116 koolonkarsinoomasoluissa, mutta ei CCD-18Co normaalin paksusuolen solujen (Fig. 2C). Lisäksi ektooppinen ilmentyminen Sox2 normaaleissa hiiren alkion fibroblasteja (MEF), tai ihmisen ensisijaisen fibroblasteissa (NFDH ja BJ) ei aiheuttanut vakuolien muodostumista (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että vakuoliin muodostumisen aiheuttama Sox2 yli-ilmentymisen HCT116-soluissa on todellakin syöpäsolu erityisiä autophagy.

(

) CCD-18Co (CRL-1459) normaalit paksusuolen solut ja HCT116, HT29 ja WiDr paksusuolensyöpä soluja viljeltiin sopivan viestintäkanavan ja transdusoitiin

Sox2

viruspartikkeleita. Soluja viljeltiin täysin kasvualusta 5 päivää transduktion jälkeen. Solujen havaittiin valomikroskoopilla. Cellular vacuoles on merkitty nuolenkärki

Sox2

ilmentävillä koolonkarsinoomasoluissa. (

B

) CCD-18Co normaalit paksusuolen soluja viljeltiin, transdusoitu

mock

tai

Sox2

viruspartikkelit ja viljeltiin täydellinen kasvualusta 5 päivää. Solut kiinnitettiin sitten, permeabilisoitiin ja hybridisoitiin Sox2 spesifisen vasta-aineen kanssa ja sitten Alexa 568-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella, ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla (X200). Tumat värjättiin DAPI. Alueet valomikroskooppisesti ovat alueita sovitettu Sox2 ja DAPI fluoresenssi. Boxed ala pienitehoinen suurennetaan vertailla morfologian välillä HCT116-

mock

ja –

Sox2

ilmentävillä soluilla. (

C

) MELAS aktivointi, joka on autophagy markkeri, verrattiin lisäämällä lysotracker-Red (50 nM) 5 päivän kuluttua transduktion CCD-18Co normaalit paksusuolen solut ja HCT116 peräsuolen syövän solut infektoitiin

mock

tai

Sox2

. Solujen havaittiin fluoresenssimikroskoopilla. LM osoittaa samalla alueella valomikroskoopilla vastaava fluoresenssimikroskopiaan (X200).

Sox2 Tavoitteet ATG10 aiheuttavan Autophagy

tutkia mekanismi (t) Sox2 aiheuttama autophagy, ensin käytettiin mikrosiruanalyysi yhteensä 30968 geenien cDNA eristettiin infektoiduista soluista

mock

tai

Sox2

tunnistaa geeni (t) saavuttamista Sox2 aiheuttavan autophagy. Tulokset paljastivat, 11245-geenit, jotka analysoitiin käyttämällä Merkittävä analyysi Microarray (SAM) (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). Huomasimme, että 2153 Sox2 aiheuttama geenien voitiin luokitella ylös-säänneltyjen ja 1575 geenejä säädellä vähentävästi HCT116-soluissa (kuvio. 3A ja Taulukko S1). Käytimme Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID v6.7; http: //niaid.abcc.ncifcrf.gove) edelleen luokitella geenien niiden biologisiin tai molekyylin toimintoja ja totesi, että geeniekspressiotasot liittyy autophagy , leviämisen ja solusyklin säätelyssä oli olennaisesti muuttunut kohdunulkoinen ilmaus

Sox2.

Altered geeniekspression sisältyvät muutokset 33 DNA: n korjaukseen geenejä, 25 DNA replikaatiogeenit, 20 solujen kasvuun liittyviä geenejä, 26 solukoko liittyvä geenit, 191 transkriptio liittyvien geenien ja 17 insuliinin signalointireitin liittyvien geenien (Fig. 3A ja taulukot S1, S2 ja S3). Tärkeää on,

Sox2

ilmaisua indusoi lisääntyneen ilmentymisen

ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D

ja

ATG8b

geenien noin 2-4-kertaisesti (kuvio. 3A). Sen sijaan

Sox2

ilmentyminen liittyi vähentynyt ilmentyminen

ATG12, ATG16L2

ja

ATG9B

geenejä (Fig. 3A). Etsimällä tietokantaan, joka sisältää Sox2 konsensus sitova motiivi promoottorialueella genomissa [26], huomasimme, että

ATG10

ja

ATG12

promoottorit sisältävät oletetun Sox2 sitova yksimielisyys nukleotidin motiivi kätkeminen 63% identiteetti (taulukko S4). Vertaamalla meidän microarray ja tietokanta hakutulokset, päättelimme, että ATG10 voisi olla kohde Sox2 induktioon autophagy. Meidän sykli riippuva RT-PCR tulokset osoittivat, että

ATG10

mRNA tasolla

Sox2-

transfektoiduista soluista lisääntyi noin 2,5 kertaiseksi verrattuna

mock

(Fig. 3B ). Erityisesti Western blotting tuloksia (Fig. 3C) ja immunocytofluorescence vastaan ​​ATG10 (Fig. 3d) osoitti, että ATG10 ja LC3 proteiini kohoamiseen yliekspressio Sox2. Sen määrittämiseksi, oliko

ATG10

promoottori aktivoidaan Sox2 rakensimme kaksi

lusiferaasin

toimittaja sisältävien plasmidien -1522–1 (

pGL3-ATG10-1522

) ja – 711 -1 (

pGL3-ATG10-711

) (Fig. 3E) etsimällä ja analysoimalla

ATG10

promoottorialueille, jotka sisältävät otaksuttu Sox ja SRY sidosmotiivien at -1327 ja – 1473 transkription aloituskohta (Fig. 3E). Huomasimme, että deleetio otaksuttu Sox2 sitovan alueen merkittävästi tukahdutti lusiferaasiaktiivisuutta (Fig. 3F). Erityisesti

ATG10

promoottorin aktiivisuus lisääntyi yli-ilmentyminen Sox2 (Fig. 3G), mikä osoittaa, että Sox2 indusoi

AT10

geenin ilmentymisen ja aiheuttaa autophagy.

(

) Microarray.

Päällyslevy

, HCT116 peräsuolen syövän solut, jotka ilmentävät stabiilisti

mock

tai

Sox2

alistettiin mikrosiruanalyysi kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Keltainen väri kertoo joukko geenejä, jotka eivät osoittaneet merkittävää eroa

mock

ja

Sox2

ilme. Punainen ja vihreä väri osoittaa joukko geenejä ylä- tai alassäädetty, vastaavasti, HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

Sox2

verrattuna soluihin, jotka ilmentävät

mock

ohjaus.

Bottom pöytä

, tiivistelmä autophagy liittyvien geenien saatujen mikrosiruanalyysillä. Ylä- ja alassäätöä merkitään sisään loki2 arvoihin. (

B

) ilmentäminen

ATG10

aiheuttama Sox2. Kokonais-RNA (1 ug) peräisin HCT116 infektoitujen solujen

mock

tai

Sox2

käänteiskopioitiin ja

ATG10

monistettiin sykli riippuvaisen PCR ja

ATG10

ilmentymistaso visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla klo 21

st aikana. ß-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtä suuri hyödyntäminen cDNA PCR. (

C

) Up-sääntely ATG10 ja LC3b proteiinin tasot aiheuttamien

Sox2

ilme. Proteiinit uutetaan HCT116 soluista jotka ilmentävät pysyvästi

mock

tai

Sox2

ja ATG10 ja LC3b proteiinit visualisoitiin Western blottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. ß-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen. (

D

) Vahvistus Sox2 aiheuttaman ATG10 proteiinin taso. HCT116 kolorektaalisyöpä solut infektoitiin

mock

tai

Sox2

ja viljeltiin 5 päivää. Solut kiinnitettiin, hybridisoitiin ATG10 tiettyjä primaarisen vasta-aineen ja Alexa 488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. ATG10 proteiini tasot havaittiin fluoresenssimikroskopialla. L. M. ilmaisee samalla alueella valomikroskoopilla vastaava fluoresenssimikroskopiaan (X200). (

E

) rakentaminen

ATG10

promoottori

lusiferaasin

reportteriplasmidilla. Nukleotidisekvenssit ihmisen

ATG10

promoottorialue oli ladattu Ensemble (https://uswest.ensemble.org). Oletetun promoottori-analyysi suoritettiin käyttäen TFSEARCH (v1.3) (https://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch). Otaksutun SRY ja Sox sitovia konsensussekvenssit merkitään punaisella ja polymeraasi III sitoutumiskohta on kehystetty. (

F

) BAC-klooni (RP11-111B20) hankittiin Empire Genomics (Buffalo, NY) ja 1528 sekä 711 emäsparia

ATG10

promoottorialueen monistettiin PCR: llä. PCR-fragmentti, annettiin rekombinoitua

pGL3

perus-vektorin rakentamiseksi pGL3-AT10-1582 ja pGL3-ATG10-711

lusiferaasin

toimittaja plasmideja.

pGL3-ATG10-luc

toimittaja plasmidit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

ATG10

promoottori

lusiferaasin

reportteri plasmideja,

pGL3-AT10-1582

ja

pGL3-ATG10-71-

luc, transfektoitiin lyhytaikaisesti osaksi HCT116 solut ja tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus analysoitiin 24 tunnin jälkeen.

phRL-SV40 Renillaa

lusiferaasireportteriplasmidin kotransfektoitiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtäläiset transfektiota ja normalisointia tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden (* p 0,001). (

G

)

pGL3-ATG10-1528

lusiferaasireportteriplasmidi oli ohimenevästi kotransfektoidaan kanssa

mock

tai

Sox2

viruksen ekspressiovektori HCT116-solut ja tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus analysoitiin 24 tunnin jälkeen.

phRL-SV40 Renillaa

lusiferaasireportteriplasmidin kotransfektoitiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtäläiset transfektiota ja normalisointia tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden (* p 0,001).

Sox2- aiheuttama autophagy välittyy Down-sääntelyn Akt signalointireitin, mutta ei läpi luokan III PI3-K: n signaloinnin

Paasto tai ehtyminen kasvutekijöiden kuten insuliinin indusoi autophagy [27]. Meidän microarray tulokset osoittivat, että geenin ilmentymistä liittyy insuliinin signalointireitin tukahdutettiin (taulukko S3). Siksi tutkimme muutokset proteiinin tasot liittyvät autophagy ja insuliinin signalointi Western-blottauksella. Olemme havainneet, että luokan III PI3-K (Vps34p) ja beclin ei muutettu, mikä osoittaa, että luokan III PI3-K /beclin signalointireitin ei ole mukana Sox2-indusoidun autophagy (Fig. 4A). Tutkimalla PI3-K-Akt signalointireitistä, huomasimme, että Akt fosforylaatio (Ser308) oli merkittävästi estyy ja kokonaisproteiinipitoisuus tasot Akt, mTOR ja p70S6K määrä väheni

Sox2

infektoiduista soluista verrattuna

mock

infektoituihin soluihin (Fig. 4B). Vahvista liittyvä signalointi inhibition PI3-K-Akt signalointireitin, olemme analysoineet GSK3α /ß ja PTEN. Tulokset osoittivat, että fosforylaatio GSK3α /ss Ser9 /Ser21 tukahdutettiin ja yhteensä GSK3α /SS-proteiinin tasot olivat hieman lisääntynyt

Sox2

infektoiduista soluista verrattuna

mock

infektoiduissa soluissa (kuvio . 4C). Erityisesti olemme havainneet, että PTEN fosforylaatio oli myös lisääntynyt (Fig. 4C), mikä johtaa tukahduttaminen PI3-K signaloinnin de-fosforylaatio [28]. Nämä tulokset osoittivat, että Sox2 muuttaa PI3-K-Akt signalointireitistä kautta GSK3α /SS ja PTEN signalointi, vaikka alkupään erityinen kinaasi vastuussa fosforylaatiota PTEN ei tiedetä tässä tapauksessa. Käsittelimme HCT116-solut ilmentävät

Sox2

tai

mock

insuliinin tai LY294002, joka on PI3-K estäjä. Tulokset osoittivat, että

Sox2

indusoimaan vacuole muodostumista inhiboivat merkittävästi insuliinihoitoa (Fig. 4D

vasen paneeli

s,

E). Kuitenkin

mock

infektoituihin soluihin ei osoittanut vacuole muodostumista vai ei insuliinia normaalissa soluviljelmässä ehto (10% FBS) tai tukahdutetaan vacuole muodostumista nälkään kunnossa (0% FBS) (Fig. 4D

vasemmalle ja keski-paneelit,

E, F). Huomasimme myös, että

mock

infektoituihin soluihin näytteillä kasvoi vacuole muodostumiseen hoidon jälkeen LY294002, kun taas

Sox2

yliekspressio aiheutti enemmän vacuole muodostumisen aiheuttama LY294002 hoitoa verrattuna

mock

( kuva 4D

oikea paneeli

s,

E, F). Samanlaisia ​​ilmiöitä havaittiin alle nälkään olosuhteissa (Fig. 4E, F). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että säätely alaspäin ja PI3-K-Akt-reitin PTEN voisi yhteistyössä aiheuttavan autophagy liittyy Sox2 ilme.

(

A-C

) Proteiinitasot luokan I molekyylejä kuten Akt, mTOR ja p70S6K ja luokan III PI3-K molekyylejä kuten Vps34p ja beclin analysoitiin HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

mock

tai

Sox2

. Yksittäiset proteiinit visualisoitiin Western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. p-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina sen varmistamiseksi, yhtä suuri kuin proteiinin loading. (

D

) osallistuminen luokan I PI3-K signalointi Sox2 aiheuttama autophagy. (

D, vasen paneeli

) HCT116-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti

mock

tai

Sox2

hoidettiin insuliinilla tai LY294002 alle 10% FBS sisältävää olosuhteissa 2 päivää infektion jälkeen. Vacuole muodostuminen havaittiin valomikroskoopilla (X200). Boxed alueet ovat yksilöllisesti suurennetaan 2 kertaa (

alempi paneelit mock ja Sox2

) paremmin visualisoida vacuoles.

(D, oikea paneeli)

Solut transdusoitiin

Sox2

viruspartikkelit ja viljeltiin 2 päivää. Soluviljelmän elatusaine korvattiin McCoyn 5a ilman FBS: ää lisäravinteen, mutta mukaan lukien 5 ug /ml insuliinia tai 5 ug LY294002 ja sitten soluja viljeltiin 5 päivää. Solut havaittiin valomikroskoopilla (X200). (

E

) kvantitatiivinen vertailu autophagy muodostumisen aiheuttama luokan I PI3-K signalointi. Ontelon muodostavien solujen D ja F laskettiin ja verrattiin on laskutaitoisia graafisen (* p 0,001).

Sox2 aiheuttama Autophagy hillitsee ja Anchorage riippumaton Colony Growth indusoimalla Cellular Vanheneminen in HCT116 solut

tukahduttaminen PI3-K aktiivisuutta PTEN on tärkeä rooli solujen lisääntymisen ja syövän kehityksen paksusuolessa [29], [30], [31]. PI3-K esto PTEN tai wortmanniinilla on käänteinen vaikutus verrattuna tuumorinekroositekijä α välisestä tasapainosta p50 ja p65-alayksiköiden Nukleaaritekijä

k

B [31]. GM3, gangliosidi, käsittely lisää dramaattisesti sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjä (CKI) p21

WAF1 ekspressiota kertyy p53-proteiinin PTEN-estoa PI3-K-Akt-MDM2 eloonjäämisen signalointia HCT116 paksusuolen syöpäsoluissa [29]. Ihmisen kolorektaalisyövän, negatiivinen korrelaatio PTEN-proteiinin tasojen ja Akt fosforylaation on havaittu [30]. Tuloksemme osoittivat, että alas-säätely PI3-K-Akt signalointi PTEN saattaa olla mukana Sox2 aiheuttama autophagy (Fig. 4). Meidän solujen lisääntymisen ja solusyklin analyysit osoittivat, että

Sox2

infektio osaksi HCT116 soluihin tukahdutti leviämisen indusoimalla kerääntyminen solujen G0 /G1 ja sub-G1 ja vähentäminen S solusyklivaiheista verrattuna

mock

infektoiduissa soluissa (kuvio. 5A). Vaimennus soluproliferaatiota liittyi noin 90%: n inhibition kiinnittymisestä riippumattoman syövän kasvua pehmeässä agarissa, tunnusmerkki syöpäsolun ominaisuudet [32] (Fig. 5B). Tutkia signalointi vastuussa indusoimiseksi menetyksestä syöpäsolun ominaisuudet, kuten tukahduttaminen leviämisen ja pehmeä agar kasvua, tutkimme erilaisia ​​tuumorisuppressoreilla, joiden tiedetään olevan rooli säätelyssä solusyklin. Havaitsimme kasvu p53 fosforylaation (Ser15) ja lisäyksiä proteiinin kokonaismäärän tasoja p16

INK4a ja p21 (Fig. 5C), jotka ovat hyvin tunnettuja olla vahvasti mukana solujen vanhenemista [33]. Sitten tutkittiin vanhenemista käyttäen SA-ß-galaktosidaasi määritys ja totesi, että ektooppinen ilmentyminen

Sox2

parannettu ß-galaktosidaasin aktiivisuuden ja proteiinin taso (Fig. 5D,

vasemmalle ja keskimmäinen paneelit

) ja tukahdutti Ki-67-proteiinin tason, solun lisääntymistä merkki (Fig. 5D,

oikea paneeli

). Erityisesti yli 90%, jotka sisältävät vakuolit värjätty ß-gal positiivinen (Fig. 5D,

kuvaajan

), Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että Sox2 aiheuttama autophagy aiheuttaa menetyksiä kasvain ominaisuuksia HCT116 peräsuolen syövän soluja .

(

)

Vasen paneeli

, vaikutus

Sox2

ilme soluproliferaatioon. HCT116-solut (2 x 10

3) stabiilisti ilmentäviä

mock

tai

Sox2

ympättiin 96-kuoppalevyille ja proliferaatio analysoitiin MTS-määritys 24 tunnin väliajoin enintään 96 tuntia (*, p 0,001).

Lähi ja oikea paneeli

, vaikutus

Sox2

ilme solusyklin jakeluun. HCT116-solut (4 x 10

5), jotka ilmentävät stabiilisti

mock

tai

Sox2

kylvettiin, viljeltiin ja sitten solusyklin jakelu (

keskimmäinen paneeli

) ja osa- G1 kerääntyminen (

oikea paneeli

) analysoitiin FACS (*, p 0,001). (

B

) vaikutus

Sox2

ilme ankkurista riippumaton pesäkkeen kasvua. HCT116-soluja (8 x 10

3) stabiilisti ilmentäviä

mock

tai

Sox2

alistettiin pehmeä agar pesäkekasvun määrityksessä 5-7 päivää. Solu pesäkettä mikroskoopilla ja Image-Pro Plus (v.6) tietokoneohjelmiston (* p 0,001). (

C

) Proteiiniprofilointi liittyvät solusyklin säätelyssä. Proteiinit uutetaan HCT116 soluista jotka ilmentävät pysyvästi

mock

tai

Sox2

ja alistettiin Western blotting havaita tasolle erilaisten proteiinien tiedetään osallistuvan solusyklin säätelyssä. ß-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen. (

D

) Cellular vanhenemista määrityksessä.

Vasen paneeli

, HCT116-solut ilmentävät stabiilisti

mock

tai

Sox2

analysoitiin vanhenemista käyttäen vanhenemista ß-galaktosidaasi -värjäyspakkausta. Solut havaittiin valomikroskoopilla (X200).

Lähi

ja

oikea paneelit

, proteiini taso beta-galaktosidaasi tai Ki-67 havaittiin HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

mock

tai

Sox2

käyttämällä erityisiä ensisijainen vasta-aineita kuten ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineella. Immunosytokemiallinen tunnistus suoritettiin käyttäen Sigma FASTTM 3,3′-diaminobentsidiini Terahyfrochloride Metal Enhancer Tablet sarjat (DAB peroksidaasisubstraatti). Proteiini tasot visualisoitiin valomikroskoopilla (X200).

Kaavio

, osoittaa vertailu beta-galaktosidaasin positiivinen solupopulaation HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

mock

tai

Sox2

(* p 0,001).

knockdovvn

ATG10

Palauttaa

Sox2

indusoimaan Autophagy, Cellular Vanheneminen ja Cell Proliferation

aikaisemmat tulokset osoittivat, että

Sox2

-välitteisen autophagy välittyy

ATG10

ilmentymistä (Fig. 3). Sen tutkimiseksi, onko knockdovvn

ATG10

voi estää autophagy aiheuttama Sox2 yli-ilmentyminen, valitsimme

PSH-ATG10-1755

taintumisen vektori (Fig. 6A).

sh-ATG10

viruspartikkelien tartutettiin osaksi

Sox2

-preinfected soluja ja ilmentyminen Sox2 (Fig. 6B,

ylemmät paneelit

) ja knockdovvn

ATG10

(Fig. 6B,

alapaneeleita

) vahvistettiin immunofluoresenssianalyysia. Erittäin merkittävää solun morfologiat autophagy aiheuttama Sox2, kuten solun madaltuminen, ydin- koko ja vakuoli muodostumista, oli täysin muutettiin jotka havaittiin

mock

infektoituihin HCT116-solut (Fig. 6B, L. M.). Lisäksi olemme vahvistaneet, että morfologinen elpyminen vastasi palauttaminen Ki-67, SS-galaktosidaasi, p16

INK4a ja p21-proteiinin tasot

mock

infektoituihin HCT116-solut (Fig. 6C). Erityisesti olemme vahvistaneet knockdovvn

ATG10

vuonna HCT116 ilmentävät stabiilisti Sox2 talteen solujen lisääntymistä, joka estyi Sox2 yli-ilmentyminen, ja kasvu oli vielä nopeampaa kuin HCT116-solut, jotka ilmentävät stabiilisti

mock

kontrolli (Fig. 6D). Nämä tulokset osoittivat, että ATG10 on tärkeä rooli autophagy muodostumisen aiheuttama Sox2 ilmentyminen HCT116 peräsuolen syövän soluja.

(

) vahvistus pudotus tehokkuuden ATG10. Knockdovvn ATG10 käyttämällä

pLKO-shATG10

.

pLKO-shATG10

pudotus lenti-virus- partikkelit infektoitiin HCT116-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti

Sox2

ja soluja viljeltiin 36 tunnin ajan. Proteiinit uutettiin ja pudotus tehokkuus määritettiin Western blot käyttämällä erityistä ATG10 vasta-ainetta. ß-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen. (

B

) Morfologiset muutokset aiheuttamien

ATG10

Knockdown in HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

Sox2

. HCT116-mock, -Sox2 ja -Sox2 /sh-ATG10 solut analysoitiin morfologisia muutoksia ja proteiinin tasot Sox2 (punainen) ja ATG10 (vihreä) määritettiin immunofluoresenssianalyysia käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Solut tarkkailtiin fluoresenssi- tai valomikroskoopilla (X200). L. M. osoittaa valomikroskoopilla. (

C

) Palauttaminen solusyklin, soluproliferaatiota ja vanhenemista markkereita lakkauttamalla

ATG10

vuonna HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

Sox2

. HCT116-mock, -Sox2 ja -Sox2 /sh-ATG10 solut ympättiin 4-kammio liukumäki, kiinteä ja läpäiseviksi. Merkkiaineita solujen lisääntymistä, solujen vanhenemista ja solukierron säätelyssä mukana Ki-67, SS-galaktosidaasi, p16

INK4a ja p21. Näitä markkereita analysoitiin immunosolukemiallisella spesifisten vasta-aineiden kuten käyttämällä Sigma FASTTM 3,3′- Diaminobenzidine Terahyfrochloride Metal Enhancer Tablet setit (DAB peroksidaasisubstraatilla). Solut tarkkailtiin fluoresenssi- tai valomikroskoopilla (X200). (

D

) Palauttaminen lisääntymisen kaatamalla

ATG10

vuonna HCT116-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti

Sox2

.