Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koirat joissa on luonnollisesti syöpä ovat tärkeä suuri eläinmallissa lääkekehityksen ja testaus uusia immunoterapioiden. Kuitenkin heikosti määritelty immunofenotyypeissä koiran leukosyyttien ovat rajoittaneet tutkimuksen kasvain immunologian koirilla. Kertyminen myelooisen johdettujen suppressorisolut (MDSCs) tiedetään olevan keskeinen mekanismi immuunisuppressiota tuumoria kantavissa hiirissä ja ihmisen potilailla. Me pyrittiin selvittämään MDSCs veressä koirien syöpään. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) koirista, joilla on edennyt tai varhaisessa vaiheessa syöpä ja ikä-haun terveillä verrokeilla analysoitiin virtaussytometrialla ja mikroskopia. Tukahduttava toiminta testattiin T-solujen lisääntymistä ja sytokiinien laadintaan määrityksissä. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin tunnistamaan mahdolliset mekanismit vastuussa immunosuppressio. PBMC koirista on levinnyt tai metastaattinen syöpä näytteillä huomattavasti suurempi prosenttimäärä CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja verrattuna koirien diagnosoitu varhaisessa vaiheessa kuin etäpesäkkeitä ja terveitä koiria. Nämä CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja muodostavat alapopulaatio aktivoitujen granulosyyttien että yhteistyössä puhdistua PBMC, näyttö polymorfonukleaarisista granulosyyttien morfologia, ja osoittaa voimakas kyky tukahduttaa lisääntymistä ja IFN-γ tuotantoa T solut normaaleista ja kasvain luovuttajien. Lisäksi nämä solut ilmensivät tunnusmerkki tukahduttava tekijät ihmisen MDSC lukien ARG1, iNOS2, TGF-β: n ja IL-10. Yhteenvetona tietomme osoittavat, että MDSCs kertyy vereen koirien kanssa edennyt syöpä ja voidaan mitata käyttämällä tätä kolmen markkerin immunofenotyypin, mikä mahdollistaa tulevaisuudentutkimuksista voi valvoa MDSC taakkaa.

Citation: Goulart MR, Pluhar GE , Ohlfest JR (2012) tunnistaminen Myelooisen johdettujen vaimennin solut Koirat luonnossa kasvavien Cancer. PLoS ONE 7 (3): e33274. doi: 10,1371 /journal.pone.0033274

Editor: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 28 lokakuu 2011; Hyväksytty: 10 helmikuu 2012; Julkaistu: 13 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Goulart et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahoja tohtori Ohlfest National Institutes of Health (NIH R21-NS055738), ja American Cancer Society (RSG-09-189-01-lib). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on johtava kuolinsyy aikuisilla koirilla Yhdysvalloissa, Australiassa, Japanissa ja Euroopassa, ja sitä pidetään suurten terveydenhuollon huolenaihe lemmikkieläinten omistajille. Noin neljä miljoonaa koiraa diagnosoidaan syöpä vuosittain Yhdysvalloissa [1]. Luonnossa esiintyvä malignances koirilla on monia ominaisuuksia ihmisen syöpiä, kuten samanlainen kasvain biologian, genetiikan, esiintymistiheys, histologinen ulkonäkö, ja vaste perinteisiin hoitoihin (tarkistetaan [2]). Kasvaimet koirilla edetä suhteellisesti nopeammin kuin sama tauti ihmisillä, jolloin liittyviä kysymyksiä hoidon tehokkuuden (etenemistä ja eloonjäämistä) voidaan käsitellä nopeammin koirilla. Tärkeä etu koiran malli on kyky testata kokeellisia terapeuttisia ihmisen mittakaavassa annoksilla asettaminen minimaalinen jäljellä tauti, jota on vaikea tehdä mielekkäällä tavalla pienillä jyrsijöillä että on suhteellisen nopea kasvaimen kasvua kinetiikka. Lisäksi koska hoidon taso useimpien koirien kasvaimia on huonosti perustettu, on paljon enemmän joustavuutta tutkimuksen suunnittelu verrattuna ihmisen kliinisissä tutkimuksissa. Yhdessä nämä ominaisuudet tekevät koiran erinomaisen alustan translationaalisen lääketieteen.

Lemmikkikoirat syövän ovat nopeasti tulossa tärkeä työväline lääkekehityksessä. Yksi parhaista esimerkeistä tästä on viimeaikainen samanaikainen kehittäminen SU11654, monen kohdistetun tyrosiinikinaasiestäjä, ja sunitinibimaleaatti (SU11248). Molemmat lääkkeet ovat voimakkaita estäjiä PDGFR, VEGFR, KIT, ja FLT3. Tutkimukset koirilla, joilla oli erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia paljasti, että plasmassa SU11654, mutaation tilan KIT, ja esto KIT fosforylaation olivat vahvasti ennustettavissa kliinisen tehon. Optimaalinen annostus parametrit ja myrkyllisyyttä perustettiin koirilla samoin. Nämä uraauurtava tutkimukset helpotti suuresti jatkokehityksen koko luokan huumeita, erityisesti hyväksymistä sunitinibimalaattia Yhdysvaltain Food and Drug Administration hoitoon munuaissolukarsinooma (RCC) ja ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet, jotka sisältävät usein samankaltaisia ​​KIT mutaatiot [3]. Myöhemmin tunnustettiin, että sunitinibi selvästi kuluttaa MDSCs ja palauttaa T-solujen toiminta ihmisen RCC potilailla [4], havainto, jota ei ole tehty koirilla aikaan rajallisuuden vuoksi koirien reagenssien ja huonosti määritelty merkkiaineita koira valkosoluja. Me, ja toiset, testaavat uusia immuuni-pohjainen hoitomuotojen koirilla, joilla oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mutta immuuni valvonta näissä tutkimuksissa on sekoitti sama ongelma. Voit laittaa kentän näkökulmasta, pinta immunofenotyypin koirien luonnollisten tappajasolujen ei ole määritelty, MHC alleelit ovat huonosti tunnettuja, ja monet merkitsijä käytetty luottaa ristireagoivat vasta jossa spesifisyys on testattava kokeellisesti. On ratkaisevan tärkeää, että uudet reagenssit kehitetään ja että immunofenotyypeissä kaikki suuret koiran valkosoluja subsets määritetään. Muuttamisesta tämä perus perusta mahdollistaa ainutlaatuinen oivalluksia voidaan tehdä uusia pienmolekyyleillä ja immunoterapioiden testataan koirilla johdantona ihmisten tutkimuksissa.

kertyminen MDSCs kasvaimia omaavilla hiirillä ja ihmisillä, joilla on syöpä on tiedossa olevan keskeinen kasvainten paeta immuunivalvonnan [5], [6], [7]. MDSCs käsittävät fenotyyppisesti heterogeeninen populaatio myeloidisolujen alkuvaiheessa erilaistumisen joka laajenee syövän ja moniin muihin sairauksiin, ja on voimakas kyky tukahduttaa T-solujen toiminta, erityisesti T-solujen lisääntymistä ja efektori sytokiinituotannossa [6], [8] . MDSCs voidaan jakaa monosyyttistä ja granulosyyttisen alatyyppejä. Yksi lähde kiistaa tällä alalla on, että MDSC heterogeenisyys on tehnyt vertailuja syöpäpotilaiden ja kasvainten hiirimallissa haastava (katso viite [9] erinomaisen näkökulmasta). Molekyylitason mekanismeja, joilla MDSCs estävät T-solujen toiminta tutkitaan. Tutkimukset ovat sekaantuneet ylössäätöä arginase 1 (ARG1), indusoituva typpioksidisyntaasi (iNOS2) ja reaktiivisten happiradikaalien (ROS) kuten tärkeitä tekijöitä MDSC-välitteisen immunosuppressiota [8], [10], [11]. ARG1 voi syvästi heikentää T-solujen toiminta tuumoripaikkaan L-arginiini ehtyminen, liipaisu aminohappo nälkään vasteen ja apoptoosin lymfosyyteissä [7]. Toinen mekanismi, immunosuppression on kemokiini nitraus, joka pilaa efektori-T-solujen infiltraatio kasvaimen [12]. Lisäksi MDSC laajennus liittyy downregulation L-selektiini CD4

+ ja CD8

+ T-solujen [13]. Tämä vähentää T-solun kaupan toissijaiseen imukudoselimiin, jossa kasvain-reaktiivisia T-soluja voidaan pohjustaa [13]. Koska kyky MDSCs säädellä vähentä- västi immuunivastetta kasvaimia vastaan ​​hiirillä ja ihmisillä, olemme arveltu, että nämä solut olisivat myös tärkeä rooli kasvaimen aiheuttama immunosuppressio koirilla, joilla on syöpä. Näin ollen tavoitteena oli selvittää solupintamarkkerien jotka luonnehtivat olemassaolo MDSCs koirilla.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimus väestö- ja näytteiden keräämistä

kuvaus kaikki koirat tässä tutkimuksessa on esitetty yhteenveto taulukoissa 1 ja 2, joissa tarkemmin taulukoissa S1 ja S2.

Taulukko S3 on yhteenveto näytteiden määritettiin kussakin kuvassa. Kliiniset tiedot saatiin potilastietoja. Ohjaus koirat määritettiin olevan terve perustuva lääkärintarkastus, omistajan havaintoja ja täydellinen verenkuva tentit. Koirille, joilla on syöpä, diagnoosi ja tuumorin luokitus perustuivat täydellinen fysikaaliset tutkimukset, histopatologia Tuumorinäytteiden, veriarvot ja erikoistunut kuvantaminen testit, kuten TT, ultraääni tai röntgenkuvat, arvioida kasvaimen sijainti ja koko, sekä läsnäolo etäpesäkkeitä. Koirat, joilla suuret, nekroottista tai useita massoja, lyyttiset tai vaikea luun tuhoutumisen (ja osteosarkooma) tai läsnäollessa etäpesäkkeiden, laitettiin pitkälle /metastaattinen ryhmä. Eläimet, joilla oli pieni massoja tai ei etäpesäkenystyröiden laitettiin alkuvaiheessa ei-metastasoituneen ryhmä. Taulukot S1 ja S2 myös luettelo lisää siitä mitään hoitoa, joka koirat syöpään oli saanut ennen tai sen aikana veren keräämisen tätä tutkimusta varten.

verinäytteet sekä syövän ja terveillä verrokeilla koirat saatiin nimenomaan tätä tutkimusta varten . Näytteitä kerättiin heparinisoituihin putkiin jonka Oncology ja yhteisön Practice palvelut Veterinary Medical Center Minnesotan yliopiston mukaan Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. Näytteet vedettiin jälkeen omistajat allekirjoittivat asiakkaan suostumus muodossa. Instituutioannissa Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) tarkastettu ja hyväksytty nimisen tutkimuksen kuin ”Virtaussytometrinen Immunofenotyypitys perifeeristen verisolujen Dogs” kautta nimetty jäsen tarkastelun alla koodinumero 0912A75493. Ellei nimenomaisesti toisin mainita, solut analysoidaan tämän käsikirjoituksen yhdessä puhdistettiin perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) koirien syöpä tai ikään terveisiin, että eristettiin käyttäen Ficoll (Sigma) gradienttisentrifugoinnilla seuraavasti. Heparinisoituihin perifeeristä verta laimennettiin 1:03 steriilillä PBS: llä (Invitrogen), ja Ficoll-Histopaque (Sigma). Näytteet sentrifugoitiin 400 x g 30 minuuttia. PBMC: t kerätään rajapinnan siirrettiin uuteen putkeen, pestiin kahdesti PBS: llä, ja suspendoitiin uudelleen jäädyttäminen liuos, joka sisälsi 90% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) 10% dimetyylisulfoksidi (DMSO) (Sigma) ja jäädytettiin sitten -80 ° C. Lisäksi PBMC: t sulatettiin 2 minuutin ajan 37 ° C: n vesihauteessa ennen värjäystä ja analysointia. Analysointiin tuoreet näytteet, PBMC: t eristettiin edellä kuvatulla tavalla, suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin, värjättiin vasta-aineilla ja analysoitiin välittömästi virtaussytometrialla tai FACS kuten on osoitettu.

Virtaussytometrinen analyysi

PBMC-näytteistä oli eristetty tuoreesta verestä tai sulatettu ja suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin. Epäspesifinen vasta-aineen sitoutuminen estettiin solujen esikäsittely 10 ug /ml canine gamma-globuliini (Jackson Immunoresearch), 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ensin soluja leimattiin käyttäen epäsuoraa värjäys 0,1 ug ei-konjugoitua hiiren anti-koira CD11b-vasta-ainetta (klooni CA16.3E10, ABD Serotec) tai IgG1-isotyyppikontrolli (ABD Serotec) ja 0,5 ug PE-konjugoitua vuohen F (ab ’) 2 anti- -hiiri IgG (Abcam) sekundaarisella vasta-aineella 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä huoneessa. Seuraavien epäsuorien värjäys, solut pestiin kahdesti ja värjättiin 0,3 ug FITC-konjugoidun rotan anti-koira MHCII (klooni YKIX334.2, ABD Serotec) ja 0,15 ug ristireaktiivisten, Alexa fluor 647-konjugoitua hiiren anti-ihmis-CD14 vasta-ainetta (klooni TÜK4, ABD Serotec) tai isotyypit valvontaa 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä huoneessa mukaan valmistajan protokollaa. Vasta-aine-leimattuja soluja pestiin kahdesti ja suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin. Soluja inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä 7-amino-aktinomysiini D (7AAD, lopullinen konsentraatio 1 ug /ml; Calbiochem), ja sitten analysoitiin Becton Dickinson Canto kolmen laser-virtaussytometrillä. Tiedot analysoitiin edelleen kanssa FlowJo ohjelmisto (Puu Star). Analyysi portit asetettiin perustuu 7AAD negatiivinen väestökehitys. Prosenttiosuus MDSCs laskettiin prosenttiosuus CD11

+ CD14

-MHCII

– solujen koko live PBMC väestöstä. Yhdessä kokeessa (kuvio S1), anti-hiiri-PE-konjugoitu CD11b (klooni M1 /​​70 eBioscience) ja anti-hiiri APC-konjugoidun Gr-1 (klooni RB6-8C5 eBioscience) vasta-aineita käytettiin myös tarkistaa ristireaktiivisuutta koira soluja.

eristäminen MDSCs, PMN: t ja T-solut

toiminnalliset analyysit, RT-PCR: llä ja solujen morfologia analyysi, tuoreen veren näytteitä peräisin kasvain koiran käytettiin eristämiseen CD11b

+ CD14

-MHCII

– tai CD11

+ CD14

+ MHCII

– soluja, kuten käyttämällä BD FACSAria -solulajittelijalla. T-solujen eristäminen, PBMC: t eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla tuoreesta verinäytteestä terveiden koirien ja värjättiin 0,3 ug FITC-konjugoitua hiiren anti-koira CD3: n (klooni CA17.2A12, ABD Serotec), 0,15 ug Pacific blue-konjugoitua hiiren anti-koira CD4 (klooni YKIX302.9, ABD Serotec) ja 0,15 ug Alexa700 konjugoitua hiiren anti-koira CD8 (klooni YCATE55.9, ABD Serotec) vasta-aineita. Polymorfonukleaarisia leukosyyttejä (PMN) puhdistettiin solujen pelletti Ficoll-gradientilla terve koira verinäytteistä, poistamisen jälkeen PBMC-(yläosassa gradientti) ja punasolujen RBC lysis-puskuria (eBioscience).

Ex vivo

leviämisen

analyysi MDSC estävää aktiivisuutta T-solujen lisääntymiseen mitattiin

3H-tymidiinin DNA: han. Lyhyesti, PBMC: t ilmoitettu koirat ympättiin U-pohjaisen 96-kuoppalevyille (5 x 10

4cells /kuoppa) elatusaineessa, joka koostuu RPMI 1640, joka sisälsi L-arginiinia (150 uM) (Invitrogen) täydennettynä penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen) ja 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Invitrogen) 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. CD11

+ CD14

-MHCII

– tai CD11

+ CD14

+ MHCII

– soluja koira syöpä lajiteltiin ja lisättiin syöpä (autologinen) tai terve vastaaja PBMC kuten osoitettu. Konkanavaliini A: (5 ug /ml) (Sigma) ja ihmisen rekombinantti-IL-2 (10 IU /ml) (R alukesekvensseissä siivouspalveluista geeni suunniteltiin koirien β-aktiini-geeni käyttäen Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Havaitsemiseksi sytokiinien IL-10 ja TGF-β, alukesekvenssit IL-10 ja TGF-β saatiin julkaistu lähteistä [14]. BLAST-algoritmia (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) käytettiin sen varmistamiseksi, alukkeen spesifisyys kohdegeenin. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi tehtiin käyttämällä QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN). Kaksivaiheista PCR-reaktio suoritettiin 12,5 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 2 x SYBR green master mix (Quanta Biosciences), 0.675U GoTaq polymeraasi, 2 nM MgCl

2 (Promega), 0,2 mM dNTP: itä (Stratagene), 0,2 uM kutakin aluketta parin ja 50 ng cDNA: ta templaattina. Reaktio-olosuhteet koostuivat alkudenaturaatio 94 ° C 2 min, sitten sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 45 s, pidennys 72 ° C ° C: ssa 45 s ja lopullinen pidennys 72 ° C ° C: ssa 5 min DNA Engine Thermal Cycler (Bio-rad). Optimaalinen pariutumislämpötilan kullekin alukeparia perustettiin ennen tutkimusta (katso alukesekvenssit taulukossa S4). PCR-tuotteet ajettiin 2% agaroosigeeleillä, joka sisälsi 0,5 ul /ml etidiumbromidia ja kuvattavan alle 590 nm UV-valo on Eagle Eye II kuva station (Stratagene). Negatiivinen kontrolli suoritettiin käyttäen RNA: ta, joka ei altistu käänteistranskriptio-PCR.

Tilastollinen analyysi

eroja kahden ryhmän välillä analysoitiin käyttäen paritonta, kaksisuuntainen Studentin

t-testiä

. Kaikki testit suoritettiin Prism 4-ohjelmiston (Graph Pad Software, Inc). P-arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Koirat, joilla on edennyt syöpä ovat kohonneet granulosyyttistä CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja että puhdistavat yhdessä kanssa PBMC

Oheislaitteet verinäytteet 45 koirista diagnosoitu syöpä ja 18 terveillä verrokeilla koiraa kerättiin (taulukot 1 ja 2). Kaikki koirat syövän tehtiin kliininen lavastus heidän sairautensa tekemällä täydellinen fysikaaliset tutkimukset, veren työ, kuvantaminen arvioida kasvaimen sijainti ja koko sekä etäpesäkkeitä, ja histopatologiset diagnoosi on tehty diagnostisten aspiraatista tai biopsia kasvain. Niistä 45 koiraa diagnosoitu syöpä, 30 koiraa luokiteltiin aikaistikin tai etäpesäkkeitä ja 15 koiraa luokiteltiin varhaisessa vaiheessa /ei-metastasoituneen tai huono laatu sairaus perustuu kliinisiin lavastus. Kukin ryhmä jakaa edelleen mukaan histologiseen diagnoosiin osaksi sarkoomat, karsinoomat tai syöttösolujen kasvaimet (yksityiskohtaisesti taulukoissa S1 ja S2). Prosenttiosuudet oletetun MDSCs koirilla, joilla on syöpä ja terveiden koirien arvioitiin virtaussytometrialla. PBMC koirista on levinnyt tai metastaattinen syöpä lisääntyi selvästi, että CD11

+ CD14

-MHCII

– osa soluista, jonka osuus useimpien solujen elävien solujen portti, verrattuna koirat diagnosoitu varhaisessa vaiheessa kuin etäpesäkkeitä tai terve koira valvontaa (Fig. 1A). Tämä solujen alaluokka osoitti polymorfonukleaaristen granulosyyttien morfologia heterogeeninen kehitysvaiheissa (Fig. 1 B), joka muistuttaa granulosyyttisen osajoukko MDSCs havaittu hiirissä [15] ja ihmisen [16].

PBMC terveiden koirien ja koiria, joilla syöpä värjättiin myeloidisolu- merkki CD11b, monosyyttistä CD14 ja MHC II. (A) edustaja virtaussytometrianalyysin eteenpäin ja sivusironta ja aidatulla CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja koirista, joilla on edennyt tai etäpesäkkeitä verrattuna koirien kanssa varhaisessa vaiheessa kuin etäpesäkkeitä ja terveillä verrokeilla koiria. Tontit ovat edustavia koiran kehittyneitä metastaattinen hemangiosarkoooma (ylhäällä), alkuvaiheen virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma (keskellä) ja terve koira. (B), FACS-lajiteltu CD11

+ CD14

-MHCII

– solut värjättiin diff-quick solujen morfologian arviointiin. Tyypillinen esimerkki ryhmästä polymorfonukleaarista granulosyyttien morfologian CD11

+ CD14

-MHCII

– soluissa esitetään 63-kertaisella suurennuksella.

Dogs on levinnyt tai metastaattinen syöpä oli merkittävästi suurempi osa otaksuttu MDSCs (36.04 ± 2,542, keskiarvo ± SEM) verrattuna koirien kanssa varhain kuin etäpesäkkeitä (9,40 ± 0,953, keskiarvo ± SEM) ja terveisiin koirat (10,24 ± 1,412, keskiarvo ± SEM) (Fig. 2A). Lisäksi tämä korkeus on CD11

+ CD14

-MHCII

– osa ei näyttänyt olevan rajoitettu tiettyyn kasvain tyyppi. Erot olivat tilastollisesti merkittäviä koirilla kanssa sarkoomaa karsinoomia, ja syöttösolujen kasvaimet verrattuna terveisiin verrokkeihin (Fig. 2B). Sitä vastoin osuus CD11

+ MHCII

– soluja, jotka ilmaisivat CD14 ei ollut merkitsevää eroa keskuudessa mihinkään ryhmään. Siksi taajuus CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja, jotka puhdistavat yhdessä PBMC korreloi kasvaintaakkaa. Tämä havainto on yhtäpitävä aiemmin julkaistu koskevat tiedot MDSC tasoilla ja kasvaintaakkaa hiirillä ja ihmisillä [17], [18].

(A) analyysi keskimääräinen CD11

+ CD14

-MHCII

– väestö usein koirilla, joilla on edennyt vaiheeseen tai etäpesäkkeitä (n = 30) verrattuna alkuvaiheen kuin etäpesäkkeitä (n = 15) ja ohjaus koirille (n = 18). Oli huomattavasti suurempi prosenttimäärä CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja koirilla, joilla on edennyt syöpä vs. varhaisessa vaiheessa kuin etäpesäkkeitä ja terveitä koiria (36.04% vs. 9,40% and10.24%, vastaavasti. B) Keskimääräinen CD11

+ CD14

-MHCII

– väestö taajuus suurten syöpä alatyypeistä: edennyt pitkälle tai metastaattinen sarkoomat (n = 18), alkuvaiheessa ei-metastasoituneen sarkoomat (n = 6) , pitkälle tai metastasoitunut karsinoomia (n = 7) alkuvaiheessa ei-metastasoituneen karsinoomien (n = 7), pitkälle tai metastaattisen syöttösolujen kasvaimet (n = 5) ja alkuvaiheessa ei-metastasoituneen syöttösolujen kasvaimet (n = 2) verrattuna ohjaus- koirien (n = 18). Merkittävästi kohonnut prosentit havaittiin kaikissa kehittyneissä kasvaimet alatyyppien suhteen alkuvaiheessa kasvaimia ja terveitä koiria. Prosenttiosuudet CD11

+ CD14

+ MHCII

– solut eivät merkittävästi ryhmien välillä (* tarkoittaa P 0,001). Keskiarvo ± SEM on esitetty.

CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja toiminnallisesti määritellään MDSCs

Sen testaamiseksi, CD11

+ CD14

-MHCII

– alaryhmä kykeni estämään T-solujen toiminta, teimme sarjan co-kulttuurin kokeiluja. Puhdistettu CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja kolmesta eri alatyyppiä syövän olivat viljeltiin yhdessä autologisten tai terveitä vastaaja PBMC. Kaikissa tapauksissa, CD11

+ CD14

-MHCII

– solut osoittivat voimakasta kykyä tukahduttaa proliferatiiviset vasteet annoksesta riippuvalla tavalla. Edustavia esimerkkejä proliferatiivisten tukahduttaminen esitetään käyttäen näytteitä koira nielurisojen levyepiteelisyöpä (Fig. 3A) ja eturauhasen adenokarsinooman (Fig. 3B). Sen määrittämiseksi, jos estyminen oli artefakti käyttää reagoivien peräisin kasvain koirilla, me analysoitiin proliferatiivisten tukahduttaminen normaalilla vasteen. Lisääminen CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja, mutta ei normaali PMN, heikentynyt leviämisen PBMC terveistä koirista (Fig. 3C). Lisäksi määrä IFN-γ eritys arvioitiin käsitelty alusta alkaen näiden samanaikaisesti kulttuureissa, paljastaen että CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja, mutta ei normaali PMN, tukahdutti IFN -γ (Fig. 3d).

CD11

+ CD14

-MHCII

– solut lajiteltiin ääreisverinäytteestä koirien syövän ja sitten yhteistyössä viljelty autologisten PBMC (A , B) tai terve koira PBMC (C) läsnäollessa mitogeeni 72 hs. Edustavia esimerkkejä yhteensä kahdeksan koiraa on esitetty. Käyrät edustavat proliferatiiviset vasteet lisäämisen jälkeen CD11

+ CD14

-MHCII

– eristetty yhdestä koira levyepiteelisyöpä (3A), eturauhasen adenokarsinooma (3B) ja osteosarkooma (3C). Ei-stimuloitu PBMC käytettiin negatiivisena kontrollina ja PBMC stimuloidaan puuttuessa CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja käytettiin positiivisena kontrollina leviämistä. PBMC myös yhteistyössä inkuboitiin PMN, kontrolloida on muita soluja (3C, 3D). Proliferatiivisia vasteita mitattiin

3H-tymidiinin. CPM, laskee minuutissa. Määrä IFN-γ eritystä yhdessä viljelemisen määritettiin käyttämällä koiran erityisiä IFN-y-ELISA-määritystä (3D). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Keskiarvo ± SEM on esitetty.

MDSCs tukahduttaa sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solujen

edelleen kuulustella suoraa vaikutusta T-lymfosyyttien, puhdistettu CD11b

+ CD14

-MHCII

– soluja koira osteosarkooma olivat viljeltiin yhdessä puhdistetun CD4

+ ja CD8

+ T-solujen terve koira 72 tuntia. Ei-stimuloidut solut ja CD4

+ ja CD8

+ soluja co-inkuboitiin terveen PBMC käytettiin kontrolleina. Kuten odotettua, CD11

+ CD14

-MHCII

– solut inhiboivat CD8

+ (Fig. 4A) ja CD4

+ T-solut (Fig. 4B), kun taas PBMC: t alkaen normaali koira ei. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CD11

+ CD14

-MHCII

– solut todellakin funktionaalisesti määritelty koira MDSCs.

, FACS-lajiteltu CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja eristettiin koiran kanssa osteosarkooman tai terveitä PBMC yhteistyössä inkuboitiin mitogeenistimuloidut CD4

+ ja CD8

+ T-solut eristettiin terve koira 72 hs. Ei stimuloi soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Proliferatiivisia vasteita mitattiin

3H-tymidiinin kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena. CPM, laskee minuutissa. Keskiarvo ± SEM on esitetty.

CD11

+ CD14

-MHCII

– solut ekspressoivat tunnusmerkki MDSC-johdettu immunosuppressiivisia tekijöitä

On osoitettu, että MDSCs voi inhiboida T-solujen toimintaa, jonka liukoisten tekijöiden, kuten arginaasi-1, reaktiivisen hapen, typpioksidia ja TGF-β (8-10). Sen arvioimiseksi, onko CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja koirista, joilla on syöpä voisi käyttää näitä mekanismeja välittävän T-solujen tukahduttaminen, arvioimme ilmaus ARG1 ja iNOS2, sekä immunosuppressiiviset sytokiinien TGF-β: n ja IL-10, tässä solupopulaatio ja PMN: t eristettiin perifeerisestä verestä terveiden koirien. PCR-analyysi RNA: sta FACS eristetty CD11

+ CD14

-MHCII

soluissa vahvisti ilmentymisen ARG-1, iNOS2 entsyymien ja immunosuppressiivisten sytokiinien TGF-β: n ja IL-10-mRNA: n (Fig. 5A) . Sen sijaan normaalin koira PMN: t eivät ilmaisseet ARG1, vaikka iNOS, TGF-β: n ja IL-10-mRNA oli detektoitavissa (kuvio. 5B). Koska mRNA ARG-1, iNOS2, TGF β ja IL-10 havaittiin kaikkien, voimme päätellä, että nämä tekijät voivat olla rooli inhibitio T-solujen lisääntymistä ja efektoritoimintoa. Koska PMN eristää terveistä koirista ei ilmaissut havaittavissa ARG-1-mRNA tai heikentää T-solujen toiminta, mikä viittaa siihen, että ARG-1 voi olla kasvaimen aiheuttama mekanismi, joka MDSCs voisi palkata T-solujen tukahduttaminen. Tämä havainto ei ollut odottamatonta ja on aiemmin dokumentoitu ihmisen MDSC tutkimuksissa [19].

RT-PCR-analyysi FACS puhdistettua CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja havaittiin ilmaus ARG1 ja iNOS2, sekä TGF-β: n ja IL-10 immunosuppressiivisia sytokiinejä. ARG-1-ekspressiota ei havaittu normaalissa PMN: t. CD11

+ CD14

-MHCII

– soluja eristettiin ääreisveren koiran kanssa osteosarkooma ja PMN: t eristettiin terve koira. NRT, RNA-templaatin puuttuessa käänteistranskriptaasia. Tulokset edustavat kolme koetta.

Keskustelu

Vertailevaa onkologian osoittaa suurta lupausta edistää kehittää uusia terapeuttisia koirien ja ihmisten potilaille. Kuitenkin vähäisyys reagenssien ja huonosti määriteltyjä immunofenotyyppi koiran valkosoluja on hillinnyt kykymme ymmärtää kasvain immunologian koirilla luonnossa kasvavien syöpä. Tuloksemme osoittavat olemassaolon MDSCs perifeerisessä veressä koiria, jotka ovat koholla kaikenlaisia ​​edenneen tai metastaattisen syövän analysoiduista verrattuna alkuvaiheessa ei-metastasoituneen syövän ja terveillä verrokeilla. Tämän perus perusta tiedon paikallaan, se on nyt mahdollista takautuvasti seurata MDSC taakka hoidetuilla koirilla kokeellisen huumeita ja immunoterapian. CD11 b

+ CD14

-MHCII

– solupopulaation että me määritelty MDSC yhteistyössä puhdistettu PBMC ollut polymorfonukleaarisista granulosyyttisen morfologia, tukahdutti T-soluproliferaatiota ja efektoritoiminto ilmaistuna tunnusmerkki tukahduttava tekijöitä ihmisen MDSC, ja korreloi positiivisesti kasvaintaakkaa. Proliferaatiomääritykset paljasti suhteellisen heikko lisääntymistä PBMC kasvain koiria (Fig. 3A, B) verrattuna normaaliin vastetta (kuvio. 3C) ilman eksogeenisen MDSC. Tämä heijastaa todennäköisesti kohonneet endogeenisen (ei kokeellisesti lisätty) MDSCs ja säätelijä-T-solujen PBMC koiria, joilla on syöpä. Lisäksi on tärkeää huomata, että toinen osajoukko MDSC joka on enemmän monosyyttistä luonnossa laajalti arvostettu hiiren ja ihmisen kasvaimen immunologian. Emme löytäneet todisteita valikoivaa laajentamiseen CD14

+ monosyytti kaltainen solu veressä koirien syöpään. Kuitenkin CD11

+ MHCII

– soluja, jotka oli puhdistettu koirien kanssa pitkälle edennyt syöpä, jotka olivat myös CD14

+ esti voimakkaasti T-soluproliferaation (kuvio S2), paljastaa, että vaikka monosyyttistä MDSC eivät ole määräävä väestön koiria, joilla syöpä, he ovat todella läsnä. Tämä havainto suosivista laajentamisen granulosyyttistä MDSC ei ole yllättävää, ja on yhtä mieltä vastaavissa tutkimuksissa toteutetaan kasvainten hiirimallissa [15]. Kaiken kaikkiaan meidän tiedot ovat sopusoinnussa globaalin tilan immunosuppression koirilla, joilla on edennyt syöpä, joka johtuu todennäköisesti useita mekanismeja.

Käytännön suoritteen Tämän tutkimuksen on yksinkertainen kolme merkki pinta immunofenotyypin joita voidaan käyttää prospektiivisesti seurata MDSC taakka koirilla. Olemme suorittaneet pilottitutkimuksia etsimään ylimääräisiä markkereita. Erityisiä alustavia tuloksia, jotka ovat syytä huomata, ovat seuraavat. Emme ole pystyneet osoittamaan onnistunut värjäys käyttäen anti-ihmisen CD66b-vasta-aineita. CD66b on aktivaatiomerkkiaine ilmaistiin joistakin ihmisen MDSC [19]. Yleisimmin käytetty merkkiaine MDSC hiiren on Gr-1, ja vasta-ainetta hiiren Gr-1 reagoi ristiin mukavasti koiran soluihin, samoin kuin anti-hiiri-CD11b (kuvio S1). Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, onko koiran solut, jotka on merkitty anti-hiiri-Gr-1 ja CD11 vasta-aineet ovat todellakin MDSCs.

Yksi mahdollinen rajoitus tämän tutkimuksen, että monet näytteet analysoitiin oli jäädytetty, sulanut ennen analyysiä, joka olisi voinut vaikuttaa solujen elinkykyä.