Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia-indusoituva tekijä-1 (HIF-1) ja sen tärkein alayksikkö, HIF-1α, on keskeinen rooli syövän etenemiseen säätelemällä geenien syöpäsolujen selviytymistä, proliferaatiota ja etäpesäkkeiden . HIF-1α aktiivisuus liittyy tumakertymään transkriptiotekijän ja säätelevät useat mekanismit kuten modulaatio proteiinin vakautta ja hajoamista. Niistä viimeaikainen edistys ovat löytöjä, jotka tulehdusperäistä sytokiinien ja kasvutekijöiden vaikuttavat proteiinin kertymistä HIF-1α alle normoksia olosuhteissa. TNFa, on merkittävä pro-inflammatorinen sytokiini, joka edistää tuumorigeneesiä tunnetaan stimulaattori HIF-1α aktiivisuutta. Parantaa ymmärrystämme TNFa-välitteisen sääntely HIF-1α tumakertymään me seulotaan kinaasia erityinen siRNA kirjasto käyttäen solukuvauksessa-pohjainen HIF-1α-eGFP chimera reportterianalyysi. Kiinnostavaa kyllä, tämä systemaattinen analyysi määritettiin, että ehtyminen kinaasien mukana tavanomaisen TNFa signalointia (IKK /NFKB ja JNK väyliä) ei ole haitallista vaikutusta HIF-1α kertymistä. Toisaalta, ehtyminen PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, ja TRIB2 vähentää merkittävästi vaikutusta TNFa on HIF-1α vakauden osteosarkooman ja eturauhassyöpäsolulinjoissa. Nämä äskettäin löydetty sääntelyviranomaisten kuljetetaan niiden toiminnan kautta kuin perinteisen RELB-riippuvainen NFKB signalointireittiä ja sääntelyn superoksidi toimintaa. Yhdessä meidän tietojen avulla voimme päätellä, että TNFa käyttää eri ja monimutkainen signalointi mekanismi aiheuttaa kertyminen HIF-1α syöpäsoluissa. Yhteenvetona tuloksemme valaista uudella mekanismilla, jonka avulla syövän taudin alkamisen ja etenemisen voidaan edistää tulehduksellisten sytokiinien, tuomalla esiin uusia potentiaalisia mahdollisuuksia taudin torjunnassa.

Citation: Schoolmeesters A, Brown DD, Fedorov Y (2012) Kinome-Wide Functional Genomics Screen paljastaa uudella mekanismilla TNFa-indusoidun Nuclear kertymistä HIF-1α transkriptiotekijä syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (2): e31270. doi: 10,1371 /journal.pone.0031270

Editor: Ying Xu, University of Georgia, Yhdysvallat

vastaanotettu 13 syyskuuta 2011; Hyväksytty: 05 tammikuu 2012; Julkaistu: 15 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Schoolmeesters et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Thermo Fisher Scientific. Ei ole nykyisen ulkopuolisen rahoituslähteitä tässä tutkimuksessa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat kilpailevan edun: Kaikki kirjoittajat työskentelevät Thermo Fisher Scientific. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta kirjoittajat noudattaa hänelle kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Tulehdus on ensisijainen puolustus prosessi vastaan ​​eri ekstrasellulaarista ärsykkeet, kuten viruksia, taudinaiheuttajia, elintarvikkeet, ja ympäristökuormituksen. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvainten synnyssä monissa syövissä läheisesti liittyvät krooniseen tulehdukseen. Epänormaali solujen muutoksia, jotka seuraavat krooninen tulehdus, kuten oksidatiivista stressiä, geenimutaatio, epigeneettiset muutos, ja tulehdusta aiheuttavien sytokiinien erittymistä jaetaan karsinogeenisia prosesseja, jotka muodostavat kriittisen rajat yhteyden kroonisen tulehduksen ja syövän syntymistä. Lähes 25% syövistä on raportoitu tapahtua krooninen tulehdus liittyvät prosessit [1], [2]. Proinflammatoristen sääntelyviranomaisten kuten TNFa ja muiden sytokiinien ja niiden reseptori verkkojen näytä pelata tärkeisiin toimintoihin kasvainten synnyssä [3].

Hypoksia-indusoituva tekijä-1 (HIF-1) ja sen tärkein alayksikkö, HIF -1α, on keskeinen rooli syövän etenemiseen säätelemällä geenien syöpäsolujen selviytymistä, proliferaatiota ja etäpesäkkeiden [4]. HIF-1 on tärkeä osa happea tunnistava järjestelmä, joka hallitsee soluvasteita vähentynyt hapen saatavuudesta. Hypoksian indusoituva transkriptiotekijä HIF-1 on heterodimeeri koostuu helix-loop-helix-Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS) proteiinien HIF-1α ja aryylihiilivety ydin- translocator (ARNT) tunnetaan myös nimellä HIF-1β. Transaktivaation HIF-1 lähettää hypoksinen signaali useiksi pathophysiological vastauksia asetuksella lukuisista kohdegeenien [4], [5].

Lisäksi hypoksia, lisää viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että HIF-1 voi olla kertynyt ja aktivoidaan normoksia kasvutekijöiden, sytokiinien ja muiden tekijöiden, jotka liittyvät tulehdukseen [5]. Useat raportit ovat osoittaneet tärkeä rooli TNFa sääntelyn HIF-1α vakaus ja toiminta [6] – [8]. Kuitenkin yksityiskohdat HIF-1 sääntelyn TNFa jäävät epäselviksi.

Tässä kuvaamme viestinvälitystekniikoita että incite HIF-1α kertymistä vastauksena TNFa. Parantaa ymmärrystämme HIF-1 sääntelyä sytokiinien, me seulotaan kinaasia erityinen pieni interferenssi-RNA (siRNA) kirjasto käyttäen HIF-1α-eGFP chimera reportterianalyysi alle TNFa hoitoa. Tässä näytössä määritetään, että ehtyminen

ADCK2

,

PRKAR2B

,

TRIB2

ja

TRPM7

merkittävimmin downregulates ydin- kertyminen HIF-1α vastauksena kohtelu luusarkoomasoluissa. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että tämä reitti on läsnä myös eturauhasen syöpäsoluja. Yllättäen mekanismi sääntelyn TNFa-esiin HIF-1α kertymistä liittyi muiden kuin perinteisten NFKB signalointireitin ja lievittäminen superoksidi toimintaa. Yhdessä meidän tietojen avulla voimme päätellä, että TNFa käyttää eri ja monimutkainen signalointi mekanismi aiheuttaa kertyminen HIF-1α.

Tulokset

TNFa on merkittävä tulehdusta aiheuttavien sytokiinien raportoitu olevan voimakas indusoija HIF-1α tumakertymään [5] – [8]. Tutkimme useita syöpäsolun linjat HIF-1α kertymistä alle TNFa hoitoa. Meidän kokeissa TNFa tuotti merkittävän kasvun tumakertymään HIF-1α useita peruuttaa solulinjoissa (Fig. 1a). Samoin TNFa indusoi ydin- kertyminen on HIF-1α-eGFP kimeeraproteiinia (Fig. S1a, Fig. 1b, c) HIF-1α_U2OS uudelleenjako määritys perustuu luusarkoomasolulinjassa. Havaittu vaikutus oli pitoisuudesta ja ajasta riippuvia (Fig. 1b, c). 24 tunnin inkuboinnin TNFa 10 ng /ml valittiin kaikkiin seulontakokeissa katsottu soveltuvan ikkunan tutkia ylös- ja alas-säätely HIF-1α kertymistä.

(A) TNFa indusoi tumakertymään HIF -1α LNCaP, DU145, MCF10a ja MDA MB231 syöpäsolun linjat. Expression ja tumakertymään HIF-1α määritettiin immunosytokemialla kuvantaminen, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) TNFa-indusoitu stimulaatio HIF-1α-eGFP ydinvoiman kertyminen U2OS osteosarkooman pitoisuusriippuvaisella tavalla. (C) TNFa stimuloi HIF-1α-eGFP ydinvoiman kertymistä U2OS solujen ajasta riippuva tavalla. Kaikki tiedot (mediaani +/- MAD) normalisoitu käsittelemättömiin soluihin. Jokaisen paneelin, tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta suoritettiin kolmena kappaleena *, **: Studentin t-testi p-arvo välillä käsiteltyjen solujen ja vastaavien kontrolliryhmän, * – p 0,01, ** – p 0,05.

on kaksi reseptoreita on kuvattu TNFa, eli TNF-reseptori 1 (TNFR1, p55-reseptori) ja TNF-reseptori 2 (TNFR2, p75-reseptori). TNFR1 ilmentyy kaikkialla, kun taas TNFR2 ilmentyy pääasiassa immuunijärjestelmän soluihin [9]. Vaikka molemmat reseptorit sitovat TNFa: aa, jonka tärkein reseptori välittävä solujen vaikutuksia useimmissa solutyypeissä on TNFR1. Meidän kokeissa knockdovvn TNFR1 tosiasiallisesti pienentää TNFa riippuva ydin- kertymistä HIF-1α (Kuva S1B). TNFa: n tiedetään aktivoida useita eri reittejä pitkin myötävirtaan TNFR1 [9]. Tutkia roolia kinaasien säätelyssä HIF-1α kertymistä alle TNFa hoito, me köyhdytettyä kinaasien HIF-1α-U2OS soluihin käyttämällä siRNA kinaasia kirjasto kohdistaminen 788 kinaasien ja sitten analysoidaan solujen kertymistä HIF-1α-eGFP inkuboinnin jälkeen TNFa: lla ( kuva 2a). Minimoida siRNA off-tavoite aktiivisuus käytimme ON-TARGET

plus

versio ihmisen kinaasien kokoelma SMART

allas

siRNA reagenssit [10]. Sama kinaasi Kirjasto seulottiin ohjauspitotilassa solulinjaa, joka ilmentää ainoastaan ​​eGFP vähennyslaskua mahdollinen ei-erityistä vaikutusta. HIF-1α-eGFP seulonta tiedot tehtiin Studentin t-testi p-arvo analyysi, Benjamini-Hochberg monivertailuja korjaus [11], ja suorituskykyä ranking seuraa vertailu kahden itsenäisen seulonta kokeiluja 1,5 kertainen muutos kynnys. Saatu data edelleen verrattiin tietoja counter-näytön solut, jotka ilmentävät eGFP vain (1,2 kertainen muutos kynnys eGFP vain, kuvassa S2) ja päällekkäiset osumia hylätään. Niistä 788 kinaasien seulottiin siRNA-välitteisen hiljentäminen, ehtyminen 77 geenien lisääntynyt HIF-1α-eGFP kertyminen yli 2-kertaiseksi (taulukko S1) ja vähenemistä vielä seitsemän kohdegeenien vähentynyt kertyminen alla TNFa hoitoon (Fig. 2a). Geenit mikä osoittaa siRNA-välitteinen väheneminen HIF-1α kertyminen oli erityisen kiinnostava, koska nämä saattavat edustaa jäseniä TNFa signalointireittien. Näitä ovat

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, ADRA1B ja TRIB2

. Vahvistaa, että lasku TNFa aiheuttama HIF-1α kertyminen siRNA-transfektoiduissa soluissa liittyi suoraan ehtyminen valitut kohteet me toisti kokeen avulla syntetisoituneeseen siRNA altaat (Fig. 2b). Vain yksi seitsemästä valittujen osuma ehdokasta ei ole vahvistettu: siRNA kohdistaminen

ADRA1B

(tuloksia ei esitetty), joka on sittemmin jätetty tarkempaa analyysiä.

(A) edustaja tietokokonaisuus peräisin kinome laajuinen näyttö 788 siRNA: iden. Data (mediaani +/- MAD) edustavat kolmesta erillisestä transfektioista ja normalisoidaan valvoa siRNA. (B) valitut siRNA osuma ehdokkaita testattiin erillisissä kokeissa. siRNA kohdistaminen

ADCK2, RIOK2, PRKAR2B, TRIB2, TRIO ja TRPM7

vahvistettiin niin osuma ehdokkaat ja alistettiin edelleen analyysiä. Kaikki tiedot normalisoidaan soluihin transfektoitu ohjaus siRNA NTC1. (C) vaikutus valittujen siRNA osuma ehdokkaita HIF-1α kertyminen LNCaP eturauhassyöpäsolulinja. Data (mediaani +/- MAD) edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. Kaikki tiedot normalisoidaan TNFa käsiteltyjä soluja. *, **: Studentin t-testi p-arvo välillä käsitellyt solut ja vastaavat kontrolliryhmän, * – p 0,01, ** – p 0,05.

korkea pitoisuus Analysis lähestymistapa mahdollistaa samanaikaisen hankinnan useiden datavirtojen samasta näytesarja. Hyödynsimme tätä lähestymistapaa analysoida edelleen seulonta tiedot. Kerättyjä tietoja (solujen määrä per kenttä) ehdotti, että yksikään valitun siRNA: iden (

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, ja TRIB2) B tuotettu mitään vaikutusta solujen elinkykyä (Kuva S3). Lisäksi valvontaan proteiinin stabiilisuuteen, HIF-1α-toiminto voidaan säädellä prosesseja, jotka vaikuttavat sen Sijainti solussa, esim. sytoplasminen vs. ydinvoiman. Samanaikainen mittaus HIF-1α kertyminen tumaan ja sytoplasmaan paljasti, että yksikään siRNA tavoitteet valittu pieneneminen tumakertymään tuotettu lisäys soluliman säilyttämistä HIF-1α (tuloksia ei ole esitetty).

tutkia jos valittu ehdokas osumia voi vaikuttaa TNFa-välitteistä kertymistä HIF-1α muissa solutyypeissä päätimme HIF-1α ydinvoiman kertyminen eturauhassyövän solulinjoissa. HIF-1α kertymistä LNCaP ja DU145-soluja havaittiin olevan herkkiä TNFa, kun PC3, eturauhasen solulinja merkittäviä invasiivista potentiaalia [12], ei osoittanut mitään tällaista herkkyys (Fig. 1 a,). Ehtyminen

PRKAR2B

,

ADCK2

,

TRPM7

ja

TRIB2

merkittävästi vähentynyt HIF-1α kertymistä LNCaP, androgeeni-herkän ihmisen eturauhasen adenokarsinooma solu sopusoinnussa alhainen invasiivisia potentiaali (Fig. 2c). Data samanlainen U2OS ja LNCaP saatiin myös MCF10a, ei-tuumorigeenisiä rintaepiteelisolulinja-solulinjassa (kuvio S4a). Vuonna DU145-soluja, eturauhassyövän solulinja, joilla on kohtalainen invasiivisia mahdollisten, vain

TRIB2

ehtyminen on tehokas kumoamisesta TNFa-indusoidun HIF-1α kertymistä (kuvio S4b). Edellä esitetyn perusteella tulokset

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7 ja TRIB2

valittiin lisäanalyysiä varten. siRNA-altaat kohdistaminen näiden geenien aikaan pitoisuudesta riippuvaisia ​​vaikutuksia TNFa: n stimuloimaa HIF-1α kertymistä U2OS luusarkoomasoluissa (Fig. 3a) B

(A) Valittu siRNA vähentää TNFa-välitteistä HIF-1α kerääntymistä pitoisuudesta riippuva maner. (B) siRNA-altaat ja yksittäisten siRNA-molekyylejä tuotetaan vertailukelpoisia vaikutuksia HIF-1α kertymistä. (C) siRNA-altaat ja yksittäisten siRNA molekyylien valitun osuma ehdokkaiden tehokkaasti kohdegeenin ehtyminen. U2OS soluja inkuboitiin TNFa: n kanssa 24 tuntia. Kaikki tiedot normalisoidaan soluihin transfektoitu ohjaus siRNA NTC1. Tiedot edustavat kaksi erillistä koetta, kolme (A, B, Mediaani +/- MAD) tai kaksi (C, Mean +/- STDEV) yksittäiset transfektioiden kukin.

Kaikissa kokeissa käytimme strategioita joiden tiedetään vähenevän siRNA off-tavoite vaikutukset: soveltaminen muutettu kemiallisesti siRNA-molekyylejä ja käyttö on siRNA yhdistämisen strategiaa. Edelleen vahvistaa, että lasku TNFa aiheuttama HIF-1α kertyminen siRNA-transfektoiduissa soluissa liittyi suoraan paikan tavoite vaikutuksista siRNA, me toisti kokeen avulla syntetisoituneeseen siRNA allasta ja neljä erillistä siRNA-dupleksit (jotka käsittävät kukin allas ) heikentävistä kaikki neljä solukohteita. Nämä kokeet tuottanut tulosta samanlainen seulonta tiedot – kaikista neljästä tavoitteesta siRNA allasta ja neljä yksittäistä siRNA-dupleksit tuotettu merkittävää laskua HIF-1α kertymistä ( 2 kertainen, Fig. 3b). Tehokkuus kohdegeenin Knockdown Valittujen siRNA osumia määritettiin käyttäen Q-PCR ja Solaris antureista. Kohdegeenin ehtyminen korreloi HIF-1α fenotyypin määrityksessä – kaikkien neljän tavoitteet siRNA allasta käytetään seulonnassa kampanjan ja neljä yksittäistä siRNA-dupleksit oli voimakasta taintumisen ( 60%, kuvio. 3c). TRPM7 on huonosti ilmaistu U2OS soluissa ja soveltamiseen RNAi reagenssin poistaa tehokkaasti ilmentymisen tämän tavoitteen havaitsemattomalle tasolle (Fig. 3c).

TNFa: n tiedetään säätelevän proteiinien omassa signalointikaskadien. Huomasimme, että ilmaus ADCK2 ja TRIB2 mRNA säätelevät TNFa in U2OS syöpäsoluissa (Kuva S5). Tilastollisesti merkitseviä muutoksia havaittiin varten PRKAR2B ja TRPM7.

Viimeaikaiset raportit osoittavat, että HIF-1α vakautta ja toimintaa voidaan säännellä oksidatiivista stressiä herkkien reittejä [6], [13], [14]. Saapumisreitit ovat myös tunnettuja sääntelyviranomaisten TNFa signaloinnin [6], [15]. Tutkia mahdollista roolia oksidatiivisen stressin mekanismien TNFa-stimuloiduissa HIF-1α kertymistä tutkimme vaikutukset eksogeenisen vetyperoksidia. Kun taas vetyperoksidi yksin tuotti merkittävän kasvun HIF-1α kertymistä, joka on päinvastainen vaikutus havaittiin TNFa-esikäsitellyt solut (Fig. 4a). Tämä tulos viittaa mahdollisen negatiivisen säätelyn HIF-1α kerääntyminen superoksidi, pääasiallinen lähde solunsisäisten peroksidien [16]. Oletimme, että äskettäin löydetty positiivisia säätelijöitä HIF-1α kertymistä voi ohjata joko superoksidituotantoa tai muuntaminen peroksidi. Vuonna U2OS soluissa, TNFa voimakkaasti lisääntyneen ekspression MnSOD, yksi suurimmista superoksidi /peroksidi muuntaminen entsyymejä (kuvio S6). Kuitenkin ehtyminen havaittiin positiivinen sääntelyviranomaisten HIF-1α kertymistä ei ollut vaikutusta ilmentymistä MnSOD (Kuva S6).

(A) Vaikka vetyperoksidin lisäys (100 uM, 3 tunnin inkuboinnin) voi stimuloida HIF -1α kertymistä, se vähentää tällaisen kerääntymisen TNFa-käsitellyissä soluissa (21 h inkubointi TNFa: n vasta sen jälkeen 3 tunnin inkuboinnin, kun läsnä on sekä TNFa: n ja vetyperoksidin). Data (mediaani +/- MAD) normalisoitu soluihin transfektoitu ohjaus siRNA NTC1 ja käsiteltiin DMSO. (B) Superoksidi puhdistavien pelastus- HIF-1α kertymistä transfektoiduissa soluissa siRNA kohdistaminen

ADCK2

ja

TRIB2

mutta ei

PRKAR2B

tai

TRPM7

. Soluja käsiteltiin TNFa samanlainen (A) ja inkuboitiin Tiron (0,3 mM), 4-hydroksi-TEMPO (0,1 mM) tai DMSO: ta (ajoneuvon hallinnan) 3 tunnin ajan. Data (mediaani +/- MAD) normalisoitu soluihin transfektoitu ohjaus siRNA NTC1 ja käsiteltiin DMSO. Kunkin paneelin tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta suoritettiin neljänä kappaleena. *, **: Studentin t-testi p-arvo välillä käsitellyt solut ja vastaavat kontrolliryhmän, * – p 0,01, ** – p 0,05.

Havaitsimme, että superoksidi scavengers Tiron ja TEMPOL pystyvät pelastamaan HIF-1α kertyminen TNFa-käsitellyissä soluissa, jotka oli transfektoitu siRNA vastaan ​​ADCK2, ja TRIB2 levitettynä pitoisuutena, joka ei merkittävästi vaikuta ohjaus soluja (Fig. 4b). Solut transfektoidaan PRKAR2B ja TRPM7 siRNA ei vaikuttanut superoksidi puhdistavien (Fig. 4b). Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että TNFa välittää HIF-1α kertyminen mekanismilla, joka vähentää superoksidituotannon, ja ADCK2, PRKAR2B ja TRIB2 ovat positiivisia sääntelyviranomaisten tämän mekanismin.

Useita reittejä ja tekijät raportoidaan säätelijöinä HIF- 1α aktiivisuus muut koe järjestelmät ja olosuhteet, mukaan lukien perinteiset NFKB, JNK, STAT3 ja proteasomiaktiivisuus [5]. Lisäksi TNFa: n tiedetään indusoivan signaloinnin kautta tavanomaisen NFKB reitti [9], [17]. Analyysi meidän Tulokset paljastivat, että ehtyminen kinaasit, jotka ovat välttämättömiä näiden reittien tuottanut ole negatiivista vaikutusta TNFa-välitteistä HIF-1α kertymistä. Meidän kokeissa TNFa tuottanut mitään merkittävää vaikutusta STAT3-riippuvaisen reitin (Kuva S7A). Oletimme, että koska TNFa indusoi HIF-1α kertymistä, se voi myös estää proteasomiaktiivisuuden. Tämän vuoksi testasimme TNFa mahdollisena agonisti U2OS_E6-AP: p53 hajoaminen ja U2OS_SCF-Skp2 E3: p27 hajoaminen uudelleenjako määrityksiä. Proteasomiaktiivisuus estäjä MG132 aiheuttamaa kertyminen eGFP-kimeerojen molemmissa määrityksissä taas inkubointi TNFa ei ollut vaikutusta (kuvio S7b, c).

Tiedot meidän seulonta kokeet viittaavat siihen, että ehtyminen ylävirtaan sääntelyviranomaisten JNK-reitin johtaa lisäys HIF-1α kertymistä vastauksena TNFa hoitoon (taulukko S1). Ehtyminen ylävirran sääntelyviranomaisten tavanomaisen NFKB polku

Chuk, IKBKB tai IKBKE

eivät moduloida HIF-1α kertymistä vastauksena TNFa hoitoon (Kuva S8). Lisäksi siRNA-välitteinen ehtyminen paljasti, että NFKB proteiinit RELA ja NFκB2 voivat toimia alipaineensäätöventtiileillä tällaisen kertymisen koska niiden Knockdown tuotettu jyrkkä nousu HIF-1α kertymistä (Fig. 5a). Sen sijaan NFKB proteiineja RELB, cREL ja NFκB1 näyttävät olevan välttämättömiä TNFa aiheuttama HIF-1α kertymistä koska ehtyminen vastaavien geenien tuotetun voimakas negatiivinen vaikutus kertymistä (Fig. 5a). Aktivointi NFKB proteiinien korreloi niiden solunsisäisen translokaatio [17]. Huomasimme, että U2OS luusarkoomasoluissa, TNFa stimuloi translokaatiota RELB ja cREL välillä tumaan ja sytoplasmaan, jossa RELB syrjäytetään tumaan ja cREL kertyminen tumaan. Samanlaisia ​​ehtyminen TNFR1, ehtyminen TRIB2 ja TRPM7 esti ydin- syrjäytymisen RELB (Fig. 5b). cREL translokaatio ei vaikuttanut ehtyminen valitut kohteet (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi vaikutus RELB ehtyminen lievitti superoksidi poistajia Tiron ja TEMPOL (Fig. 5c). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että TNFa-välitteistä HIF-1α kertyminen voidaan ainakin osittain säätelee kuin perinteisen NFKB signalointireittiä aktivoida TRIB2 ja TRPM7.

(A) kuluminen NFκB1, RELB ja cREL mutta ei NFκB2 ja RELA häiritä HIF-1α kertyminen TNFa-käsitellyissä soluissa. (B) kuluminen ADCK2 ja PRKAR2B estää kerääntymisen RELB ytimet TNFa-käsiteltyjen solujen. (C) vaikutus ehtymisen RELB pelastaminen ROS scavengers. Soluja käsiteltiin samanlainen kuin kuvio. 4C. (D) Kaikki tiedot (mediaani +/- MAD) on normalisoitu transfektoitujen solujen ohjaus siRNA NTC1 käsiteltiin TNFa: n (10 ng /ml, 24 h). Tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta suoritettiin kolmena kappaleena. *, **: Studentin t-testi p-arvo välillä käsitellyt solut ja vastaavat kontrolliryhmän, * – p 0,01, ** – p 0,05.

Keskustelu

TNFa on tunnettu herättää useita signalointimekanismeja jossa eri kinaasien pelata korvaamaton rooli. Viimeaikaiset edistysaskeleet funktionaalisen genomiikan ja solujen kuvantamismenetelmiä pystyimme suorittamaan säännöllisesti tutkimus mahdollisista mekanismeista TNFa-välitteistä HIF-1α kertymistä. Tutkia roolia kinaasien säätelyssä HIF-1 aktiivisuutta hoidettaessa TNF-α, me köyhdytettyä kinaasien U2OS luusarkoomasoluissa käyttäen kemiallisesti modifioitua siRNA kinaasi kirjasto kohdistaminen 778 kinaasien ja sitten analysoitiin ydin- kertymistä HIF-1α-eGFP chimera konstitutiivisesti näissä soluissa. Tässä määrityksessä TNFa voimakkaasti lisääntynyt HIF-1α-eGFP proteiinien kertymistä (Fig. 1 b, c).

Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa HIF-1α kertymistä voimakkaasti tukahdutettu useita säätelyreittejä. Kinaasit ja niihin liittyviä proteiineja tiedetään hyvin tärkeä rooli näissä reittejä. Niinpä odotimme, että suurin osa siRNA osuma ehdokkaista antaisi vapautumisen tukahduttaminen HIF-1α kertymistä. Todellakin, yksi 788 kinaasien seulottiin siRNA-välitteisen hiljentäminen, ehtyminen 6 kinaasien merkittävästi vähentynyt HIF-1α keskittymisen ja ehtyminen toisen 89 kinaasien lisääntynyt HIF-1-aktiivisuutta soluissa käsiteltiin TNFa: n (Fig. 2a, b ja taulukko S1).

jossain määrin, meidän tiedot esitetään yhteenveto aiempia havaintoja koskien negatiivisia säätelijöitä HIF-1α toimintaa [18]. On raportoitu, että SMG-1 estää HIF-1-aktiivisuus hypoksisissa olosuhteissa ja että siRNA-välitteinen väheneminen geenituotteen lisää merkittävästi aktiivisuus HIF-1α-herkkä reportteri [18]. Tulokset meidän seulonta kokeet osoittavat, että ehtyminen SMG-1 nimenomaan up-säätelee TNFa aiheuttama HIF-1α kertymistä (tuloksia ei ole esitetty).

Useita väyliä havaittiin olevan merkittävästi yliedustettuna ryhmässä 77 alipaineensäätöventtiileillä: 16 geenejä edustaa GO: 0007049 solusyklin (

NEK4

,

TAF1L

,

CKS2

,

TTK

,

MAP3K8

,

PIM2

,

TLK1

,

PPP2CA

,

NEK9

,

PRKAG1

,

NEK6

,

PLK4

,

DGKZ

,

DUSP1

,

PIM1

,

PRKAA2

), 11 geenejä edustaa GO: 0000165 MAPKKK signalointiryöpyn (

PPP2CA

,

RPS6KA3

,

DUSP5

,

MAPKAPK3

,

MAPK8IP3

,

MAP4K5

,

DUSP2

,

MAPK11

,

MAP4K1

,

DUSP1

,

MAP3K9

), ja neljä kinaasien edustavat GO: 0007254 JNK Kaskadijärjestelmä (

MAP4K1

,

MAP4K5

,

MAPK8IP3

,

MAP3K9

) (taulukko S1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että tällaiset keinot voivat vastustaa TNFa signaloinnin ja estävät HIF-1α kertymistä.

väheneminen useiden kohdegeenien estävät TNFa-välitteistä HIF-1α kertymistä (Fig. 2). Nämä geenit voivat edustaa yhden tai useamman TNFa viestinvälitystekniikoita, ja ovat erityisen kiinnostavia. Meidän seulonta kampanja me tunnistettu kuusi tavoitetta tällaista (Fig. 2b). Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että neljä näistä geeneistä –

ADCK2

,

PRKAR2B

,

TRIB2

ja

TRPM7

– näyttävät säännellä HIF-1α kertymistä useita syöpäsolulinjoissa (Fig. 2, kuva S4). Kaikki neljä geenit kuvattiin aikaisemmin yhteydessä säätelyyn syöpäsolujen lisääntymistä ja liikkuvuuteen, mutta olemassa olevia tietoja ei viitannut niiden osallistumista TNFa signalointi [19] – [23]. Toiminnot

ADCK2

proteiinia eivät ole vielä selvillä. Ei tiedetä, jos se on proteiinikinaasi aktiivisuutta ja minkälainen alustan se fosfory-. Useat raportit perustanut yhteyden

ADCK2

syöpäsolujen lisääntymistä ja liikkuvuus [20].

PRKAR2B

koodaa cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin tyypin II-beeta säätelyalayksikköä. CAMP-riippuvainen proteiinikinaasi A: (PKA) on kaikkialla läsnä oleva seriini /treoniini proteiinikinaasi. PKA hyväksytään merkittävänä välittäjänä solunsisäisen cAMP signaaleja eukaryooteissa. Tähän mennessä useita soluliman ja muutaman ydin- PKA substraatteja on raportoitu [23]. Mielenkiintoista, ehtyminen

PRKAA1

(katalyyttinen alayksikkö PKA) tuotetaan myös väheneminen HIF-1α kertymistä, vaikka vähemmässä määrin kuin

PRKAR2B

väheneminen (tuloksia ei ole esitetty). Lisätutkimukset ovat tarpeen selventää tarkkaa roolia PKA in TNFa stimuloiman HIF-1α kertymistä. Vaikka molekyylipainon funktio TRIB2 (Tribbles homologi 2) on edelleen epäselvä, se on tunnistettu mahdollisesti edistää keuhkojen kasvaimien syntyyn ja myelooinen onkogeenin [21], [22]. TRPM7 on läsnä kaikissa konstitutiivisesti aktiivinen kaksiarvoisen kationin kanava. Se tarjoaa mekanismin Mg2 + tulon ja siten on välttämätöntä solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [19], [24].

Key sääntelyviranomaisten TNFa signalointipolkujen ovat reaktiivisia happiradikaaleja (ROS;

esim

., superoksidi, vetyperoksidi, ja hydroksyyliradikaali) [6], [15]. ROS on ehdotettu moduloivan TNFa signalointia, joka tarjoaa sekä positiivista että negatiivista sääntelyn NFKB järjestelmän myötävirtaan TNFR1 riippuen koejärjestelmää ja olosuhteet [6], [25]. Tuloksemme tarkoita, että vetyperoksidi estää TNFa-välitteistä HIF-1α kertymistä (Fig. 4a). Nämä tiedot viittaavat siihen, että lähde solunsisäisen vetyperoksidin, superoksidianionin voi estää TNFa-välitteistä HIF-1α kertyminen samoin. Oletimme, että äskettäin kuvattua säätelijöitä kertyminen voi saada niiden vaikutuksen kautta modulaatio superoksidituotantoon. Todellakin, lievitykseen Superoksidianionin aktiivisuuden pelastaa HIF-1α kertymistä taustalla ehtyminen ADCK2 ja TRIB2 (Fig. 4b). Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että TNFa-indusoidun HIF-1α kertymistä voidaan säädellä superoksidi- herkkä polku, ja että edellä mainitut kolme proteiinit voivat olla mukana negatiiviseen säätelyyn superoksidituotannon (Fig. 6).

tulokset viittaavat siihen, että TNFR1-reseptori voi välittää sen vaikutus läpi monimutkainen mekanismi, joka sisältää ei-perinteisen NFKB-riippuvaisen reitin. Tämä mekanismi voi säädellä negatiivisesti reaktiivisten happiradikaalien ja näyttää ohjata TRIB2, ADCK2 ja PRKAR2B.

On hyvin tunnettua, että tavanomainen ja epätavanomaisia ​​NFKB signa- ovat päämekanismia jotka välittävät vaikutukset TNFa sisäistä solun fysiologiaa [26]. Meidän seulonta tulokset viittaavat siihen, että ehtyminen positiivisia sääntelyviranomaisten ylävirtaan tavanomaisten NFKB – IKK-α (

Chuk

), IKK-β (

IKKB

) tai IKK-ε (

IKBKE

) – valmistettu ole negatiivista vaikutusta HIF-1α tumakertymään (Kuva S8).

Lisäksi olemme havainneet, että ehtyminen

RELA

ja

NFKB2

johtaa merkittävään ylössäätely HIF-1α kertyminen taas ehtyminen

RELB

,

cREL

ja

NFKB1

tuottaa lasku HIF-1α kertymistä. Tällainen vähennys voidaan pelastaa lieventäminen Superoksidianionin aktiivisuuden (Fig. 5). Lisäksi ehtyminen

TRIB2

ja

TRPM7

havaittiin estävän solunsisäisen translokaatiota RELB käsittelemällä TNFa. Nämä havainnot antoi meille mahdollisuuden spekuloida, että TNFa voi säädellä HIF-1α kertyminen kautta sekä perinteisen ja muun kuin perinteisen NFKB reittejä. Todellinen määrä kertynyt HIF-1α sitten riippuu tasapaino eri TNFa aiheuttama NFKB reittejä. Ehdotettu malli näyttää olevan sopusoinnussa tunnetun monimutkaisuus tulehdus syövän suhteet [3].

Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että TNFa aiheuttama HIF-1α kertyminen säädellään useita reittejä (Fig. 6 ). Ainakin osittain TNFa voi välittää vaikutuksensa kautta TNFR1 reseptorin signalointi johtaa muiden kuin perinteisten NFKB-riippuvaisen mekanismin, joka säätelee negatiivisesti reaktiivisten hapen lajeja. Tämä mekanismi näyttää ohjata ADCK2 ja TRIB2. TRPM7 näyttää stimuloida RELB translokaatio, mutta sen ehtyminen fenotyyppiä ei voida pelastaa lievittämiseen superoksidi toimintaa. Täten TRPM7 voi edustaa riippumattoman reitin sääntelyn HIF-1α kertymistä. Lisätutkimukset ovat tarpeen ymmärtää monimutkaistumisesta TNFa riippuvan stimulaation HIF-1α tumakertymään ja sen roolia kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

PC3, DU145, LNCaP, MCF10a, MDAMB-231, MCF7, SW480 ja HepG2 saatiin ATCC ja huolletaan suositellaan protokollien.

HIF-1α_U2OS uudelleenjako määritystä käytettiin seulonnassa kampanjan seurata HIF- 1α tumakertymään: rekombinantti U2OS solut, jotka ilmentävät stabiilisti ihmisen

HIF-1α

(NM_001530) fuusioitu C-päähän parannettua vihreää fluoresoivaa proteiinia (eGFP). U2OS solut ovat kiinnittyneet epiteelisolujen, jotka ovat peräisin ihmisen osteosarkooma. Expression eGFP-HIF-1α ohjataan standardin CMV-promoottori ja jatkuvaa ilmentymistä ylläpidetään lisäämällä G418: aa elatusaineeseen valmistajan mukaan protokollaa. U2OS vakaa solulinjaa, joka ilmentää eGFP ainoastaan ​​käytettiin vähennyslasku ohjaus seulonnassa kampanja.

Lisäksi HIF-1α_U2OS vaikutus TNFa hoidon testattiin kolmessa erillisessä Thermo Fisher Scientific uudelleenjako Kokeet: Tällä STAT3_U2OS Redistribution Assay , E6-AP: p53 hajoaminen uudelleenjakautumista Assay (U2OS) ja SCF-Skp2 E3 ligaasin: p27 hajoaminen uudelleenjakautumista Assay (U2OS). Määritykset suoritettiin valmistajan protokollien kaikille viite yhdisteitä. TNFa-käsittely, kukin määritys solulinja käsiteltiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa TNFa seuraavilla pitoisuuksilla: 80 ng /ml, 40 ng /ml, 20 ng /ml, 10 ng /ml, 5 ng /ml, 2,5 ng /ml, 1,25 ng /ml, ja 0,63 ng /ml. Kukin TNFa titraus suoritettiin neljänä rinnakkaisena 96-kuoppaisilla määritystä levyt, ja jokainen määritys levyyn suoritettiin kolmena kappaleena. Jälkeen TNFa hoito, levyt kiinnitettiin, värjättiin Hoechst 33258, ja kuvattiin kuten alla on kuvattu. TNFa hankittiin R & D Systems, vetyperoksidi, Hoechst 33258, Tiron ja 4-hydroksi-TEMPO (TEMPOL) hankittiin Thermo Fisher Scientific.

Transfektio

Kaikki solulinjat transfektoitiin kanssa Dharmafect (DF) Transfektiomenetelmätapa reagenssit (Thermo Fisher Scientific): DF1 (HepG2, MCF7, MCF10A), DF2 (SW480), DF3 (HIF-1α_U2OS, DU145, LNCaP, PC3) ja DF4 (MDA-MB-231). Seulonta kampanja HIF-1α_U2OS ja ohjaus soluja suoritettiin käyttäen ON-TARGET

plus

versio ihmisen kinaasien kokoelma SMART

allas

siRNA Regents kinaasi kirjasto kohdistaminen 788 kinaasien (Thermo Fisher Scientific ).