Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ennuste potilaita, joilla on peräsuolen syöpä (CRC) on yleensä huono, koska niillä ei ole yksinkertainen, kätevä ja noninvasive työkaluja CRC havaitsemiseksi varhaisessa vaiheessa. Löytö MikroRNA (miRNA) ja niiden ilmaisun profiileja eri mahdollisista sairauksista on avannut uuden avenue kasvainten diagnosointiin. Rakensimme seerumin microRNA ilmaisun profiilin allekirjoitus ja testattu sen spesifisyys ja herkkyys biomarkkerina diagnoosissa CRC. Tutkimme myös sen mahdollista roolia valvonnassa etenemisen CRC. Teimme kaksi vaihetta tapaus-verrokki testi tunnistaa seerumin miRNA biomarkkereina CRC diagnoosia. Kvantitatiivisin käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktioilla testasimme kymmenen ehdokkaan miRNA koulutustoimeen joukon (30 CRC vs 30 ohjaa). Riskiluku analyysiä käytettiin arvioimaan diagnostista arvoa seerumin miRNA profilointitoimilaitteen. Muut riippumattomat näytteet, mukaan lukien 83 CRC ja 59 valvontaa, käytettiin vahvistamaan diagnostisen mallin. Vuonna training set kuusi seerumin miRNA (miR-21, anna-7 g, miR-31, miR-92a, miR-181B, ja miR-203) oli merkittävästi erilainen ilme tasojen CRC ja terveillä verrokeilla. Riskiluku analyysi osoitti, että kuuden miRNA-pohjainen biomarkkereiden allekirjoitus oli suuri herkkyys ja spesifisyys erottamaan CRC näytteet syöpää vapaa valvontaa. Kuuluvilla alueilla vastaanotin toimii (ROC) käyrä Kuuden miRNA allekirjoitus profiilit olivat 0,900 ja 0,923 kahden sarjaa seeruminäytteitä, vastaavasti. Kuitenkin saman seeruminäytteet, kuuluvilla alueilla ROC käyrän käyttämä kasvainmerkkiaineet syöpä -antigeeni (CEA) ja hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9) oli vain 0,649 ja 0,598, tässä järjestyksessä. Ilmentymistasojen kuuden seerumin miRNA myös korreloivat CRC etenemistä. Siten tunnistettu kuusi miRNA allekirjoitusta voidaan käyttää noninvasive biomarkkeri diagnoosin CRC, jolla on suhteellisen suuri herkkyys ja spesifisyys.

Citation: Wang J, Huang Sk, Zhao M, Yang M, Zhong Jl Gu Yy, et ai. (2014) tunnistaminen Kiertävä MicroRNA allekirjoitus peräsuolen syövän havaitseminen. PLoS ONE 9 (4): e87451. doi: 10,1371 /journal.pone.0087451

Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Ranska

vastaanotettu: 30 lokakuu 2013; Hyväksytty: 28 joulukuu 2013; Julkaistu 7 huhtikuuta 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Key Basic Research Program of China (2007CB914700). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa. Sen osuus lähes 50000 kuolemantapausta vuosittain ja se on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat [1], [2]. On arvioitu, että joka vuosi, yksi ja puoli miljoonaa uutta CRC tapausta diagnosoidaan maailmanlaajuisesti [2]. Tutkimus on rekisteröity National Cancer Institute: n Surveillance Epidemiology and Lopputulokset (SEER) tietokanta, suoritettiin 119363 ihmiset diagnosoitu paksusuolen adenokarsinooma vuodesta 1991 ja 2000. Tutkimuksessa todettiin, että havaitut 5 vuoden eloonjäämisluvut liittyivät vaiheeseen sairauksien diagnosointiin; potilaille diagnosoidaan I /II vaiheen selviytyminen oli paljon parempi kuin potilailla diagnosoitiin myöhemmissä vaiheissa [3]. Vaikka pätevän hoito ja seulontaohjelmat tärkeitä rooleja selviytymisen potilaalla on CRC, kirurginen resektio alkuvaiheessa on tehokkain hoito ja pidentää potilaiden selviytymiseen. Valitettavasti alkuvaiheen CRC on vaikea havaita, koska vähemmän oireita.

Tällä hetkellä tähystys ja ulosteen piilevän veren testit (FOBT) käytetään usein klinikoilla diagnosoida CRC potilaille. Kuitenkin, ei vain satunnainen koepalan invasiivista toimenpidettä, mutta mahdollisten näytteenotto voi esiintyä, mikä edelleen rajoittaa niiden tehoa. Samaan aikaan, vaikka FOBT on yksinkertainen, edullinen ja noninvasive, se esittää erityisesti huono herkkyys havaitsemiseksi alkuvaiheen CRC [4], [5]. Proteomiin verenkierrossa on sovellettu myös havaita biomarkkereita CRC kuten syöpä -antigeeni (CEA) ja hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9), mutta sen herkkyys ja spesifisyys, erityisesti varhaisessa vaiheessa peräsuolen syövän, vaikuttaa riittämättömältä [6]. Siksi tarvitaan uusia menetelmiä ja uusia diagnostisia biomarkkereiden tarvitaan pikaisesti massa tutkimuksia varhaisen tapahtumien CRC.

MicroRNA (miRNA) on ~22-nt pitkä ei-koodaava RNA, jolla on negatiivinen rooli geeniekspression [7], [8]. Muuttunut ilmentyminen miRNA on yhdistetty erilaisiin sairauksiin, erityisesti syöpää. MiRNA on osoitettu onnistuneesti erottaa erilaisia ​​syöpiä ja ennustaa tuloksia sekä kiinteiden ja hematologisten maligniteettien [7]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa suuria määriä miRNA verenkierrossa. Nämä kiertävän miRNA kestävät epäsuotuisat fysiologisia olosuhteita, kuten äärimmäiset pH, lämpötila, ja useita pakastus /sulatus-sykliä [9], [10]. Lisäksi jotkut tutkijat huomautti, että profiilit kiertävän miRNA olivat pysyvästi ekspressiotasot poikki fysiologisesti terveillä yksilöillä [11]. Koska seerumi ja plasma on suhteellisen helppo käyttää, kiertävän miRNA on yksi lupaavimmista ehdokkaita syövän diagnoosissa. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmentyminen kuviot seerumin miRNA voivat mahdollisesti tunnistaa eri syöpätyyppejä, mukaan lukien keuhkosyöpä, eturauhassyöpä, rintasyöpä, munasarjasyöpä, ja maksasyöpä [12], [13]. Siksi tunnistaminen ainutlaatuinen seerumin miRNA ilmaisun profiilin CRC on hyötyä diagnosoinnissa ja jatkohoidon kasvainten.

Vahvistaa diagnostinen tehokkuus liikkeeseen miRNA, uusia menetelmiä nostaa niiden diagnostista arvoa CRC vaaditaan. Monet tutkijat havaitsivat, että yhdistelmä useista miRNA biomarkkerina voisi parantaa diagnostista tehokkuutta [14], [15]. Nämä tutkimukset keskittyivät pääasiassa sääteli miRNA. Tässä tutkimuksessa pyrittiin yhdistämään sekä ylä- ja alassäädetty miRNA, rakentaa diagnostinen malli CRC. Ensin validoitu kymmenen miRNA aiemmin raportoitu liittyvän CRC, eli miR-21, miR-31, miR-203, miR-92a, miR-181 b, miR-145, miR-143, miR-30c, miR-17, ja anna-7g. Sitten, jonka tilastollinen analyysi, tunnistimme profiilin, joka yhdistetään kuusi seerumi miRNA, joka voi toimia uutena noninvasive biomarkkeri CRC diagnoosia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja terveillä vapaaehtoisilla ennen tutkimusta, ja kaikki näytteet kerättiin protokollien mukaisesti hyväksymän Clinical Research eettiselle toimikunnalle Cancer Institute ja sairaalan, kiina Academy of Medical Sciences.

tutkimus suunnittelu ja potilaat

tunnistamiseksi korvike biomarkkeri CRC, monivaiheinen tapauskontrollitutkimuksessa suunniteltiin tunnistamaan diagnostinen seerumin miRNA profiilin (katso kuva 1). Kaikkiaan 113 primaarisessa CRC (vaiheet I-IV) ja 89 verrokeilla rekrytoitiin tähän tutkimukseen. Kaikki 113 syöpäpotilasta rekrytoitiin Cancer Institute ja sairaalan, Kiina Academy of Medical Sciences vuosien 2008 ja 2010 Potilaat, joilla on aiemmin ollut pahanlaatuisia kasvaimia, perinnöllinen ei-polypoosin CRC tai familiaalinen adenomatoottisen polypoosin, jätettiin pois. Seerumi kerättiin ennen mitään kasvaimen resektiota, kuten leikkaus, kemoterapia ja /tai sädehoito. Jokainen potilas oli histologisesti diagnosoitu, ja kasvain vaiheessa määritettiin perustuu pääosin kirurgian havaintoja, tai biopsia ja kuvantamisen teknologiaan, kun kasvain ei sopinut leikkaushoitoa. Terveillä verrokeilla, joilla ei ole tunnettua maligniteetti tai aktiivisia tulehdustila oli sovitettu potilaiden iän, sukupuolen ja etnisen taustan. TNM luokittelu järjestelmää käytettiin arvioimaan kasvain vaiheessa mukaan kasvain-solmu-etäpesäke lavastus järjestelmä kuudennen Edition American Joint komissio. Väestörakenne ja kliinisiä piirteitä tutkimuskohortissa on lueteltu taulukossa 1.

biomarkkereiden valintavaiheessa, paneeli kymmenen ehdokkaan miRNA (miR-21, anna-7 g, asennuspalveli- 31, miR-92a, miR-181B, miR-203, miR-17, miR-30c, miR-143, ja miR-145) valittiin tutkimuksen seeruminäytteistä perustuu aikaisempaan katsauksia peräsuolen syöpä [13], [ ,,,0],16]. Koulutusta asetettu, me satunnaisesti valitun 30 CRC ja 30 tervettä verrokkia ja suoritetaan kvantitatiivinen käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktioilla (qRT-PCR) valita ehdokas miRNA. Myöhemmin, validointi suoritettiin käyttäen jäljellä 83 CRC ja 59 terveen luovuttajan näytteistä (validointi sarja).

Serum kokoelma, RNA: n eristys ja qRT-PCR-määritys

Laskimoverinäytteet (≈5 ml ) kerättiin seerumia keräysputkia, ja jätettiin huoneen lämpötilassa noin 1 tunnin ajan ennen kuin sentrifugoitiin 820 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Saatu seerumi siirrettiin uusiin putkiin, minkä jälkeen edelleen sentrifugoimalla 16000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, täysin kaiken solujäännöksen poistamiseksi. Kokonais-RNA eristettiin 250 ui seerumia käyttäen Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) samanaikainen puhdistus tekniikkaa. Kunkin 250 ui seerumia, faasierotus suoritettiin lisäämällä 750 ui Trizol LS. Sitten 200 ui trikloorimetaania lisättiin lisätä RNA faasin erotusprosessia. Kokonais-RNA saostettiin käyttäen isopropanolia ja pestiin 75% etanolilla, sitten 30 ui RNaasitonta vettä lisättiin liukenemisen. Kukin 250 ui seerumia saatiin 30 ui kokonais-RNA: ta, joka oli varastoitu -80 ° C: ssa. Kolme ui kokonais-RNA: ta polyadenyloituina poly (A) polymeraasilla ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen TaKaRa microRNA transkription (Takara, Japani), seuraten valmistajan protokollaa. Käänteistranskriboidusta tuotteet laimennettiin viidesosa RNaasi-vapaata vettä ja käytettiin templaatteina edelleen PCR-analyysiin. PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara) ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan tarjoama yleispohjamaaliksi ja miRNA-erityisiä eteenpäin aluketta. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 2. Kukin reaktio suoritettiin 20 ul: n tilavuudessa, joka sisältää 2 ui cDNA: ta, 0,4 ui kutakin aluketta (10 uM), 0,4 ul: ROX viite väriainetta (50 x), 6,8 ul: aan steriiliä tislattua vettä, ja 2 x SYBR Esisekoite Ex Taq II. PCR-ohjelma oli seuraava: denaturaatio 95 ° C: ssa 30 sekuntia, minkä jälkeen 40 sykliä denaturointi 5 s 95 ° C: ssa ja pidentäminen 31 s 60 ° C: ssa. Lopussa PCR-sykliä, sulamiskäyräanalyysillä analyysit suoritettiin vahvistamaan spesifisyyden, odotettu PCR-tuote. Jokainen reaktio suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja cDNA laimennus käytettiin templaattina negatiivisen kontrollin.

Endogeeninen miR-16 käytettiin normalisoija kierrättämiseksi miRNA kvantifiointiin. Suhteellinen ekspressiotasot miRNA laskettiin vertaileva 2-

ΔΔCT menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [17], [18].

Serum CA19-9 ja CEA-analyysi

kasvainmerkkiaineet CEA ja CA-199 analysoitiin kanssa Elecsys immunomääritys analysaattorin (Roche, Basil, Sveitsi). Ylempi normaalin rajoissa varten kasvainmerkkiaineet olivat 6,5 ng /ml CEA ja 39 U /ml CA-199.

Tilastollinen

vertailu demografiset ja kliiniset piirteet välillä CRC potilaiden ja terveillä verrokeilla määritettiin Studentin t-testiä, yksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA), tai chi-potenssiin testi.

Risk pisteet analyysi suoritettiin arvioimaan assosiaatio CRC näytteiden ja miRNA ekspressiotasot. Riski pisteet jokaisen miRNA että koeryhmä merkitään

s

. Sillä säädellään ylöspäin miRNA, diabetesriskitestiin asetettiin 1, jos ilmentymistaso oli korkeampi CRC näytteissä kuin ylempi 95% viiteaikavälillä vastaaville miRNA tasolla kontrolleissa, ja että alassäädetty miRNA, riski tilanne oli asetetaan -1 jos ilmentymistaso oli alempi CRC näytteissä kuin alempi 95% viiteaikavälillä kontrolleissa; muuten pisteet asetettiin 0. korrelaation jokaisen miRNA CRC riski, kutakin potilasta riskipainoa pisteet toiminto (RSF), joka perustuu lineaarisen yhdistelmän ekspressiotasot miRNA. Tietojen avulla kuudesta miRNA, RSF näytteen

i

on seuraava: Laskennallisesti edellä,

sij

on riski pisteet miRNA

j

näytteen

i

, ja W

j

on paino riskin pistemäärä miRNA

j

. Voit selvittää Ws, kuusi yhden muuttujan logistinen regressio mallien varustettu tautitilanne jokaisen riskin tulokset. Regressiokerroin kunkin riskitekijän pisteet käytettiin painon osoittamaan osuus kunkin miRNA että RSF. Taajuus taulukko ja vastaanotin toimivat (ROC) käyriä käytettiin sitten diagnoositietoja vaikutuksia profiloinnin ja löytää sopiva sulku kohta. Validointi menettelyn ja cutoffs suoritettiin validointi asetettu.

Riippumaton otosten t-testiä käytettiin vertaamaan seerumin miRNA pitoisuudet välillä syövän ja terve näytteitä. Suuruuden vuoksi ja erilaisia ​​suhteellisia miRNA ekspressiotasoja, jotka havaittiin, tulokset tietoja log-transformoitiin analysoitavaksi (log

2). Kaikki testit olivat 2-puolinen ja merkitsevyystasolla p-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ja kuvaajat muodostettiin kanssa Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data esitetään keskiarvo. Klusterin analyysi, hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttäen Cluster 3.0 (Berkeley, CA, USA) kanssa täydellisen sidoksen menetelmällä.

Tulokset

kuvaus potilaiden

Kaikki 113 potilasta, jotka osallistuivat tässä tutkimuksessa oli kliinisiä ja patologisia diagnoosi CRC. Kuten taulukossa 1 esitetään, ei ollut merkittävää eroa jakelu iän, sukupuolen ja muiden sairauksien, kuten sydämen vajaatoimintaa tai neurologinen sairaus, välillä CRC potilaiden ja terveiden verrokkien koulutukseen ja validointi sarjaa. Kohonneet CEA ( 6,5 ng /ml) ja CA19-9 ( 39 U /ml) havaittiin 40 ja 26 potilasta, vastaavasti.

arviointi miRNA ilmaisun CRC potilaiden ja terveiden verrokkien reaaliaikaisella qRT-PCR-analyysi

kaksivaiheinen tapaus-verrokki koe suunniteltiin tunnistamaan seerumin miRNA ehdokkaaksi biomarkkereita CRC diagnoosia. Valitsimme kymmenen ehdokasta miRNA raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa, ja käytetty qRT-PCR-määrityksissä vahvistamaan ilmaisua 30 CRC tapauksissa ja 30 iän ja sukupuolen terveisiin koulutuksessa asetettu. MiR-16 ilmentyminen käytettiin normalisoimaan qRT-PCR tietoja. Ei havaittu merkitsevää eroa tasojen miR-17, miR-145, miR-143, miR-30c välillä CRC ja vertailunäytteet (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin ekspressiotasot kuusi miRNA olivat merkittävästi toisistaan ​​CRC ja vertailunäytteet; kaksi miRNA, miR-21 ja anna-7g, otettiin säädelty, ja neljä miRNA, miR-31, miR-92a, miR-181B, ja miR-203, oli alassäädetty (taulukko 3). Pitoisuudet kuudesta differentiaalisesti ilmaisi miRNA tutkittiin qRT-PCR: llä 83 CRC potilaiden ja 59 verrokkia validoinnissa asetettu. Muutoksilla on miRNA ekspressiokuvioita havaittiin validointi asetettu olivat yhdenmukaisia ​​löytyy koulutusta asetettu. Ero ilmentymistä kuuden miRNA on 113 CRC tapauksissa verrattuna 89 valvonta on esitetty kuviossa 2. Näin ollen, tämä kaksivaiheinen testi ja analyysi prosessi syntyy profiili kuuden seerumin miRNA joka toimi mahdollisena biomarkkeri CRC. Kuusi ehdokasta biomarkkerit alistettiin sitten lisätestejä ja analyysejä.

seerumissa ekspressiotasoja Kuuden valitun miRNA mitattiin 113 CRC tapauksissa ja 89 terveiden verrokkien (sekä harjoitussarjassa ja validointi asetettu) käyttämällä SYBR-pohjainen qRT-PCR. Jokainen reaktio suoritettiin kolminkertaisena.

erottaminen CRC tapauksissa ja terveillä verrokeilla riskialueittain pisteet analyysi

arvioimiseksi diagnostinen arvo miRNA ilmaisun allekirjoitus, joka sisältää kuusi tunnistettu miRNA, teimme riskiluvun analyysin erottaa CRC seeruminäytteet ja seeruminäytteistä terveillä verrokeilla. Ensinnäkin riski pisteet kullekin miRNA koulutukseen set laskettiin käyttämällä riskiluku kaavaa. Tällä optimaalinen raja ennustearvo 9,595 riskien pisteet toiminto, kun herkkyys ja tarkkuus olivat selvimmin, seeruminäytteet jaettiin matalan riskin ryhmään ja korkean riskin ryhmään edustava terveiden luovuttajien ja CRC tapauksissa vastaavasti . Seuraavaksi käytimme kynnysarvon analyysin 142 näytteiden validointi asetettu. Kuten taulukosta 4, positiivinen ennustearvo ja negatiivinen ennustearvo on kuuden miRNA allekirjoitus koulutuksessa asetettu olivat 0,96 ja 0,85 vastaavasti, ja validointi asettaa positiivinen ja negatiivinen ennustearvo arvot olivat 0,95 ja 0,92 vastaavasti. Olemme myös rakennettu ROC käyrät arvioida herkkyys ja spesifisyys miRNA-pohjainen biomarkkerit. Alueet käyrien alla (AUC) oli 0,900 ja 0,923 koulutus- asettaa ja validointi asettaa vastaavasti (kuvio 3A ja 3B). Käyttämällä samaa seeruminäytteet, vertasimme AUC varten kuuden miRNA allekirjoituksen kanssa AUC varten kasvainmerkkiaineet CEA ja CA19-9, joita tällä hetkellä käytetään klinikoilla CRC havaitsemiseksi. AUC-arvot kuuden miRNA allekirjoitus olivat merkittävästi korkeammat kuin AUC CEA (0,649) ja CA19-9 (0,598) (kuvio 3C ja 3D). Nämä tulokset osoittavat, että kuuden miRNA allekirjoitus on tarkempi biomarkkereiden kuin CEA ja CA19-9 CRC diagnoosia.

(A) ROC-käyrä analyysi profiilin kuusi- miRNA allekirjoituksen harjoitussarjassa tuotti AUC-arvo on 0,900 (95% CI: 0,812-0,988), jossa 83,3% herkkyys ja 96,7% spesifisyys (cut-off-arvo = 9,595). (B) ROC-käyrä analyysi profiilia kuuden miRNA allekirjoituksen validoinnissa joukko tuotti AUC-arvo 0,923 (95% CI: 0,869-0,976), jossa 96,4% herkkyys ja 88,1% spesifisyys (cut-off-arvo = 9,595) . (C) Karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) tuotti AUC-arvo 0,649 (95% CI): 0,574-,724) 35,4% herkkyys ja 94,4% spesifisyys ja (D) hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9) tuotti AUC-arvon of 0,598 (95% CI: 0,521-0,676), jossa 23% herkkyys ja 96,6% spesifisyys, saman seeruminäytteistä.

Assosiaatio demografiset ja kliiniset tekijät

määrittämään roolia kuusi miRNA-pohjainen tuumorimarkkereina CRC kehittämiseen, CRC tapausta edelleen stratifioitiin perustuu niiden TNM pysähdyspaikan. Tässä analyysissä CRC näytteet opetusjoukolla ja validointi asettaa yhdistettiin ja ekspressiotasot kuudesta miRNA korreloivat kasvaimen vaiheessa CRC potilaista. Huomasimme, että riski pisteet arvot olivat erilaiset keskuudessa CRC tapauksissa eri kasvaimen vaiheissa (katso kuva S1A). Keskimääräinen riski pisteet CRC tapauksista myöhemmissä vaiheissa (IIb, III ja IV) oli huomattavasti korkeampi kuin pisteet aiemmissa vaiheissa (I ja II). Ei ollut merkittävää yhteyttä välillä kuusi miRNA ja sukupuoli, ikä, imusolmukestatuksesta, ja kasvaimen invasiivisia syvyys (katso kuva S1B-E).

valvomaton klusterianalyysillä

analysoimiseksi ero ilmaus miRNA välinen CRC ja kontrolliseerumin näytteitä, teimme valvomattoman Klusterointiprosessia joka oli sokea kliinisen merkinnät. Dendrogrammi osoitti selvän eron CRC näytteitä kontrollinäytteistä perustuu kuuden miRNA allekirjoituksen profiilin (katso kuva S2). Koulutuksessa joukko, yksikään 30 CRC näytteitä ja vain neljä 30 verrokkinäytteitä luokiteltu virheellisesti (kuvio S2A). Validoinnissa asetettu, 83 CRC tapauksissa ja 59 valvonnan luokiteltiin kahteen pääryhmään; vain yksi CRC tapaus ja kolme kontrolleja luokiteltu väärin (kuva S2B).

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA ilmaisu ei ole täydellistä CRC kehittämiseen; mutta useimmat näistä tutkimuksista keskityttiin ilmentyminen miRNA kasvain- kudosten ja solujen. Vaikka kudos miRNA voi antaa tarkan diagnoosin eritasoisten Syövän vaikeuksia kerätä kudosnäytteistä rajoittaa sen soveltamista varten havaitsemalla syöpä biomarkkereita. Hankkiminen kudosnäytteet on invasiivinen menettely ja riippuu kirurgisen osissa kuluttua ensimmäisestä kliinisen luokittelun. Etsintä noninvasive työkaluja diagnoosi syöpä on pitkään ollut tavoite monet tutkijat, ja paljon kiinnostusta on ollut liikkeessä nukleiinihappojen plasmassa ja seerumissa. Verrattuna DNA: n ja mRNA: n, verenkierron miRNA osoittaa hämmästyttävää vakautta Pitkän inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa, ja /tai useita jäädytys-sulatus prosesseja. Kuitenkin suojaava mekanismi kiertävän miRNA on vielä tuntematon. Jotkut tutkijat kertoivat, että kiertävä miRNA olivat muodossa argonaute 2 (Ago2) -miRNA komplekseja, jotka voivat välttää RNaasi ruuansulatusta [19]. MiRNA plasmassa voidaan erittää soluista ja vapauttaa prosessi voi olla selektiivinen mekanismi, joka korreloi pahanlaatuisuuteen [20]. On olemassa monia etuja käyttämällä verenkierrossa miRNA CRC havaitsemiseksi. Näytteiden kerääminen on helppo ja edullinen, ja tärkeintä on suhteellisen noninvasive menettely, jota voidaan soveltaa helposti seulonta ja seuranta syöpäpotilailla. Lisäksi miRNA profiilit ovat pääasiassa yhdenmukaisia ​​joukossa terveet yksilöt ja ovat hyvin stabiileja veressä.

Early etsii noninvasive työkaluja diagnosointiin syöpien painottuivat yhden tai muutaman tuumorispesifisen miRNA [9] , [21] – [23]. Esimerkiksi Liu et ai. [21] tutki miRNA profiilit seerumissa mahalaukun syövän potilaiden, peräsuolen syöpä potilaiden ja terveiden yksilöiden. Kiinnostavaa kyllä, he huomasivat, että kiertävä miR-378 liittyi mahasyövän, mutta ei ollut yhteydessä muihin ruoansulatuskanavan syöpiin. He kertoivat, että miR-378 ekspressiotasot voivat erottaa mahasyöpä potilaita terveisiin kontrolleihin, jossa 87,5% herkkyys ja 70,73% tarkkuus [21]. Seerumin miR-1246 yksinään tuottivat ala ROC käyrän 0,754, jossa 71,3% herkkyys ja 73,9% spesifisyyttä erottaa ruokatorven syöpään potilaita terveisiin kontrolleihin [23]. Vaikka tällainen lähestymistapa on yksinkertainen ja käytettävissä, spesifisyys biomarkkerit perustuu yhteen tuumorispesifisen miRNA on yleensä huono. Aloittaminen ja syövän kehittyminen liittyy monia erilaisia ​​ja monimutkaisia ​​molekyylitason tapahtumia, jotka vaikuttavat proliferaatiota syklit, ja apoptoosin. Näin ollen, yhdistelmä usean seerumin miRNA pitäisi olla luotettavaa kasvainten havaitseminen kuin tavanomainen yhden proteiinin perustuva tai hiilihydraatti-pohjainen biomarkkerit. Tässä tutkimuksessa olemme määritelleet kaksi sääteli seerumin miRNA (miR-21, anna-7g), ja neljä alassäädetty miRNA (miR-31, miR-181B, miR-92a, miR-203). Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus kuvaamaan seerumin miRNA-pohjainen allekirjoitus, joka oli rakennettu yhdistämällä yli- ja ilmaisi miRNA, jotka molemmat osallistuvat merkittävällä tavalla kasvaimen proliferaatiota, migraatiota, ja hyökkäystä. Kuuden miRNA allekirjoitus voisi havaita CRC seeruminäytteet herkkyydellä ja spesifisyys 93% ja 91%, vastaavasti (katso taulukko S2), huomattavasti korkeampi kuin mikään yksittäinen-tekijä biologisten merkkiaineiden, kuten CA19-9 tai CEA. Tuloksemme osoittivat, että saman seeruminäytteet, herkkyyttä CRC havaitsemisen CA19-9 ja CEA olivat 35% ja 23%, tässä järjestyksessä. On selvää, yhdistetty kuuden miRNA allekirjoitus voi menestyksekkäästi erottaa CRC potilaiden valvontaa, ja voisi toimia tarkka biomarkkerina CRC diagnoosia. Erityisesti tämä biomarkkeri saatiin erilainen ilme profiilin välillä normaalin valvonnan ja CRC potilailla, joilla on vain vaiheen I /II syöpiä (taulukko S1). CRC potilaalla on vaiheen I /II voi läpikäydä täydellinen resektio kasvain, ja on parempi ennuste. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että soveltaminen kuuden miRNA allekirjoituksen biomarkkerina määrittelyyn alkuvaiheen CRC voi olla tehokas tapa muuttaa tuloksia ja parantaa ennustetta. Olemme havainneet, että miRNA ilmentyminen korreloi kasvaimen vaiheessa, ja seerumi miRNA allekirjoitus voidaan käyttää havaitsemaan etenemisen vaiheessa CRC. Eroja ei havaittu, kun CRC tapausta ositettu demografiset ja kliiniset tekijä, kuten sukupuoli, ikä, imusolmukestatuksesta ja kasvaimen invasiivisia syvyys; kuitenkin, meidän tulokset osoittivat, että korkean riskin pisteet liittyi kehittyneen kliinisen vaiheissa tämän taudin (kuva S1). Tällä hetkellä TNM lavastus järjestelmä on tärkein väline lääkärit arvioida kasvaintaakkaa ja ennustaa ennustetta ja selviytymistä. Ehdotamme, että kuuden miRNA allekirjoitus seeruminäytteistä voi tulla tärkeä ennustava parametri valittaessa paras yhdistelmä hoitomuotoja, kuten leikkaus, säteilyä, ja /tai kemoterapiaa. Kuitenkin meidän tiedot ovat osittain ristiriitaisia ​​tuloksia joidenkin aiempien tutkimusten; esimerkiksi ekspressiotasot miR-181 b, miR-92a, miR-31, ja miR-203 on raportoitu olevan koholla CRC kudosnäytteistä verrattuna kontrolleihin. Tämä ero saattaa johtua eri miRNA ekspressiotasot välillä kudoksen ja plasman. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA ilmentymistä kudosnäytteitä muuttunut vastakkaiseen suuntaan niiden ilmentymistä seeruminäytteistä [21], [24]. Tämä voi johtua solun valinnan mekanismi miRNA vapautumisen [20]; Esimerkiksi syöpäsolut voivat selektiivisesti säilytyspussit miRNA, jolloin lasku miRNA seerumissa. Enemmän kiinnostavaa, ilmaus näistä neljästä alassäädetty miRNA havaittiin myös olevan alassäädetty joissakin muiden syöpien. Esimerkiksi miR-31, joka sijaitsee kromosomissa 9p21.3, oli huomattavasti alhaisempi virtsarakon syöpä [25], rintasyövän [26], mahasyöpä [27], eturauhassyöpä [28], ja CRC aivometastaasi [ ,,,0],29]. Monet tutkijat ovat havainneet, että miR-31 voi estää rintasyövän etäpesäkkeitä [26], [30], ja sääntelyn purkaminen miR-31 on liittynyt syövän etenemiseen ja etäpesäkkeitä. Korkea ilmentyminen miR-92a on liittynyt kehittymistä ja etenemistä monien syöpien [31]; kuitenkin, Shigoka et ai. [32] havaitsivat, että miR-92a oli hyvin ilmaistu maksasyövän kudosten, oli alhaisempi plasmassa näistä potilaista, mutta kohosi niiden plasmassa jälkeen leikkaushoitoa. Nilsson et ai. [33] osoitti, että matalan miR-92a tasoa kasvaimia liittyy vaiheessa kasvain ja että sen alassäätöä kasvoi solumigraation. MiR-181 b on osoitettu toimivan kasvainsuppressorigeenin, ja sen alas-säädellä ihmisen glioomissa [34], [35].

Yhteenvetona, tämä on ensimmäinen tutkimus raportoi kliinisesti diagnostista arvoa of kuuden miRNA-pohjainen biomarkkereiden allekirjoitus seerumin, joka sisältää sekä ylä- ja alassäädetty miRNA. Työmme toimii perustana lisätutkimuksissa mieluiten laajamittainen validointi kliinisissä kokeissa, ennen kuin seerumin miRNA voidaan käyttää seulontakäytäntö työkalu CRC.

tukeminen Information

Kuva S1.

yhdistys ekspressiotasoja kuuden miRNA väestökehityksen ja kliiniset tekijät CRC potilaista. (A) Kun CRC tapausta ryhmitellään niiden TNM lavastus, keskimääräinen riski pisteet CRC tapausten myöhemmissä vaiheissa (IIb, III ja IV) oli huomattavasti korkeampi kuin aiemmissa vaiheissa (I ja II) (p 0,05). (B-E) ei ollut merkitsevää assosiaatiota kuusi miRNA ja kasvaimen invasiivisia syvyys, imusolmukestatuksesta, sukupuoli ja ikä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0087451.s001

(DOCX) B Kuva S2.

Dendrogrammi n valvomattoman klusterointi tuloksia. Dendrogrammi osoittaa selvän eron CRC näytteitä kontrollinäytteistä perustuu kuuden miRNA allekirjoitus sekä harjoitussarjassa (A) ja validointi setti (B).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0087451. S002

(DOCX) B Taulukko S1.

Differentially-ilmaistuna miRNA vaiheessa I /II CRC seeruminäytteiden verrattuna hallita seeruminäytteistä. Normalisoitu miRNA ekspressiotasot esitetään keskiarvona ± SD.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0087451.s003

(DOCX)

Taulukko S2.

herkkyys ja spesifisyys kuuden miRNA biomarkkereiden allekirjoitus verrattuna CEA ja CA19-9 markkereita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0087451.s004

(DOCX) B