Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sisplatiini käytetään yleisesti munasarjasyövän kemoterapian kuitenkin chemoresistance sisplatiinia edelleen suuri kliininen haaste. Onkogeeniset transkriptiotekijä FOXM1 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt munasarjasyöpä. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään mahdollista roolia FOXM1 munasarjojen syöpiä chemoresistance sisplatiiniin. Tuloksemme osoittavat, että FOXM1 on yliaktiivista solunsalpaajaresistentti munasarjasyövän näytteitä, ja puolustaa munasarjasyöpäsoluja vastaan ​​sytotoksisuuden sisplatiinia. FOXM1 helpottaa DNA korjaukseen läpi säännellä suoraan transkription tavoite EXO1 suojella munasarjasyövän soluja sisplatiinin välittämän apoptoosin. Lieventävät FOXM1 ja EXO1 ilmaisun Sirna, täydentää kemoterapia tehoa vastaan ​​munasarjasyöpä. Tuloksemme osoittavat, että kohdistaminen FOXM1 ja sen kohdegeenin EXO1 voisi parantaa sisplatiinin vaikutusta munasarjasyövän, vahvistaa niiden asemaa moduloinnissa sisplatiinin herkkyyttä.

Citation: Zhou J, Wang Y, Wang Y, Yin X, hän Y, Chen L, et ai. (2014) FOXM1 moduloi Cisplatin Herkkyys säätelemällä EXO1 munasarjasyövässä. PLoS ONE 9 (5): e96989. doi: 10,1371 /journal.pone.0096989

Editor: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center at San Antonio, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 lokakuu 2013; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 13, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: In suorittaa tämän käsikirjoituksen, kirjoittajat ovat saaneet tukea National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81272882,81302275, 81072137) ja Shanghai komitean Science and Technology (Grant nro 12411950200). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti maailmassa, jossa 225500 uutta tapausta ja 140200 kuolemantapausta arvioitu 2008 [1]. Useimmat naiset epiteelin munasarjasyöpä (EOC) läsnä kehittyneitä sairaus (vaihe III tai IV) ajankohtana diagnoosin. Nykyinen standardi munasarjasyövän hoitoon, sekä varhainen ja pitkälle edennyt, muodostuu täydellinen sytoreduktiivisen leikkauksen jälkeen kemoterapiaa, perustuvat yleensä platinaa ja taksaania kaksinkertainen [2]. Mutta kehitystä chemoresistance liittyy edelleen merkittävä este onnistuneelle hoitoon. Useimmat potilaat periksi chemoresistance ja uusiutuminen, ja koko 5 vuoden pysyvyys on noin 31% [3]. Parempi ymmärrys molekyylitason perustan Sisplatiinin vastus voi johtaa uusiin kasvainten vastainen strategioita, jotka herkistävät penseä munasarjasyöpiä sisplatiiniin kemoterapiaan.

Nisäkkäiden transkriptiotekijä Forkhead Box M1 (FOXM1) kuuluu suuri perhe Forkhead transkriptiotekijät. Forkhead perheenjäsenet ovat mukana monenlaisia ​​biologisia prosesseja kuten alkionkehityksen proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosin, transformaatio, tuumorigeneesiprosessin pitkäikäisyys, ja metabolisen homeostaasin [4]. Toisin kuin muut FOX-transkriptiotekijöiden, FOXM1 liittyy solujen lisääntymistä ja on yli-ilmentynyt syövän. Esimerkiksi geeni-ilmentymisen profiilit karsinoomat, mukaan lukien eturauhas-, rinta-, keuhko-, munasarja-, paksusuoli-, haima-, maha-, virtsarakko-, munasarja-, maksa- ja munuais-, paljasti, että FOXM1 on yli-ilmentynyt kaikissa karsinoomissa [5] – [9]. Yliekspressio FOXM1 eri kasvaimissa osoittaa voimakas riippuvuus kasvaimen solujen FOXM1 [10]. Lisäksi munasarjasyöpä, integroidun polku analyysi osoitti, että FOXM1 transkriptiotekijä verkko on muuttunut merkittävästi 87% korkealaatuisesta serous munasarjasyöpä [11]. FOXM1 edistää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion munasarjasyövän [12]. FOXM1 on myös osoitettu olevan ratkaiseva merkitys huumeiden reagointikykyä ja kestävyys. Esimerkiksi on osoitettu, että vapautettu FOXM1 ilmentyminen voidaan resistenssin kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten sisplatiini ja epirubisiini [13], ja suojaavat syöpäsolujen vastaan ​​DNA-vaurion indusoiman solukuoleman rintasyövän [14]. On kuitenkin edelleen heikko, onko FOXM1 sama asema vastaa annetaan sisplatiinin vastarinnan munasarjasyöpä.

EXO1 on proteiini, 5 ’: sta 3’ eksonukleaasiaktiivisuudella sekä RNaasi H toimintaa, joka on vuorovaikutuksessa MSH2 ja joka on mukana mismatch korjaus ja rekombinaatio [15], [16]. Tuore tutkimus osoittaa, että EXO1 myötävaikuttaa induktioon DNA-vaurioita tarkistuspisteitä ja osallistuu DNA-vaurioiden korjaamiseen [17], [18].

Tässä tutkimuksessa tarjoamme todisteita että FOXM1 ja sen suora myötävirtaan DNA: n korjaukseen geeni EXO1 voisi olla lisäämisessä eloonjäämisen munasarjasyöpäsoluja jälkeen sisplatiinihoitoon, ja kohdistaminen FOXM1 /EXO1 akselin herkistää munasarjasyövän solusta sisplatiinihoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

protokollia käsittelyyn parafinoidut munasarjasyöpä yksilöitä ja analysointi potilastiedot hyväksyi eettiset komiteat Renji sairaala, Shanghai Jiao Tong University, Kiina. Kirjallinen suostumukset allekirjoitti kunkin tutkimukseen tullut potilas, jos hän oli vielä elossa tai hänen ensimmäisen asteen sukulainen, jos hän on kuollut. Kaikki kudosnäytteet kirjaaman asian numero tietokannassa ilman potilaan nimiä tai henkilökohtaisia ​​tietoja ilmoitetaan.

immunohistokemia

parafinoidut kudosnäytteitä kerättiin 20 naisten ensisijainen epiteelin munasarjasyöpä , stagesIIto IV, joille oli tehty alustava kirurgian osastolla Naistenklinikka, Renji sairaala, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston välillä 2005-2008. Objektilasit poistettiin parafiini, vedettömät ja pantiin sitruunahappo (pH 6,0, 0,1 M) lämmityksen 10 min. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus sitten blokattiin 3% H

2O

2 10 minuuttia. Sen jälkeen leikkeitä inkuboitiin estopuskurilla (Beyotime, Kiina) 1 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin yön yli 4 ° C: FOXM1-vasta-aineen (1:50, Santa Cruz). Sen jälkeen kun on inkuboitu 10 minuutin ajan biotinyloidun toisen vasta-aineen, objektilasit uudelleen inkuboitiin streptavidiini-peroksidaasilla samoissa olosuhteissa. Immunoreaktion jälkeen visualisoitiin inkuboimalla diaminobentsidiiniä kromogeenin (DAB, Maixin-Bio, Kiina) 5 min. Lopuksi levyt vasta- värjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, poistetaan ja asennetaan. Negatiiviset kontrollit inkuboitiin estopuskurissa yksin. Nämä tulokset huomioon vain, jos nämä kontrollinäytteiden osoitti negatiivisesti värjätty.

Solulinjat ja kulttuurin

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa A2780 ja SKOV3 ostettiin Cell Bank of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina). Molemmat solulinjat viljeltiin RPMI 1640 (Hyclone, USA), johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 g /ml streptomysiiniä ja soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO2 /95% ilmaa.

siRNA ja plasmiditransfektiolla ja kotransfektiojärjestelmää

siRNA dupleksit valmistettiin RiboBio (Guangzhou, Kiina). SiRNA: n sekvenssi siRNA: iden olivat seuraavat: FOXM1 siRNA-1: 5′-GCCAAUCGUUCUCUGACAGAATT-3 ’, siRNA-2: 5′-GGACCACUUUCCCUACUUUUUTT-3′ [19]. EXO1 siRNA-1: 5’-CAAGCCUAUUCUCGUAUUUTT-3 ’, siRNA-2: 5′-UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCU-3′ [18]. Sekvenssi negatiivisen kontrollin (NC) on: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’. Transfektio tai kotransfektoimalla siRNA ja plasmidi suoritettiin valmistajan protokollan Lipofec- tamin’ia (Invitrogen).

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen), ja cDNA syntetisoitiin käyttäen PrimerScript RT reagenssia Kit (Takara). Reaaliaikaiseen kvantitatiivinen PCR, sama määrä cDNA lisättiin SYBR esiseokseen EX Taq II (Takara) ja ajaa Stepone reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystem). Sykliohjelma oli 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena, ja β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus. Eteenpäin ja taaksepäin-aluketta olivat seuraavat: FOXM1: 5’GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3 ’ja 5′-GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3’, EXO1: 5’CCTCGTGGCTCCCTATGAAG-3 ’ja 5′-AGGAGATCCGAGTCCTCTGTAA-3’. PLK4: 5’AAGCTCGACACTTCATGCACC-3 ’ja 5′-GCATTTTCAGTTGAGTTGCCAG-3’. XRCC1: 5’CCTTTGGCTTGAGTTTTGTACG-3 ’ja 5′-CCTCCTTCACACGGAACTGG-3’. BRCA2: 5′- TGCCTGAAAACCAGATGACTATC-3 ’ja 5’AGGCCAGCAAACTTCCGTTTA-3’. Rad51: 5’CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3 ’ja 5′-TTCTTTGGCGCATAGGCAACA-3’. β-aktiini: 5’CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ’ja 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’.

klonogeeninen määritys

transfektion jälkeen NC tai geenispesifistä siRNA, solut altistettiin ilmoitettu pitoisuus sisplatiinin 1 h. Sitten solut suspendoitiin uudelleen tuoreeseen täydelliseen kasvualustaan, ja maljattiin 6-kuoppaisille soluviljelmässä levyyn tiheydellä 500 solua /kuoppa. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO2 /95% ilmaa, 8-10 päivää, väliaine vaihdetaan joka 3 päivä. Lopussa kulttuurin, solut värjättiin 1% metyleenisineä 50% metanolia 20 minuutin ajan, pestään vedellä, ja pesäkkeet (≥50 solua) laskettiin.

Western blot

solut lyysattiin RIPA-puskuriin täydentää PMSF-proteaasinestäjä, jota seuraa sentrifugointi 14000 g 10 minuuttia. Lopussa sentrifugoimalla solulysaatit kerättiin ja proteiinipitoisuus solulysaateista mitattiin. Sama määrä proteiineja (10-20 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore). Blotteja inkuboitiin sitten primaaristen vasta-aineiden 5% naudan seerumin albumiinia /Tris-puskuroitua suolaliuosta Tween-20 4 ° C: ssa yön yli, jonka jälkeen inkuboitiin toissijaisen vasta-aineiden huoneenlämpötilassa 1 tunti. Proteiini signaalit havaittiin Odessey skanneri. Vasta-aineet, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat: ihmisen FOXM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology), fosfori-histoni H2A.X (γH2AX, 1:1000, Cell Signaling Technology), kaspaasi-3 (1:1000, Cell Signaling Technology) , EXO1 (1:100, Thermo Fisher Scienfitic), β-aktiini (1:2000, Abcam).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus mitattiin Cell Counting Kit-8 määritys ( Dojindo Molecular Technologies). Lyhyesti, solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja altistetaan eri tavalla. Seuraavat 48 h inkubointi 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2/95% ilmaa, näytteitä inkuboitiin vielä 2 h CCK8 reagenssilla. Absorbanssi määritettiin 450 nm: ssä käyttäen FLx800 Fluoresenssi Microplate Reader (Biotek).

γH2AX immunofluoresenssivärjäyksellä

A2780 ja SKOV3-solut transfektoitiin NC tai geenispesifistä siRNA. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin sitten ilmoitetun pitoisuuden sisplatiinin 1 h, ja tuoretta väliainetta vaihdettiin. 24 tuntia myöhemmin, solut altistettiin anti-γH2AX (Ser139) värjäys. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 10% formaliinilla 15 min, sitten läpäiseviksi 0,1% Triton-100 10% FCS: ää 10 minuutin ajan. Näytteet peitettiin 5% vuohen seerumia 10% FCS: ssa 1 tunnin ajan ja sitten niitä inkuboitiin yön yli primaarisen kanin anti-γH2AX (Ser139, 1:400, Cell Signaling). Pesujen jälkeen PBS: llä, sekundaarinen vuohen anti-kani-IgG-TRITC (1:400; Sigma-Aldrich) lisättiin näytteisiin 1 tunti. Solut vastavärjättiin DAPI ennen asennusta. Kuvat otettiin käyttäen Laser Scanning -konfokaalimikroskoopilla TCS SP5 (Leica). Sillä pesäkkeitä kvantifiointiin, soluja yli 10 pesäkkeet laskettiin positiivisiksi standardin mukaisesti [20]. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Virtaussytometria

Apoptoosi exmamined virtaussytometrisellä analyysi anneksiini V: n ja PI-värjäyksellä (BD) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, sen jälkeen, kun osoitetun hoidon, solut suspensoitiin uudelleen konsentraationa 1 x 10

6 solua /ml, sitten 5 ui FITC anneksiini V: n ja 5 ui PI lisättiin 1 x 10

5-soluja (100 ui) ja soluja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Inkuboinnin jälkeen solut analysoitiin virtaussytometrillä FC500 /FC500-MPL (Beckman Coulter). Solusyklin analyysi, solut trypsinoitiin, pelletoitiin ja suspendoitiin sitten uudelleen propidiumjodidiliuoksella (50 ug /ml propidiumjodidia, 0,1 mg /ml RNaasiA, ja 0,05% Triton-X). Kaikki reagenssit hankittiin Sigma. 40 minuutin kuluttua inkubaation jälkeen solut analysoitiin FC500 /FC500-MPL.

Kromatiini immuunisaostustesti

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) kokeet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. 24 tuntia sisplatiinin jälkeen hoidon, solut kiinnitettiin 1% formaldehydiin 10 minuutin ajan, jotta silloittumista ja sitten reaktio lopetettiin glysiinillä. Solut kerättiin ja hajotettiin SDS hajotuspuskuria. Lysaattia sonikoitiin, esipuhdistettiin, inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, ja otettiin talteen proteiini-A + G agaroosi /lohen sperman DNA: ta. DNA-proteiini ristisidosten peruttiin ja chromatin DNA puhdistettiin ja alistettiin PCR-analyysillä. Alukkeilla 5′-AAA TCT GGC AAC CCT ACC TCA-3 ’ja 5′-TTA AGT GTG CCT GTC AGT TCC-3′ käytettiin monistamiseen EXO1 FHRE1 sisältävä alue (-1934 /-1575), ja alukkeita 5’-CAA TTT CGA TTT GTA GAG GCA AC-3 ’ja 5′-CGG CTT CCA ACT CAT AGG GT-3’ käytettiin monistamiseen FHRE2 sisältävä alue (-459 /-74). Monistamisen jälkeen PCR-tuotteet erotettiin agaroosigeelissä visualisoitiin GelRed (Biotium).

Promoottori toimittajille ja Lusiferaasimäärityksiä

EXO1 promoottorialue PCR-monistettiin genomisesta DNA: ta A2780-soluja käyttäen eteen- ja taaksepäin aluketta, jotka sisältävät Nhel: llä ja Hindlll restriktiokohdat (5′-CTA GCT AGC AGG ACC AAA GAG CCA TCA CA-3 ’ja 5′-CCC AAG CTT CAC GGG TAA CTT GCC TAC ACA 3′). Jälkeen restriktiodigestion, fragmentti kloonattiin pGL-3 perus-reportterigeenin vektori tuotti EXO1 promoottorin pGL3-FHER2 promoottori rakentaa -490 /-148 kloonattiin PCR: llä (alukkeet: 5’-CTA GCT AGC AAA GAA CCC AGC GTG AAC TGA-3 ’, 5′- CCC AAG CTT CAC GGG TAA CTT GCC TAC ACA 3’). Otaksutun Forkhead päällä mutageneesi suoritettiin käyttäen kohdennetun mutageneesin kittiä (ExCell Biology). pGL3-Basic, pGL3-EXO1, villityypin pGL3-FHRE2, villityypin pGL3-FHRE2 plus FOXM1 siRNA, ja mutantti-pGL3-FHRE2 transfektoitiin soluihin vastaavasti. Transfektoidut solut käsiteltiin sisplatiinin kanssa 24 h ja niiden lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin Luciferase Assay (Promega).

Tilastollinen analyysi

käytetään SPSS19.0 ohjelmisto laskea standardipoikkeamat ja tilastollisesti merkitsevä eroja näytteiden välillä. Tähtien kunkin kaavion osoittavat tilastollisesti merkittäviä muutoksia, joissa

P

laskettujen arvojen Student

t

testiä seuraavasti: *,

P

0,05; **,

P

≤0.01; ***,

P

≤0.001.

P

arvoja 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. FOXM1 ilme oli säädellään ylöspäin sisplatiini kestävä munasarjasyövän kudosten ja solujen

Aikaisemmin on osoitettu, että FOXM1 yliekspressoituu munasarjasyövän, ja että FOXM1 yli-ilmentyminen korreloi merkitsevästi korkealaatuista munasarjasyöpiä, mikä osoittaa, että FOXM1 voi pelata onkogeenisessä rooli munasarjasyöpä [12]. Tähän mennessä, rooli FOXM1 vuonna sisplatiinin vastus munasarjasyöpään ei ole selvitetty. Tutkimaan ilmentymistä FOXM1 sisplatiinin herkkiä tai resistenttejä munasarjasyöpä, munasarjasyöpä kudosnäytteet saatiin 10 naista, joilla on uusiutuva epiteelin munasarjasyövän 6 kk kuluttua tavanomaisen hoidon, ja muut 10 naista, jotka olivat chemosensitive. Kaikki potilaat saivat optimaalista sytoreduktiivisen leikkaus seurasi 6 sykliä systeemistä kemoterapiaa yhdistelmällä sisplatiinin ja paklitakselin. Niistä 10 chemosensitive potilasta, joista 7 uusiutunut 12 kuukauden kuluttua ja 3 heistä ei toistu toistaiseksi. Kaikki diat olivat peräisin munasarjasyöpä kudosten resekoitu alkuperäisessä toiminnassa. Parafiini-sulautettujen Levyjä immunohistokemiallisesti värjättiin FOXM1 vasta-aineella ja edustava värjätään levyt näytettiin 1A ja kuvio 1 B. Kohtalainen tai suuri FOXM1 ilmentymisen havaittiin peräti 8 10 vastustuskykyisten tapauksissa, mutta vain 4 10 arkaluontoisissa tapauksissa (1C). Seuraavaksi vertasimme sisplatiiniin kestävyys ja FOXM1 ilmentymistä kolmessa solulinjoissa. SKOV3, joka osoitti korkein ilmentymä FOXM1, oli myös eniten kestävät sisplatiini, kun taas ES2, joka oli herkin sisplatiinin ilmaistuna FOXM1 alimmalla tasolla (Fig.1D). Nämä tulokset osoittavat, että sisplatiini kestävä munasarjasyöpä näyttelyitä korkeampi FOXM1 ilmentymisen verrattuna sisplatiiniin herkkä munasarjasyöpään.

(A) edustaja FOXM1 immunovärjättiin jakso näytetään päässä chemosensitive potilasryhmässä (B) edustaja FOXM1 immuno- osio on osoittaneet päässä solunsalpaajaresistentti potilasryhmässä. (C) numerot tapauksissa osoitetun tason FOXM1 ilmaisun chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti ryhmän näkyvät. (D) IC

50-arvot eri solulinjoja esitetään yläpaneeli, ja ilmaus FOXM1 solussa linjat näytettiin alemmassa paneelissa.

2. FOXM1 on säädellään ylöspäin munasarjasyöpäsoluja jälkeen sisplatiinihoitoon

edelleen selvittää ekspressiokuviota FOXM1 munasarjan syöpäsolujen käsittelimme A2780 ja SKOV3 eri sisplatiinin, ja löysi mRNA taso FOXM1 lisääntynyt vain hieman jälkeen sisplatiinihoitoon (2A). Löysimme kuitenkin, että FOXM1 proteiini huomattavasti lisääntynyt pitoisuutena ja ajasta riippuvaisia ​​tavalla molemmissa solulinjoissa, ja vastasi tasoa γH2AX (kuvio 2B ja Fig.S1), joka on kultakanta DNA-vaurioita määrällisesti [22 ]. Olemme myös suorittaa ON /OFF hoito sisplatiinin, kohonnut FOXM1 proteiinin havaittiin molemmissa solulinjoissa 24 tuntia hoidon jälkeen, ja vaikutus jatkuva till 96 tuntia (kuvio 2C). Koska kohonnut taso FOXM1 proteiinia ei vastaa kasvanut määrä FOXM1 mRNA, oli mahdollista, että kohonnut FOXM1 proteiini oli pitkälti välittämä proteiini vakauttaminen [23].

(A) A2780 ja SKOV3- soluja käsiteltiin kanssa ilmoitetun pitoisuuden sisplatiinin 24 tuntia. Hoidon jälkeen, FOXM1 mRNA transkription tasot määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja p-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus. Jokainen pylväs ja pylväs edustaa keskiarvo ± S.D. kolminkertaisten määritysten. (B) Solulysaatit valmistettiin sen jälkeen sama käsittely kuin (A), erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin immunoblottauksella analyysillä käyttäen anti-FOXM1, anti-γH2AX, tai anti-β-aktiini, vastaavasti. (C) A2780 ja SKOV3-soluja käsiteltiin 2 ug /ml ja 4 ug /ml sisplatiinia 12 tuntia vastaavasti, niin viljeltiin tuoreeseen täydelliseen kasvualustaan ​​ja ilmoitettuina ajankohtina (aika, jolloin täydellistä alustaa lisättiin asetettiin 0 h) . Western blot suoritettiin ekspression määrittämiseksi FOXM1 ja β-aktiini.

3. Kohdistaminen FOXM1 lisää sisplatiinin herkkyyttä munasarjasyövän

Koska FOXM1 yliekspressoitui munasarjasyövän, ja oli edelleen säädellään ylöspäin vasteena sisplatiinihoitoon, me arveltu, että kohdentaminen FOXM1 voi herkistää munasarjasyöpäsolu sisplatiinia. Me transfektoitiin lyhytaikaisesti kaksi siRNA kohdistaminen FOXM1 A2780 ja SKOV3 sekä siRNA vähensi huomattavasti FOXM1 ilmaisun ja siRNA-2 on suurempi hiljentäminen vaikutus kahdessa solulinjassa (kuva 3A ja 3B). 48 h kuluttua siRNA-2 transfektion jälkeen solut käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden sisplatiinia. Klonogeenisten määritys suoritettiin 1 h post-sisplatiinihoitoon, ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen CCK8 kokeessa 48 h post-sisplatiinihoitoon. Kuten odotettua, FOXM1 siRNA transfektio A2780 ja SKOV3- solujen sulatettu molemmissa solulinjoissa herkempiä sisplatiinin myrkyllisyyttä, mistä on osoituksena vertailun IC

50-arvot välillä ryntäily siRNA ja FOXM1 siRNA käsiteltyjä soluja (-1,7 mikrog /ml vs. ~ 4,1 ug /ml A2780, ~2.5 ug /ml vs. noin 6,1 mikrog /ml SKOV3) (kuvio 3C). Hoito FOXM1 siRNA ja sisplatiinin johti myös vähentää merkittävästi A2780 ja SKOV3 solujen määrä mitattuna klonogeeniset määritys (on noin 17% vs. ~45% A2780, -16% vs ~37% vuonna SKOV3) (Fig.3D). Lisäksi olemme tutki knockdovvn FOXM1 lisännyt apoptoosia sisplatiinihoitoon. Kuten esitetään Fig.3E, sisplatiini yhdistettynä FOXM1 siRNA lisännyt apoptoosia hinnat molemmissa solulinjoissa (~18% vs. ~38% A2780, -20% vs. -40% vuonna SKOV3). Vastaava apoptoosimäärityksessä, western blot-analyysi myös osoitti parannettu lohkaistaan ​​kaspaasi-3 jälkeen yhteistyössä hoidon FOXM1 siRNA ja sisplatiini (4A). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kohdistaminen FOXM1 tarjoaa strategian herkistävät munasarjasyöpä sisplatiinia.

A2780 ja SKOV3- soluja transfektoitiin ohimenevästi siRNA (100 nM), kohdistettu FOXM1. Ohjaus solut vasemmalle transfektoimattomilla tai negatiivinen kontrolli siRNA (100 nM) -transfected. 48 h transfektion jälkeen, FOXM1 mRNA-tasolla (A) ja proteiini taso (B) määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja western-blottauksella, vastaavasti. Jokainen pylväs ja pylväs edustaa keskiarvo ± S.D. kolminkertaisten määritysten. (C) 48 h transfektion jälkeen, A2780 ja SKOV3-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sisplatiinin vielä 48 h, ja niiden hinnat elinkelpoisuuden mitattiin CCK8 ja verrattuna soluihin ilman sisplatiinihoitoon. (D) 48 h kuluttua siRNA transfektion, A2780 ja SKVO3 soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan 1 ug /ml ja 2 ug /ml sisplatiinia, vastaavasti. Sitten solut maljattiin 6-kuoppalevyllä, pesäkkeet värjättiin ja laskettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 8-10 d. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. Kuvaajat tarjoavat kvantifiointiin prosentteina ei-käsitellyn kaivoja. Jokainen pylväs ja pylväs edustaa keskiarvo ± S.D. kolminkertaisten määritysten. (E) 48 h transfektion jälkeen, A2780 ja SKOV3-soluja käsiteltiin vielä 48 h 1 ug /ml ja 2 ug /ml sisplatiinia, vastaavasti. Hoidon jälkeen, apoptoosi määritettiin virtaussytometria-analyysi anneksiini V: n ja PI-värjäyksellä. Oikeassa paneelissa näkyy keskiarvoja ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

(A) 48 h transfektion jälkeen, A2780 ja SKOV3-soluja käsiteltiin 24 h 2 ug /ml ja 4 ug /ml sisplatiinia, vastaavasti. Hoidon jälkeen, solulysaatteja valmistettiin, SDS-PAGE: lla ja alistettiin im- analyysi FOXM1, γH2AX, pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini. (B) A2780 ja SKOV3-soluja tai ilman hiljentäminen ja FOXM1 ilmaisun, käsiteltiin 1 ug /ml ja 2 ug /ml sisplatiinia 1 h, vastaavasti. γH2AX pesäkkeitä A2780 ja SKOV3- soluja määrällisesti eri ajankohtana: 24, 48 ja 72 h kuluttua sisplatiinihoitoon. Prosenttiosuus γH2AX positiivisten solujen piirrettiin. Käsittelemättömiä soluja käytettiin kontrollina.

4. FOXM1 koputtaa alas johtaa DNA: n korjaukseen puutos

On raportoitu, että FOXM1 säännelty useita geenejä DNA korjaukseen liittyvä reitti [14], [24], me seuraavaksi tutkittava, onko FOXM1 knock-down-solut olivat herkkiä DNA katkoksia munasarjasyöpä. Tätä varten, FOXM1 siRNA-käsiteltyjä soluja, ja sekoituskoodin käsiteltyjä soluja käsiteltiin sisplatiinin ja western blotting-analyysi suoritettiin 24 tunnin käsittelyn jälkeen. Erityisesti lisääntynyt γH2AX havaittiin FOXM1 siRNA käsiteltyjä soluja jälkeen sama käsittely sisplatiinin (4A). Lisäksi me värjättiin γH2AX 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua sisplatiinihoitoon. γH2AX pesäkkeitä tumaa kohti laskettiin yli 100 solua kussakin aikapisteessä. Tulokset ilmaistiin prosentteina γH2AX positiivisten solujen kunakin ajankohtana. FOXM1 siRNA-käsitellyt solut näytetään suuri osa käsittelemättömien DNA vahingoista (γH2AX positiiviset solut) 48 h ja 72 h kuluttua sisplatiinihoitoon verrattuna muokkaamaan käsiteltyjä soluja (kuvio 4B). Siksi nämä tulokset tukevat johtopäätöstä DNA korjauksen puute FOXM1 siRNA-käsitellyissä soluissa.

5. Seulonta FOXM1 kohdegeenin osallisena sisplatiinin aiheuttama DSB korjaus munasarjasyövän

Useat kohdegeenien FOXM1, kuten

BRCA2

,

XRCC1

,

Rad51

,

EXO1

,

PLK4

, on raportoitu olevan mukana DNA: n korjaukseen jälkeen DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) [14], [24]. Nämä tulokset sai meidät sanoa, ovatko nämä FOXM1 kohdegeenien välittävät FOXM1 riippuvaa DNA: n korjautumista munasarjasyöpä. QPCR käytettiin ekspression määrittämiseksi profiilin edellä geenien sisplatiinin jälkeen hoidon.

EXO1

mRNA näytti vahvin muutos ja vastasi muutos FOXM1 proteiinia jälkeen sisplatiinihoitoon A2780 ja SKOV3 (Kuvio 5A). Muut geenit, oli kuitenkin hieman tai kohtuullisesti indusoi jälkeen sama käsittely (tuloksia ei ole esitetty). Kiinnostavaa kyllä, Huomasimme myös, että EXO1 proteiinia korkeasti ilmaistu A2780 ja SKOV3 verrattuna ES2 solu (Fig.S2A), mutta oli säädelty annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla A2780 ja SKOV3 kun sisplatiinia, kuten FOXM1 proteiinia (Fig.5B ja Fig.S2B). ON /OFF käsittely sisplatiinin myös lisännyt ilmentyminen EXO1 till 96 h (5C). Se ei ollut yllättävää, että pudotus on FOXM1 mukana on 60-70%: n vähennys EXO1 mRNA: n ilmentymisen (Fig.5D). Kuitenkin FOXM1 koputtavat alaspäin ei aiheuttaa syvän solusyklin pysähtymiseen (Fig.S2D), mikä viittaa siihen, että vähentäminen EXO1 ei ollut välillinen vaikutus solukierron muutoksen. Lisäksi, FOXM1 hiljentäminen ei vain heikennettyjä EXO1 proteiinin ekspressio vasteena sisplatiinihoitoon (Fig.S2C), mutta myös sen jälkeen ON /OFF sisplatiini treatement (Fig.5E). Nämä tulokset osoittavat, että EXO1 on ehdokas tavoite geenin FOXM1 DNA korjaukseen liittyvä reitti munasarjasyövän.

A2780 ja SKOV3- soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden sisplatiinin 24-PCR-analyysi (A) ja Western blotting (B). Tulokset on esitetty kolmen riippumattoman kokeen kolmena rinnakkaisena. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (C) A2780 ja SKOV3-soluja käsiteltiin 2 ug /ml ja 4 ug /ml sisplatiinia 12 tuntia vastaavasti, niin viljeltiin tuoreeseen täydelliseen kasvualustaan ​​ja ilmoitettuina ajankohtina (aika, jolloin täydellistä alustaa lisättiin asetettiin 0 h) . Western blot suoritettiin ekspression määrittämiseksi EXO1 ja β-aktiini. (D) A2780 ja SKO3 solut transfektoitiin FOXM1 siRNA, 48 tuntia myöhemmin, EXO1 ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR-analyysillä. Tulokset on esitetty kolmen riippumattoman kokeen kolmena rinnakkaisena. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (E) 24 h kuluttua FOXM1 siRNA transfektion, A2780 ja SKOV3-soluja käsiteltiin 2 ug /ml ja 4 ug /ml sisplatiinia 12 tuntia vastaavasti, niin viljeltiin tuoreeseen täydelliseen kasvualustaan ​​ja ilmoitettuina ajankohtina (aika, jolloin täydellisessä alustassa oli Lisätty asetettiin 0 h). Nuoli (↓) osoittaa transfektion ja myöhemmät sisplatiinihoitoon. Western blot suoritettiin ekspression määrittämiseksi FOXM1, EXO1 ja β-aktiini.

6. FOXM1 sitoutuu suoraan EXO1 promoottorin ja säätelee sen aktiivisuutta

oletettu, että FOXM1 voisi lisätä EXO1 transkriptiota vasteena sisplatiinin hoitoon. Sekvenssianalyysi tunnisti kaksi konsensus Forkhead elementteihin (FHREs) promoottorialueella (6A) [25], [26]. Sen osoittamiseksi, että FOXM1 suoraan sitoutuu endogeeniseen EXO1 promoottorisekvenssi jälkeen sisplatiinihoitoon teimme chromotatin immunopresipitaatiomäärityksiä A2780 ja SKOV3- soluja. Anti-FOXM1-vasta-aine, mutta ei kontrollivasta-aineella (IgG), saostetaan FHRE2 sisältävän alueen (-459 /-74) (6B), kuitenkin FHRE1 sisältävä alue (-1934 /-1575), ei ollut saostunut (tuloksia ei ole esitetty). Arvioida toiminnallista roolia FHRE2 on EXO1 asetuksessa, suoritimme kohdennetun mutageneesin sisällä FHRE2 on EXO1 promoottorin pGL3-FHRE2 (Fig.6C). Kuten on esitetty Fig.6D, mutaatio FHRE2 kumosi kyky FOXM1 aktivoida toimittaja rakentaa sisplatiinin jälkeen hoidon A2780 ja SKVO3 lisäksi, kotransfektoimalla FOXM1 siRNA ja villityypin pGL3-FHRE2 johti myös alhainen lusiferaasia aktiivisuutta. Mielenkiintoista, pGL3-FHRE2 on vahvempi transkriptioaktiviteettia kuin täysi promoottorisekvenssin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että FHRE2 välittää transkriptionaalista vaikutus FOXM1 on EXO1 promoottorin ja että siellä saattaa olla joitakin muita alueita, jotka voivat tunnistaa transkriptio estämällä tekijöitä ylävirran alueelta FHRE2.

(A) sekvenssi ja sijainti konsensussekvenssin FHRE sekvenssi on EXO1 promoottori. (B) pelimerkin määritykset tehtiin A2780 ja SKOV3- soluja. Kromatiinin fragmentit solut immunosaostettiin anti-FOXM1-vasta-aineen ja negatiivinen kontrolli IgG: n ja PCR: ään. 1% koko solun lysaatit altistettiin PCR ennen immunosaos- tuloina. (C) Kaaviokuva rakenne villityypin (WT) ja mutantti (Mut) muodot FHRE2 sisältävää promoottoria toimittajille. (D) Lusiferaasiaktiivisuutta tai ilman mutaatio EXO1 promoottori. A2780 ja SKOV3- solut transfektoitiin villityypin tai mutantti FRHE2 sisältäviä toimittaja, tai kotransfektoitiin FOXM1 siRNA ja villin tyypin toimittaja (pGL-3-Basic ja pGL3-EXO1 käytettiin negatiivisena ja positiivisena kontrollina, vastaavasti), sitten käsiteltiin sisplatiinin kanssa 24 h. Sen jälkeen lusiferaasiaktiivisuus soluissa mitattiin. Kolme riippumatonta kokeita.

7. DNA korjaus sääntely FOXM1 osittain välittyy EXO1

EXO1 on osoittautunut suoraan mukana DNA korjautumismekanismi [18], [27], [28]. Niinpä seuraavaksi tutkitaan, onko EXO1 osuus FOXM1 välittämän sisplatiinin vastarintaa. Me ohimenevästi pudotti ilmentymistä EXO1 A2780 ja SKOV3- soluissa siRNA transfektiolla. Molemmat siRNA kohdistaminen EXO1 vähentää tehokkaasti mRNA ja proteiinin ilmentyminen A2780 ja SKOV3 solulinjoissa (7A ja 7B). Knockdovvn EXO1 myös herkistyneet soluja sisplatiinin, mistä on osoituksena vertailu IC

50-arvot (~2.3 ug /ml vs. ~4.2 ug /ml A2780, ~4.1 ug /ml vs. ~6.4 ug /ml SKVO3) ja klooni numerot (~23% vs. ~42% A2780, ~21% vs. ~38% vuonna SKOV3) välillä ryntäily siRNA ja EXO1 erityisiä siRNA käsiteltyjä soluja (Fig.7C ja 7D). Mukaisesti edellä, sama hoito sisplatiinilla johti enemmän apoptoottisia soluja EXO1 erityisiä siRNA-transfektoiduissa soluissa (~18% vs. ~27% A2780, ~21% vs. ~ 33% in SKVO3) verrattuna muokkaamaan käsiteltyjä soluja (Fig.7E). Vaikka EXO1 knock-down ei vaikuttanut ilmaus FOXM1, se ei osittain kerrata sisplatiinin herkistymistä vaikutus FOXM1 hiljentäminen vuonna munasarjasyöpäsoluja. EXO1 siRNA-käsitellyt solut osoittivat myös enemmän DNA vahingoista, parannettu apoptoosin signalointireittejä ja heikentynyt DNA korjaukseen tehoa, kuten havaittiin immunoblottauksella varten γH2AX ja pilkottiin kaspaasi-3 (Fig.7F), ja γH2AX kvantifiointi (Fig.7G).