Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ensisijainen haimakarsinooma- on epäsuotuisa ennustetta ja tavallinen hoito strategiat enimmäkseen epäonnistuvat kehittyneiden tapauksissa. Virotherapy voisi voittaa tämän resistenssin nykyisten hoitomuotojen. Kuitenkin Kliinisten tutkimusten kanssa onkolyyttisiä viruksia, mukaan lukien replikoituvan adenoviruksen (Ad) vektoreita, ovat osoittaneet vain vähäistä aktiivisuutta haimasyövän ja muut syövät. Koska haiman karsinoomat on monimutkainen kasvain arkkitehtuuria ja usein voimakas strooman osastoon, joka koostuu ei-neoplastisten solutyyppejä (pääasiassa haiman tähtisolut = hPSCs) ja soluväliaineen, ei ole yllättävää, että Ad-vektorit replikoitumaan neoplastiset solut todennäköisesti onnistu poistamaan tämän aggressiivinen kasvain tyyppi. Koska TGF-reseptori (TGFBR) ilmentyy sekä neoplastisten solujen ja hPSCs me asettanut TGFBR kohdistaminen peptidi CKS17 osaksi hypervariaabelialueen 5 (HVR5) kapsidiproteiinin heksoni, jonka tavoitteena on tuottaa replikoiva ilmoitus vektori parannettu aktiivisuus monimutkainen kasvaimissa . Me havaittu olevan transduktio sekä haimasyövän solulinjoissa ja hPSCs ja tehostetun sytotoksisuuden yhteistyössä kulttuureissa molempien solutyyppien. Pintaplasmoniresonanssilla analyysi osoitti vähentynyt sitoutuminen hyytymistekijä X CKS17 modifioitua Ad hiukkaset ja

in vivo

biodistribuutio tutkimukset suoritettiin hiirillä osoitettu vähentynyt transduktion hepatosyyttien. Niinpä aktiivisuuden lisäämiseksi jäljittelemään Ad vektorien ehdotamme rentoutua kasvain soluselektiivisyys geneettisellä heksoniin välittämä kohdistuksen TGFBR (tai muihin reseptoreihin läsnä sekä neoplastisten ja ei-neoplastisten solujen sisällä kasvain), jotta lisääntymään myös stroomasolujen osastoon kasvaimia, kun taas poistaminen maksasolujen transduktion, ja siten lisätä turvallisuutta.

Citation: Lucas T, Benihoud K, Vigant F, Schmidt CQA, Bachem MG, Simmet T, et al. (2015) Hexon Muutos parantaa aktiivisuus Onkolyyttiset Adenovirusvektorit vastaan ​​Neoplastiset ja stroomakasvaimet solut Haimasyöpä. PLoS ONE 10 (2): e0117254. doi: 10,1371 /journal.pone.0117254

Academic Toimittaja: Eric J. Kremer, Ranskan kansallisen tieteellisen tutkimuksen, FRANCE

vastaanotettu: 14 marraskuu 2013; Hyväksytty: 22 joulukuu 2014; Julkaistu: 18 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Lucas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Rahoitus: Tämä työ on tuettu Avustuskohtaisesti 109545 (SK ja AW) Deutsche Krebshilfe. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haimakarsinooma- kuuluu kohtalokkain ihmisen pahanlaatuisten länsimaissa on alhaisin eloonjäämisaste syöpä [1,2]. Syyt ovat nopea kasvaimen kasvua, varhainen syntyminen etäpesäkkeitä, ja diagnoosi on edennyt pitkälle. Tähän mennessä vastaus nykyinen standardi hoitoja (kirurgia, radio- ja kemoterapia) on rajallinen. Täten muita strategioita tarvitaan kiireellisesti ja geeniterapian lähestymistapojen virusvektoreilla saattaa merkitä uuden keinon haimasyövän potilaille. Adenoviruksen (Ad) vektoreita on käytetty laajalti kliinisissä syövän hoidossa tutkimuksissa. Huolimatta lupaavien prekliinisten Ad vektoreita käytetään hoidossa haimasyövistä ovat osoittaneet vain huono kliininen teho [3,4]. Esteet selittää nämä pettymyksen sisältävät i) voimakas maksan tropismi ihmisen adenovirus tyyppi 5 (HAdV-5, lyhyet: Ad5), ii) monimutkainen morfologia haiman syövät ja alhaisen ilmentymisen ensisijaisen Ad-reseptorin kasvainsoluihin, ja iii ) riittämätön kasvaimensisäistä leviäminen ei-replikoituva tai ehdollisesti replikoituvat vektorit.

Koska nopea eteneminen ja iällä etäpesäkkeitä haimatiehyen adenokarsinoomat (PDACs) laskimoon Ad vektorien vaadittaisiin saavuttamaan levittää etäpesäkkeitä. Aikana verisuonten liikenne kuitenkin Ad5 vuorovaikutuksessa erilaisten kiertävän liukoisen tekijät, kuten hyytymisen veren tekijät [5-7], luonnollisten vasta-aineiden, ja täydentää [8] tuloksena on vahva otto eri maksan solutyyppejä, esim. hepatosyyteissä, maksan makrofagien (Kupfferin solut) [9,10], ja maksan sinusoidien endoteelisoluihin, jotka (LSECs) [11,12]. Vaikka sarja sitoutumisen Ad5 primaarireseptorinaan CAR [13] ja a vp 3 ja a vp 5 integriinit [14] on kriittinen solujen entry

in vitro

, nämä vuorovaikutukset eivät näytä kuitenkaan vaadita hepatosyyttien transduktio, ainakin hiirillä [15]. Sen sijaan useat ryhmät ovat tunnistaneet eri Ad oton mekanismia, joka perustuu veren hyytymistekijöiden [5,6,16], erityisesti tekijän X (FX), välittämisessä maksasolujen transduktio [5,7]. FX sitoo kautta Gla-domeenin eri hypervariaabelialueet (HVR) on heksonin kapsomeerejä sekä fuusioproteiineja [7,16] ja vuorovaikutuksessa kalvo-lokalisoitu heparaanisulfaattiproteoglykaani proteoglykaanin (HSPGs) [6], mikä ”tasoittaa” virus kuin maksasolut pintaan. Äskettäin toinen funktio FX sitoutumisen Ad hiukkasia on kuvattu, jotka osoittavat, että FX suojaa Ad hiukkasia hyökkäyksiltä klassisen komplementtireittiä, mahdollistaa maksan transduktio [17]. Lisäksi FX, toinen otto mekanismi on tunnistettu. Useat ryhmät ovat osoittaneet ottoa ja poistumista Ad hiukkasia verestä Kupfferin solut (ja LSEC) mukaan scavenger-reseptorien, luonnollisten vasta-aineiden ja täydentää [8,18,12].

Haiman karsinoomat kaltaiset muut syövät-on monimutkainen kehosta. Lisäksi neoplastiset solut, peruskudoskomponentit tavataan kasvain käsittää ei-neoplastisia solutyyppejä, mukaan lukien stroomasolut, endoteelisolut ja makrofagit, ja soluväliaineen (ECM) komponenttien (esim. Kollageenien, fibronektiineja). Monissa tapauksissa, syöpäsolut muodostavat pieniä edistää solujen massan tuumorin sisällä. Usein strooman solut ja ECM kattaa kokonaan kasvainsolun pesiä. Tämä tiukka fyysinen este muodostaman strooman voi estää nykyinen Ad-vektorit (suunnattu vain kasvainsoluissa) transduktion viereiseen kasvainsolun alueilla ja levitä koko kasvain. Stromasoluja haiman karsinoomat-nimetty aktivoituna haiman tähtisolut (PSCs) – on keskeinen rooli kasvaimen kasvua ja desmoplasia. Hiirillä coinjection haimasyövän soluja ja ihmisen PSCs (hPSCs) on osoitettu johtavan nopeutetussa kasvaimen kasvua korostetaan hPSCs haimasyövän [19,20].

Monimutkainen keskinäistä vuorovaikutusta syöpä solut ja ei-neoplastisia PSCs on järjestettyjä läpi erityksen eri kasvutekijöitä kuten transformoiva kasvutekijä beeta (TGF). Näin ollen useimmat haimasyövän solulinjoissa ilmentävät normaali tai jopa korkea tyypin II TGF-reseptori (TGFBRII) [21-23], ja analyysi PDACs paljasti lisääntynyt TGFBRII ilmaisu verrattuna normaaliin haiman kudos [24,25]. Koska alhaisen CAR lauseke (Ad5-reseptori) haiman karsinoomat tai muiden pahanlaatuisten kasvainten [26-28], TGFBRII saattaisi olla ehdokkaana reseptori tavoite voittaa rajoitettu kasvaimen transduktio Ad vektorit.

Täydellinen kasvaimen tuhon tehokas leviämisen Ad5 vektorien kasvainkudoksen tarvitaan. Periaatteessa kasvaimeen leviäminen voidaan saavuttaa käyttämällä replikoituvan (onkolyyttisten) Ad vektoreita. Verrattuna replikaatiovialliset, E1-poistettu (ΔE1) Ad-vektorit, onkolyyttisten vektorit voivat replikoitua ja tuhota tuumorisoluja vapauttamalla infektiokykyisten virusten, jotka kykenevät infektoimaan naapurisoluja, kunnes-ihanteellisesti-koko kasvain tuhoutuu. Johtuen turvallisuusnäkökohdat, jäljittelyn onkolyyttisten Ad vektorien, yleensä rajoittuu tavallisesti syöpäsoluja, joko käyttämällä kudos- /kasvain-promoottorit ohjaamaan E1A ilmentymisen, tai viemällä mutaatioita E1A ja /tai E1B, jälkimmäinen periaatteessa poistamalla viruksen replikaatiota ei-neoplastisen solu- tyyppejä. Kun otetaan huomioon monimutkainen koostumus haiman kasvaimet (kuten edellä on kuvattu), kuten vektori suunnittelu tulee kuitenkin epätodennäköistä johtaa hävittämiseksi karsinoomien.

Kohti tavoitteemme tuottamaan onkolyyttistä Ad5 vektori kohdentaa uudelleen välillä hepatosyyttien levitetään tuumorikudoksia olemme korvattu hypervaihtelevan alueen 5 (HVR5) heksonin (osallistuvien FX sitovia ja maksasolujen transduktio) synteettisen kohdistamista peptidin CKS17, joka on homologinen konservoitunut domeeni löytyy retroviruksen vaipan proteiineja [29-31]. Kiinnostavia kohdistettu sekä haimakarsinooma soluja ja julkisia, The heptadekapeptidi CKS17 sisältää oletetun TGF aktiivinen-motiivin [32], joka välittää sitoutumisen TGFBRII, joka on säädelty useimmissa haiman karsinoomat. Todellakin, huomasimme, että CKS17 muunnettuja Ad-vektorit voivat palkata TGFBRII riippuvaisen solun merkintä mekanismi transdusoida CAR-negatiivinen haimasyövän parit ja hPSCs, mikä puolestaan ​​lisää sytolyyttisen tehokkuuden

in vitro

. Lisäksi heksonin korvaaminen HVR5 mukaan CKS17 alennetaan sitoutumalla FX ja vähensivät vektori sisäänottoa hepatosyyteissä

in vivo

hiirillä.

Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että Ad5 vektorit alentunut hepatosyyttien tropismista ja lisääntynyt kohdistaminen eri solutyyppejä sisällä kasvaimen erityisesti syövän ja stroomasolujen-saattaa ratkaista joitakin suurimmista esteistä (merkittävä hepatosyyttien transduktio, tehoton transduktio kohdesoluihin ja rajoitettu kasvaimensisäisenä leviäminen johtuu monimutkainen kasvain rakenne) tehokasta kasvaimeen kohdistaminen ja tuhoaminen haiman syövistä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

N52.E6 solut perustuvat ihmisen amniosyyttejä stabiilisti transformoitu E1A ja E1B Ad5) [33] ja viljeltiin α-MEM-väliaineessa (Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Saksa), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 2 mM glutamiinia (Glutamax; Gibco). A549-solulinja on ihmisen keuhkojen adenokarsinooman epiteelisolulinja, joka oli saatu American Type Culture Collection (ATCC n: o CCL-243). A549-soluja ylläpidettiin MEM-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS: ää ja 2 mM glutamiinia. Perustettu ihmisen haiman kasvainsolulinjoja Panc1 (ATCC nro CRL-1469), ja MiaPaca (ATCC nro 1420), ja varhaisen ihmisen haiman kasvainsolulinja UlaPaCa [34], viljeltiin DMEM /Ham’s F12 (PAA, GE Healthcare, Cölbe, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 2 mM glutamiinia. Primäärisistä ihmisen haiman tähtisolut (hPSC), eristetty kuten aiemmin on kuvattu [19,35], pidettiin DMEM /Ham’s F12-alusta täydennettynä 20% FCS: ää ja 2 mM glutamiinia. Kiinalaisen hamsterin munasarjan K1 (CHOK1, ATCC-nro CCL-61) solulinja, josta puuttuu coxsackie- ja adenovirus-reseptori (CAR) kasvatettiin DMEM-väliaineessa, jota täydensi 10% FCS: ää ja 2 mM glutamiinia. Hiiren makrofagin RAW 264.7 (ATCC-nro CRL-2278) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS: ää ja 2 mM glutamiinia. Solulinjoja kasvatettiin standardiolosuhteissa 37 ° C: ssa, 95%: n kosteudessa ja 5% CO

2.

Virukset ja adenovirusvektorit

Kaikki vektorit olivat peräisin HAdV-5 (lyhyt : Ad5). Ad1stGFP on ΔE1 Ad5 vektori aiemmin on kuvattu [36]. AdGFPhCKS17 ja AdGFPhWt ovat ΔE1 /E3 Ad vektoreita. Kaikki kolme vektorit ilmentävät GFP valvonnassa hCMV: n välitön aikainen promoottori sijasta E1-alue. Lisäksi, AdGFPhCKS17 on Heksonimodifioidut korvaamalla 13 aminohappoa hypervariaabelin alueen 5 (HVR5), joka vastaa Ad5-sekvenssit nukleotidiin (nt). 19645 ja 19684 (numerointi on mukaan HAdV-5-sekvenssin GenBank AC_000008) synteettisen retroviruksen CKS17 peptidi [37], jota reunustavat muuta aminohappoa, joka toimii spacer paremmin peptidin näyttö [38]. Koodaus sekvenssi CKS17 peptidin käytetään tässä työssä reunustavat lyhyet, jotka koodaavat välialueen (pienet kirjaimet) ja viereisen Ad5 sekvenssit (alleviivattu): CAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCGgggTTACAGAATCGTAGAGGCCTAGATCTACTATTCCTAAAAGAGGGAGGTTTGctgggcgggCCTAAGGTGGTATTGTACAGT. Sillä vektorituotannosta kaikki ΔE1 ja ΔE1 /E3 Ad-vektorit tuotettiin N52.E6 soluissa.

replikaatiokykyisistä vektori AdhCKS17 (ollessa villityyppi Ad5 E1) kulkee sama heksoni-muutos kuin sen ei-replikoituva vastine AdGFPhCKS17. AdhCKS17 ja heksoni-modifioimaton kontrollivektorin (AdhWt) tuotettiin lisäämällä Ad5 E1-alue ja AdhCKS17 CKS17 peptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin osaksi bacmid pBelo-pGS66 perustuu pGS66 [33] homologisella rekombinaatiolla (Gene Bridges, Heidelberg, Saksa ), jonka jälkeen vektori palautuminen alkaen bakmidi. Ihmisen Ad5 villityypin viruksen (Ad5Wt; ystävällisesti Albert Heim, Hannover Medical School, Hannover, Saksa), AdhWt ja AdhCKS17 kasvatettiin A549- soluissa.

Kaikki vektorit puhdistettiin aikaisemmin kuvatulla [39] mukaan CsCI tiheys vaihegradientin jälkeen jatkuvana CsCI tiheysgradientti. Vektorit poistettiin suola PD-10-kolonnista (GE Healthcare, Dassel, Saksa) ja säilytettiin -80 ° C: ssa PBS: ssä, johon oli lisätty 10% (v /v) glyserolia. Sen jälkeen, kun vektori puhdistuksen vektori-DNA eristettiin vektori hiukkasia, jotka QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa), kuten kuvataan manufacturer`s protokollan ja varmistettiin restriktioanalyysillä ja osittainen sekvensointi. Tarttuva ja hiukkasten vektori ainetiitterit määritettiin DNA slot blot-analyysi [40] käyttämällä Ad5 kuitukohtaisten koetin kattaa nt. 31042 ja 32390 Ad5-sekvenssin. Käänteisen bioaktiivisuus laskettiin jakamalla useita fyysisiä useissa tarttuvien hiukkasten.

Ad vektori välittämän transduktion

in vitro

2×10

4 hPSCs tai 2×10

5 kasvainsoluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille. Noin 16 tuntia myöhemmin solut transdusoitiin ΔE1 GFP-proteiinia ekspressoivien Ad5-vektorit (Ad1stGFP, AdGFPhCKS17 tai AdGFPhWt) ilmoitetuilla infektiokertoimella (MOI) fyysisten partikkelien (PMOI) tai tarttuva hiukkasia (Imoi) solua kohti.

arviointia varten vektorin välittämän GFP: n ilmentymisen solut irrotettiin viljelymaljoilta 24 tuntia transduktion jälkeen käyttäen esilämmitettyä trypsiiniliuosta (Gibco). Lisäämisen jälkeen PBS, joka sisälsi 20 mM EDTA: ta ja 10% (v /v) FCS: ää (trypsiinin inaktivoimiseksi), ja sentrifugoimalla 300 x g 5 minuutin ajan, solut suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin, joka sisälsi 2% (v /v) FCS: ää, 20 mM EDTA PBS: ssä. Solut arvioitiin virtaussytometrianalyysillä käyttäen Becton-Dickinson FACSCalibur ilman gating (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Yhdysvallat). Suhteellinen transduktio yksiköt viittaavat prosenttiosuus GFP-positiivisten solujen tai fluoresenssikeskiarvo kaikkien solujen. Määrittää suhteellinen Ad genomin sisällön solujen sisällä, solut pestiin kahdesti esilämmitetyllä PBS: llä 5 minuuttia 2 tuntia transduktion jälkeen ja sitten irrotettiin 200 ui 50 mM EDTA: ta PBS: ssä. Kun oli lisätty 200 ui 0,8 N NaOH: a solujen hajoamisen, solulysaatit altistettiin DNA slot blot-analyysi [40]. Suhteellinen Ad vektorigenomista sisältö ilmaistaan ​​suhteellisina transduktio yksiköt laskettiin ja asetettu 100%: A549-soluja transdusoitu heksoni-muunneltua Ad vektori.

AdWt replikointi

in vitro

1×10

6 kasvainsolujen per 6 cm malja ympättiin edeltävänä päivänä tartutettiin Ad5Wt aikavälirajoissa blot säädetty MOI 1. Kaksi ja 48 tuntia infektion jälkeen solut pestiin esilämmitetyllä PBS: llä ja irrotetaan trypsination. Inaktivoinnin jälkeen trypsiini FCS Solut pelletoitiin (300 x g, 5 min, 4 ° C) ja pestiin 1 ml: lla PBS: ää. Kun toinen sentrifugointi vaiheessa (300 x g, 5 min, 4 ° C), joista kukin solupelletti uudelleensuspendoitiin 200 ul: aan PBS: ää ja kokonais-DNA eristettiin kanssa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Kaksi mikrogrammaa DNA alistettiin slot blot-analyysi käyttämällä Ad5 kuitukohtaisten koetin. Ad replikointi laskettiin suhde Ad genomin sisällön saatu 48 ja 2 tuntia infektion ja asetettu 100%: Ad5Wt-tartunnan saaneiden A549-solut.

Tuotanto tarttuvien Ad hiukkasista

in vitro

1×10

6 kasvainsolujen per 6 cm malja ympättiin edeltävänä päivänä tartutettiin Ad5Wt aikavälirajoissa blot säädetty MOI 1. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia infektion solut pestiin esilämmitetyllä PBS: llä ja irrotettiin trypsination . Inaktivoinnin jälkeen trypsiini FCS Solut pelletoitiin (300 x g, 5 min, 4 ° C) ja pestiin 1 ml: lla PBS: ää. Kun toinen sentrifugointi vaiheessa (300 x g, 5 min, 4 ° C), joista kukin solupelletti uudelleen suspendoidaan uudelleen 1 ml: aan PBS: ää. Sitten solut hajotettiin toistuvasti jäädytys ja sulatus, ja lysaatit kirkastetaan sentrifugoimalla (1800 x g, 5 min, 4 ° C). Poistaa pakkaamattomia adenoviruksen genomeja, solujen DNA ja RNA, lysaatit käsiteltiin 5 yksiköllä Bentsonaasi endonukleaasi (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Kaksi ja 10 mikrolitraa lysaatin käytettiin reinfect 2×10

5 A549-soluja ympätään edellisenä päivänä. Kaksi tuntia sen jälkeen, kun tartuntoja, A549-solut pestiin kahdesti esilämmitettyä PBS: llä. Sitten solut irrotettiin 50 mM EDTA: PBS: ssä ja lyysattiin 0,4 N NaOH: lla. Määrä tarttuvien hiukkasten määritettiin DNA-slot blot-analyysi [40] käyttäen Ad5-säikeen-spesifistä koetinta ja määrä tarttuvien partikkelien per kasvainsolujen laskettiin.

CAR ilmentymisen haiman soluja

5×10

4 hPSCs ja 5×10

5 tuumorisolut ympätään edellisenä päivänä pestiin PBS: llä ja irrotetaan trypsiinillä. Jälkeen trypsiini inaktivointi FCS, solut pelletoitiin (300 x g, 5 min, 4 ° C) ja pestiin 1 ml: lla pesupuskuria (jääkylmää PBS: ää, joka sisälsi 5% (v /v) FCS). Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti aspiroitiin, anti-CAR primaarinen vasta-aine (1 ug näytettä kohti, RmcB klooni, Millipore, Schwalbach, Saksa) lisättiin ja inkuboitiin 30 minuuttia jäillä. Solut pestiin jälleen ja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen, Alexa 488, F (ab ’)

2-fragmentti (1 ug per näyte; Invitrogen, Darmstadt, Saksa), 30 minuutin ajan jäillä. Kontrollina toimi soluja, jotka värjättiin sekundaarisen vasta-ainetta ainoastaan. Kun toinen pesuvaihe solut suspendoitiin uudelleen pesupuskuriin ja alistettiin virtaussytometria analyysi määrittää CAR ilmentymisen lasketaan fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo kaikkien solujen.

vakaan tilan tasot TGFBRII haiman soluja

Haiman hPSCs ja kasvaimen solut lyysattiin NP40-lyysipuskuria (50 mM Tris /HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,15% (w /v) Nonidet P-40), kun läsnä on täydellinen proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Penzberg, Saksa) ja 1 mM PMSF 1 tunti jäillä. Toistuvan jäädytys ja sulatus Solujätteet pelletoitiin (21000 x g, 15 min, 4 ° C). Proteiinipitoisuus lysaatin supernatantti määritettiin (Bio-Rad-proteiinimääritys, Biorad, Munchen, Saksa). Viisikymmentä ug lysaatit analysoitiin 8% SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus. TGFBRII havaittiin anti-TGFBRII-spesifinen polyklonaalinen vasta-aine, kanin (sc-1700, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine DM1A Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Saksa) käytettiin havaitsemiseen α-Tubulin toimii latauskontrollina.

kilpailukykyinen virustransduktio määrityksissä

osoittamiseksi muutettua solua merkintä polusta CKS17 heksoni modifioitua Ad vektori, yksikerroksiset A549-soluja esikäsiteltiin liukoista kuitua nupilla (ystävällisesti Pierre Boulanger, Université Lyon, Lyon, Ranska) 1000 kertainen mooliylimäärä kuitu proteiinia tai polyklonaalisella anti-TGFBRII vasta-aine, kanin (sc-1700, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa) 1000-kertainen molaarinen ylimäärä yli heksoniproteiinia 30 min huoneen lämpötilassa. Koska isotyyppikontrollia anti-TGFBRII vasta-aineen saman tilavuuden kanin seerumia käytettiin. AdGFPhCKS17 ja kontrollivektori lisättiin yhdellä PMOI 100 irrottamatta competitiors. Inkuboinnin jälkeen 1,5 tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa solut pestiin kahdesti kasvualustalla jäljellä olevien virusten ja kilpailijoita. Sen jälkeen soluja viljeltiin 37 ° C: ssa vielä 2 tunnin ajan määrittämiseksi Ad genomiin tasoilla eristetty kokonais-DNA: qPCR tai 24 tuntia arvioida GFP: n ilmentymisen (ilmaistuna fluoresenssin kaikki) virtaussytometrialla.

vapautuminen jälkeläisten virionien

1×10

6 hPSCs tai 2.5×10

6 A549, Panc1 tai UlaPaCa soluja kylvetään päivää ennen pestiin kerran PBS: llä. Lisäämisen jälkeen väliaineen ja jäljittelemällä Ad-vektorit (AdhWt tai AdhCKS17) on tarttuva MOI 20, soluja inkuboitiin 6 tuntia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen alustaa, joka sisälsi Ad-vektorit poistettiin ja solut pestiin kaksi kertaa, ennen kuin tuoretta väliainetta lisättiin soluihin. Näytteitä väliaineen otettiin 48 ja 72 tunnin infektion jälkeen, sentrifugoitiin solujen poistamiseksi, sekoitettiin glyserolin kanssa (jolloin saadaan 10% glyse- rolin lopullinen konsentraatio), ja säilytettiin -80 ° C: ssa. 72 tuntia infektion jälkeen, solut kaavittiin irti jäljellä väliaineessa ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

myöhemmin kvantitatiivinen PCR-analyysi julkaistiin Ad hiukkasten keskipitkällä DNA eristettiin elatusaineesta otetuista näytteistä 48 ja 72 tuntia infektion jälkeen käyttämällä GenElute ™ Mammalian Genominen DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa). Kvantitatiivinen PCR-analyysi suoritettiin monistus Ad5 E4-geeni käyttäen Stratagene 2 x Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step in Stratagene 3005P qPCR kone. Voit luoda standardikäyrä, väliaine piikkeinä 1×10

8 hiukkaset AdhWt ja laimennetaan sarjoittain. Oligonukleotidit: E4-sense (5′-tagacgatccctactgtacg -3 ’), E4-antisense (5’ggaaatatgactacgtccgg -3’). Neljäkymmentä sykliä seuraavan termisen protokolla suoritettiin: sulamispiste (95 ° C, 30 sekuntia), alukkeiden (60 ° C, 30 sekuntia), ja pidennys (72 ° C, 30 sekuntia). Analyysiä määrä E4 kopioiden määritettiin E4 Ct (KH) arvot ja standardi käyrä ja viittasi solumäärät ympätty.

määrä tarttuvien hiukkasten vapautuu väliaineen 48 ja 72 tunnin kuluttua infektio ja solujen sisällä ja väliaine kerätään 72 tunnin määritettiin plakkimäärityksellä. Solut kerätään yhdessä väliaineen hajotettiin toistettiin jäädytys ja sulatus, kuten edellä on kuvattu. Solujätteen poistamiseksi, näytteet sentrifugoitiin 400 x g 10 minuuttia, ja supernatantit siirrettiin uusiin putkiin. Väliaine otetaan ilmoitettuina ajankohtina käytettiin suoraan tässä määrityksessä. Sarjalaimennoksia supernatanttien ja väliaine käytettiin infektoimaan A549-soluja, jotka ympättiin useita 7.5×10

5-solut päivänä. 5% (w /v) PeqGold alhaalla sulavan agaroosin liuos (liuotettu PBS: ään ja autoklavoitiin) oli 1: 4 laimennettiin alustalla, joka sisälsi 2% seerumia, ja pidettiin 37 ° C: ssa. 2 tunnin kuluttua viruksen sisältävä väliaine oli huolellisesti pois ja solut peitettiin esilämmitettyä (37 ° C) 1,25% (w /v) agaroosiliuosta. 15 minuutin kuluttua huoneen lämpötilassa, jotta agaroosi jähmettyä, soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Plakkien lukumäärä laskettiin 10 päivää infektion jälkeen.

solunelinkykyisyysmääritys

sytolyyttinen aktiivisuus heksonin modifioitua vektoria analysoitiin sekä yhden ja co-viljelmiä syöpäsolujen ja hPSCs. Näin ollen, 2 x10

3-soluja yhden soluviljelmissä 96-kuoppalevyille per kuoppa, ja jokainen 1 x10

3 kasvainsolujen ja hPSCs yhteistyössä kulttuureissa kylvetään päivää ennen oli transdusoitiin AdhCKS17 ja AdhWt ohjaus, vastaavasti, eri hiukkasten mÕIS välillä 1 1000. Seitsemän päivää infektion jälkeen solujen elinkykyisyys määritetään valmistajan antamat protokollan avulla Cell-TiterGlo (Promega, Mannheim, Saksa).

SPR analyysi

analysoimiseksi vuorovaikutuksista heksoniin-modifioitu (AdGFPhCKS17) ja heksoni-muunneltua ohjaus (AdGFPhWt) vektorien tekijän X (FX) pintaplasmoniresonanssin (SPR) kokeet suoritettiin käyttäen Reichert SR7500DC SPR väline (Reichert Technologies, Buffalo, New York, Yhdysvallat Amerikka). Ihmisen veren FX (Hematologinen Technologies, Essex Junction, Vermont, Yhdysvallat) immobilisoitiin kovalenttisesti yhdelle virtausta soluun (karboksimetyyli- hydrogeelin biosensorisiruun (CMD500m siru ostettu XanTec bioanalytiikka GmbH, Düsseldorf, Saksa)) amiiniyhdistämisellä mukaan valmistajan ohjeita. Standard amiinikytkentää in puuttuessa proteiinia (dummy kytkin) suoritettiin toinen virtaus solu tuottaen vertailuvirtaus soluun. Signaaleja, jotka on saatu FX-pinta vähennettiin signaaleista, jotka on saatu viite virtauksen solun standardimenetelmän mukaisesti. Vain viite vähennetään sensorigrammit esitetty. Glyserolin poistaminen viruksen kantaliuokset ja vaihto-puskuria 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl

2, ja 0,005% Tween 20 saatiin aikaan geelisuodatuksella käyttämällä PD MiniTrap G-25 saraketta (GE Healthcare , Dassel, Saksa). Vektorit laimennetaan sarjoittain samaan puskuriin saada pitoisuuksina 1.25×10

8 1×10

9 fyysinen hiukkasia per millilitra johdettiin lastun yli 3 min ajan virtausnopeudella 25 ul /min. Dissosiaatio faasi koostui puskuria virtaus 25 ul /min 5 min ja sitä seurasi regenerointivaihe regeneraatiopuskurilla (10 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl: a, 3 mM EDTA: ta, ja 0,005% Tween 20), joka ruiskutettiin 50 s virtausnopeudella 25 ul /min.

FX-riippuvainen transduktio

vaikutuksen tutkimiseksi heksonin muutos vuorovaikutukseen FX FX-riippuvaisen transduktio hinnat CKS17 heksoniin-modifioitu Ad vektori analysoitiin. Siksi 2×10

4 A549-solut intensiivisesti pestiin kahdesti PBS: llä yhden päivän kuluttua kylvö. Sitten solut saivat joko seerumittomassa elatusaineessa (kontrolli) tai seerumia, joka sisälsi 8 ​​ng /ml FX (fysiologinen konsentraatio). Ad-vektorit, joissa on hiukkasen MOI (PMOI) 1000 lisättiin soluihin. Sitten soluja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Lisäyksen jälkeen seerumia sisältävien solujen elatusaineessa, soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Sitten solut otettiin talteen, kuten edellä on kuvattu, ja GFP-ekspressio analysoitiin virtaussytometrialla analysointia.

In vivo

biodistribuutio

vaikutuksen tutkimiseksi vähentyneen FX sitoutumisen heksonin modifioituja Ad vektori AdGFPhCKS17

in vivo

, joka on biologista jakautumista hiirillä tehtiin. Naaraspuoliset BALB /c-hiiriä (6-8 viikkoa ikäisiä) hankittiin Charles River, Sulzfeld, Saksa. Kaikki eläinkokeet oli hyväksynyt Animal Care komissio hallituksen Baden-Württembergin (Luvan numero: 975) ja olivat tiukasti vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti. Klodronaatti oli lahja Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Saksa). Se kiteytettiin lipsosomes kuten aiemmin on kuvattu [41]. Sillä Kupfferin solujen väheneminen, 200 ui klodronaatin liposomien injektoitiin häntälaskimoon. 24 tunnin kuluttua, Ad vektori hiukkasia (3 x10

10) injektoitiin laskimonsisäisesti häntälaskimoon hiirten kokonaistilavuudessa 200 ui (HEPES-puskuroitu suolaliuos). Neljäkymmentä minuuttia tai 72 tuntia injektion jälkeen hiiret nukutettiin isofluraanilla (Fo- rene, Abbott, Ludwigshafen, Saksa) hengitettynä, maksat perfusoitiin PBS, ja elimet kerättiin. Sen jälkeen hiiret tapettiin kahdenvälistä thoracotomy. Sitten elimet olivat snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää DNA eristäminen (qPCR analyysi) tai homogenointi (fluorimetrisella analyysi).

kvantitatiivinen PCR-analyysit

kvantitatiivinen PCR analyysi suoritettiin monistamalla Ad5-säikeen geeni käyttäen Stratagene 2 x Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step in Stratagene 3005P qPCR kone. Normalisoimaan solun DNA-pitoisuuden hiiren tai ihmisen β-aktiini on käytetty. Tuottaa standardikäyrät, maksan DNA naiivi hiiriä (biodistribuutio tutkimus) tai genomista DNA: ta eristettiin ihmisen A549-soluja (kilpailu-koe) on sekoitettava pGS66 sisältävien Ad5-säikeen geenin. Oligonukleotidit: hiiren β-aktiini-sense (5′-GCTGTGTTCTTGCACTCCTTG-3 ’), hiiren β-aktiini-antisense (5′-CGCACGATTTCCCTCTCAGC-3′), ihmisen β-aktiini-sense (5’-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 ’), ihmisen β-aktiini-antisense (5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 ’), kuitu-sense (5′-GCTACAGTTTCAGTTTTGGCTG-3′), kuitu-antisense (5’-GTTGTGGCCAGACCAGTCCC-3 ’). Neljäkymmentä sykliä seuraavan termisen protokolla suoritettiin: sulamispiste (95 ° C, 30 sekuntia), alukkeiden (60 ° C, 30 sekuntia), ja pidennys (72 ° C, 30 sekuntia). Analyysiä varten kuitu Ct (KH) arvot normalisoitiin p-aktiini Ct (dR) arvot samasta näytteestä.

Fluorimetric analyysi hiiren maksahomogenaatit

Viisisataa mikrogrammaa perfusoiduille ja snap-pakastetut maksan homogenisoitiin 1 ml: aan homogenointipuskuria (50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v /v) NP-40, 0,25% (w /v) natriumdesoksikolaatti) kanssa kartiomainen kudosjauhimessa (Wheaton, Millville, NJ, USA), siirrettiin 1,5 ml: n reaktioputkeen ja inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Näytteitä sentrifugoitiin 10 minuuttia, 20000 x g, 4 ° C: ssa. Supernatantti kirkas fraktio siirrettiin uuteen reaktioputkeen, sentrifugoitiin 10 minuuttia, 20000 G, 4 ° C: ssa, ja laimennettiin suhteessa 1: 500-1: 20000 homogenointipuskuriin. GFP-fluoresenssi analysoitiin fluoresenssi spektrometri LS50B (Perkin Elmer, Waltham, MA, Yhdysvallat) 488 nm: n virityksellä aallonpituudella ja 512 nm: n emission aallonpituudella. Suhteellinen yksiköt laskettiin ja mielivaltaiset yksiköt muunneltua vektori asetettiin 1.

neutralointi Ad vektorien luonnolliset IgM

vaikutus heksonin muutoksen tunnustamista luonnollisten IgM tutkittiin neutra- määritys. 2×10

4 A549 siirrostettiin päivää ennen pestiin kerran PBS: llä, ja seerumitonta alustaa lisättiin. 1×10

7 Ad hiukkasia, jotka oli inkuboitu 20 minuuttia 37 ° C: ssa 30 ui hirudinized (Refludan®, Celgene, Munich, Saksa) plasmaa NMR1 hiiriä tai seerumia (kontrolli) kokonaistilavuudessa 32 ui, lisättiin soluihin. 3 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa solut pestiin kerran PBS: llä, ja sen jälkeen lisättiin seerumia sisältävää väliainetta soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen virtaussytometrialla määrittämiseksi GFP-ekspressiota.

otto Ad vektorit hiiren makrofageissa

1×10

5 Raaka 264,7 solut ympätään edellisenä päivänä pestiin kerran PBS: llä, ja seerumitonta alustaa lisättiin.

2×10

8 Ad vektori hiukkasten, jotka oli inkuboitu 30 ul: hirudinized plasman NMR1 hiiriä tai seerumia (kontrolli) (kokonaistilavuudessa 35 ui) 20 minuuttia 37 ° C: ssa lisättiin soluihin. 45 minuutin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja kokonais-DNA eristettiin mukaisesti val- mistajan protokollaa. 0,01, ***

P