Krooninen sairaus

tiivistelmä

Chemoresistance in monilääkeresistenteistä (MDR) solut yli-ilmentävät P-glykoproteiinia ( P-gp), jota koodaa MDR1 geeni, on merkittävä este onnistuneen kemoterapia peräsuolen syövän. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sinomenine voi parantaa imeytymistä eri P-gp: n substraatteja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta sinomenine on chemoresistance paksusuolen syöpäsoluissa ja tutkittu taustalla olevaa mekanismia. Olemme kehittäneet monilääkeresistenteistä Caco-2 (MDR-Caco-2-soluissa) altistuminen Caco-2-solujen kasvavien pitoisuuksien doksorubisiinin. Havaitsimme yliekspressio COX-2 ja MDR-1-geenien sekä aktivaatiota NF-KB-signaalin väylän MDR-Caco-2-soluilla. Tärkeää on, olemme huomanneet, että sinomenine parantaa herkkyyttä MDR-Caco-2-soluja kohtaan doksorubisiiniksi vähen- tämisessä MDR-1 ja COX-2: n ilmentymisen estämällä NF-KB-signaloinnin kautta. Nämä havainnot tarjoavat uusia mahdollisuuksia strategian käänteinen P-gp-välitteistä syöpälääkkeen vastus.

Citation: Liu Z, Duan Z-J, Chang J-Y, Zhang Z-f, Chu R, Li Y-L, et al. (2014) Sinomenine herkistää monilääkeresistenteistä Colon Cancer Cells (Caco-2) doksorubisiinille mukaan alassäätely MDR-1 Expression. PLoS ONE 9 (6): e98560. doi: 10,1371 /journal.pone.0098560

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 22 tammikuu 2014; Hyväksytty: 05 toukokuu 2014; Julkaistu: 05 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ruoansulatuskanavan radalla. Viime vuosina ilmaantuvuus peräsuolen syöpä on merkittävästi kasvanut Kiinassa [1]. Kirurginen resektio on optimaalinen hoito tällaista syövän, kun taas kemoterapia toimii yksi tärkeä adjuvanttia hoitoja sen hoitoon. Tällä hetkellä kehitys monilääkeresistenssin (MDR), fenotyypin syöpäsolut tulleet vastustuskykyisiksi laaja kirjo kemoterapeuttisten [2], on merkittävä este peräsuolen syövän kemoterapiaa. On osoitettu, että syntyminen MDR syöpäsoluissa on korreloi merkitsevästi yli-ilmentyminen kalvopumpun proteiineja, mukaan lukien P-glykoproteiinin (P-gp) [3].

P-gp: n, jota koodaa MDR- 1-geeni, kuuluu suuri ATP-sitovaa kasetti proteiini-superperheen [4]. P-gp pystyy pumppaamaan suuri määrä yhdisteitä, intrasellulaarisesta extra-cellular sivustoja. Kun syöpäsolut kohtaavat kemoterapeuttiset lääkkeet, rasvaliukoisia huumeet tulevat soluihin kautta väkevyysero vaikutus. Sitoutumisen jälkeen P-gp, rasvaliukoisia lääkkeitä jatkuvasti pumpataan solun ulkopuolelle menetelmällä virtansa ATP hydrolyysin, asiakkuutta jatkuva lasku solunsisäisten lääkepitoisuuksiin [5]. Näin ollen lääkkeen toksisuutta syöpäsolujen vähitellen heikentynyt, jolloin se menettäisi tehoa, ja lopuksi tuottaa lääkeresistenssin syöpäsoluissa.

Sinomenine (7,8-didehydro-4-hydroksi-3,7-dimetoksi- 17-methylmorphinae-6-oni) on yksi useista alkaloideja uutetaan varren

Sinomenium acutumRehder

Wilson (kilpikiertokasvit), jota on käytetty perinteisesti Kiinassa ja Japanissa hoitaa erilaisia ​​reuma- ja nivelsairauksien [6]. On syytä huomata, että sinomenine on omiaan lisäämään absorptio kuljetusta digoksiinia (prototyyppiä substraatti p-glykoproteiinin) ja vähentämällä erityskapasiteetil- kuljetukseen [7]. Jotkut tutkimukset osoittavat, että sinomenine voi estää NF-KB: n [8]. Taustalla mekanismi näistä ilmiöistä jää epäselväksi.

syklo (COX), nopeutta rajoittava entsyymi, joka katalysoi biosynteesiä prostaglandiinien (PG) alustasta arakidonihapon (AA) ja osallistuu useita fysiologisia ja patologisia tapahtumia . Tällä hetkellä on olemassa kaksi isoformia COX: COX-1 ja COX-2. Useimmissa kudoksissa, COX-1 ilmentyy konstitutiivisesti, kun taas COX-2 indusoituu kasvutekijöiden, sytokiinien, ja karsinogeenien [9]. COX-2 on yleisesti havaittu monia eri kasvaimen kudoksissa, mukaan lukien ruokatorven, mahan, paksusuolen, maksan, sapen, haima, rinta-, keuhko- ja virtsarakon syövät [10]. Viimeaikaiset havainnot ovat osoittaneet, että COX-2: n ilmentymisen korreloi positiivisesti P-gp ilmentyminen kasvainkudoksessa [11]. Asiaa koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että COX-2-estäjät lisätä herkkyyttä syöpäsolujen kemoterapeuttisia säätelemällä P-gp: [12], [13]. On havaittu, että selekoksibin, COX-2-inhibiittori, voi downregulate P-gp: n ilmentymistä syöpäsoluissa ilmentymisen estämiseksi transkriptiotekijöiden, kuten NF-KB: n [14], [15]. Useat tutkimukset osoittivat, että MDR-1-geenin voi sisältää DNA: ta sitovia kohtia varten transkriptiotekijä NF-KB: n [16], [17].

Jotkut tutkimukset osoittavat, että sinomenine estää kypsymistä monosyyteistä johdettujen dendriittisten solujen avulla estää aktivoinnin NF-KB: n [8]. Nykyisessä tutkimuksessa testasimme hypoteesia, että sinomenine voivat parantaa herkkyyttä syöpäsolujen kohti syöpälääkkeiden ja tutkitaan mahdollisia molekyylitason mekanismeja tästä vaikutuksesta suoraan vaikutusta arvioitaessa COX-2 ja NF-KB: n reitit P-gp ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Regents ja vasta-aineet

Sinomenine, selekoksibi, doksorubisiini, 3- (4, 5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -2, 5- difenyyli tetra-zolium bromidia (MTT) ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) ostettiin Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) ja vasikan sikiön seerumia (FCS) saatiin GIBCO Life Technology (Grand Island, NY). PGE

2 ja PGE

2 arvio pakki ostettiin Cayman Chemical Co., USA. Triton X-100 ostettiin Amresco, USA. P-glykoproteiinin (P-gp) hiiren anti-humaani monoklonaalinen vasta-aine, p-IKB-α (Ser 32/36) ja IKB-α kanin anti-ihmis-polyklonaalinen vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) . NF-KB: n p65: n kanin anti-ihmis-polyklonaalinen vasta-aine saatiin Proteintech Group, USA. Monoklonaalinen hiiren anti-beeta-aktiini ja polyklonaalista kanin anti-COX-2 saatiin Biosynteesissä Biotechnology (Peking, Kiina). FITC-leimatulla vuohen anti-hiiri-IgG: n ja FITC-leimatulla vuohen anti-kani-IgG hankittiin Amersham Pharmacia Biotech. (Piscataway, NJ).

Cell Culture

Caco-2 solulinjat Tässä tutkimuksessa käytetyt ostettiin Kiinan Academy of Medical Sciences. Caco-2-soluja viljeltiin runsaasti glukoosia Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Gibco, Bethesda, MD, USA), elatusaineet, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. MDR-Caco-2-solut ovat kehittäneet altistuminen Caco-2-solujen kasvavia pitoisuuksia doksorubisiinin (0,1 uM 1,6 uM 7 päivää). Sitten MDR-Caco-2-soluja inkuboitiin ilman doksorubisiinille viikon ennen kokeita.

MTT Kolorimetrinen

Sovellus pitoisuus sinomenine, selekoksibi, PGE

2 ja valmiutta sinomenine herkistää koolonkarsinoomasoluissa kohti doksorubisiinin arvioitiin käyttäen MTT kolorimetristä määritystä. Caco-2-solujen ja MDR-Caco-2-solujen logaritmisen kerättiin, inkuboitiin 96-kuoppalevyllä, jonka pitoisuus on 2 x 10

4 solua per kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia DMEM: llä, jota oli täydennetty 10% FCS. Liittämisen jälkeen solujen seinä, DMEM-elatusainetta (ilman FCS: ää), joka sisälsi sinomenine (0, 50, 100, 300, 400, 500, 1000, 2000 uM), selekoksibi (0, 5, 10, 15, 20, 25 , 30, 35 uM) ja PGE

2 (0, 10

-5, 10

-4, 10

-3, 10

-2, 10

-1, 1, 10 uM) täydennettiin lopulliseen tilavuuteen 200 ul /kuoppa 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen väliaine poistettiin ja solut pestiin kahdesti DMEM: llä. Sitten 200 ui DMEM 10% FBS: ää ja 10% MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin. Kun oli inkuboitu vielä 4 h, alennettu solunsisäinen formatsaanituotteesta liuotettiin korvaamalla 150 ui DMEM, jossa on sama tilavuus DMSO: ta. Optinen tiheys (OD) arvo havaittiin aallonpituudella 490 nm mikrolevylukijalla (Bio-rad680, CA, USA). Neljä kaksoiskappaleet oli suunniteltu kuhunkin kuoppaan, ja keskiarvo laskettiin kolme kertaa. Solu kasvun esto laskettiin seuraavasta kaavasta: solujen kasvun esto = (1 -OD arvo tutkimusryhmän /OD arvoa vertailuryhmässä) x 100%.

kasvuinhibitiotestillä suoritettiin arvioimiseksi valmiutta sinomenine ja selekoksibin herkistää Caco-2 ja MDR-Caco-2-solujen kohti doksorubisiinia. Liittämisen jälkeen solujen seinä, DMEM-elatusainetta (ilman FCS: ää), joka sisälsi sinomenine (500 uM), selekoksibi (25 uM), sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM), jossa on välein 2 h . Kun oli inkuboitu 48 tuntia, väliaine korvattiin DMEM: llä (FCS-vapaa), joka sisältää doksorubisiinia (1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0 uM) 24 tuntia.

WST -1 proliferaatiomääritystä

Caco-2-solut ja MDR-Caco-2-solujen logaritmisen kerättiin, inkuboitiin 96-kuoppalevyllä, jonka pitoisuus on 2 x 10

4 solua per kuoppa ja viljeltiin 24 tunnin ajan DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Liittämisen jälkeen solujen seinä, DMEM-elatusainetta (ilman FCS: ää), joka sisälsi sinomenine (500 uM), selekoksibi (25 uM), sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM), jossa on välein 2 h . Kun oli inkuboitu 48 tuntia, väliaine korvattiin DMEM: llä (FCS-vapaa), joka sisältää doksorubisiinia (1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0 uM) 24 tuntia. 10 ui reagenssia WST-1, lisättiin (Roche Applied Science, Vilvoorde, Belgia) ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Optinen tiheys luettiin 450 nm: ssä mikrolevylukijaa Labnet (Celbio, Milano, Italia). WST-1 tiedot esitettiin keskiarvona (± SD) on kolmena kokeita.

PGE

2 Arvio

MDR-Caco-2 ja Caco-2-solut tiheydellä 5 x 10

6 ympättiin 90 mm viljelymaljoilla. Niitä inkuboitiin kanssa tai ilman snomenine (500 uM) 48 tuntia. Lopussa hoitojakson ajan, viljelyväliaine otettiin talteen määrän määrittämiseksi PGE

2 näiden solujen erittämät ja varastoitiin) -80 ° C: ssa. Kvantitatiivinen analyysi PGE

2 vapautuu väliaine arvioitiin käyttäen PGE

2 immuno- kohti valmistajan ohjeiden (Cayman Chemical Company, USA).

Immunosytokemia

Jakelu P-gp solukalvon ja tumaansiirtymiseen NF-KB: n p65 analysoitiin immunosolukemiallisella vakiona menettelyjä. Lyhyesti, Caco-2, ja MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin sinomenine (500 uM) ja ohjaus alustaa (ilman sinomenine) 48 tuntia ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Soluja inkuboidaan P-glykoproteiinin (P-gp) hiiren anti-humaani monoklonaalinen vasta-aine (1:200 laimennus) tai NF-KB: n p65: n kanin anti-ihmis-polyklonaalista vasta-ainetta (1:200 laimennos) 1 h, mitä seurasi inkubointi FITC leimattua vuohen anti-hiiri-IgG (1:200 laimennus) tai FITC-leimattua vuohen anti-kani-IgG: tä (1:200 laimennos) 1 h, vastaavasti. Lopuksi solut tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Reaaliaikainen Suhteellinen Quantitative RT-PCR (PCR) määritys

Tutkiakseen vaikutus sinomenine ja selekoksibi on P-gp: n ja COX-2: n ilmentymisen, reaaliajassa suhteellinen kvantitatiivinen PCR suoritettiin. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille DMEM täydennetty 10% FCS: ää 24 tunnin ajan. Caco-2 ja MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin sinomenine (500 uM) tai selekoksibia (25 uM) 48 tunnin ajan.

Kokonais-RNA eristettiin TRIzol reagenssilla (Keygen Biotech Co., Ltd, Nanjing , Kiina), protokollan mukaisesti valmistajan. Eristetty RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti (optinen denisty 260/280 nm). MRNA käänteistranskriptoitiin sitten cDNA: ksi, mukaan PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time ostettiin Takara Bio Inc. (Dalian, Kiina).

Reaaliaikainen suhteellinen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 nopeampi Real-Time PCR System SYBR Esiseos Ex Taq (Tli RNaseH Plus) Master Mix ostettiin Takara Bio Inc. (Dalian, Kiina) kolmena kappaleena kullekin näytteelle ja jokaisen geenin. PCR: t suoritettiin käyttämällä oligonukleotidialukkeita, jotka on lueteltu taulukossa 1, joka kuvaa koko odotetut fragmentit. PCR-olosuhteet olivat täysin: denaturaatio 95 ° C: ssa 30 s, jonka jälkeen 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 5 s ja 30 s 60 ° C: ssa hehkutus ja 30 s 72 ° C: ssa venymä. Tulokset ilmaistiin suhteena arvoa CT-arvo kohde-mRNA: n, joka on β-aktiini-mRNA: n (Ct näyte /Ctβ-aktiini).

Western blot -analyysi

Western blotit suoritettiin perustuu standardiin menettelyihin. Lyhyesti, otettiin talteen solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä (pH 7,4). Nuclear uutteet eristettiin käyttäen Nuclear /sytosoliin fraktiointi Kit (Keygen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kiina) mukaan valmistajan suositusten. Kokonaisproteiinista poimittiin seuraavia valmistajan ohjeiden testipakkauksen Nanjing KEYGEN Biotech. CO., LTD (Kiina). Jälkeen määritetään proteiinipitoisuus näytteiden avulla bikinkoniini- happoa (BCA) proteiinimääritys, yhtä suuret määrät proteiinia näytteistä (30 ug proteiinia), erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä (8% P-gp, 15% COX-2, 12% NF-KB: n p65: n, p-IKB-α, IKB-α ja beeta-aktiini).

erotetut proteiinit siirrettiin PVDF-membraanille. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (TTBS), PVDF-kalvoa inkuboitiin yön yli estopuskurissa laimealla primaaristen vasta-aineiden: anti-P-glykoproteiinin (1:500 laimennus), anti- p-IKB-α (Ser 32/36) ja anti-IkB-α (1:300 laimennus), anti-NF-KB: n p65 (1:400 laimennus), anti-COX-2 (1:500 laimennus) ja anti- beeta-aktiini (1:1000 laimennus), 4 ° C: ssa. Sen jälkeen PVDF-kalvo pestiin kolme kertaa käyttäen TTBS, minkä jälkeen altistus toissijainen vasta-aine: peroksidaasikonjugoitua AffiniPure Goat Anti-Rabbit ja anti-hiiri-IgG (Biosynthesis Biotechnology, Peking, Kiina, 1:2000 laimennus). Tuote nauhat valokuvattiin, ja tiheys kunkin tuotejuovassa kvantitoida ChemiDoc XRS dokumentointijärjestelmän (Bio-Rad Laboratories). Intensiteetti kunkin signaalin korjattiin käyttämällä saatujen arvojen immunologisesti beeta-aktiini.

Tilastollinen analysointi

Data esitetään keskiarvoina ± SE. Alustava analyysi oli. suorittaa onko aineistot myönnetty normaali. jakelu, ja laskenta varianssin homogeenisuudesta suoritettiin käyttämällä Bartlettin testi. Välineet moninaisista näytteitä verrattiin ANOVA, ja useita vertailuja ryhmien kesken suoritettiin käyttäen vähiten merkitsevä ero (LSD) menetelmällä. Jos F-arvot olivat merkittävästi (P ​​ 0,05), Dunnettin menetelmää käytettiin arvioimaan yksittäisiä eroja keinoin, ja P 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tiedot analysoitiin tilastollisesti SPSS 11.5 Windowsille.

Tulokset

Effect of Sinomenine, selekoksibi ja PGE

2 Caco-2 Elinkelpoisuus

kokeet suoritettiin inkuboimalla Caco-2-soluja 48 h kasvavien pitoisuuksien kanssa sinomenine, paljasti, että tämä yhdiste ei vaikuta Caco-2-solujen elinkelpoisuus pitoisuuksina 500 uM tai vähemmän (Fig. 1A). Konsentraatio 500 uM valittiin sovelluksen pitoisuus.

sytotoksisia vaikutuksia merkitty yhdisteiden Caco-2-soluja määritettiin MTT-määrityksellä. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. Ajoneuvon käsiteltyjä soluja käytettiin normalisointi ohjaus. * P 0,5, ** P 0,05.

annosvasteyhteys ja aika-kurssi tutkimukset osoittivat, että selekoksibia, COX-2 spesifinen estäjä ei vaikuta Caco-2-solujen lisääntymisen annosvaihtelu 0-25 uM (Fig. 1 B). Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että selekoksibi säätää MDR1 ilmentyminen COX-2-entsyymin aktiivisuutta, jonka pitoisuus on 25 uM. Niin, annos 25 uM valittiin kokeiden perusteella [18].

Sen arvioimiseksi, PGE

2 voi vaikuttaa vaikutuksia sinomenine, Caco-2-soluja inkuboitiin kanssa tai ilman kasvavia konsentraatioita (0 10 uM) PGE

2, COX-2-lopputuotteen, osoittivat, että tämä yhdiste ei vaikuta Caco-2-solujen elinkelpoisuus missä tahansa pitoisuudessa testattava (Fig. 1 C). Tutkimukset ovat osoittaneet, että PGE

2 säätelee MDR1 ilmaisu pitoisuudella 1 uM [12], [18], [19], ja se on hiljaista, että Akt estyy mekanismiin. Siksi päätimme annos 1 uM meidän kokeita.

Sinomenine ja Selekoksibi Enhanced doksorubisiinin aiheuttaman Ctotoxicity sekä Caco-2 ja MDR-Caco-2 solut

Sen arvioimiseksi, sinomenine ja selekoksibi voi herkistää Caco-2 ja MDR-Caco-2-soluja sytotoksisille vaikutuksille doksorubisiinin, Caco-2, ja MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin doksorubisiinia (10

-5-10 uM) poissa tai läsnä ollessa of sinomenine (500 uM), selekoksibi (25 uM), tai sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM) 48 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksellä (Fig. 2 A ja B) ja WST-1-määritys (Fig. 2 C ja D). Doksorubisiini vähentynyt solujen elinkykyä annosriippuvaisesti sekä Caco-2 ja MDR-Caco-2-solujen IC

50-arvo on noin 2,41 ± 0,15 uM ja 4,67 ± 0,12 uM (kuvio. 2 A), tässä järjestyksessä. MTT-määritys, yhteiskäsittely Caco-2-solujen sinomenine tai selekoksibi, säteilyherkät Caco-2-soluja sytotoksisille vaikutuksille doksorubisiinin pienentymisen kanssa IC

50-arvot 2,41 ± 0,15 uM 1,91 ± 0,16 uM ja 1,85 ± 0,2 uM (Fig. 2), vastaavasti. Kuitenkin yhteiskäsittely kanssa sinomenine plus PGE

2 ei ollut vaikutusta herkkyyteen Caco-2-solujen kohti doksorubisiini.

Caco-2 ja MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin 48 tuntia doksorubisiinin (10

-5-10 uM) yksin tai yhdessä sinomenine (500 uM), selekoksibi (25 uM), tai sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM). Solujen elinkyky määritettiin sitten MTT-määrityksellä. Ct ryhmä (A ja C) viittaa doksorubisiini käsiteltyä Caco-2-ryhmä ja ct-ryhmän (B ja D) viittaavat doksorubisiini saaneista MDR-Caco-2-ryhmä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. (N = 3) edustavan kokeessa, joka suoritettiin kolmena kappaleena. ** P 0,01, * P 0,05 verrattuna doksorubisiiniin saaneilla Caco-2-ryhmä. ## P 0,01, # P 0,05 verrattuna doksorubisiiniin saaneilla MDR-Caco-2-ryhmä.

Sinomenine ja selekoksibi tehosti sytotoksisten toiminta doksorubisiinin MDR-Caco-2-solut, mikä laski IC

50-arvon 4,67 ± 0,12 uM 2,45 μ ± 0,14 uM ja 2,56 uM ± 0,11 uM (kuvio. 2 B), tässä järjestyksessä. Yllättäen yhteiskäsittely kanssa sinomenine plus PGE

2 oli negatiivinen vaikutus herkkyyteen MDR-Caco-2-soluja kohtaan doksorubisiinia lisääntynyt IC

50-arvon 4,67 ± 0,12 uM 5,35 μ ± 0,13 uM.

WST-1 määritys, IC

50 arvo Caco-2-solut laski 2,33 ± 0,14 uM 1,85 ± 0,13 uM ja 1,88 ± 0,21 uM (kuvio. 2 C). Kuitenkin yhteiskäsittely kanssa sinomenine plus PGE

2 heikentynyt herkkyys Caco-2-soluja kohtaan doksorubisiinia pienentynyttä IC

50-arvot 2,33 ± 0,14 uM 2,55 ± 0,17 uM (kuvio. 2 C). Sinomenine ja selekoksibi tehosti sytotoksisten toiminta doksorubisiinin MDR-Caco-2-solut, mikä vähensi IC

50-arvon 4,55 ± 0,19 uM 2,55 μ ± 0,25 uM ja 2,52 uM ± 0,18 uM (kuvio. 2 D) vastaavasti. Hämmästyttävää, yhteiskäsittely kanssa sinomenine plus PGE

2 oli negatiivinen vaikutus herkkyyteen MDR-Caco-2-soluja kohtaan doksorubisiinia lisääntynyt IC

50-arvon 4,55 ± 0,19 uM 5,15 μ ± 0,14 uM (Fig. 2 D).

Sinomenine Vähentynyt PGE

2 Julkaisu

tarkastella lähemmin osallistumisen COX-2, PGE

2, COX-2 lopputuote, vapautettiin Caco-2 ja MDR-Caco-2-soluihin määritettiin ELISA-menetelmällä. Tulokset osoittavat selvästi merkittävä kasvu PGE

2 tasot MDR-Caco-2-soluja verrattuna Caco-2-solut ja merkittävä väheneminen tasot PGE2 MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin sinomenine (Fig. 3).

MDR-Caco-2 ja Caco-2-soluja viljeltiin 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa 500 uM sinomenine, kuten on osoitettu, ja korjattu. Supernatantit kerättiin sitten PGE

2 mittaus. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. (N = 3) edustavan kokeessa, joka suoritettiin kolmena kappaleena. Verrattuna Caco-2-solut, PGE

2 tasot MDR-Caco-2-solut huomattavasti (P ​​ 0,01), mikä merkittävästi vähentynyt MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin sinomenine (P 0,01).

Sinomenine ja Selekoksibi vaimentua Expression P-gp /MDR1 in MDR-Caco-2 solut

jotta ymmärtää mekanismia vastus kehitetään MDR-Caco-2-solut, ja mekanismi, joka osallistuu sinomenine ja selekoksibi herkistävä MDR-Caco-2-solujen kohti doksorubisiini, immunofluoresenssilla sytokemian, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR, ja western blotting suoritettiin. Tulokset osoittivat yli-ilmentyminen MDR1 mRNA: ta ja proteiinia merkittävästi vähentynyt, kun läsnä on sinomenine ja selekoksibi (Fig. 4).

monilääkeresistenteistä Caco-2 (MDR-Caco-2-solut) ovat kehittäneet altistuminen Caco -2 solujen kasvavia pitoisuuksia doksorubisiinin (0,1 uM 1,6 uM 7 päivää). MDR-Caco-2-soluja inkuboitiin ilman doksorubisiinille viikon ennen kokeita. Sitten MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman sinomenine (500 uM) ja selekoksibin (25 uM) 48 tunnin ajan. (A) immunosolukemiallinen kohdistaminen P-gp (vihreä). (B) Western blot-analyysi sinomenine ja selekoksibin välittämä vaikutus P-gp ilmentymisen Caco-2-solut ja MDR-Caco-2-soluilla. Vasta-aine beeta-aktiini käytettiin tasapuolisen lastaus proteiinin kunkin kaistan. (C) suhteellinen bändi tiheysarvoilla P-gp ilmaisu kaistat kuvataan baarissa chat. (D) Reaaliaikainen PCR-analyysi MDR1 ilmentymisen Caco-2-solut ja MDR-Caco-2-solut, joita käsiteltiin tai ei sinomenine. Beta-aktiini käytettiin sisäisiä havaitsemiseksi MDR1 ilmaisua. Kaikki tulokset edellä on ilmaistu keskiarvoina ± SE (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. *, P 0,05 ja **, P 0,01 verrattuna MDR-Caco-2-ryhmä.

Sinomenine vaimentua Expression COX-2 in MDR-Caco-2 solut

roolin ymmärtämiseksi COX-2: n resistenssin kehittymistä, ja vaikutus sinomenine COX-2: n ilmentymisen, Caco-2, ja MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman sinomenine ja selekoksibi, COX-2- spesifinen inhibiittori, kvantitatiivisen reaaliaikainen PCR ja western-blottauksella. Tulokset paljastivat, että COX-2-yli-ilmennetään MDR-Caco-2-solut ja sinomenine tukahdutetaan COX-2: n ilmentymisen (Fig. 5). Sen lisäksi, että selekoksibi ei ole vaikutusta ekspression. Voimme päätellä, että selekoksibin, kuten COX-2-spesifinen estäjä, estää toiminnan COX-2 sen sijaan, säätämällä sen ilmentymistä.

MDR-Caco-2-soluja inkuboitiin ilman doksorubisiinia viikon ennen kokeita. Sitten MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman sinomenine (500 uM) ja selekoksibin (25 uM) 48 tunnin ajan. (A) Western blot-analyysi sinomenine ja selekoksibin välittämä vaikutus COX-2: n ilmentymisen in Caco-2-solut ja MDR-Caco-2-soluilla. Vasta-aine beeta-aktiini käytettiin tasapuolisen lastaus proteiinin kunkin kaistan. (B) suhteelliset bändi tiheys arvot COX-2: n ilmentymisen kaistaa kuvataan baarissa chat. (C) Reaaliaikainen PCR-analyysi COX-2: n ilmentymisen in Caco-2-solut ja MDR-Caco-2-solut, joita käsiteltiin tai ei sinomenine ja selekoksibi. Beeta-aktiini käytettiin sisäisenä viitteenä havaitsemiseksi COX-2: n ilmentymisen. Kaikki tulokset edellä on ilmaistu keskiarvoina ± SE (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. *, P 0,05 ja **, P 0,01 verrattuna MDR-Caco-2-ryhmä.

Sinomenine ja Selekoksibi Laskua NF-KB aktivoituminen

P-gp ilme on ollut korreloi selvästi NF-κ B aktivointi [17], [20], [21], joka välittää fosforylaatiota IKB-α. Tämän jälkeen aktivoitu NF-KB: n p65-alayksikön siirtyy tumaan ja sitoutuu DNA-sivuston, joka lopulta aktivoi transkription MDR-1 [22]. Ymmärtää mekanismia, jolla sinomenine ja selekoksibi parantaa herkkyyttä MDR-Caco-2-solujen kohti doksorubisiini, immunofluoresenssilla sytokemian, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR, ja Western blotting suoritettiin havaita p65-alayksikköä ydin- ja sytoplasman p-IKB-α ja IKB-α. Tulokset osoittivat, että NF-KB-reitin aktivoitiin MDR-Caco-2-soluja, kun taas sinomenine ja selekoksibi tukahdutti NF-KB-reitin MDR-Caco-2-solut (Fig. 6).

sitten MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman sinomenine (500 uM) ja selekoksibin (25 uM) 48 tunnin ajan. (A) immunosolukemiallinen kohdistaminen P65 (vihreä). (B) Western blot-analyysi sinomenine ja selekoksibin välittämä vaikutus ydin- translokaatiota P65 in Caco-2-solut ja MDR-Caco-2-soluilla. Vasta-aine beeta-aktiini käytettiin tasapuolisen lastaus proteiinin kunkin kaistan. (C) suhteellinen bändi tiheysarvoilla ydin- ilmaisun P65 kaistat kuvataan baarissa chat. (D) Suhteellinen bändi tiheysarvoilla sytoplasmisen p-IKB-α kaistat on kuvattu baarissa chat. Kaikki tulokset edellä on ilmaistu keskiarvoina ± SE (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. *, P 0,05 ja **, P 0,01 verrattuna MDR-Caco-2-ryhmä.

Keskustelu

Kemoterapia toimii yksi tärkeä hoitoja peräsuolen syövän. Pitkäaikainen kemoterapiaa väistämättä johtaa lääkeresistenssin ja tämä on tullut suuri haaste voiton kemoterapiaa. Syntyminen Lääkeresistenssin voi korreloivat kasvu effluksipumpun toiminnan väheneminen imeytymistä, aktivointi detoksifikaatioentsyymejä, muutokset huumeiden tavoitteita ja vähentää solujen apoptoosin [23]. Aiemmat tutkimukset effluksipumpun ovat osoittaneet, että P-gp: n, jota koodaa MDR-1-geeni, on tärkeä rooli, koska se pumput lääkeaineena ulkopuolella vähentää sytotoksisuuden esittämän syöpäsoluja ja parantaa vastustuskykyä karsinooma terapeuttisia aineita. Kuitenkin lääkeresistenssin esittämä syöpäsolut voidaan tehokkaasti päinvastaiseksi tukahduttamalla P-gp ilmentymistä ja toimintaa [24], [25], [26].

Sinomenine, bioaktiivinen alkaloidi johdettu

Sinomenium acutum

, hoidetaan reuma- ja nivelsairauksien Kiinassa. Sinomenine on erilaisia ​​toimintoja, kuten anti-tulehdus ja immunosuppressio [27], [28]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sinomenine laski ulosvirtausta prototyyppiä p-gp-substraattien, kuten digoksiinin ja paeoniflorin [6], [7], ja sinomenine itsessään voi olla substraatti P-gp [29]. Joten sääntelyn menetelmiä sinomenine P-gp jäi tuntemattomaksi. Tuloksemme osoittivat, että sinomenine vaimentua P-gp ilmentymisen MDR-Caco-2-solut (Fig. 4) ja parannettu herkkyys MDR-Caco-2-solut kohti doksorubisiinia (Fig. 2). Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että sinomenine esti ilmaus COX-2 [30], [31]. Yhdenmukainen nämä tulokset, havaintomme ilmenee, että sinomenine vaimentua COX-2: n ilmentymisen in MDR-Caco-2-solut (Fig. 4) ja vähensi PGE

2, lopun tuotantoa COX-2, vapautetaan MDR-Caco- 2-solut (Fig. 3).

COX-2, joka on yksi nopeutta rajoittava entsyymi arakidonihappoaineenvaihdunnan prostaglandiineja, yliekspressoituu monissa ihmisen primaarinen ja metastaattinen kasvaimet [32]. Olipa COX-2 on mukana kehittämässä lääkeresistenssin ominaista P-gp yli-ilmentymisen on kiistanalainen. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että COX-2: n ilmentymisen korreloi P-gp: n ilmaisun [33], [34]. On todettu, että adenovirus transfektio COX-2-geenin up-regulation MDR-1-geenin ilmentymistä rotan glomerulus soluissa ja ylläpitää myrkyllisyyttä adriamysiinin vastaan ​​munuaisten solut. Kun läsnä on COX-2-estäjän NS-398, MDR-1-geenin ilmentymisen tasot vähenivät merkitsevästi ja sytotoksisuus adriamysiinin tehostettiin [35]. Mukaisesti Näiden havaintojen huomasimme, että ilmaisua sekä COX-2 ja P-gp vahvistetaan huomattavasti MDR-Caco-2-soluilla. Selekoksibi, COX-2-spesifisen inhibiittorin, vaimentua P-gp: n ilmentymisen MDR-Caco-2-solut ja herkistetty MDR-Caco-2-soluja kohtaan doksorubisiini. Kuten edellä on todettu, sinomenine esti ilmentymisen COX-2 ja P-gp. Lisäksi, kun MDR-Caco-2-soluja käsiteltiin sinomenine ja PGE

2, sinomenine ei lisätä toksisuutta doksorubisiinin kohti MDR-Caco-2-solut (Fig. 2).

Aiemmat tutkimukset osoittivat että MDR-1-geeni sisältää sitoutumiskohdat NF-KB: n, joka saattaa korreloida MDR-1-geenin ilmentymisen [16], [17].

NF-KB esiintyy yleensä heterodimeeri p50 ja p65-polypeptidit sitoutuneena sytoplasmaan jonka inhibiittoriproteiinista IKB [36], [37]. Seuraavat solujen stimulaatio joukko sytokiinejä tai taudinaiheuttajien, IKB-fosforyloituu että IKB-kinaasin (IKK) kompleksi seriinissä 32 ja 36, ​​sitten hajoavan 26S proteosomin. Sen jälkeen, NF-KB siirtyy tumaan,, jossa se sitoutuu säätelyelementtejä promoottorialueella kohdegeenien. On näyttöä siitä, että NF-KB oli alavirtaan COX-2 [38] kuitenkin, tutkimukset ovat osoittaneet, että alas-säätely COX-2 ilmaisun voisi estää NF-KB [39], [40]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että sinomenine ja selekoksibi tukahdutti NF-KB-reitin MDR-Caco-2-solut (Fig. 6).

Yhteenvetona, olemme kehittäneet monilääkeresistenteistä Caco-2- (MDR-Caco-2) solulinja altistetaan Caco-2-solujen kasvavien pitoisuuksien doksorubisiinin, joka yli-ilmentää sekä P-gp: n ja COX-2. Sinomenine vaimentua ilmaus MDR1-mRNA: n ja proteiinin kautta NF-KB-reitin, ja esti ilmentyminen COX-2, joka korreloi P-gp ilmentymistä. Tutkimuksemme siis tarjonnut uusia oivalluksia sääntelyn P-gp ilmentymistä monilääkeresistenteistä solujen ja ehdotti uusia mahdollisuuksia strategioita käänteinen P-gp-välitteisen syövän huumeiden vastarintaa. Kuitenkin muut signalointi molekyylit voivat myös osallistua sääntelyn aktiivisuuden MDR-Caco-2-solut ja siten edistää monilääkeresistenttien kehitystä. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään, miten COX-2 NF-KB: n ja muiden signalointimolekyylejä vuorovaikutuksessa kehittämisessä P-gp-välitteisen monilääkeresistenttien syöpäsoluissa.