Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeavaan K-ras signalointi vastaa liipaisu immunologisia vasteita ja tulehdus-odotuksiin kasvaimien syntyyn. Interleukiinit IL-17, IL-22 ja IL-23 on raportoitu erilaisia ​​pahanlaatuisia sairauksia, mutta tarkka mekanistinen merkitys näiden molekyylien vielä selvittämättä. Koska rooli K-ras ja osallistumista interleukiinien peräsuolen kasvainten synnyssä, tutkimustyötä raportoidaan ensimmäistä kertaa, mikä osoittaa, että ilmennetty eri interleukiini IL-17, IL-22 ja IL-23 arvot liittyvät K-ras esiintymislavan erityinen muoti pitkin peräsuolen syövän etenemistä. Erityisesti a) vaikutus K-ras signalointi tutkittiin yleistä ilmaisua interleukiinien potilailla, joilla peräsuolen syöpä ja terveiden verrokkien, ja b) yhdistyksen välille perustettiin mutantti K-ras ja sytokiinien GM-CSF: n ja IFN-γ. Tulokset osoittavat, että tietyt interleukiinit ilmentyvät differentiaalisesti K-ras positiivisilla potilailla ja käyttö K-ras: n estäjä Manumycin pienentää sekä interleukiini tasoilla ja apoptoosin Caco-2-soluja estämällä solujen elinkelpoisuus. Lopulta tulehdus-ajettu GM-CSF: n ja IFN-γ tasot moduloidaan interleukiini ilmaisun kasvain potilailla, interleukiini ilme suolistossa ja syöpäkudoksen välittämä poikkeava K-ras signalointi. Yhdessä havainnot a) osoittavat, että interleukiini ilmentyminen vaikuttaa ras signalointi ja erityisiä interleukiinit pelata onkogeenisessä promoottori rooli peräsuolen syöpä, korostaen molekyylitason yhteydestä tulehduksen ja kasvaimen kehittymisen, ja b) korostavat kudottu molekyyli korrelaatiot kuten johtaa uusiin hoitomenetelmät tulevaisuudessa.

Citation: Petanidis S, Anestakis D, Argyraki M, Hadzopoulou-Cladaras M, Salifoglou A (2013) Differential ilmentäminen IL-17, 22 ja 23, eteneminen peräsuolen syövän potilailla, joilla on K-ras mutaatio: Ras Signaalin esto ja Crosstalk GM-CSF: n ja IFN-γ. PLoS ONE 8 (9): e73616. doi: 10,1371 /journal.pone.0073616

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2013 Hyväksytty: 23 heinäkuu 2013; Julkaistu: 06 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Petanidis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osarahoittaa EU-ESF ja kreikkalainen kansallisten varojen kautta NSRF-Heracleitus II ohjelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on toiseksi yleisin syöpä maailmassa. Nykyisin useimmissa kehitysmaissa ei ole järjestäytynyt seulontaa ja diagnostisia ohjelmia [1], [2]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että paksusuolen ja peräsuolen syöpä on monitekijäinen sairaus, jossa ilmentyminen monia erityisiä geenejä, kutsutaan onkogeenejä tai tuumorisuppressorien, on poikkeuksellisen muuttunut [3]. Tässä suhteessa PIK3CA geeni, joka on mukana PI3K /AKT signalointireitin, on säädelty kolorektaalisyövässä. Tuumorisuppressorigeenin fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) on alassäädetty johtuu geneettinen mutaatio tai deleetio [4]. Kuitenkin molekyylimekanismeja peräsuolen syövän synnyn jäävät selvittämättä. Kohti tällaisia ​​toimia, on tärkeää tunnistaa erityisiä molekyylimarkkereiden havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi mekanismeja, jotka auttavat peräsuolen syövän synnyn. Yksi tällainen edustava biomarkkereiden on K-ras, onkogeenin kanssa guanosiinitrifosfaatin (GTP) sitovat ominaisuudet [5]. Koska sen kyky olla vuorovaikutuksessa keskeisten molekyylejä kuten signaalin anturin ja aktivaattori transkription (STAT), fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K), ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK), K-ras-geenin tuottaa olennainen toiminto solunjakautumisen solujen kasvuun ja erilaistumiseen. Siten mutaatiot K-ras-geenin (erityisesti yhden nukleotidin substituutioita) on liitetty useimpien kasvainten, mukaan lukien keuhkojen adenokarsinooma, keuhkosyöpä, duktaalikarsinooma haiman, ja kolorektaalisyövän [6].

viime vuosina, todisteet ovat osoittaneet, että interleukiinit suorittavat tärkeitä tehtäviä kasvainten kehittymiseen, solujen erilaistumista, tulehduksen ja etäpesäkkeiden [7], [8]. Tässä suhteessa IL-17, joka on suurelta osin tuottavat aktivoidut muisti-T-lymfosyyttien, stimuloi sekä luontaisen immuniteetin ja isännän puolustukseen, ja sillä on tärkeä rooli tulehdussairauksien, autoimmuunisairauksien ja syöpä. Tarkemmin, IL-17 indusoi ilmentymisen tumatekijä-kappa B (NF-KB), kemokiinit CXCL8, CXCL6 ja CXCL1, kasvutekijät G-CSF, GM-CSF (granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä), IL-6: ja adheesiomolekyylien (ICAM-1), joka johtaa täydennetty neutrofiilien kertymistä, granulopoeisis, ja inflammatoriset vasteet [9], [10]. Toisaalta, IL-22 toimii välittäjänä solun tulehdusreaktioita aktivoimalla solunsisäisten kinaasien (JAK1, Tyk2, ja MAP-kinaasien) ja transkriptiotekijöitä kuten STST3 [11]. Lisäksi IL-22 on anti-apoptoottisen ja tuumorigeeniset toimintoja, joissa viimeaikaiset tiedot osoittavat, että yli-ilmentyminen, joka molekyylin suojaa keuhkosyövän solulinjoja apoptoosin kautta) aktivointi STAT3 ja sen alavirran anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl- xL, ja b) inaktivoituminen ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasien [12]. Samoin IL-23: lla on keskeinen rooli kroonisissa suolistotulehdus ja sen ylössäätöä in pahanlaatuinen kudosten yhtäläisyyksiä täydennetty tasot ”metastaattinen biomarkkereiden” matriksimetalloproteinaasi MMP-9, tuumorinekroositekijä TNF-alfa, ja kohonneeseen angiogeneesin [13 ], [14], [15].

pyrki löytää molekyylien välisiä yhteyksiä tuumorigeenisemmiksi ja immunologiseen tulehdus reittejä syövän fysiologia, tutkimus käynnistettiin meidän labs koetin osaksi vuorovaikutusta ja mahdollisten yhteen kietoutuneita roolit edellä mainittu molekyyli tavoitteita voisi olla peräsuolen monivaiheinen syövän etenemistä. Tätä varten me raportoimme tässä ensimmäistä kertaa, että a) erityiset interleukiinit ovat säädellään ylöspäin kolorektaalikarsinoomasta verrattuna terveisiin peräsuolen kudoksiin, b) interleukiinit yli ilmentyy kaikissa K-ras potilaat ja voi edistää solujen kasvua ja estävät solujen apoptoosin Caco-2 peräsuolen syövän solujen läpi ras-signalointireitin, c) käyttö K-ras -estäjä Manumycin vähenee interleukiini tasoja, ja vähentää apoptoosia Caco-2 peräsuolen syövän soluja estämällä solujen elinkelpoisuuden, ja d) GM-CSF: ja IFN-γ (gamma-interferoni) moduloidaan kautta interleukiini ilmaisu joko positiivisesti tai negatiivisesti. Kollektiivinen havainnot valottaa päälle toiminnallisen yhdistyksen välillä interleukiinit tulehduksessa, ras-signalointi ja peräsuolen kasvaimen kehittymisen ja näin mahdollisesti avustaisivat kehittämässä tulevaisuuden syövän havaitsemiseen ja terapeuttisia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Tämä tutkimus suoritettiin hyväksyntää Institutional Review Board on AHEPA sairaalan Medical School, Thessalonikin Aristoteles-yliopisto. Paperi täyttää PLoS One periaatteisiin ihmiskoe. Kirjallinen suostumus saatiin jokaiselle potilaalle. Kirjalliset hyväksynnät saatiin, ennen leikkausta, potilaiden vapaaehtoisesti mukana käyttö kudosten yksinomaan tutkimustarkoituksiin. Potilaat oli lukenut ja ymmärtänyt potilastietoja asiakirjaa, ja tavoitteet ja menetelmät Tutkimuksen oli täysin selitetty heille. Potilaat mukana oli antanut kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen tekijöille tämän käsikirjoituksen julkaistavaksi näiden tietojen. Kliinisen tutkimuksen suorittanut ohjeiden mukaan ilmaistu Helsingin julistuksen.

reagenssit

Manumycin A Sigma (Sigma Saksa, Europe). DMEM-Hepes, PBS: ssä (fosfaatti-puskuria suolaliuos), FBS (naudan sikiön seerumia), ja trypsiini-EDTA reagenssit hankittiin Invitrogen (Invitrogen, Darmstadt, Saksa). DMSO (dimetyylisulfoksidi) ja Tris-EDTA: ta (Tris-etyleenidiamiinitetraetikkahappo) ostettiin Applichem (Applichem, Darmstadt, Saksa). K-ras (A-18) vuohen polyklonaalinen IgG-piparjuuriperoksidaasi (HRP), hiiren anti-vuohi-IgG-HRP, ja GAPDH (L-20), vuohen polyklonaalisen IgG-HRP-vasta-aineiden Western blot -analyysiin saatiin Santa Cruz ( Santa Cruz, Kalifornia, USA). Ihmisen IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF: n ja IFN-γ havaittiin käyttäen anti-ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, Santa Cruz. Valmistamiseksi vesiliuoksen kantaliuosta (1,0 Μ), Manumycin A liuotettiin 10 mM Tris, pH 7,4. Manumycin varastoliuos liuos suodatettiin 0,22 um: n ruiskun suodattimen ja sitten eriin ja säilytetään pimeässä huoneenlämpötilassa. Tris-EDTA (TE) -puskuria valmistettiin 1 M Tris, pH 8, ja 100 mM EDTA kantaliuosta. Lopulliset pitoisuudet olivat 50 mM Tris ja 1 mM EDTA. Näin valmistettua varastoliuosta suodatettiin läpi 0,22 um: n suodattimen ja sitten eriin ja säilytetään pimeässä huoneenlämpötilassa.

Potilaat

yhteensä 92 peräsuolen syöpä (CRC) potilasta, 37-88 vuotiaita, olivat peräisin AHEPA Hospital, Medical School, Thessalonikin Aristoteles-yliopisto (taulukko S1). Näistä potilaista 28 harboured K-ras-mutaatioiden (24 kanssa G12V ja 4 kanssa G12D). Nämä potilaalle tehtiin resektio peräsuolen syöpä (vaiheessa B1-D) välillä 2009 ja 2012. Lisäksi 56 tervettä vapaaehtoista, jotka a) täyttävät vaatimukset, joilla Hyväksytty sukupuolen ja samanikäisiä kanssa näytteitä CRC potilaiden, ja b) ei esiintynyt paksunsuolen adenoomia, valittiin valvontaa. Potilaat, joilla on tulehdustiloja, kuten tartuntatautien tai kollageenin tautien, jätettiin pois. Kaikki potilaat luokiteltiin UICC vaiheessa luokituksia käyttäen resekoitu näytteitä. Verinäytteet otettiin laskimosta ennen peräsuolen leikkausta. Jokainen näyte sentrifugoitiin 3000 g: ssä 5 min, ja jäädytettiin sitten -80 ° C: ssa analyysiin asti.

DNA: n ja RNA: n uuttaminen

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut potilaan kasvaimen kohdat valittiin patologi diagnoosin varmistamiseksi ja määritellä kasvaimen rikastettu alueita leikkely. Eristetty syövän solut hajotettiin puskurissa (0,2 M Tris HCI, 0,5 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% SDS, 1 M natriumasetaatti), joka sisälsi proteinaasi K 60 ° C: ssa 72 tunnin ajan ja DNA uutettiin käyttämällä Qiagen DNA ja RNA Purification Kit valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen, Ateena, Kreikka). RNA-uutto, syövän solut suspendoitiin uudelleen 400 ui RNA lyysipuskuria (0,5 M EDTA, 10% SDS, 1 M Tris, pH 7,5), johon oli lisätty 300 mg proteinaasi K ja inkuboitiin 60 ° C: ssa 16 tunnin ajan, kunnes kudos oli on liuennut täydellisesti. RNA puhdistettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen, Paisley, UK), sen jälkeen käsiteltiin DNaasi välttää genomisen DNA-kontaminaation ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA)

Ennen määrityksiin, jäädytetyt kudosnäytteet saatettiin huoneenlämpötilaan. Sen jälkeen ne pestiin isotonisella liuoksella natriumkloridia (Sigma), leikataan paloiksi, punnittiin ja homogenisoitiin 4 ° C: ssa lyysipuskuria (50 mM HEPES, pH 7,4, 5 mM CHAPS, 5 mM 1 DTT). Näytteen käsittely tapahtui massa mittakaavassa 1 g kudosta /10 ml lyysipuskuria. Homogenoitu kudokset pysyi -20 ° C: ssa 24 tuntia ja sitten sentrifugoitiin 20000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit (10 ui per kuoppa) käytettiin kvantitatiivista vaiheessa erityisiä (B1, B2, C1, C2, D) havaitaan IL-17, IL-22 ja IL-23 avulla entsyymi-immunologiset määritykset päässä Cytoscreen (BioSource International , Camarillo, CA). Herkkyyden varten ELISA, kuten valmistajan määrittelemä, olivat 9 pg /ml (IL-17), 8 pg /ml (IL-22) ja 4 pg /ml (IL-23). Manumycin Hoito on sovellettu kaikkiin vaiheessa D potilaan näytteitä kaikkiin kolmeen interleukiinit tutkittu.

RT-PCR (RT-PCR) B

RT-PCR suoritettiin potilaiden kudosnäytteistä IL -17, IL-22, IL-23, GM-CSF: n ja IFN-γ. GAPDH (glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi) käytettiin sisäisenä kontrollina. Monistaminen suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui reaktiota kohti, joka sisälsi 10 ui PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 5 ui alukkeet (1 pmol /ul), ja 5 ui cDNA: ta (40 ng RNA: ta) . RT-PCR-alukkeiden IL-17, 1L-22, IL-23, GM-CSF, IFN-γ ja GAPDH on lueteltu taulukossa S2. PCR-reaktion parametrit asetettiin seuraavasti: 95 ° C: ssa 15 minuuttia, jota seurasi 40 PCR-sykliä reagoida 94 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Sulamiskäyräanalyysi monistustuotteiden suoritettiin lopussa kunkin PCR-reaktion nostamalla lämpötilaa 60-95 ° C: n lämpötilassa siirtyminen nopeudella 0,1 ° C sekunnissa, jotta voimme erottaa aidot tuotteet epäspesifisiä tuotteita ja aluketta dimeerejä. PCR-tuotteet olivat myös erotettiin 1,5% agaroosigeelillä visualisoida muodostumista oikean PCR-tuotteita. Suhteellinen kvantifiointi (RQ) geeni-ilmentymisen on laskettu olettaen 100% tehokas PCR, jossa kukin n CT-arvo reaktioiden normalisoitiin GAPDH mRNA: n ilmentymisen.

K-ras mutaatio havaitseminen ja Sequence Analysis K-ras G12 Kodonissa

Kaikki potilaan kasvain kudosnäytteet olivat snap-jäädytetty ja säilytetään nestetypessä ennen käyttöä. Parafiinileikkeet valmistettiin sitten ja yksi osa kustakin tapauksessa valittiin hematoksyliini-eosiini-värjäys. Kokenut patologi analysoi hematoksyliini-eosiini osan vahvistaa läsnäoloa kasvainkudoksen. Sen jälkeen, kudosnäytteitä vähintään viisi perättäistä leikkeitä macrodissected sen varmistamiseksi, että näytteet sisälsivät vähintään 80% kasvainsoluja. DNA eristettiin näistä kudosnäytteitä käyttäen Qiagen DNA: n uuttamis- kittiä (Qiagen, Berliini, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Myöhemmin mutaatiot kodonissa 12 K-ras: n eksonissa 1. havaittiin näissä genomisista DNA-näytteistä PCR-pohjainen suoralla sekvensoinnilla. PCR-alukkeet K-ras käytettiin K-ras-Forward: 5′-AAGGCCTGCTGAAAGTGACTG-3 ’ja K-ras-Reverse: 5′-CTGGTGCAGGACCATTCTTCAG-3’. PCR-reaktio suoritettiin kokonaistilavuudessa 50 ui, joka sisälsi 150 ng uutettu genomi-DNA: ta. PCR-monistus-olosuhteet olivat seuraavat: alkudenaturaatio 94 ° C 1 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 55 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s, jonka lopullinen ekstensiovaihe 72 ° C: ssa 5 min ajan TP-600-lämpösyklilaitetta (TaKaRa). PCR-tuotteet analysoitiin sitten käyttäen 2,5% agaroosigeelielektroforeesilla ja puhdistettua edelleen suoralla DNA-sekvensoinnilla kautta ABI-3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Europe).

immunohistokemiallinen analyysi IL-17, IL-22, ja IL-23

parafinoitu osa ihmisen paksusuolen kudos- potilailla, joilla on kolorektaalisyöpä, käsiteltiin anti-humaani IL-17, anti-humaani IL-22, ja anti-humaani IL-23 monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Värjäys hiiren IgG1-isotyyppiä on käytetty negatiivisena kontrollina. Kuvat saatiin läpi Carl Zeiss mikroskooppi käyttäen kuva-analyysi-ohjelmisto (Carl Zeiss, Berliini, Saksa).

Western Blot analyysi IL-17, IL-22 ja IL-23

Kerätyt peräsuolen potilaan kudosnäytteet pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja hajotettiin 100 ul: aan jääkylmää lyysipuskuria per 1 x 10

6 solua. Lysaatit inkuboitiin jäillä 10 min, vorteksoitiin 45 s ja pidettiin jäillä vielä 10 minuuttia. Seuraavat sentrifugoimalla 14000 g ja 4 ° C: ssa 15 minuutin aikana, kerättiin supernatantti, ja proteiinit kvantitoitiin Bradfordin menetelmällä. Lysaatti proteiinit liuotetaan 6xLaemmli näytepuskuriin erotettiin (30 ug /kaista) käyttämällä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (10% akryyliamidi) ja elektro-siirrettiin PVDF (polyvinylideenidifluoridi) kalvoja. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa TBST-puskurissa (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,6), membraaneja inkuboitiin 90 min sopivaa laimennosta primaarista vasta-ainetta TBST: hen plus 1% rasvatonta maitoa. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin sopiva laimennus piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa TBST: ssä plus 1% rasvatonta maitoa. Lopuksi blotit kehitettiin ECL (tehostettu kemiluminesenssi) ja digitoitu kautta BioSpectrum 500 Imaging System. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina kaikissa kokeissa.

ELISA SPOT GM-CSF: n ja IFN-γ

IFN-γ-tuottavien solujen potilaan verinäytteet kvantitatiivisesti IFN-γ ELISPOT kit (Diaclone, Besancon, Ranska) valmistajan ohjeiden mukaisesti, vähäisin muutoksin. Kalvot päällystettiin ihmisen IFN-γ-vasta-aineita ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Sitten 1 x 10

5 PBMC (perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa) peräisin peräsuolen syöpäpotilasta lisättiin levyille ja inkuboitiin 26 h 37 ° C: ssa 5% CO

2. Solut poistettiin ja biotinyloidun vasta-aineita ihmisen IFN-γ lisättiin kalvoille. Pilkut laskettiin automaattisella levyn laskurin Applied Biosystems (Applied Biosystems, Europe).

GM-CSF tuottavat solut PBMC: istä potilaiden kvantitoitiin käyttäen GM-CSF ELISPOT-kittiä (R seoksen annettiin inkuboitua 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan 5% CO

2 kostutetaan kammio, ja sitten värjäämällä suoritettiin. Havaittu kautta Carl Zeiss fluoresenssi mikroskooppi, jossa detektio 570 nm: ssä, normaalit solut eivät värjätään taas apoptoottiset solut on vahva punainen fluoresenssi.

Tilastollinen analyysi

t-testiä ja yksisuuntaista ja kaksisuuntainen ANOVA testejä käytettiin tilastollisia analyysejä tiedoista. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad 5,1 (GraphPad, La Jolla, USA). Tapaukset, joissa P-arvojen 0,05 tai 0,01 katsottiin tilastollisesti merkitsevä (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

Tulokset

interleukiini ja K-ras korrelaatio in peräsuolen syövän Stage Progression

tasot IL-17, IL-22 ja IL-23 syöpäpotilailla ja terveillä verrokeilla määritettiin käyttäen ihmisen interleukiini ELISA Immunoassay, Western Blot, ja RT- PCR-tekniikoita.

IL-17

Aluksi, IL-17 ekspressiotasot mitattiin peräkkäisissä vaiheissa paksusuolisyövän ja terveillä verrokeilla kudoksissa käyttäen ELISA. Tulokset osoittivat, että IL-17 ekspressiotasot olivat yleisesti korkeampia K-ras positiivinen syöpä kudoksiin (170 pg /ml B1 247 pg /ml D) verrattuna K-ras negatiiviset näytteet (150 pg /ml B1 225 pg /ml D) (P 0,05) (kuvio 1A). Analyysi IL-17-proteiinin tasot pitkin syöpä vaiheessa B1-D potilailla osoitti, että ne olivat huomattavasti korkeammat verrattuna a) vastaava tasoja K-ras negatiivisella potilaalla (62% vs. 38%), ja b) terveiden verrokkien ( 62% vs. 16%) (kuvio 2A). Lisäksi mRNA-tasolla IL-17 määritettiin K-ras positiivista näytettä. Merkittävä nousu mRNA IL-17 tasot havaittiin (kuvio 2B). Jotta voidaan tutkia vaikutusta K-ras-mutaatio (G12V) interleukiinin lauseke, ras farnesyylitransferaasin estäjä Manumycin A levitettiin normaali ja vaihe D potilaan näytteitä, koska valikoiva yli-ilmentymisen että interleukiini kulloisessakin. Lopussa on Manumycin Hoito (10 μΜ), merkittävä lasku (P 0,001) IL-17-tasojen havaittiin (kuvio 1A). Samanlainen lasku K-ras myönteinen vaihe D näytettä on esimerkkinä proteiini ja mRNA-tasot (P 0,001 proteiinin tasot, P 0,01 mRNA) (kuvio 3A-B). Kokeissa osoittavat, että on tärkeää mutantti K-ras-signalointia IL-17 ilmentyminen.

määritys interleukiini (A) IL-17, (B) IL-22, ja (C) IL-23-pitoisuudet (pg /ml) kasvainkudoksessa K-ras positiivinen, K-ras negatiivinen paksusuolen syöpäpotilaiden ja verrokeilla eri vaiheissa paksusuolen syövän etenemisessä. Manumycin A levitettiin normaali ja vaihe D potilaan näytteitä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD näytteiden kunkin ryhmän mukana. Suuri palkki osoittaa vertailun potilaan vaihe D ja vaihe D + Manumycin käsittely näytteitä.

(A) Proteiinin ilmentymisen tasoja IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, ja IFN -γ. GAPDH käytettiin lastaus kontrollina Western blot-analyysi. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Densitometrinen analyysi kunkin proteiinin taso laskettiin keskiarvo kolmesta kokeesta. Kukin arvo ilmaistiin suhteena mitatun proteiinin GAPDH tason (P 0,001). (B) mRNA: n ilmentymisen tasoja IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, ja IFN-γ paksusuolen syövän kudoksista suoritettiin RT-PCR-analyysillä. 5 ug kokonais-RNA eristettiin syöpäkudoksissa. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Effect of Manumycin Hoito (10 uM) on (A) mRNA: n ilmentymisen tasoja IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, ja IFN-γ K-ras positiivinen peräsuolen syövän potilaille suoritettiin RT-PCR-analyysillä. Potilaan vaiheessa D paksusuolen soluja käsiteltiin Manumycin A (10 uM) 24 tunnin ajan, ennen kuin RT-PCR: llä. 5 ug kokonais-RNA eristettiin käsiteltiin paksusuolen solut. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) proteiini ekspressiotasot IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, ja IFN-γ K-ras positiivinen peräsuolen syövän potilaille suoritettiin Western Blot -analyysillä. Potilaan vaiheessa D paksusuolen soluja käsiteltiin Manumycin A (10 uM) 24 tunnin ajan, ennen kuin proteiini kvantifiointiin. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD kolmen erillisen kokeen.

IL-22

Tissue IL-22 tasot olivat merkittävästi esille K-ras negatiivinen ryhmässä verrattuna potilaiden varustettujen K-ras-mutaatio (94 pg /ml vs. 80 pg /ml B1 216 pg /ml vs. 150 pg /ml D) (P 0,05 B1-C1, P 0,01 C2-D) ( kuvio 1 B). Lisäksi proteiini ja mRNA-tasoja IL-22 oli merkittävästi korkeampi K-ras negatiivinen ryhmä. Erityisesti näistä potilaista, proteiini IL-22-tasot koholla K-ras negatiivinen ryhmässä (84% vs. 60%) (P 0,001) (kuvio 2A). Lisäksi IL-22-mRNA tasot K-ras positiivinen ryhmä olivat alhaisemmat verrattuna K-ras negatiivinen ryhmä (P 0,001) (kuvio 2B). Lisäämällä Manumycin A 10 μΜ normaaliksi ja vaiheessa D potilaan näytteitä vähensi IL-22 tasoa (P 0,001 proteiinin tasot, P 0,01 mRNA) (kuvio 1 B, 3A-B).

IL-23

ELISA, mRNA ja proteiini-analyysi paljasti, että K-ras positiiviset potilaat osoittivat kasvua IL-23 ilmentyminen verrattuna K-ras negatiivinen (P 0,01 B1, P 0,05 B2-D) ja terveet kontrolliryhmän (P 0,001) (kuvio 1 C, 2A-B). Voit selvittää korrelaatio K-ras läsnäolo ja IL-23 ilmentyminen, Manumycin A lisättiin normaalia ja vaihe D potilaan näytteitä ja IL-23-proteiinin ja mRNA tasoilla K-ras positiivisilla potilailla määritettiin (kuvio 1 C, 3A-B) . Tulokset osoittavat, että esto K-ras aiheuttaa merkittävän laskun IL-23 tasossa (P 0,001 proteiinin tasot, P 0,01 mRNA), luoden näin korrelaatiota K-ras ja IL-23 tasoja.

GM-CSF

Tutkitaan mahdollisia mekanismeja GM-CSF osallistumista eri vaiheissa paksusuolen syövän synnyn, ilmaus GM-CSF seurattiin ja kvantifioitiin, ELISPOT, Western Blot, ja RT- PCR-menetelmillä. Jotta GM-CSF ELISPOT, solut juuri eristettyjä PBMC: t valmistettiin ja käytettiin GM-CSF: n havaitsemiseen. Tulokset osoittavat asteittainen nostaminen GM-CSF-tasot aikana paksusuolensyöpä etenemisen, erityisesti vaiheissa C2 ja D (P 0,001) (Kuva 4A, Kuva S1). Lisäksi GM-CSF-proteiinin ja mRNA-tasot olivat merkitsevästi korkeammat K-ras positiivinen, vaiheen D potilaat (P 0,001) (kuvio 2A-B) verrattuna K-ras negatiivinen ja terve verrokeilla, mikä osoittaa indusoi GM-CSF aktivointi aikana paksusuolensyöpä vaiheen etenemisen tumorigeneesin (Kuva 4A, Kuva S1). Havaitut tulokset ovat yhtä mieltä viimeaikaiset havainnot osoittavat, että on tärkeää GM-CSF K-ras positiivisia paksusuolensyöpä tuumorigeenisia prosesseja (katso alla). Manumycin A lisättiin normaalia ja vaiheessa D potilaan näytettä (kuvio 4A) ja GM-CSF-proteiinin ja mRNA-tasot K-ras positiivisilla potilailla määritettiin (kuvio 3A-B). Tulokset osoittavat, että esto K-ras aiheuttaa merkittävän laskun GM-CSF-mRNA ja proteiini tasoilla (P 0,001 proteiinin tasot, P 0,05 mRNA), luoden näin korrelaatio kahden molekyylin.

(A) GM-CSF: n ELISPOT-PBMC saatiin potilailta ennen leikkausta. Mononukleaarisolut stimuloitiin ja tutkittiin GM-CSF: n eritystä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD eri ryhmiin. (B) IFN-y-ELISPOT-PBMC saatiin potilailta ennen leikkausta. Mononukleaariset solut stimuloitiin ja tutkittiin IFN-γ eritystä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD eri ryhmiin. Suuri palkki osoittaa vertailun potilaan vaihe D ja vaihe D + Manumycin käsittely näytteitä.

IFN-γ

Jotta voidaan tutkia vaikutusta K-ras-mutaation IFN-γ etenemisen aikana vaiheissa peräsuolen syövän, ilmentymisen taso IFN-γ määritettiin. Kuten kuvassa (kuva 4B, 2A-B, kuva S1), IFN-γ on säädellä vähentävästi paksusuolensyöpä potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin. Lisäksi, on merkittävä lasku IFN-γ-proteiinin ja mRNA: n välillä K-ras negatiivisia ja K-ras positiivisen henkilön (P 0,001), mikä muistuttaa vaikutusta K-ras signaloinnin IFN-y down-regulation . Lisäksi hoito Manumycin aiheutti nousua IFN-γ ekspressiotasot, kuten on osoitettu Western Blot ja RT-PCR-kokeet (P 0,001 proteiinin tasot, P 0,01 mRNA) (kuvio 3A-B). Tulokset viittaavat siihen, K-ras palautetta signalointi mekanismi IFN-γ, jolla on tärkeä rooli paksusuolen syövän syntymistä.

Manumycin vaimennusta elinkelpoisuuden ja Cell Growth of Caco-2 solut

havaitut tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa, että ras: n estäjä Manumycin vähentää solujen elinkelpoisuutta Caco-2 paksusuolen syöpäsoluissa. Tämän seurauksena erityinen muoto inhibiittorin elinkelpoisuudesta koolonkarsinoomasoluissa tutkittiin inkuboinnin jälkeen alustassa, joka sisältää Manumycin A pitoisuudet ovat välillä 10-300 uM 24 tunnin ajan. Soluja inkuboitiin väliaineen puuttuessa Manumycin toimivat kontrolleina. Työllisyyden MTT-määritystä osoitti, että inhibitio solujen elinkelpoisuuden kaikissa Caco-2 paksusuolen adenokarsinooma syöpäsoluja testattiin tapahtui annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5A-B). Yksityiskohtaisesti, solujen elinkelpoisuus väheni merkittävästi 90% (10 μΜ) 40% (300 μΜ) (P 0,001), verrattuna kontrolliin. Havaittu kuviot eston funktiona Manumycin Keskittymä paljastaa antituumoriominaisuuksia ras-inhibiittorit K-ras indusoidun paksusuolisyövän signalointia.

(A) MTT-määritys, joka osoittaa Manumycin A syöpäsolujen elinkelpoisuutta Caco-2-soluilla. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Manumycin A 24 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus mitattiin ELISA levylukijalla 570 nm: ssä. Suurennus × 200. (B) Tulokset osoittavat, että Manumycin estää elinkelpoisuutta ihmisen paksusuolen adenokarsinooma Caco-2-soluihin annoksesta riippuvaisella tavalla. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Manumycin indusoi apoptoosia (C) Caco-2 ihmisen paksusuolen adenokarsinooman syöpäsoluja. Caco-2-solujen apoptoosin havaittiin käyttäen TUNEL detektiokokeessa Rochelta. Manumycin a pitoisuus: 10, 50, 100, 200, ja 300 μΜ. Syöpä solulinja altistunut Manumycin A eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan ja värjätään. Red apoptoottisia soluja tarkastella myös Carl Zeiss (Zeiss Europe) fluoresenssimikroskoopilla. Suurennus × 200. (D) Käyrät edustavat kvantitatiivisia tuloksia apoptoosin.