Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yksi piirre kasvain microenvironment on happi vaihtelu, joka johtuu hyper-leviämisen ja epänormaali aineenvaihdunta syöpäsoluja sekä sekavaa neo-verisuoniston. Uudelleenhapetukselle kasvaimia voi aiheuttaa oksidatiivisen stressin, mikä johtaa DNA-vaurioita ja genomin epävakautta. Vaikka soluvasteiden hypoksia ovat hyvin tiedossa, tiedetään vähän dynaamista vastetta uudelleenhapetukselle. Sen tutkimiseksi, transkription vasteita kasvaimen sopeutumisen uudelleenhapetukselle, rintasyövän MCF-7-solut viljeltiin 0,5% happea 24 h, mitä seurasi 24 tunnin uudelleenhapetukselle normaaleissa happiolosuhteissa. Solut kerättiin 0, 1, 4, 8, 12, ja 24 h aikana uudelleenhapetukselle. Transkription profiili MCF-7-soluissa, kun uudelleenhapetukselle tutkittiin käyttäen Illumina Human-6 v3 BeadChips. Havaitsimme 127 ilmentyvät eri geenejä, joista 53,1% oli säädelty ja 46,9% oli alassäädetty upon uudelleenhapetukselle. Pathway analyysi paljasti, että HIF-1-alfa-transkriptiotekijän verkon ja validoitu tavoitteet C-MYC transkription aktivaatio oli huomattavasti rikastettu näissä differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Näistä geenit, osajoukko kiinnostavia geenejä edelleen vahvistettu kvantitatiivisella käänteis- transkriptio-PCR. Erityisesti ihmisen N-MYC alassäädetty geeni 1 (

NDRG1

) oli erittäin tukahdutetaan päälle uudelleenhapetukselle. NDRG1 liittyy erilaisia ​​stressin ja solujen kasvua sääntelyyn olosuhteissa. Sen määrittämiseksi, onko

NDRG1

on rooli uudelleenhapetukselle, NDRG1 proteiini yli-ilmentyy MCF-7-soluissa. Kun uudelleenhapetukselle, yliekspressio

NDRG1

esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen. Tuloksemme paljasti dynaaminen luonne geeniekspression MCF-7-solujen upon uudelleenhapetukselle ja osoitti, että

NDRG1

on mukana kasvain sopeutumista uudelleenhapetukselle.

Citation: Lai LC, Su YY, Chen KC Tsai MH, Sher YP, Lu TP, et ai. (2011) Down-asetus

NDRG1

Edistää Migration syöpäsolujen aikana uudelleenhapetukselle. PLoS ONE 6 (8): e24375. doi: 10,1371 /journal.pone.0024375

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 05 elokuu 2011; Julkaistu: 30 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Lai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain avustuksilla Kiinasta Medical University, Taiwan (myönnä. 97F008-119; 99F008-308, https://english.cmu.edu.tw/) ja Center geneettisen Medicine, National Taiwan University (myönnä . 99R81400; https://www.cgm.ntu.edu.tw/chinese2007/eng_index.asp), ja National Science neuvoston (Grant No. 98-2320-B-002-044-MY3, http: //web1. nsc.gov.tw/mp.aspx?mp=7). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvainpopulaatiot täytyy voittaa erillisiä microenvironmental esteitä ennen metastasizing muihin elimiin. Invasiivisia syöpiä vuoksi voidaan pitää useita muutoksia fenotyypin heidän mikroympäristöihin. Kaikki kasvain mikroympäristöihin on tunnusomaista ravinteiden puutetta, alhainen pH, ja hypoksia [1]. Nämä muutokset liittyivät perfuusioksi puutteita kiinteiden kasvainten, joka tuli kasvaimen nopeasta kasvusta ja syvästi sekavaa verisuonistossa [2]. On ehdotettu, että kasvain microenvironment on ainutlaatuiset puitteet syövän etenemiseen, mikä edellyttää geneettisiä muutoksia syöpäsoluissa edelleen selviytymistä ja proliferaatiota. Cell rasitukset mikroympäristön, varsinkin hypoksia [3], [4] ja uudelleenhapetukselle [5], [6], saattavat aiheuttaa näitä geneettisiä muutoksia.

alueet hypoksia ovat yhteinen piirre kiinteitä kasvaimia. Happi on rajoittava tekijä, koska epätasapainossa O

2 toimitus ja kulutus [7]. O

2 puutos johtuu riittämätön vasculatures ja happikato peräkkäisissä solukerroksiin distaalisesti aluksen lumenia; samanaikaisesti, on kasvu O

2 kulutus johtuen nopeasta aineenvaihdunnasta syöpäsoluja. Useissa tutkimuksissa on todettu, että hypoksinen kasvaimet olivat pahanlaatuinen ja resistenttejä, ja oli siten huonompi ennuste [8]. Tämä ilmiö on osoitettu useissa kasvaintyypeissä [9], [10].

Lisäksi, happipitoisuus sisällä hypoksinen alue on erittäin vaihteleva. Koska kasvain vasculatures ovat erittäin tehoton ja epävakaa, punasoluja flux on hypoksinen alueille, jolloin reperfuusio tai uudelleenhapetukselle [11]. Uudelleenhapetukselle ei vain lisää hapensaantia vaan myös aiheuttaa oksidatiivista stressiä soluissa. Tämä oksidatiivista stressiä voi vahingoittaa solun makromolekyylien ja johtaa lisääntyneeseen perimän epävakaisuuden [12]. Jos kasvainsolujen hengissä altistumisen jälkeen hypoksian /uudelleenhapetukselle loukkauksia, ne voivat osoittaa nousua maligniteetti [13], DNA yli-monistaminen [14], lääkeresistenssin [15], ja metastaattinen potentiaali [16].

Cellular sopeutuminen hypoksia on hyvin dokumentoitu, mutta vähän tiedetään mukautuva mekanismeja uudelleenhapetukselle. Siksi käytimme genominlaajuisten ilmaisun mikrosiruja tutkia dynamiikkaa transkription profiloinnin aikana uudelleenhapetukselle MCF-7 rintasyövän soluja. Meidän mikrosirujen tulokset osoittivat, että N-MYC alassäädetty geeni 1 (

NDRG1

) oli maksimaalinen vaste uudelleenhapetukselle. Siksi olemme keskittyneet tutkimalla sen toiminnallista roolia uudelleenhapetukselle. Toiminnalliset analyysit paljastivat, että solujen migraatio rintasyövän solujen aikana uudelleenhapetukselle ajoi alas-säätely

NDRG1

. Lopuksi sääntelyn malli

NDRG1

käyttämällä

in silico

analyysi ehdotettiin jatkotutkimuksia varten.

Tulokset

tunnistaminen geenien reagoivat uudelleenhapetukselle

MCF-7 ihmisen rintasyövän soluja inkuboitiin hypoksian (0,5% O

2-pitoisuus) 24 tunnin ajan, ja sitten siirretään normoksia. Solut kerättiin vastaavasti 0 (hypoksia kontrolli), 1, 4, 8, 12 ja 24 h kuluttua uudelleenhapetukselle. Jokainen aikasarja on itsenäisesti tehtävä kolmeen kertaan. Sen jälkeen kun talteen kokonais-RNA, Illumina Human-6 v3 BeadChips käytettiin tutkimaan dynamiikkaa transkription profiloinnin yhteydessä uudelleenhapetukselle. Taustaa korjattu signaaleja normalisoituna kvantiili normalisointi algoritmi. Jotta voitaisiin tunnistaa eri tavoin ilmentyvien geenien, Studentin t-testiä käytettiin tutkimaan ekspressiotasoja aina pisteen jälkeen uudelleenhapetukselle verrattuna, että aika nolla. Geenit reagoi uudelleenhapetukselle valittiin valitsemalla geenejä, joiden keskiarvo

P

-arvo tiettynä ajankohtana oli 10

-4. Kaikkiaan tunnistimme 127 geenejä, joiden transkriptipitoisuuksissa poikkesivat merkittävästi aikaa nolla. Heistä 53,1% oli säädelty ja 46,9% oli alassäädetty upon uudelleenhapetukselle. Useimmat näistä geeneistä (n = 112) havaittiin vain yhdessä ajankohtana, mutta 13 havaittiin kahdessa ajankohtina, ja kaksi geeniä tunnistettiin yli kaksi ajankohtina.

Seuraavaksi pääkomponenttianalyysi ( PCA) levitettiin tutkia toistettavuus eri rinnakkaisnäytteiden ja ajat, jolloin geenit aktivoituivat. Kuten kuviossa 1a, jäljittelee saman ajankohtana yhteen yhdessä, mikä osoittaa korkea toistettavuus tietomme. Lisäksi, eri ajankohtina jaettu peräkkäin mukaan aikaa alle uudelleenhapetukselle. Ajankohtina 8 h, 12 h, ja 24 h oli ryhmitelty yhteen, mikä osoittaa, samanlaisia ​​geeniekspressiomalleja myöhempinä ajankohtina.

(a) Pääkomponenttianalyysi (PCA) O

2-reagoiva geenejä MCF7-soluissa aikana 24 h uudelleenhapetukselle hypoksian jälkeen. Akselit ovat kaksi ensimmäistä pääkomponentit (PC), joka voidaan selittää useimmat geeniekspressioprofilointi. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kunakin ajankohtana. Eri muodot edustavat eri rinnakkaista; eri värejä edustavat eri ajankohtina. (B) määrä O

2-reagoivaa geenejä kussakin aikapisteessä aikana uudelleenhapetukselle. Sekä säädelty ja alas geenien piirretään ajan funktiona. Mustat palkit osoittavat määrä geenejä, jotka tunnistettiin ensimmäisen kerran, kun taas harmaat palkit ilmaisevat määrä geenejä, jotka tunnistettiin aikaisemmin pistettä. (C) suhteellinen ilmentyminen profiilit O

2-reagoiva geenien jälkeen siirtymässä uudelleenhapetukselle. Ilmaisu arvoja kussakin aikapisteessä normalisoitiin että aikaa nolla. Mittakaavapalkki vasemmalle tarkoittaa 20 geenejä, ja väri alareunassa ilmaisee asteen geenin ilmentymisen muutoksen suhteessa aikaan nolla. (D) Kvantitatiivinen RT-PCR validointi kymmenen O

2-reagoivaa geenien niiden aikoina maksimaalisen vasteen.

Dynaaminen vasteita geenien ilmentymisen profilointi upon uudelleenhapetukselle

kvantitatiiviseksi luonnehtivat O

2-reagoivaa geenejä kussakin aikapisteessä aikana totuttamiseksi uudelleenhapetukselle, tilastollinen analyysi (Studentin

t

-testin) kunkin aikapisteen ajan funktiona 0 haettiin kutakin geeniä. Määrä geenejä, jotka olivat merkittävästi erilaiset (

P

0,0001) päässä hypoksia ohjaus piirrettiin kuvassa 1b. Numerot O

2-reagoiva geenejä, mukaan lukien sekä ylä- ja alas geenien, olivat 0 1 h, 17 4 h, 44 8 h, 49 klo 12 h ja 35 24 tuntia. 8 h, vain 7% geenien (3/44) oli tunnistettu 4 tuntia, kun taas 22% geeneistä (11/49) 12 h oli tunnistettu 4 tai 8 tuntia. Näin ollen tämä tulos osoitti, että transkription vasteita aktivoitiin välillä 8 ja 12 tunnin kuluttua uudelleenhapetukselle, ja sitten vähentynyt 24 tunnin kuluttua uudelleenhapetukselle.

Jotta ymmärtää ilmaisun profiilit näiden O

2-reagoiva geenien , niiden ilmentyminen arvot kussakin aikapisteessä normalisoitiin, että aika 0 (kuva 1c). Heatmap osoitti, että yleensä, intensiteetti ylä- tai alas geenien lisääntynyt solujen oleskellut alle uudelleenhapetukselle. Seuraavaksi 10 geenien kanssa suurin ilmentyminen muuttuu kun uudelleenhapetukselle valittiin vahvistamaan microarray tuloksia käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR. Kuten on esitetty kuviossa 1 d, ilmaisu arvot näiden geenien, paitsi yksi, ajanhetkellä, jossa maksimaalinen vaste oli hyvin sopusoinnussa microarray tuloksia.

Pathway analyysi geenien reagoivat uudelleenhapetukselle

jotta ymmärtää mikä reittejä olivat mukana sopeutumista uudelleenhapetukselle, polku analyysi suoritettiin käyttäen NCI-Nature Pathway Vuorovaikutus Database [17]. Niistä 127 tunnistettu geenejä, polku analyysi paljasti, että odotetusti kaikkein merkittävästi (

P

0,01) rikastettu polku oli HIF-1-alfa transkriptiotekijän verkko, ja toiseksi merkittävin koulutusjakso on validoitu tavoitteet C-MYC transkription aktivaation (taulukko 1). Lisäksi tutkia mikä polku oli aktivoitu kullakin ajanhetkellä, polku analyysit tehtiin erikseen käyttäen O

2-reagoivaa tunnistettujen geenien kunakin ajankohtana. Tulokset osoittivat, että geenit aktivoituvat 8 h olivat mukana validoitu tavoitteisiin C-MYC transkription aktivaation (taulukko 1). Geenit aktivoituu 12 h olivat pääasiassa mukana HIF-1-alfa transkriptiotekijä verkko, seramidi signalointireitin ja yhteissääntely on androgeenireseptorin aktiivisuutta.

Down-regulation of NDRG1 edistää solujen maahanmuuton alla uudelleenhapetukselle

Koska

NDRG1

, joka säätelee MYC signalointireitin, oli suurin muutos ilmaisun seuraavissa uudelleenhapetukselle, ja että nämä uudelleenhapetukselle geenit rikastuneet validoitu tavoitteisiin C-MYC transkription aktivointi, me halusi tutkia tarkemmin vastaus

NDRG1

on uudelleenhapetukselle. Ei ollut selvää, oliko

NDRG1

voi vaikuttaa metastaattisen kyvyn kasvainsolujen. Näin ollen, transwell testit suoritettiin tutkimaan siirtymisen kyky MCF-7-solujen eri O

2 pitoisuuksia. Kuten kuviossa 2 on esitetty, transkriptio tasot

NDRG1

olivat merkittävästi vähentynyt, kun uudelleenhapetukselle (kuva 2a), kun taas siirtyminen kyky MCF-7 merkittävästi (kuvio 2b). Western blot vahvisti, että C-MYC ja N-MYC lisääntynyt, ja NDRG1 vähentynyt mukaisesti uudelleenhapetukselle olosuhteissa (kuva 2c). Nämä tulokset osoittavat, että

NDRG1

voi vaikuttaa migraation transformoitujen solujen kautta MYC-signalointireitin.

(a) Suhteellinen ekspressiotasot

NDRG1

eri O

2 olosuhteissa. MRNA tasot

NDRG1

mitattiin RT-PCR ensin normalisoitiin 18s rRNA, ja sitten verrattuna vuonna normoksia (*

P

0,01). (B) suhteellinen muuttoliike kyky MCF-7 eri O

2 olosuhteissa. Transwell määritystä käytettiin mittaamaan MCF-7 muuttoliikettä. Migration kyky ilmaistiin kertaiseksi muutoksia suhteessa normoksia. (C) Länsi-blotit HIF1α, C-MYC, N-MYC, ja NDRG1 hypoksia ja uudelleenhapetukselle. GAPDH oli latauskontrollina.

Seuraavaksi, koska

NDRG1

oli alassäädetty upon uudelleenhapetukselle, me yli-ilmentynyt

NDRG1

MCF-7-solujen tutkia sen fysiologisten toiminto. Vahvista yli-ilmentyminen, mRNA: ta ja proteiinia tasot NDRG1 tutkittiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä (kuvio 3a) ja Western blotting (kuvio 3b). Transkriptio ja proteiinin tasot NDRG1 in NDGR1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi suurempi kuin soluissa, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla ohjaus. MCF-7-solut transfektoitu

NDRG1

tai tyhjän vektorin inokuloitiin sitten siirtoaltaat toiselle kierrokselle solumigraation määritykset alla uudelleenhapetukselle. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen NDRG1 merkittävästi (

P

0,001) esti solumigraation mukaisesti uudelleenhapetukselle (kuvio 3c).

(a) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

NDRG1

yli-ilmentyminen MCF-7. MRNA tasot

NDRG1

normalisoitiin 18s rRNA. EV: tyhjän vektorin. (B) Western-blottaus yliekspressoitu NDRG1. Proteiini kokosolulysaateista blotattiin kanssa NDRG1-spesifisellä vasta-aineella, ja p-aktiini oli kuormituksen valvonta. (C) kulkeutuminen suhteessa kyky MCF-7-soluissa, sen jälkeen yli-ilmentävät NDRG1. Migration kyky ilmaistiin kertamuutoksia suhteessa MCF-7 alle uudelleenhapetukselle.

ennustaminen MYC liittyvien transkriptiotekijöiden ja hypoksia liittyviä MikroRNA säätelyssä

NDRG1

jotta ymmärtää sääntelymekanismeissa

NDRG1

ilmaisua, käytimme bioinformatiikan työkaluja ja kirjallisuuskatsaus ennustaa sitovien motiivien MYC liittyvien transkriptiotekijöiden että edistäjä

NDRG1

ja sitova sivustoja hypoksia liittyvien MikroRNA (miRNA) 3’UTR. Käyttämällä Matlnspector ja mainittujen perusteiden Materiaalit ja menetelmät, 170 sitovia motiiveja transkriptiotekijöiden tunnistettiin edistäjä

NDRG1

. Näistä transkriptiotekijät, MYC liittyvät transkriptioon, joka on raportoitu aikaisemmin valittu. Nämä transkriptiotekijät sisältyy E2F-MYC aktivaattori, MYC liittyy sinkkisormia, ja E-box sitova tekijöistä. Heidän sitova motiivi, sijainti, ja sekvenssi logo ovat taulukossa S1. Nämä tulokset syytteeseen

NDRG1

voidaan säädellä näiden transkriptiotekijät, vaikkakin kokeet ovat perusteltuja.

Lopuksi ekspressiotasot miRNA tiedetään muuttaa hypoksiassa. Tutkia mahdollisuutta

NDRG1

on käytävä miRNA sääntelyn eri O

2 olosuhteet, sitoutumiskohdat hypoksian liittyvien miRNA etsittiin 3’UTR on

NDRG1

. Hakukriteerit sallittu yksi yhteensopimattomuus, vaappua, poisto, tai väli toisen ja seitsemännen nukleotidit miRNA. Kuten on esitetty taulukossa S2, kuusi sitoutumiskohtia siementen alueiden neljän hypoksia liittyvien miRNA-miR-25, miR-93, miR-106a, ja miR-210-tunnistettiin 3 ’UTR:

NDRG1

, mikä viittaa siihen, että

NDRG1

voitaisiin säännellä näillä neljällä miRNA. Tätä tulosta voidaan käyttää suunnitella kokeita tutkia transkription jälkeisen sääntelyn

NDRG1

mukaan miRNA.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että kasvainsolut lisääntynyttä lääkeresistenssin ja metastaattinen potentiaali altistumisen jälkeen hypoksian /uudelleenhapetukselle solvausten [13], [15]. Vaikka solujen mukauttaminen hypoksia on hyvin dokumentoitu, vähän tiedetään mukautuva mekanismeja uudelleenhapetukselle. Täällä, tutkimme dynamiikkaa genominlaajuisten geeniekspression aikana uudelleenhapetukselle, ja totesi, että ilmennetty eri geenit olivat mukana HIF-1-alfa transkriptiotekijän verkkoon ja C-MYC transkription aktivaation.

Tässä tutkimuksessa , pääkomponenttianalyysi hapen reagoivien geenien osoitti korkea toistettavuus ajan. Määrän perusteella O

2-reagoiva geenien eri ajankohtina, aktiivisen jakson transkription vasteena uudelleenhapetukselle näyttää olevan välillä 8 ja 12 tuntia. Lisäksi reitti-analyysi paljasti, että O

2-reagoiva geenien 12 tuntia oli mukana HIF-1-alfa-transkriptiotekijän verkkoon, seramidi-signalointireitin, ja yhteissääntelyssä on androgeenireseptorin aktiivisuutta. Ei ole yllättävää, että HIF-1-alfa transkriptiotekijä verkosto oli mukana uudelleenhapetukselle, koska se on raportoitu samanlaisessa tilanteessa, ts säteilytys. Sädehoidon, kasvain uudelleenhapetukselle johtaa ydinaseiden kertyminen HIF-1 vastauksena reaktiivisia happiradikaaleja [18]. Yksi geenien eli

NDRG1

, että HIF-1-alfa transkriptiotekijä verkko kiinnittää huomiota, sillä se oli suurin muutos ilmaisun seuraavissa uudelleenhapetukselle.

NDRG1

ilmentyy kaikkialle kudoksiin stimuloi alla erilaisia ​​jännityksiä ja solujen kasvua sääntelyolosuhteet, kuten hypoksia [19], [20], DNA-vaurioita [21], solujen erilaistuminen [22], [23], [24], lisääntymistä ja kasvun pysähtymisen [23]. On raportoitu, että

NDRG1

on voimakkaasti säädelty hypoksisissa olosuhteissa. Onkogeeninen ja kasvaimen edistämisen rooli

NDRG1

on myös raportoitu, koska se yli-ilmentyy eri ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhko-, aivo-, iho-, munuais-, ja rintasyöpiä [25], [26]. Kuitenkin

NDRG1

toiminut metastaattinen vaimentimen eturauhasen ja paksusuolen syöpiä [24], [27]. Ristiriitainen roolit

NDRG1

syövän jäi selvitettävä, vaikka ne saattavat selittyä sen useiden solujen lokalisointi ja monimutkainen sääntelyn erilaisiin fysiologisiin ja patologisiin tekijöihin. Äskettäin Toffoli et ai. osoittivat, että

NDRG1

voidaan aiheuttaa vaihtelevalla hypoksia edistää solujen vaeltamiseen [28]. Useat tutkimukset ehdotti myös, että

NDRG1

aiheutetaan hypoksia ja liittyy etäpesäkkeitä, mutta sääntelymekanismi on

NDRG1

edelleen heikko ja sen toiminta alle uudelleenhapetukselle on vielä epäselvä.

NDRG1

oli maksimaalinen transkription vastaus uudelleenhapetukselle tässä tutkimuksessa, jota tunsimme aiheen lisätutkimuksiin. Havaitsimme, että ilmaus

NDRG1

oli käänteinen suhde solujen vaeltamiseen päälle uudelleenhapetukselle. Nämä tulokset NDRG1 aggressiivisuutta vähentävänä, sopusoinnussa havaintojen Maruyama ym. [8]. Ristiriita tuloksemme ja niille Toffoli et al. [28] voi johtua eri solutyypistä ja kokeellisia asetuksia.

Jotta ymmärtää paremmin tämän sääntelyn mekanismeja

NDRG1

alle uudelleenhapetukselle,

in silico

sekvenssianalyysi suoritettiin ennustaa DNA: ta sitovaa motiivia transkription tekijöitä promoottori

NDRG1

. Niistä MYC liittyvä sitovia motiiveja tunnistettiin, sinkki sormi proteiineja, E2F-MYC aktivaattori /solusyklin sääntelyviranomaisten, ja E-box sitova tekijät voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen [29], [30], [31], [32]. Nämä ehdokas transkriptiotekijät voidaan edelleen validoitu rakentamalla eri promoottorien avulla Lusiferaasimäärityksiä. Lisäksi ekspressiotasot useiden miRNA on osoitettu muuttaa hypoksia [33], [34], [35]. Erityisesti, miR-210 indusoi aikana hypoksia kautta HIF1-riippuvaisen mekanismin, ja ilmaus miR-210 oli vahva korrelaatio ilmentymisen

NDRG1

[34]. Siksi me arveltu, että ilmaus

NDRG1

myös säännelty miRNA. Todellakin, sitoutumiskohdat siemenen alueiden neljän hypoksia liittyvien miRNA (miR-106a, miR-93, miR-25, ja miR-210) tunnistettiin 3’UTR

NDRG1

. Siksi ehdotimme toimintamalli perustuu bioinformatiikka ennustaminen ja kirjallisuuskatsauksesta (kuva 4). Tämä malli tarjoaa puitteet tuleville biologisia kokeita.

TSS: transkription aloituskohdasta. White box: transkriptiotekijän sitoutumispaikasta + lohkoon; musta laatikko: transkriptiotekijän sitoutumispaikasta – lohkon; harmaalle: miRNA sitoutumiskohtaa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen rintasyövän MCF-7 saatiin Bioresource Collection ja Research Center ( Hsiuchu, Taiwan). MCF-7-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), joka sisälsi 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (Hyclone, Gibco) ja 1% antibiootti liuos (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Sillä hypoksinen viljelmiä, soluja inkuboitiin hypoksian kammiossa (Invivo

2-200, Ruskinn Technology, Leeds, UK) 24 tunnin kaasuseoksella, joka sisälsi 5% CO

2, 95% N

2 37 ° C: ssa. Happipitoisuus hypoksia kammiossa pidettiin 0,5%. 24 tunnin hypoksisten kasvua, soluja inkuboitiin hyvin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 ja 95% huoneilman 37 ° C: ssa. Kuusi näytettä kerättiin vastaavasti 0, 1, 4, 8, 12 ja 24 h kuluttua uudelleenhapetukselle. Solut pestiin kylmällä PBS: llä, flash-jäädytettiin nestemäisessä N

2, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten RNA: n eristämistä. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena.

RNA

Yhteensä-RNA uutettiin TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja puhdistettiin RNeasy Micro uudelleenjärjestäminen (Qiagen, Valencia, CA ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin käyttämällä NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ja Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), joka laskee RNA eheyden numero (RIN). Kokonais-RNA (500 ng) A

260 /A

280 = 1,7-2,1 ja RIN 7,0 käytettiin syntetisoimaan ensimmäisen juosteen cDNA kautta käänteistranskriptio.

Illumina ihmisen koko genomin ilme beadchips

kokonais-RNA pohjustettiin T7 Oligo (dT) alukkeen ja monistettiin Illumina TotalPre RNA Amplification Kit (Ambion Inc., Austin, TX), syntetisoimiseksi cDNA, joka sisälsi T7-promoottorin sekvenssin. Sen jälkeen kun ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi, toisen juosteen cDNA syntetisoitiin muuntamalla yksijuosteinen cDNA kaksijuosteinen DNA (dsDNA) templaattina transkriptiota. Reaktio palveluksessa DNA-polymeraasin ja RNaasi H samanaikaisesti hajota RNA ja tiivistetään toisen juosteen cDNA. Kaksinkertainen cDNA sitten tehtiin puhdistamisen liika RNA, pohjamaalit, entsyymejä, ja suolat, jotka estäisivät in vitro transkriptio. Sen jälkeen, in vitro transkriptio suoritettiin käyttäen kaksijuosteisen cDNA: ta templaattina ja T7 RNA-polymeraasia syntetisoimaan useita kopioita biotinyloidun cRNA. Monistuksen jälkeen cRNA sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa hybridisaatio- puskuria ja hybridisoitiin Illumina Human-6 v3 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) 58 ° C: ssa 16 tuntia. Hybridisaation jälkeen BeadChip pestiin ja värjättiin streptavidiini-Cy3 väriainetta. Intensiteetti helmi: n fluoresenssi havaittiin, että Illumina BeadArray Reader, ja tulokset analysoitiin käyttäen BeadStudio v3.1 ohjelmistoa. Kaikki tiedot on MIAME mukainen ja että raaka data on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta. Microarray data Tämän tutkimuksen on toimitettu GEO (Gene Expression Omnibus) tietokantaan (hakunumero GSE30019).

Tiedon louhinta ja tilastollinen analyysi

Skannauksen jälkeen, intensiteetti tiedot Illumina käyttöliittymätutkimukseen 6 v3 BeadChips analysoitiin kaupallinen ohjelmisto Partek® (Partek, St. Charles, MO) ja mRNA: n ilmentymisen analyysi. Taustaa korjattu signaaleja normalisoituna kvantiili normalisointi algoritmi, joka normalisoitu koetin intensiteetin perusteella intensiteetin jakautuminen kaikkien dioja. Normalisoinnin jälkeen, Principal Component Analysis (PCA), joka vähentää korkean ulotteinen tiedot 2D-kuvaajan, käytettiin arvioimaan samankaltaisuuden geeniekspressioprofiilit. Jotta voitaisiin tunnistaa eri tavoin ilmentyvien geenien, t-testejä tutkimalla ekspressiotasot aina pisteen jälkeen uudelleenhapetukselle verrattuna, että aika nolla käytettiin. Geenejä, joiden

P

-arvo on kolme toistoa yhdellä tai useammalla ajankohtina oli 10

-4 tunnistettiin ja määriteltiin O

2-reagoiva geenejä. Genesis-ohjelma [36] käytettiin tuottamaan visuaalinen esitys ilmaisun profiileja. Lisäksi NCI-Nature Pathway Vuorovaikutus Database [17] sovellettiin tunnistamaan biologisia toimintoja eri tavoin ilmaistuna geenejä.

yli-ilmentyminen

NDRG1

MCF-7

ihmisen

NDRG1

geenin väliin

EcoRI

ja

BamHI-

kohtiin eukarioottiekspressiovektoriin pcDNA3.1 + (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 /NDRG1 solut luotiin transfektoimalla MCF-7-solujen pCDNA3.1 + koodaa

NDRG1

geenin lipofektamiinia 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 /NDRG1 soluja valikoitiin sitten 200 ug /ml Zeocine kahden viikon ajan. MRNA: n ilmentyminen

NDRG1

tutkittiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä, ja NDRG1 proteiinin ilmentyminen tutkittiin Western blot.

Quantitative käänteisen transkription PCR

Kokonais-RNA oli uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio kokonais-RNA: ta suoritettiin High Capacity cDNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja 1 ug kokonais-RNA: ta templaattina. Reaktioseos inkuboitiin 25 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 37 ° C: ssa 2 h ja 85 ° C: ssa 5 sekunnin ajan. Reaaliaikainen PCR havaittiin SYBR Green (Sigma), ja suoritettiin käyttäen ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaktiot suoritettiin käyttämällä seuraavaa ohjelmaa: 40 sykliä, denaturointi 95 ° C 15 s ja 1 min hehkutus ja pidentämällä 60 ° C: ssa. Kunkin cDNA näytteestä, sisäisen valvonnan, 18s rRNA, mitattiin myös SYBR Green koetin pyritty varmistamaan määriä cDNA kaikissa kuopissa. Suhteellinen ilmentyminen NDRG1 verrattuna 18s rRNA kussakin näytteessä laskettiin (△ Ct) ja suhteellinen ilmentyminen NDRG1 joukossa näytteitä määritettiin laskemalla ero △ Ct näytteiden välillä (△△ Ct). Kaikki mittaukset tehtiin kolminkertaisina (5 ng kokonais-RNA: per kuoppa).

Western blotting

Koko solu-uutteet valmistettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria täydennetty 1% Nonidet P-40 (NP 40) ja Mini proteaasiestäjäseostabletit Tabletit (Roche, Mannheim, Saksa). Solujäte otettiin talteen sentrifugoimalla 8000 x g 4 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus mitattiin bikinkoniini- happo-menetelmällä (BCA-määrityksellä), ja 20-50 ug proteiinia ladattiin 10% denaturoivalla natriumdodekyylisulfaatti polyakryyliamidigeelillä. Elektroforeesin jälkeen proteiini siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-membraaneille yli yön 55 mA. Membraanit blokattiin Tris-pusku- roitu suolaliuos Tween-20 (TBST), 5% rasvatonta maitojauhetta, huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Detection spesifisten proteiinien tehtiin tutkimalla kalvoja, joilla on primaarinen vasta-aineiden TBS 0,1% Tween-20: ssa 1,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Näitä vasta sisältyy NDRG1 (Abcam, 1:500), HIF1α (Millipore, 1:1000), C-MYC (Millipore, 1:1000), N-MYC (Millipore, 1:250), ja kuormituksen valvonta GAPDH (GeneTex, 1:10000) tai β-aktiini (1:5000). Inkuboinnin jälkeen piparjuuriperoksidaasikonjugoitua IgG sekundääriset vasta-aineet (1:5000) immunoreaktiivisuus visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssi- kanssa Luminol Reagent (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).

Cell migraatiokokeessa

Migration määritykset tehtiin käyttämällä 24-kuoppaista transwell muuttoliike kammiot (Corning, Corning, New York, USA) 8 mm: n huokoskoon polyeteeni kalvoja. Soluja ensimmäinen nälässä 24 tuntia ja kerättiin Accutasella (PAA Laboratories, Linz, Itävalta). Yläkammiot ympättiin 5 x 10

4 solua /kuoppa 0,1 ml: ssa seerumitonta DMEM-solujen liuosta, ja alemman kammiot täytettiin 0,6 ml: lla DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti. Solujen annettiin kulkeutua 24 h 37 ° C: ssa. Mittaamiseksi siirretyn solut, 2 ug /ml Calcein-AM (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) /Cell dissosiaatio Solution (Trevigen) lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 60 min, insertit poistettiin ja levyt luettiin aallonpituudella 485 nm eksitaatio ja 520 nm emissio. Solujen lukumäärät laskettiin vertaamalla absorbanssi standardikäyrän. MCF-7-solut transfektoitu tyhjällä vektorilla, käytettiin kontrollina kussakin kokeessa.

In silico

analyysi

NDRG1

tunnistamaan mahdollisia sitovia kuviot MYC liittyvien transkriptiotekijöiden, että promoottori

NDRG1

, Matlnspector-ohjelman käytettiin [37]. Kaksi ennalta ryhmää transkriptiotekijöiden, kuten yleisistä keskeiset promoottorielementtejä ja selkärankaisten, analysoitiin matriisissa kirjaston versio 8.3 käyttäen seuraavia parametreja: (1) matriisi perheet Hyväksytty sijaan yksittäisen sekvenssin; (2) ydin samankaltaisuus oli vähintään 0,75; (3) matriisi samankaltaisuus on optimoitu. Ydinalueen määriteltiin neljä peräkkäistä nukleotidia, jolla on korkein säilyttämisen tulokset [38]. Ydin ja matriisin samankaltaisuutta laskettiin vertaamalla hakusekvenssistä eniten konservoituneen nukleotidisekvenssin matriisissa. Sen jälkeen tunnistamalla mahdollisuudet transkriptiotekijän ehdokkaita, MYC liittyvä transkriptiotekijöiden olivat edelleen valitaan perustuen kirjallisuuskatsaus.

tunnistamiseksi sitoutumiskohdat hypoksian liittyvien miRNA,

NDRG1

3 ’ sekvenssin, ladattiin UCSC n Genome selain (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway; GRCh37 /hg19 kokoonpano), ja oli linjattu hypoksia liittyviä miRNA. Hakuperusteita sitoutumiskohdista siemenen alueen, joka mahdollistaa yhden yhteensopimattomuuden, vaappua, poisto, tai väli toisen ja seitsemännen nukleotidit hypoksia liittyvien miRNA.

tukeminen Information

Taulukko S1.