PLoS ONE: transkription säätelyyn of hTREX84 Human Cancer Cells
tiivistelmä
TREX (transkriptio /vienti) on multiproteiinikompleksissa joka on keskeinen rooli transkription venymä ja kuljetus mRNA tumasta sytoplasmaan. Olemme aiemmin raportoitu puhdistamiseksi ihmisen TREX proteiinia ja havaittiin, että ekspressio jäsen tämän monimutkaisen, p84N5 (jäljempänä hTREX84 tai hHPR1), RB-sitova proteiini, korreloi rinta- kasvaimen koon ja etäpesäkkeiden. Tässä tarkastellaan mekanismeja poikkeavasta ilmentymisen hTREX84 rinta- ja munasarjasyövän solujen ja arvioida sen rooli kasvainten synnyssä. Osoitamme, että munasarjojen kasvainsolut yli-express hTREX84 4-kertainen ja 10-kertainen verrattuna kuolematon, ei-tuumorigeeniset ja primääri munasarjojen pinnan epiteelisolujen vastaavasti. Vähentäminen hTREX84 tasoilla Sirna johtaa solun proliferaation inhibitio ja G
2 /M pidätykseen. Vaikka me havaitsimme, että hTREX84 ilmentyminen indusoitiin käsittelemällä demetylaation aineen, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), natriumbisulfiitti DNA: n sekvensointi ja metylaatiospesifisen PCR mitään todisteita muutoksia DNA metylaatio CpG saarilla säädin alueella
hTREX84
. Me nimetä useita transkriptiotekijöitä, kuten NF-KB: n sitoutumiskohtia
hTREX84
geenin promoottori ja osoitettava chromatin immunoprecipation (chip) ja kohdennetulla mutageneesillä että RelA /p65 sitoo NF-kB sitoutumiskohtiin ja indusoi
hTREX84
ilme. Lopuksi osoitamme immunohistokemiallinen (IHC) että RelA /p65 on runsaasti ilmaistaan pahanlaatuisia soluja, jotka ilmentävät poikkeavasti hTREX84 osoittaa, että RelA /p65 voisi olla keskeinen rooli säätelyssä hTREX84 ilmaisun syöpä. Tuloksemme osoittavat, että yli-ilmentyminen
hTREX84
liittyy syöpäsolujen transformaatio, lisääntymistä ja voi säädellä RelA /p65.
Citation: Guo S, Liu M, Godwin AK (2012) Transkription sääntely hTREX84 Human Cancer Cells. PLoS ONE 7 (8): e43610. doi: 10,1371 /journal.pone.0043610
Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Yhdysvallat
vastaanotettu: 12 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 27 elokuu 2012
Copyright: © Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health, R01 CA140323 ja 5U01CA113916, puolustusministeriön Breast Cancer Research Program US Army Medical Research, DAMD17-03-1-0312, ja Munasarjojen Cancer Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
TREX (transkriptio /vienti) kompleksi on keskeinen rooli transkription venymä ja kuljetus mRNA tumasta sytoplasmaan [1]. Tämä kompleksi on konservoitunut hiivasta ihmisen. Hiiva, TREX kompleksi koostuu THO monimutkainen ja mRNA: n vientiä tekijät SUB2 ja Yra1 [2], [3], [4], [5]. THO kompleksi sisältää hetero- alayksiköt, Tho2, Hpr1, Mft1 ja Thp2 [6], [7]. Lisäksi, Tex1, proteiinin toimintaa ei tunneta, havaittiin yhteistyössä puhdistaa kanssa THO monimutkainen, vaikkakin alistökiometrisellä määriä [3], [5]. TREX monimutkaisia osia liittyy myös Gbp2 ja Hrb1 [5], [8]. Nämä kaksi proteiinia ovat tunnusmerkkejä seriini-arginiini-rikas perhe liitos tekijöitä ja rekrytoidaan syntymässä mRNA: iden kautta fyysisen vuorovaikutuksen TREX monimutkaisia transkription aikana venymään [9]. Toiminnallisesti THO kompleksi on rooli transkriptiosta riippuvan rekombinaatio ja transkriptio [6]. On osoitettu, että THO kompleksi rekrytoidaan aktiivisesti puhtaaksi geenejä [5] ja joita tarvitaan tehokkaaseen transkriptioon pidentymisen [4]. Nolla mutaatiota kussakin koodaavien geenien alayksiköt THO kompleksin johtaa mRNA viennin vika [5], [10].
Äskettäin
Drosophila
ja ihmisen TREX komplekseja karakterisoitiin useat ryhmät myös meidän [5], [11], [12], [13]. Ihmisen TREX Kokonaisuuteen kuuluu THO2 (hiiva komponentti Tho2), HPR1 (hiiva Hpr1), UAP56 (hiiva SUB2) ja ALY (hiiva Yra1). Lisäksi, ihmisen TREX kompleksi sisältää muita komponentteja, TREX90 (fSAP79), TREX40 (fSAP35) ja TREX30 (fSAP24), joka on vastaavien
Drosophila
(THOC5, 6 ja 7, vastaavasti), mutta ei hiivassa [1], [11], [14]. Sekä
Drosophila
ja ihmisen TREX monimutkainen puute homologeja Mft1 tai Thp2. Kuitenkin,
Drosophila
ja ihmisen RNA-interferenssi tutkimuksia Tho2 ja /tai Hpr1 osoittavat, että metazoan ja ihmisen THO monimutkainen, kuten sen hiiva vastine, toimii mRNA vienti [11], [13]. TREX84 /HPR1 kumppaniaan kasvavaan RNA-polymeraasi II, joka osoittaa ihmisen THO monimutkainen toimii myös transkription venymä [12].
etuja ihmisen HPR1 johtui havaintomme että p84N5 oli poikkeuksellisesti ilmaistu ihmisen rintasyövän [15] . p84N5 löydettiin sitovana proteiinia, joka on yhteistoiminnassa retinoblastooma tuumorisuppressoriproteiinia (RB) [16]. Jo pitkään, se toimi tumaproteiini merkki [17], [18]. Yllättäen totesimme p84N5 on ihmisen Hpr1, hiiva vastine, että TREX monimutkainen [11]. Tämä havainto vahvistettiin lisäksi muut ryhmät itsenäisesti [12], [14] ja sitä kutsutaan hTREX84 /HPR1.
mekanismi sääntelyn ihmisen TREX monimutkainen, mukaan lukien hTREX84 normaaleissa ja transformoiduissa soluissa ei ole hyvin tutkittu. Me raportoimme että hTREX84 on poikkeuksellisesti ilmaistaan sekä rinta- ja munasarjasyöpään ja sen ilmentymistä säädellään osittain RelA /p65.
Tulokset
Yli-ilmentyminen hTREX84 Human munasarjasyöpäsoluja
Aikaisemmin on raportoitu, että ilmentyminen hTREX84 rintasyövän kasvaimia on kääntäen verrannollinen hormonin reseptoriin asema [11]. Lisäksi, kun verrataan hTREX84 mRNA: n ekspression 6 edustavia vähentämiseen mammoplasty yksilöt, mukaan lukien 3 poikimattomia premenopausal ja 3 parous premenopausaalisilla naisilla
hTREX84
mRNA: n ekspressio oli merkittävästi koholla poikimattomia yksilöiden [11] [tietoja ei näytetty]. Nämä tulokset osoittavat, että hTREX84 ei ole vain vapautui rinta- kasvaimia, mutta myös erittäin säännelty normaalissa ihmisen rinta- lobulaarinen erilaistumista ja saattaa modifioida tiettyjen hormonien, kuten ihmisen istukkagonadotropiinia (hCG). Siksi me kysyttiin hTREX84 myös poikkeuksellisesti ilmaista muissa hormoniriippuvaisia, kuten munasarjasyöpä. Havaitsimme, että hTREX84 oli hyvin ilmentyy kaikissa 30 tapauksessa munasarjojen epiteelin karsinoomien (tuloksia ei ole esitetty). Edelleen, me määritetty hTREX84 lauseke (hTREX84 /beeta-aktiini-suhde) primaarisissa ihmisen munasarjan pintaepiteelisolujen (HOSE) soluviljelmissä (n = 10), SV40 Tag kuolematon, ei-tuumorigeenisiä HOSE solulinjoissa (n = 10) ja munasarjojen tuumorisolun linjat (n = 11) western blotting-analyysi. Huomasimme, että hTREX84 ilmentyminen on merkittävästi kohonnut kuolemattomia solulinjoja (keskiarvo, 0,51) verrattuna ensisijaisen epiteelisoluihin (keskiarvo, 0,125; p = 0,00024) ja suurimmalla voimakkuudella syöpäsolulinjoissa (keskiarvo, 2,10; p = 0,0022) (kuvio 1 a, b).
A,
hTREX84 proteiinin ilmentymistä edustaja munasarjasyövän solulinjoissa (OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289), kuolemattomia epiteelin solulinjoja (HIO- 118, HIO-102, HIO-104, HIO-113), ensisijainen epiteelisolut (ROE). Proteiininäytteet erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelillä immunoblot käyttämällä anti-hTREX84 tai ß-aktiini-monoklonaalisia vasta-aineita.
B,
hTREX84 /SS-aktiini suhde primääri munasarjojen epiteelin soluviljelmissä (epiteelin), kuolematon epiteelin solulinjoja (HIO) ja syövän solulinjat (syöpä).
Edelleen selvittämiseksi biologista merkitystä hTREX84 munasarjan syöpäsolujen siRNA vastaan
hTREX84
on transfektoidaan OVCAR10 soluihin. RT-PCR-analyysi käyttäen spesifisiä oligonukleotidialukkeita, että
hTREX84
geenin osoitti, että ilmentymistaso hTREX84 transkriptin laskee -70 80% transfektiosta siRNA osaksi OVCAR10 soluihin verrattuna kontrolliryhmän solujen . Näissä olosuhteissa, jatkuva ekspressiotasot glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (
GAPDH
) geeni saatiin molemmissa soluissa (kuvio 2a). hTREX84 kohdistetut siRNA tehokkaasti vähensivät hTREX84, mutta ei vaikuttanut tasoa Kohdentamattoman selostukset kuten β-aktiini (kuva 2b). Immunovärjäys vahvisti, että hTREX84 proteiinia voimakkaasti vähentynyt useimmissa käsiteltyjen solujen (kuvio 2c). Kokonaismäärät solujen väheni merkitsevästi hoidon jälkeen hTREX84-siRNA: t verrattuna soluihin käsitelty transfektioreagenssia tai kontrolli-siRNA (kuvio 2d). Havaitsimme, että solujen kasvu väheni käsitellyissä viljelmissä hTREX84-siRNA kontrolliin verrattuna (kuvio 2e). Guava neksiini määritykset osoittivat, että siellä oli myös vähentäminen anneksiini V-PE ja 7-AAD positiivisten solujen soluissa, joita käsiteltiin hTREX84-siRNA: t verrattuna kontrolleihin ja erot olivat myös eivät ole merkittäviä (p 0,05) (aineistoa ei esitetty). Jotta tarkastella mekanismin hTREX84 siRNA toimia, me edelleen määrittää solusyklin jakautumisen virtaussytometrialla ja totesi, että solumäärät G2-M-vaiheessa oli vähentynyt ja solumäärät G1 vaiheessa korotettiin OVCAR10 käsitelty hTREX84 siRNA kuin verrattuna käsiteltyjen solujen ohjaus siRNA, joka osoittaa, että hTREX84 voi olla tarpeen tuloa G2-M-vaiheen (kuvio 2f). Nämä tulokset osoittavat, että poikkeava ilmentyminen hTREX84 voivat edistää munasarjasyövän edistämällä solujen proliferaatiota. Samanlaisia tuloksia saatiin käyttämällä muita kasvainsolulinjoja [tietoja ei näytetty].
A,
analyysi hTREX84 ja GAPDH-mRNA-tasot hoidon jälkeen solujen siRNA vastaan hTREX84 tai ohjaus siRNA.
B,
Analyysi hTREX84 ja β-aktiini-proteiinin tasot hoidon jälkeen solujen siRNA vastaan hTREX84 tai ohjaus siRNA.
C,
analyysi hTREX84 ilmaisun seuraavista siRNA hoitoa 72 tunnin immunof- värjäys soluissa (
jäljellä,
solut transfektoitu ohjaus siRNA;
oikea,
soluja käsiteltiin hTREX84-siRNA).
D,
mikrovalokuvia esittäen morfologia seuraavat ehtyminen hTREX84 (
jäljellä,
kasvainsolut transfektoidaan ohjaus siRNA;
oikea,
solut käsiteltiin hTREX84-siRNA).
E,
Soluproliferaatiomääritys kasvainsolujen seuraavista ehtyminen
hTREX84
. Solujen lisääntymisen ja apoptoosin (tuloksia ei ole esitetty), tutkittiin käyttämällä guava ViaCount ja neksiini määrityksiä vastaavasti. Määrä elinkelpoisia soluja (x10
4) piirretään hoidon kesto on 24, 48, ja 72 tuntia hoidon jälkeen ohjaus siRNA tai hTREX84-siRNA. Siinä on esitetty tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta. Ero on tilastollisesti merkittävä. *, P 0,05; **, P 0,01.
F
. FACS-analyysi soluista seuraavat down-regulation of hTREX84 tasoilla. Näkyy on prosenttiosuus solujen G1, S, G2-M jälkeen 72 tunnin hoidon joko siRNA (vasen paneeli) tai hTREX84-siRNA (oikea paneeli).
Lisääntynyt hTREX84 Expression by 5- atsa-dC in Munasarjojen Immortal Solut
aikaisemmassa tutkimuksessa raportoitiin, että
hTREX84
mRNA poikkeuksellisesti ilmaistu valtaosa korkealuokkaisesta ja invasiivisia ductal rinta- [11]. Lisäksi
hTREX84
mRNA tasot olivat koholla pahanlaatuisia epiteelisolujen verrattuna normaaliin maitorauhasen ductal epiteelisolujen, kuten on osoitettu laser jää mikro-leikkely ja qPCR analyysi. Siksi spekuloida, että vapauttaminen transkription
hTREX84
mRNA voi olla yksi mekanismi hTREX84 proteiinin yli-ilmentymisen syöpäsoluissa. Auttaa selvittää molekyylitason mekanismit epänormaalin transkription
hTREX84
kasvainten synnyssä, kuolematon, ei-tuumorigeenisiä munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja, HIO-107 käsiteltiin demetyloivan aineen, 5-atsa-dC pitoisuuksina 1, 5, 10 tai 50 uM 5 päivää. Yhteensä RNA: t eristettiin ja RT-PCR: llä alukkeilla hTREX84 cDNA: n tai β-aktiini-cDNA tehtiin. Tulokset osoittivat, että voimakkuudet RT-PCR-tuotteen
hTREX84
kasvatti 5-atsa-dC hoidon annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3). Sitä vastoin, tuotteet β-aktiini oli tasaisesti monistettiin kaikki näytteet, mikä osoittaa, että ilmentymisen β-aktiini ei ole muutettu 5-atsa-dC hoitoa (kuvio 3a, c). hTREX84 proteiini havaittiin myös lisätä samalla tavalla käyttäen western blotting -analyysi (kuvio 3b, d). Samanlaisia tuloksia saatiin, kun käytimme munasarjasyövän solulinja, OVCAR2, joilla on alhainen endogeenisen hTREX84 (tuloksia ei ole esitetty).
A,
HIO-107-soluja käsiteltiin 5 -aza-dC pitoisuuksina 1, 5, 10, 50 uM vastaavasti 5 päivää. RT-PCR näytä
hTREX84
mRNA ilmaisun ja
B
, western blot-analyysi osoittaa hTREX84 proteiinin tasot.
C, D,
kvantitatiivinen mRNA ja Western blot tiedot laskettiin densitometrisen analyysin bändejä kanssa NIH ImageJ ohjelmisto, vastaavasti. Arvot normalisoitiin p-aktiini sisäisenä kontrollina.
Natriumbisulfiitti DNA sekvensointi promoottori ja Exon1 of hTREX84 Gene
Havaitsimme GenBank ™ ihmisen genominen klooni (RP11 -70501) johdettu kromosomista 18p, joka sisälsi ihmisen TREX84 cDNA-sekvenssin raportoitiin aluksi Durfee et ai [16] (DDBJ /GenBank ™ /EMBL Data Bank, hakunumero AAA53571), samoin kuin muiden ryhmien [5], [19] , [20] (Liittymisnumero NM_005131). Rinnastus ihmisen
TREX84
cDNA: n ja genomisen kloonin GenBank ™ antoi meille mahdollisuuden määrittää eksoni-introni organisaatio geenin. Genominen DNA eristetään sen jälkeen näistä 5-atsa-käsitellyt DC-solut ja natriumbisulfiitin DNA: n sekvensointi suoritettiin. Yllättäen tulokset osoittivat, että kaikki CpG-dinukleotidien paikantaa hTREX84 promoottorin ja eksonin 1 alueita käsitellyn ja käsittelemättömän HIO107 ja OVCAR2 solut kaikki demetyloidaan, mikä osoittaa, että muutokset promoottori metylaatio ei liity ekspression lisäämiseksi
hTREX84
mRNA: ta ja proteiinia, kun 5-atsa-dC hoitoon.
lisäksi korreloivat metylaatiostatuksen
hTREX84
promoottorin ja eksonin 1 alueella ja hTREX84 ilmaisun, analysoitiin 15 tapausta rinta- ja munasarjasyövän solulinjat, 10 tapausta rinta- ja munasarjasyövän kuolemattomia solulinjoja, 6 invasiivista rinta- duktaalikarsinooma, 13 tapausta munasarjojen kasvaimia, sekä niiden yhdistetty normaaleissa kudoksissa natriumbisulfiitilla DNA-sekvensoinnilla. Tulokset osoittivat, että
hTREX84
promoottori ja eksonin 1 alueilla lähes kaikilla solulinjat demetyloituu (kuvio 4a, b).
hTREX84
promoottori ja eksonin 1 alueita useimmissa normaaleissa kudoksissa myös demetyloitunut. Oli satunnaisia metyloitu CpG sivustoja normaaleissa kudoksissa (kuvio 4c); kuitenkin poikkeava promoottori metylaatio
hTREX84
ei näytä olevan merkittävä epigeneettiset mekanismi liittyy epänormaali ilmentyminen hTREX84 rinta- ja munasarjojen kasvaimia ja kasvaimen solulinjojen.
, DNA-sekvenssi
hTREX84
säädin alueilla. CpG sivustot näkyvät vihreällä. Nukleotidit on numeroitu alkaen elokuu käännös aloituskoodin, joka on alleviivattu.
B
, natriumbisulfiittia sekvensointi DNA eristettiin käsittelemättömien (I) ja käsiteltiin (II) soluja. Tähdet ilmaisevat CpG sivustoja.
C
. Natriumbisulfiitti sekvensointi DNA normaalin rintakudoksen (N) ja invasiivisen duktaalikarsinooma (T). Tähdet ilmaisevat CpG sivustoja.
tunnistaminen transkriptiotekijöiden sitoutuneen hTREX84 geenipromoottorin
Tarjota parempaa ymmärtämistä molekyyliperustan hTREX84 yli-ilmentyminen rinta- ja munasarjasyövän arvioimme transkriptiotekijän sitoutumiskohdat
hTREX84
säädin alueilla [21] käyttämällä AliBaba2 (https://wwwiti.cs.uni-magdeburg.de/grabe/alibaba2). Yhdeksän SP1, 7 NF1, 4 AP1, 2 NF-KB, yhdessä muiden transkriptiotekijöitä sitovia kohtia ennustettiin tätä ohjelmaa. Me keskittyi kahteen NF-KB: n sitoutumiskohdat transkription säätelyyn
hTREX84
. Ensin käytettiin kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) sen määrittämiseksi tilan RelA /p65, joka on yksi alayksiköistä NF-KB: n, on promoottori
hTREX84
. Jälkeen ChIP-protokollaa,
hTREX84
geenin promoottorin alueet monistettiin ja analysoitiin semikvantitatiivinen PCR käyttäen spesifisiä alukepareja noin NF-KB: n sitoutumisen alueiden promoottori
hTREX84
(kuvio 5a). Yksi rinta (MDA-MB-231) ja kaksi munasarjojen (OVCAR10, OVCAR5) tuumorisolulinjat kasvatettiin altistettiin ChlP vasta-aineen kanssa (Ab) ja RelA /p65. Rikastaminen spesifisten DNA-sekvenssien kromatiinin immunosaostumissa, mikä osoittaa yhdistys RelA /p65 DNA säikeitä ehjä kromatiinin, visualisoitiin PCR-monistuksella. Ei ole sitovia nähtiin immunosaostuksella näytteistä ilman RelA /p65-vasta-ainetta (kuvio 5b). Nämä tulokset vahvistettiin lisäksi, kun transfektoitiin ohimenevästi RelA /p65 ekspressioplasmideja osaksi ei-tuumorigeenisiä rintaepiteelin, MCF-10F ja stimuloitiin hTREX84 proteiinin ekspressio (kuvio 5c). Lisäksi kun pudotti RelA /p65 ilmaus käyttämällä siRNA kohdistettu RelA /p65, The hTREX84 proteiinin tasot olivat puolestaan väheni (kuva 5d).
, Kaavakuva hTREX84 promoottori osoittaa säilytetyn NF-KB: n DNA: ta sitovan motiivin.
B
, siru määritys RelA /p65 sitoutumisen
hTREX84
geenin promoottori MDA-MB-231 (kaista 1, 2); OVCAR5 (kaista 3, 4); OVCAR 10 (kaista 5, 6). Soluja viljeltiin 48 tuntia. ChIP määritykset suoritettiin sitten anti-RelA /p65-vasta. PCR-analyysi suoritettiin immunosaostus näytteistä ilman vasta-ainetta (kaista 1, 3, 5), jossa RelA /p65-vasta-ainetta (kaista 2, 4, 6).
C
, MCF-10F-soluja transfektoitiin ohimenevästi kontrollivektorilla (kaista 1) tai RelA /p65-cDNA-ekspressiorakenteeseen 48 tuntia. Western blot analyysi RelA /p65, hTREX84 ja β-aktiini.
D
, Western blot-analyysi RelA /p65, hTREX84 ja β-aktiini-proteiinin tasot hoidon jälkeen MDA-MB-231-solujen ohjaus siRNA (kaista 1) ja siRNA vastaan RelA /p65 (kaista 2) ja 72 tuntia.
edelleen selvittää NF-kB suoraan säätelee hTREX84 promoottorin aktiivisuutta näillä kahdella NF-kB sitoutumiskohtia, suoritimme ohimenevä transfektioanalyysissä MCF-10F solujen hTREX84 /pGL3 toimittajille. Reportteri-konstruktit sisältävät mutatoidun NF-kB sitoutumiskohtia (kuvio 6a, b), jotka on tuotettu PCR-mutageneesillä, verrattiin villityypin sekvenssin läsnä RelA /p65. Tulokset osoittivat kaikki toimittajat, jotka sisältävät NF-kB mutatoitunut sitoutumiskohta (t) ovat vähentäneet promoottorin aktiivisuutta (kuva 6c).
A
DNA-sekvenssi NF-κB1M osoittavat, että ensimmäinen NF-kB-sitoutumiskohta on mutatoitunut 5′-GGAAACTCCC-3 ’5’-CCAAACTCCC-3′.
B,
DNA-sekvenssi NF-κB2M, joka osoittaa, että toinen NF-kB sitoutumiskohta on mutatoitunut 5′-AGGTAATCCA-3 ’5’-ACCTAATCCA-3′. N5-κB1 /2M edustivat sekä kaksi NF-KB: n sitoutumiskohtia on hTREX84 promoottorialueen mutatoitiin kuten edellä on kuvattu (sekvenssi ei ole esitetty).
C
, Promoottori toimintaa joukossa kolme Toimittajat konstrukteja, jotka sisältävät joko yhden mutatoidun NF-KB: n sitoutumiskohtia tai molemmat (NF-κB1 /2M), joka määritetään lusiferaasianalyysissä. 1) Villityypin NF-KB: n sitoutumiskohtia; 2) NF-κB1M; ja 3) NF-κB2M; ja 4) NF-κB1 /2M.
Koska meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että hTREX84 oli hyvin ilmaistu solun tumassa etenkin heikosti eriytetty ja aggressiivisempia ihmisen rintasyöpiä [11], kysyimme RelA /p65 voidaan ilmaista vastaavalla tavalla. Olemme tutkineet proteiinin ilmentymistä RelA /p65 immunohistokemiallisella analyysi 89 tapauksissa ihmisen rintasyöpä, sekä 5 normaalin rintakudoksen kudoksissa (taulukko 1). Tämä kasvain paneeli sisältää 22, 33 ja 34 tapausta hyvin, kohtalaisesti ja huonosti eriytetty kasvaimia, vastaavasti. RelA /p65 oli heikosti (0 /+ 1) havaittu normaaleissa rinta- epiteelisolut (4 5) ja proteiinivärjäys osoitti sytoplasmassa lokalisointi (kuva 7a). Värjäys RelA /p65 havaittiin myös pääosin sytoplasmassa hyvin eriytetty kasvaimet (kuva 7b). Selvästi rakeinen värjäys lisääntynyt määrä positiivisesti värjättyä ytimien havaittiin huonosti eriytetty kasvain yksilöitä (+ 2 /+ 3, 31 34) (Fig. 7c). Molemmat RelA /p65 ja hTREX84 ovat erittäin ilmaistaan aggressiivisempia syöpä osoittaa, että RelA /p65 ja /tai hTREX84 voi olla rooli kasvainprogression ja etäpesäkkeitä.
, RelA /p65 oli heikosti havaittiin normaaleissa rinta- epiteelisoluissa ja positiiviset tuotteet sijaitsivat sytoplasmassa.
B
, värjäystä RelA /p65 havaittiin lähinnä sytoplasmaan korkealla eriytetty kasvaimia.
C
, Intense ja selvästi rakeinen värjäytyminen RelA /p65 havaittiin värjätään ytimet alhaisen eriytetyn kasvain yksilöitä.
D
, Tumor osassa arvioida ilman primaarista vasta-ainetta, joka toimii negatiivisena kontrollina. Suurennus 200x.
Keskustelu
Tässä raportissa laajensimme aiemmin havainto, että yli-ilmentyminen hTREX84 ei ole vain liittyy aggressiiviseen rintasyöpään, mutta liittyy myös poikkeava solu leviämisen munasarjasyöpä. Nuclear lokalisointi hTREX84 munasarjasyövän, sekä muissa syöpätyypeissä, kuten rinta- [11], keuhkosyöpä [22] on todettu sijaitsee ydin- matriisin ja RNA käsittely keskustassa. hTREX84 säätelee transkriptiota venymä osajoukko geenien osallistumalla TREX proteiini-kompleksin [11], [12], joka on konservoitunut hiivasta ihmiseen. Lisäksi hTREX84 on mukana transkription venymän, pre-RNA: n silmukoinnin ja mRNA: n vientiä. Olemme tutkineet molekyylitason mekanismit yli-ilmentyminen hTREX84 syöpäsoluissa. Koska
hTREX84
mRNA arvot ovat selvästi kohonneet rinta- kasvaimia ja kasvaimen solulinjojen, me arveltu, että epigeneettisellä mekanismit voivat edistää tätä fenotyyppiä. On tunnettua, että metylaatio DNA CpG dinukleotideissä on tärkeä mekanismi geenin ilmentymisen säätelyyn nisäkässoluissa [21], [23]. Metylointi sytosiineista CpG järjestyksessä sijaitseva säädin alueilla joidenkin geenien ajatellaan varmistaa vaiennettaisi tiettyjen kudosspesifisiä geenejä nonexpressing soluissa. Poikkeava metylaatio pidetään nyt tärkeänä epigeneettiset muutos esiintyy ihmisen syövässä [24], [25]. Hypermetylaatiota normaalisti metyloitumattomien tuumorisuppressorigeeneille korreloi menetys ilmaisun syöpäsolulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia [26], [27], [28]. Toisaalta, epäonnistuminen tukahduttamiseksi geenien asianmukaisesti epänormaali demetylaation kudoksen vapaan geenejä tai hypometylaatio esikasvaintekijöiden voi johtaa menetykseen kudosspesifisyyttä ja voisi edistää syövän muodostumisen [29], [30], [31]. Aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että γ-synukleiini promoottori, joka on samanlainen kuvio CpG sivustoja
hTREX84
, on hypometyloidut monissa ihmisen kiinteiden kasvainten, että poikkeuksellisesti ilmentävät tätä proteiinia [32], [33]. Oletimme, että
hTREX84
voidaan säädellä samalla mekanismilla. Itse asiassa, 5-atsa-dC indusoi hTREX84 kaikissa käsitellyissä soluissa, vaan välillisesti osoituksena puute metylaation muutoksia CpG-sivustoja, mikä osoittaa, että hypometylaatio ei ole suoraan liittynyt voimistunutta ilmentymistä
hTREX84
mRNA: ta ja proteiinia. Nämä tulos varmistettiin vielä kun analysoimme sarjan rinta- ja munasarjasyövän kasvaimia ja kasvaimen solulinjojen ja normaaleissa kudoksissa todisteita poikkeavalle metylaation natriumbisulfiitin DNA-sekvensoinnilla. CpG sivustoja
hTREX84
promoottori ja eksonin 1 alueet olivat yleisesti demetyloitunut riippumatta tasosta
hTREX84
ilme. Tulokset viittaavat siihen, että epänormaalit hTREX84 metylaatio ei kohonnut hTREX84 ilme rinta- ja munasarjasyövän kasvaimet ja voidaan säännellä muilla epigenetic mekanismeja.
On olemassa useita mahdollisuuksia, jotka voisivat selittää, miksi 5-atsa-dC ei indusoi hTREX84 ilmentyminen suoraan hTREX84 geenin metylaatiostatuksen. Esimerkiksi 5-atsa-dC voi olla dramaattisia vaikutuksia kromosomeja, mikä decondensation kromatiinin rakennetta, mikä parantaa tietyn geenin ilmentymistä [34], [35]. Toinen mahdollisuus on, että 5-atsa-dC voisi vaikuttaa joihinkin transkriptiotekijöitä, jotka myöhemmin vaikuttavat hTREX84 ilmentymistä.
ymmärtämään paremmin molekyyli perusteella hTREX84 yli-ilmentyminen solussa kuolemattomaksi ja kasvaimen kehittymisen, olemme määritelleet transkriptiotekijän sitoutumiskohdat
p84N5
promoottori. Keskitymme ydin- tekijä KB (NF-KB) ja vahvistaa se useista syistä. NF-KB ei ole yksi ainoa proteiini, mutta pieni ryhmä läheistä sukua oleva proteiini dimeerejä, jotka sitoutuvat yhteiseen sekvenssimotiivin tunnetaan KB sivustolla [36]. Mukaan Hanahan ja Weinberg, kasvaimen kehittymisen vaatii kuusi olennaisia muutoksia normaalin solun fysiologia: omavaraisuusasteen kasvun signaaleja; sieto kasvun estäminen; kiertäminen apoptoosin; kuolemattomaksi; kestävän angiogeneesi; ja kudosten ja metastaasit [37]. NF-KB pystyy aiheuttamaan useita näistä solun muutokset [38], ja sen on osoitettu olevan konstitutiivisesti aktivoitua joidenkin syöpien soluja, mukaan lukien rintasyöpä. Aiemmat tutkimukset ovat dokumentoitu koholla tai konstitutiivista NF-KB: n DNA-sitoutumisaktiivisuutta sekä rintasyöpä solulinjoissa ja primaarisissa rintasyövän ihmis- ja jyrsijöiden alkuperästä [39], [40], [41]. Tämä voitaisiin korreloi tehostetun kasvutekijän perhe reseptoreita (EGFR) [42]. Käyttämällä kromatiinin immunosaostus [43], [44] ja funktionaalisissa määrityksissä olemme selvästi osoittaneet, että RelA /p65, joka on yksi alayksiköistä NF-KB: n, sitoutuu promoottori
hTREX84
ja vaikuttaa
hTREX84
mRNA ilmaisun. Lisäksi kun nimenomaan uhanalainen siRNA lähestymistapoja, menetys RelA /p65 tukossa hTREX84 ilme. Edelleen määrittää, onko NF-KB: n suoraan säätelee
hTREX84
promoottorin aktiivisuuden kautta NF-KB: n sitoutumiskohtia, teimme lusiferaasin promoottorin määritys, jossa NF-KB-sitoutumiskohtia mutatoitiin yksitellen tai yhdistelmänä. Tulokset osoittivat, että NF-KB-sitoutumiskohtia olivat välttämättömiä enintään promoottorin aktiivisuutta. Olemme edelleen tutki proteiinin ilmentymistä RelA /p65 IHC ihmisen rintasyöpänäytteistä ja osoitti vakiintunut yli-ilmentymisen aggressiivisempia, huonosti eriytetty kasvaimia. Näin ollen, RelA /p65 on ilmaistu samalla tavalla kuin hTREX84 [11], mikä osoittaa, että nämä kaksi proteiinia voivat yhteistoiminnallisesti edistää kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden.
NF-KB: n ja sen RelA /p65-alayksikön erityisesti voi edistää tumorigeneesin kyvyllään indusoida anti-apoptoottiset geenit kuten
Bcl
-XL,
XIAP
ja
IEX
-1L [45], [46]. NF-KB voi myös stimuloida kasvaimen proliferaatiota läpi asiakkuutta tiettyjä onkogeenien kuten sykliini D1 [47] ja c-MYC [48]. Muita NF-KB kohdegeenien jotka edistävät tuumorisolun muuttoliike ja /tai etäpesäkkeiden kuuluvat soluadheesiota molekyyli, kuten ICAM-1 ja VCAM-1 [49]; matriisimetalloproteinaaseja, kuten MMP-9; kemokiinireseptorit, kuten CXCR4: ään, ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [50]. Tuoreessa raportissa, NF-KB osoitettiin säännellä laaja verkosto geenien; paljon enemmän kuin alun perin arvioitiin [51]. Merkitys
hTREX84
uutena RelA /p65 tavoitetta ei pidä unohtaa yksinkertaista toinen NF-KB säänneltyä geenin, koska. hTREX84 on välttämätöntä transkription venymä ja mRNA: n vientiä [11]. Siten on mielenkiintoista spekuloida, että NF-KB voi suoraan välittää mRNA aineenvaihdunnan säätelyn kautta
hTREX84
syöpäsoluissa. NF-KB: n on myös tietää indusoida joitakin sytokiinien ja kemokiinien ja puolestaan indusoi ne [48], [52]. Tämä positiivinen palaute mechanismis yleensä aisoissa tuottaa krooninen tai liiallinen reaktio tiettyihin sairauksiin liittyvää kun NF-KB tulee poikkeavasti aktiivinen [52]. hTREX84 ja RelA /p65-alayksikköä NF-KB voitaisiin myös keskenään aktivoida aggressiivinen rintasyöpä. Aiemmissa tutkimuksissa hTREX84 stimuloi transkriptio RelA /p65 [53]; kuitenkin, rooli hTREX84 transkription tekijä ei ole vakiintunut. Havaitsimme myös, että hTREX84 ilmentyminen on parannettu estrogeenireseptorin (ER) rintasyöpä [11], kun taas konstitutiivisen NF-KB: n on osoitettu liittyvän aggressiivisempia rintasyöpiä [40], [42], [54] . Sinänsä ei ole molekyyli tavoitteiden ER-negatiivinen rintasyöpä on edelleen merkittävä terapeuttinen este. Aivan kuten NF-KB, hTREX84 voidaan pitää ihanteellinen terapeuttinen kohde ER-negatiivisen rintasyövän.
Muita transkriptiotekijöitä ovat omiaan edistämään sääntelyn
hTREX84
. Neljä AP-1 sitoutumiskohdat tunnistettiin
hTREX84
promoottorialueen. AP-1-transkriptiotekijän on dimeerinen kompleksi, joka sisältää jäsenet JUN FOS, ATF ja MMM-proteiinia perheiden [55]. Kohonnut AP-1-aktiivisuus myös löydetty ihmisen rinta- kasvaimissa ja lääkkeille vastustuskykyiset rinta- kasvainsolulinjoissa [56], [57], [58]. NF-KB voi epäsuorasti lisätä ilmentymistä AP-1-geenien fysikaalisesti liittämällä AP-1 [59]. Mahdollista roolia AP-1 ja muut transkriptiotekijät säätelyssä
hTREX84
ilmaisua vielä määritettävä; kuitenkin, meidän viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että RelA /p65 on keskeinen rooli säätelyssä
hTREX84
ilmentymistä rinta- ja munasarjasyövän.
Materiaalit ja menetelmät
Solulinjat ja Cell Culture
Media ja soluviljelmäreagenssit valmistettiin Cell Culture Facility Fox Chase Cancer Center. Kymmenen ensisijainen ihmisen munasarjan pintaepiteelisolujen (HOSE) soluviljelmissä ja 10 SV40 Tag kuolematon, ei-tuumorigeenisiä HOSE solulinjat perustettiin ja viljeltiin 199 Medium 15% FBS ja insuliini (290 yksikköä /per 500 ml), kuten olemme aiemmin kuvattu [ ,,,0],60]. Immortalisoitu ihmisen rinta- epiteelisolut MCF-10F (HMECs), jotka oli kasvatettu DMEM /F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% hevosen seerumia, insuliinia, hydrokortisonia, epidermaalinen kasvutekijä, koleratoksiini, ja antibiootit, perustettiin potilaasta, jolla sidekudossairaudessaan ja eivät näy piirteitä pahanlaatuisen fenotyypin [61], [62]. Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa OVCAR2, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR8, OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289, UPN300, A2780 [63], [64], [65], [66], ja rintasyövän solulinjoissa, MDA-