Krooninen sairaus

tiivistelmä

mucinous adenokarsinooma (MAC) edustaa erillistä histopatologinen kokonaisuus kolorektaalisyövän (CRC), joka liittyy tautiin etenemisen ja huono ennuste. Tässä havaittiin, että ekspressiotasot miR-205 ja miR-373 varta yliaktiivista vain potilaille, joilla on mucinous paksusuolen syövät, mutta ei CRC, että ei ole mucinous komponentteja. Tutkia vaikutukset miR-205 ja miR-373 suolen epiteelisolujen (IEC) biologia jonka vahvistus- ja loss of funktion kokeiluja proof-of-concept lähestymistapa päätimme aiemmin määritettyyn

in vitro

ihmisen Caco-2 perustuvia malleja eriytetty, ei-invasiivisia (ilmentävien TLR4 villityypin, kutsutaan Caco-2 [WT]) versus erilaistumaton, invasiivisia (ilmentävät TLR4 mutantti D299G, kutsutaan Caco-2 [D299G]) IEC. Suoliston kaltainen Caco-2 [WT] osoitti vähäistä miR-205 ja miR-373 ilmaisua, vaikka molemmat miRNA merkittävästi yläreguloituja kolorektaalikarsinoomasta kaltainen Caco-2 [D299G], mikä muistuttaa miRNA ekspressiokuviota pariksi normaali verrattuna kasvaimen näytteitä MAC potilaista. , Stabiili transfektio, me syntyy miR-205- tai miR-373-ilmentävät ja miR-205- tai miR-373 estävä alaklooneja näiden IEC linjat. Huomasimme, että käyttöönotto miR-205 osaksi Caco-2 [WT] johti laajentamiseen limaa erittävä pikarisolu- kaltaisia ​​soluja, joka liittyi induktioon Klf4 MUC2 ja TGFp 1 ilme. Aktivointi miR-205 Caco-2 [WT] aiheuttama chemoresistance, kun taas esto miR-205 Caco-2 [D299G] edistetään kemosensitiivisyys. Caco-2 [WT] yli-ilmentävät miR-373 osoitti mitoottisia poikkeavuuksia ja tehtiin morfologisia muutoksia (tappio epiteelin polaarisuus, solun tukirangan uudelleenjärjestely, ja junktionaalinen häiriö) liittyy epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja eteneminen tulehdukseen liittyvä paksusuolen syöpä, joka korreloi induktion fosforyloituu STAT3 ja N-kadheriiniekspressiota. Toiminnallisesti käyttöönotto miR-373 osaksi Caco-2 [WT] rustokadon solu-solu tarttumista ja lisätä leviämisen ja invaasion. Käänteisesti, esto miR-373 annettiin mesenkymaalisten IEC takaisin epiteelin ominaisuuksia, jotka korreloivat ilman neoplastisten etenemisen. Käyttämällä hiirissä osoittivat miR-373-välitteistä kiihtyvyys pahanlaatuisten suoliston kasvaimen kasvua. Lopuksi todettakoon, että tulokset antavat ensimmäistä näyttöä siitä miR-205 ja miR-373 voidaan differentiaalisesti edistää aggressiivinen fenotyyppi MAC CRC.

Citation: Eyking A, Reis H, Frank M, Gerken G, Schmid KW , Cario E (2016) MiR-205 ja MiR-373 liittyvät Aggressiivinen Human mucinous peräsuolen syövän. PLoS ONE 11 (6): e0156871. doi: 10,1371 /journal.pone.0156871

Editor: Aamir Ahmad, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2016; Hyväksytty: 20 toukokuu 2016; Julkaistu: 06 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Eyking et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: Tämä tutkimus tukee Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant CA226 /4-3 EY) ja sisäisen rahoituksen (Sisäiset Forschungsförderung Essen EY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä ja yksi johtavista syistä syöpään liittyvän kuoleman maailmassa [1]. Sisällä heterogeeninen CRC-spektri, mucinous adenokarsinooma (MAC) edustaa erillistä histologinen alatyyppi, jolle on tunnusomaista runsas tuotanto solunulkoisen musiinia ( 50% tuumorin tilavuudesta) [2]. Tyypillisesti, paksusuolen pikarisolujen johdettu musiinia MUC2 ilmentyy korkeilla tasoilla MAC [3]. Liman liikaeritys on yhdistetty muutoksiin suoliston mikrobiston ja induktio tulehdusvasteesta, jotka voivat edistää kasvainten kehittymiseen [4]. Vaikka esiintyvyys vaihtelee 4%: sta 11% kaikista CRC tapauksista riippuen maantieteellisestä sijainnista [5], MAC on paljon yleisemmin diagnosoitu potilailla, joilla on CRC Haavainen paksusuolitulehdus (UC) [6]. Uskotaan, että krooninen tulehdus UC saattaa helpottaa poikkeavaa mucin erilaistumista CRC synnyssä [7], mutta signalointireittejä ei vielä ymmärretä.

Kliinisesti MAC on liittynyt kehittyneempien kasvain vaiheessa diagnoosin, kehno terapeuttisen vaikutuksen ja vähentää eloonjäämisen useita sarjan [8-11]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet yksilöllisen hoidon ja hallinnan strategioiden sairastavien potilaiden MAC, ennusteen Metastasoituneessa näyttää olevan vielä huonompi kuin potilailla, joilla on muita alatyyppejä CRC [12]. Kasvava näyttö viittaa siihen, että MAC voi edustaa geneettisesti ja fenotyypiltään erilaisia ​​taudin kokonaisuus muunlaisista koolonadenokarsinoomasolulinjalla (AC) [13-15], mutta erityinen molekyylitason mekanismeja, jotka voivat johtaa taudin etenemiseen ja metastaattisen muutosta mucinous karsinogeneesissä ovat suurelta osin tuntemattomia.

MikroRNA (miRNA) ovat erittäin konservoitunut luokan 19-25 nukleotidin pituinen yksijuosteinen ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät monia biologisia prosesseja, kuten syövän synnyssä [16]. Muuttaminen monipuolinen miRNA profiilien on osoitettu korreloivan paksusuolensyöpä etenemisen muuntavan geenin ilmentymisen translaation ja /tai kopiointia monimutkaisissa signalointi verkoissa [17,18]. Kuitenkin miRNA ilmaisu allekirjoitukset voivat erota merkittävästi toisistaan ​​CRC populaatioiden [19], mahdollisesti heijastaa fenotyyppinen vaihtelevuus johtuu eri histologisia alatyypin jakaumat heterogeenisissä CRC ikäluokat [20]. Se on toistaiseksi epäselvää, onko yksittäinen miRNA saattaa laukaista biologista käyttäytymistä MAC. Viime aikoina riippumattomia raportteja ovat vaihtelevasti raportoitu miR-205 ja miR-373 liittyvän CRC [21-23], mutta yksittäisiä tapauksia ei ole luokiteltu histologinen alatyyppi.

miR-205 on vuorovaikutuksessa jäsenten miR -200 perhe (miR-200A /-200b) [24] ja edustaa epiteelin-erityinen miRNA [25], lähinnä mukana normaalin solun toimintoja, kuten uudistaminen ja kantasolujen laajentamiseen [26]. miR-373 kuuluu miR-520 /-373 perhe, joka koostuu kolmesta eri miRNA klustereita (miR-302 /-367, miR-371 /-372 /-373, ja miR-520) [27]. miR-373, tunnistettiin ensin alkion kantasolu-spesifinen miRNA [28], voivat suoraan säätelevät Wnt /β-kateniinin reitin [29]. Sekä miR-205 ja miR-373 näyttävät valvovan pleiotrooppisia vaikutuksia kasvainten synnyssä, riippuen solujen tai kudosten alkuperän. Ne kohdistaa useita geenejä tai proteiineja suoraan tai välillisesti [27,30] ja voivat siten toimia joko onkogeenien helpottamalla kasvaimen aloittamisen tai tuumorisuppressoreilla estämällä hyökkäystä. Signaloinnin kautta miR-205 ja miR-373 voi suosia epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja syöpäsolun muuttoliike tietyissä kasvain yhteisöihin [24,31-33]. Kuitenkin mahdollinen roolit miR-205 ja miR-373 CRC synnyssä pysyvät toistaiseksi tunneta.

Tässä osoitamme, että ekspressiotasot miR-205 ja miR-373 on erityisesti yliaktiivista vain mucinous CRC. Toiminnallisesti miR-205 ohjaa suolen epiteelisolujen kohtalon päätöksen kohti limaa tuottavien pikarisolujen kaltaisia ​​linjan ja miR-373 ohjaa tulehdukseen liittyvä kasvaimen etenemistä pienentämällä solu-solu-adheesion ja lisäämällä hyökkäystä. Siten tarjoamme ensimmäiset todisteet siitä, että erillisiä signalointi vaikutukset miR-205 ja miR-373 voidaan differentiaalisesti edistää ainutlaatuinen fenotyyppi MAC CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

yksityiskohtainen luettelo kaikista vasta-aineiden annetaan S1 taulukossa. Metotreksaatti (MTX) saatiin Pfizer ja matrigeelin

® välille Corning.

Ihmisen paksusuolisyövän yksilöitä

suoritettu retrospektiivinen, single-keskus kohorttitutkimuksen potilailla, joilla on diagnosoitu CRC käyttämällä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) materiaali arkistoidaan vuoden 2003 heinäkuun ja marraskuun 2013 Institute of Pathology, University Hospital of Essen, Saksa. Tämä tutkimus noudattaneet Helsingin julistuksen ja hyväksyi paikallinen eettinen komitea ( ”Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essenin” # 13-5602-BO, nimetön analyysi historiallinen kokoelma). Taulukossa 1 esitetään histopatologinen ominaisuudet 51 potilasta. Vain sovitettu viereisen ei-neoplastisia, normaalia kudosta (R

0) ja kasvainblokki paria kulloinkin olivat mukana. Kaikki kasvain ja pariksi kasvaimettomina kudokset patologisesti tarkistetaan, luokitellaan peräsuolen adenokarsinooma (AC) ja jaettu 1. tavanomainen (määritelty seuraavasti: 50% rauhasen muodostumista, ei musiinituoton), 2. mucinous ( 50% ekstrasellulaarinen musiinigeenit), tai 3. krooninen UC liittyvää (mitään histologisia variantti). Alatyypin useimmiten havaittu UC liittyvien CRC oli MAC ( 50% solunulkoisen musiinia) tai AC mucinous komponentin ( 50% vaurion koostuu musiinia) (

n

= 10), kun taas loput oli sinetti cell (

n

= 1) tai rauhanen muodostava AC (

n

= 2). Mikään tavanomaisen kasvainten luokiteltiin huonosti eriytetty, verrattuna lähes kaksi kolmannesta mucinous (60%;

p

0,0001; Fisherin eksakti testi) tai enemmän kuin yksi kolmasosa UC liittyvän (38%;

p

0,01; Fisherin tarkka testi) kasvaimia. Kaikki näytteet (kasvain vs. R

0) UC potilailla osoitti lievää tai kohtalaista tulehdusta.

Solulinjat

Ihmisen suolen epiteelisolujen (IEC) linja Caco-2 edustaa laajalti käytetty malli tutkia molekyylitason tapahtumia osallistuu erilaistumiseen ja syövän etenemisen vaiheet [34]. Sukupolven ja fenotyyppien ihmisen IEC linjat, jotka ovat peräisin Caco-2 (saatu ATCC cat # HTB-37, erä 1537739) transfektoitu stabiilisti TLR4-WT tai TLR4-D299G konstruktioita äskettäin kuvattu yksityiskohtaisesti [35]. Caco-2-TLR4-WT osoittavat tyypillisiä morfologisia ja toiminnallisia ominaisuuksia tavanomaisen, kypsä suoliston, ja nimettiin Caco-2

WT. Kasvu kuvio Caco-2

WT on ei-invasiivisia ja IEC alkaa polarisoituvan kohti yhtymäkohta, verrattavissa vanhempien Caco-2. Sen sijaan, Caco-2-TLR4-D299G omaksunut aggressiivisen fenotyyppi koolonkarsinooman solujen [35], ja ne kutsutaan Caco-2

D299G. Nopeutettu kasvua Caco-2

D299G on erittäin invasiivinen ja IEC pysyvät eriyttämätön tilassa huolimatta yhtymäkohta. Kuvattu fenotyypit aiemmin toistettu 3 klooneja Caco-2

WT ja 3 klooneja Caco-2

D299G [35].

Muita johdetut solulinjat potilaalla on paksu- ja adenokarsinooma hankittiin ATCC: LS 174T (cat # CL-188, erä 3752718), HT-29 (cat # HTB-38; erä 1467609), HCT-116 (cat # CCL-247, erä 60286831) ja SW480 (kissa # CCL- 228; [36]), jossa kaikki vaihtelevasti ilmaista MUC2 [37-39]. Caco-2, HT-29 ja HCT 116 kasvatettiin korkea-glukoosi (4,5 g /l) DMEM (Life), SW480 Leibovitzin L-15 (Life) ja LS 174T in EMEM (ATCC). Kaikki alustat täydennettiin 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Life tai PAA) ja 10% FBS (Thermo; erä RYF35911), paitsi Caco-2, joka sai 20% FBS. Kaikki solulinjat testattiin rutiininomaisesti negatiivisia mykoplasman (MycoAlert

™, Lonza).

plasmidikonstrukteja ja vakaa transfektio

klooneja eGFP-tagged miExpress

™ edeltäjä miRNA Mir -205 (cat # HmiR0026-MR04) ja miR-373 (cat # HmiR0347-MR04) ja vastaavat lähtöaineiden miRNA salattu ohjaus klooni (miR-c) vektori pEZX-MR04 (cat # CmiR0001-MR04) sekä klooneja mCherry leimatun miArrest

™ miRNA estäjiä miR-205 (α-miR-205; cat # HMIR-AN1314-AM02), miR-373 (α-miR-373; cat # HMIR-AN0461-AM02) ja vastaavat miRNA estäjä salattu ohjaus klooni (α-miR-c) vektori pEZX-AM02 (cat # CmiR-AN0001-AM02) saatiin GeneCopoeia (Rockville, USA). Plasmidit (EndoFree Maxi, Qiagen) ja miRNA transfektoitiin stabiilisti osaksi suoliston kaltainen Caco-2

WT ja miRNA estäjät osaksi kohdunkaulan kaltainen Caco-2

D299G, vastaavasti. Transfektio suoritettiin Poly-D-lysiini päällystettyjä 12-kuoppalevyn käyttäen 1 ug plasmidia /kuoppa (Lipofectamine LTX, Thermo Fisher). Vakaa jatkokloonit valittu 1 ug /ml blastisidiinia ja 1-3μg /ml puromysiiniä (InvivoGen). 14-34 alaklooneja kohti plasmidia laajennettiin ja seulottiin eGFP /mCherry ilmaisun fluoresenssimikroskopialla. Niistä 2-7 loput ehdokkaat kohti plasmidia, yksittäiset jatkokloonit valittiin perustuu parhaisiin ekspressiotasot kypsän miR-205 ja miR-373 avulla qPCR analyysiä.

Ennen kokeita soluja (0,7-3 x 10

5/2 ml) viljeltiin 8 päivää, ellei toisin mainita. Vakioitu väliaine Caco-2

D299G väkevöitiin käyttäen Amicon Ultra-4 (3 kDa: n) Centrifugal Filter yksikköä (Millipore) ja inkuboitiin Caco-2

WT 18 h.

CD-1

nu /nu

ksenograftimallia

nainen CD-1

nu /nu

hiiriä (Charles River) pidettiin tiukassa erityisiä patogeenivapaissa olosuhteissa Central Animal Facility, University Hospital Essen, Saksa. Pöytäkirjat noudatti Saksan lain elävien eläinten käyttöä ja tutkimuksen hyväksyi Nordrhein-Westfalenin valtion virasto Nature, Environment ja kuluttaja. Ksenografti kokeet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35]. Isofluraani aiheuttama anestesian, CD-1

nu /nu

hiiriä (

n

= 4) iältään noin 7 viikkoa injektoitiin

s

.

c

. osaksi kupeet suspensioita 1 x 10

6 yhden solua 200 ul korkean pitoisuuden matrigeeliä

® /PBS (1: 1). Hiiret injektoitiin

i

.

p

. (0,5 mg in 500 ui) joka 5.

päivänä polyklonaalisilla anti-siaalihappoa GM1-vasta poistaa luonnollisten tappaja solujen toimintaa. Kasvaimet mitattiin digitaalisella jarrusatulat ja kasvaimen tilavuus (

V

) laskettiin käyttämällä kaavaa:

V

= 0,4 x

x

b

2 [

: pituus;

b

: leveys]. Kaikki hiiret tapettiin katkaisemalla kaula. Kasvaimet leikattiin jälkeen 11 tai 23 päivää kuoli hiiristä, puolitetaan formaliinikiinnitetyt ja parafinoidut, ja poikkileikkaus (5 um) värjättiin. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimystä ja vähentää käytettyjen eläinten määrää.

RNA /miRNA louhinta ja reaaliaikainen qPCR ilmentymisanalyysiä

Cell näytteet jäädytettiin triatsoli (RNA) tai Qiazol ( miRNA) -80 ° C: ssa. Yhteensä solujen RNA uutettiin (RiboPure Kit, Thermo Fisher Scientific) ja puhdistettu (Rneasy Kit, Qiagen). miRNA eristettiin käyttäen miRNeasy Kit (Qiagen). FFPE kudosnäytteet leikattiin 10 um paksu kohdissa jälkeen macrodissection (rikastamiseksi alueelle kiinnostuksen sisältöä, tarvittaessa). miRNA uutettiin yhdestä kuuteen peräkkäiseen osia samasta parafiiniblokkiin käyttäen miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) kanssa deparaffinization liuosta (Qiagen), mukaan manufacturer`s ohjeita. miRNA (1 ug) oli cDNA: ksi käyttäen miScript II RT Kit (Qiagen). Reaaliaikainen qPCR-analyysi suoritettiin käyttäen yksivaiheista QuantiFast SYBR Green RT-PCR-kittiä (Qiagen) on ”Mastercycler ep realplex

2″ (Eppendorf) reaaliajassa vahvistusta järjestelmän. QuantiTect Primer määritykset (Qiagen) käytettiin geenispesifisillä alukepareilla. miRNA ekspressiotasoja analysoitiin miScript Primer Analyysit (Qiagen) kanssa miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) aiheesta ”Mastercycler ep realplex

2″ reaaliaikainen järjestelmä. Kopio määriä yksittäisten transkriptien liittyi GAPDH (mRNA) tai RNU6 (miRNA) endogeenisinä valvonta (x /100000 kopiota) ja normalisoitu kuten.

Proteiinianalyysi immunoblottauksella

Proteiinit eristettiin viljellyistä soluista jääkylmässä lyysipuskuria (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X (Thermo Fisher Scientific), jota oli täydennetty PhosSTOP fosfataasilla /täydellinen Mini-inhibiittorin seoksen tabletit ja 1 mM PMSF ( Roche)). Immunoblottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [36]. Vahvista yhtäläinen proteiini lastaus, geelit värjättiin SimplyBlue (Thermo Fisher Scientific) ja blotteja uudelleenseulottiin anti-GAPDH. Edustaja blots vähintään 2 itsenäisestä kokeesta on esitetty.

ELISA

pitoisuudet CHI3L1 ja TFPI: n soluviljelmien supernatanteista määritettiin käyttäen ihmisen kitinaasi-3-like 1 ja kudostekijäreaktiotienestäjäesiaste Quantikine ELISA (R 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM.

Tulokset

Expression tasot miR-205 ja miR-373 ovat lisääntyneet limaa tuottavien ihmisen paksusuolen syövissä

tutkineet roolia miR-205 ja miR-373 patofysiologiassa eri histologisia alatyyppejä paksusuolisyövän arvioimalla niiden ilmaisua, yhdessä muiden miRNA, yksilöillä tavanomaisten, mucinous ja UC-liittyvän ihmisen paksusuolen adenokarsinooma. Vain sovitettu tuumorikudoksista viereisten ei-neoplastisia, normaali kirurginen marginaalit (R

0) kunkin potilaan tutkittiin. Ekspressiotasot miR-205 ja miR-373 oli erityisesti lisääntynyt kahden alaryhmän paksusuolen adenokarsinooma liittyy musiinituoton (mucinous ja krooninen UC liittyvät paksu- ja peräsuolen syövät) suhteessa viereisiin on normaalia koolonin limakalvoa (kuvio 1A ja 1 B). Huomattavaa on, että ilmaus miR-205 oli hieman suurempi UC-liittyvän syöpään verrattuna (ei-UC) mucinous syöpä. Ei merkittäviä eroja miR-205 ja miR-373 ilmentymistä havaittiin pareittain paksusuolen kasvainkudoksessa ja vastaavassa normaalissa limakalvon potilaista, joilla on tavanomaisten koolonin adenokarsinooma (ei-mucinous). Molemmat miRNA olivat yhtä ilmaistiin alhaisilla tasoilla koko kasvaimettomina paksusuolen kudokset näiden kolmen potilasalaryhmissä. Sen sijaan, miR-1, miR-10a ja miR-133a oli vaimentua ihmisen CRC tuumorikudoksissa, riippumatta histologiset alatyypin (S1A, S2A ja S3A kuvioissa).

Expression tasoa (A) asennuspalveli- 205 ja (B) miR-373 merkittävästi yläreguloituja ihmisen mucinous (

n

= 20) ja krooninen UC (

n

= 13) CRC kasvain alueilla verrattuna Hyväksytty R

0 marginaalit, määritettynä qPCR. Sen sijaan, ei ole merkittäviä eroja miR-205 ja miR-373 ilmentyminen on havaittu pariksi tavanomaisen CRC (

n

= 18), kasvainkudoksen ja vastaavat normaali limakalvo. (C) Vaikka suoliston kaltainen Caco-2

WT osoittamaan alhainen miR-205 ja miR-373 ilmaisua, molemmat miRNA merkittävästi yläreguloituja paksusuolikarsinooma kaltainen Caco-2

D299G soluja, arvioituna qPCR . (D) transfektointi tehokkuutta miR-205 /miR-373 esiasteita tai inhibiittorit vahvistavat qPCR vastikään luotu (katso materiaalit ja menetelmät) Caco-2

WT /miR-205, Caco-2

WT /miR -373, Caco-2

D299G /α-miR-205 ja Caco-2

D299G /α-miR-373 kloonia (n = 3 per klooni). Tulokset on esitetty suhteessa RNU6 miRNA ilmentymisen. Data esitetään keskiarvoina ± SEM (ns: ei merkittävää, *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001, ****

p

0,0001; A, B: Wilcoxonin-rank testi vertailuja Hyväksytty ryhmien (R

0 vs. kasvain), muuten pariton t-testi; C, D: pariton t-testi).

Kliinisesti mucinous paksusuolen syövät näkyy entistä progressiivinen kasvain vaiheessa jakelu alkudiagnoosin verrattuna tavanomaisiin tai UC-liittyvän CRC (taulukko 1). Advanced tauti kaukaisiin elimen etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi havaittiin useammin CRC potilailla kanssa mucinous alatyyppiä kuin potilailla, joilla on tavanomaisten tai krooninen UC kasvaimia. Emme kuitenkaan ei havainnut korrelaatioita miR-205 ja miR-373 ekspressiotasot ja syövän vaiheissa (mukaan lukien histologinen arvosana) missään alatyypin.

Expression of miR-205 ja miR-373 on yliaktiivista paksusuolen syöpä solut

in vitro

Seuraavaksi haluttiin selvittää vaikutukset miR-205 ja miR-373 solubiologian ja toiminta normaalissa ja neoplastisia suoliepiteeliin

in vitro

. Olemme aiemmin perustettu kaksi

in vitro

malleja ihmisen polarisoitunut, suoliston kaltainen (Caco-2

WT) ja erilaistumaton, paksusuolen karsinooma kaltainen (Caco-2

D299G) soluihin [35 ], kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Käyttämällä reaaliaikainen qPCR, löysimme (kuvio 1 C) että Caco-2

WT osoitti vähäistä miR-205 ja miR-373 ilmaisua, vaikka molemmat miRNA merkittävästi yläreguloituja Caco-2

D299G. Lisäksi miR-1, miR-10a ja miR-133a laskivat tuntuvasti vuonna Caco-2

D299G verrattuna Caco-2

WT (S1B, S2B ja S3B kuviot). Olemme myös seuloa muita CRC linjat, mutta ne eivät paljasta miRNA ekspressiokuvioiden samanlaisia ​​kuin ihmisen paksusuolen kudoksessa (S4 kuvio). Päätimme edetä käyttää näitä IEC alilinjat (Caco-2

WT ja Caco-2

D299G), koska ne mieluiten peilataan meidän miRNA ilmentymisen tulokset pariksi normaali ja mucinous peräsuolen adenokarsinooma näytteitä potilaista.

käyttäminen stabiili transfektio miRNA esiasteita tai inhibiittorit, muodostimme (katso materiaalit ja menetelmät) miR-205-ilmentävät ja miR-373-ilmentävät Caco-2

WT kloonia (Caco-2

WT /miR-205; Caco-2

WT /miR-373) sekä miR-205 estäviä ja miR-373-estävä Caco-2

D299G kloonia (Caco-2

D299G /α-miR-205; Caco -2

D299G /α-miR-373). Negatiivisina kontrolleina, salattu vektori-ilmentäviä klooneja käytettiin (Caco-2

WT /miR-c, Caco-2

D299G /α-miR-c). Yli-ilmennetty valmiiksi miR-205 ja pre-miR-373 ei voitu käsitellä lisäämään ilmentymistä kypsän miR-205 ja miR-373 Caco-2

WT, vastaavasti, mikä vahvistetaan qPCR analyysi (kuvio 1 D). Yli-ilmentyminen MIR-205- ja miR-373- estäjät vähensivät ilmentymistä kypsän miR-205 ja miR-373 Caco-2

D299G.

miR-205 indusoi kasvoi musiinituoton, kun taas miR-373 aiheuttaa erilaistamattomuuden

Kuten kuviossa 2A-2D, ohjaus klooni Caco-2

WT /miR-c osoitettu pylvään yksikerroksista normaalia, polarisoitu IEC säännöllisesti musiinin tuotantoa, kun taas ohjaus klooni Caco-2

D299G /α-miR-c osoitti litistetty yksikerroksista neoplastisten, erilaistumaton solut vähemmän mukiinia tuotantoon. Vakaa yli-ilmentymisen miR-205 Caco-2

WT indusoi muodostumista erittävien solujen sisältää suuria rakkuloita, joiden vaalean lucent sisältö miehittää lähes koko sytoplasmassa (kuvio 2A). Musiinituoton havaittiin PAS (kuvio 2B) ja TEM osoitti valtava rakkulat apikaalisella sytoplasmassa vähemmän elektroneja tiheitä (kuvio 2C), viittaavia mucoid aineita. Immunofluoresenssianalyysi vahvisti lisääntynyt tuotanto MUC2 in Caco-2

WT /miR-205 (kuvio 2D). Sen sijaan yli-ilmentyminen miR-373 Caco-2

WT aiheuttama piirteitä huonosti eriytetty, heterogeeninen solut kasvavat tasainen arkkia, joka muistutti neoplastiset Caco-2

D299G /α-miR-c (kuvio 2A-2D ). Suppressio miR-373 päinvastaiseksi joitakin neoplastisten ominaisuuksien Caco-2

D299G. Vakaa esto miR-373 Caco-2

D299G johti järjestämisestä polarisoitunut epiteelisolujen, joka muistutti eriytettyä Caco-2

WT /miR-c (kuvio 2A-2D).

( AD) Caco-2

WT yliekspressoivia miR-205 tai miR-373 näyttö merkittäviä morfologisia muutoksia verrattuna ohjata Caco-2

WT /miR-c. Sen sijaan tukahduttaminen miR-373 kääntää joitakin neoplastisten ominaisuuksien Caco-2

D299G. Kuvat ovat (

n

≥ 2 näytettä /klooni) osoittavat (A) H valkoiset nuolet osoittavat limaa (B) tai MUC2 (D) -positiivinen rakenteita.

miR-205 ja miR-373 häiritä suolen epiteelin esteen eheyden

edelleen ymmärtää morfologisia muutoksia aiheuttama by miR-205 ja miR-373, suoritimme joukon immunofluoresenssivärjäyksen kokeita arvioimaan vaikutuksia organisaatiorakenne aktiinisytoskeletonin (kuvio 3A), jakelu este liittyvien tiukka junktionaalinen ZO-1 (kuvio 3B) ja fosforia p-kateniini (kuvio 3C) ja muodostumisen sukkularihmaston (kuvio 3D). Yli-ilmentymisen miR-205 Caco-2

WT välittämää häiriintyminen aktiini-pohjainen tukirankansa ja vähentynyt ilmentyminen ZO-1 solukalvon, mutta ei muuttanut mitoottisiin lukuja. Yli-ilmentymisen miR-373 Caco-2

WT aiheuttanut häiriöitä ja epäsäännöllinen uudelleenjako aktiinisäikeiden, tiukka junktionaalinen ZO-1 ja fosforyloitu β-kateniinin sytoplasmaan, mikä vaarantaa suolen Epiteeliesteen ja aidan toiminto. Lisäksi suurennettu ytimiä Caco-2

WT /miR-373 paljasti kokonaispaino häiriöiden sukkularihmaston, verrattavissa Caco-2

D299G /α-miR-c. Sen sijaan, inhibitio miR-373 Caco-2

D299G edistää epiteelisolujen kiristäminen apikaalisella polarisaatio aktiinifilamenttien ja uudelleen perustaminen ZO-1 ja fosfo-β-CATENIN- liittyvät esteen eheys, mikä vähentää mesenkymaaliset fenotyyppi huonosti eriytetty Caco-2

D299G. Merkillistä, Caco-2

D299G /α-miR-373 osoitti normaalia mitoosi metafaasit, verrattavissa Caco-2

WT /miR-c. Kuitenkin esto miR-205 Caco-2

D299G ei muuttanut fibroblastien kaltainen ulkonäkö aktiinisytoskeletonver- epäjärjestyksestä, soluliman uudelleenjako ZO-1 ja poikkeava mitoottisia.

Expression of miR-205 ja miR-373 differentiaalisesti (A) muuttaa aktiinisytoskeletonver- arkkitehtuuri, vaikutteita (B) ZO-1 ja (C) fosfo-β-kateniinin -associated esteen eheyden, ja (D) indusoi muodostumista monitumaisten solujen moninapaisen karat. Kuvat ovat (

n

≥ 2 näytettä /klooni) on immunofluoresenssivärjäyksellä kanssa (A) phalloidin (AlexaFluor

® 647;

valkoinen

, keltainen bar, 20.29μm [3-ulotteinen etäisyys ], valkoinen palkki, 100 um), (B) anti-ZO-1 (AlexaFluor

® 647;

valkoinen

, bar, 50 pm) ja DAPI (

sininen

), (C ) fosfo-β-kateniinin (AlexaFluor

® 647;

vihreä

, bar, 50 pm) ja DAPI (

punainen

) ja (D) anti-fosfo-histoni H3 (PacificBlue <