Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epibrassinolide (EBR) on poly- steroli- johdannainen ja biologisesti aktiivinen yhdiste on brassinosteroideja. Lisäksi kuvataan hyvin rooleja kasvien kasvua, EBR indusoi apoptoosia LNCaP eturauhassyövän solut, jotka ilmentävät funktionaalisia androgeenireseptorin (AR). Sen vuoksi on ehdotettu, että EBR voisi olla estävä potentiaali androgeenireseptorin signalointireitin. Kuitenkin mekanismi, jolla EBR kykenee sen vaikutukset LNCaP on huonosti ymmärretty. Ongelman aukko tiedon, käytimme puolueeton maailmanlaajuinen proteomiikka lähestymistapa eli vakaa-isotooppi merkintöjä aminohappojen soluviljelmissä (SILAC). Kaikkiaan 964 proteiineja tunnistettiin, 160 joista ilmentyvät eri kuluttua 12 h EBR hoitoa. Määrällinen differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien paljasti, että ilmentymisen laskostumattoman proteiinin vaste (UPR) kaperoniproteiinina, kalretikuliinin (CALR), dramaattisesti vaimentua. Väheneminen CALR ilmentyminen oli myös validoitu immunoblottauksella. Koska meidän data paljasti, että osallistuminen UPR vastauksena EBR altistumista, arvioimme ilmaus muiden UPR proteiineja. Olemme osoittaneet, että EBR hoidon vaimentua kalneksiini ja voimistunut BiP ja IRE1α ekspressiotasot ja indusoi CHOP translokaatio sytoplasmasta tumaan. Translokaation CHOP kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 aktivaation jälkeen 12 h EBR hoitoa. Co-hoito EBR kanssa rapamysiinin, ylävirran mTOR estäjä, esti EBR aiheuttama solujen elinkelpoisuuden menetys ja PARP pilkkominen LNCaP eturauhasen syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että EBR voisi aiheuttaa ER stressiä näissä soluissa. Lisäksi havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia DU145 solujen funktionaalinen androgeenireseptorin. Kun proteasomaalisten hajoaminen proteiinien esti MG132 co-hoito, EBR hoito edelleen aiheuttama PARP pilkkominen suhteessa pelkkään lääkehoitoon. EBR indusoi myös Ca

2+ sitomisen, jotka vahvistivat muuttaminen ER reitin takia lääkehoitoa. Siksi ehdotamme, että EBR edistää ER stressiä ja indusoi apoptoosia.

Citation: Obakan P, Barrero C, Coker-Gurkan A, Arisan ED, Merali S, Palavan-Unsal N (2015) SILAC-Based massaspektrometria analyysi paljastaa, että Epibrassinolide indusoi apoptoosia kautta aktivointi Endoplasmakalvosto Stressi eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (9): e0135788. doi: 10,1371 /journal.pone.0135788

Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 04 elokuu 2014; Hyväksytty: 27 heinäkuu 2015; Julkaistu: 09 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Obakan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Istanbulin Kultur yliopiston tiedehankkeita Support Center ja Temple University Felsin Institute of Cancer ja molekyylibiologian osasto käyttämällä omia resurssejaan.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

brassinosteroideja (BRS) ovat steroidi johdettuja molekyylejä lukuisia fysiologisia vaikutuksia, kuten sääntely hormonaalisen tasapaino, proteiinin aktivoitumisen ja nukleiinihapon synteesi, entsymaattinen aktiivisuus, solusyklin ja solujen kasvua [1, 2]. Rinnalla hyvin kuvattuja vaikutuksia kasveihin, niiden roolit nisäkässoluissa ovat huonosti tunnettuja ja parhaillaan tutkitaan syöpälääkkeet [3-5]. Äskettäinen käsityksen mukaan EBR, jäsen perusasetusten indusoi apoptoosia tehokkaammin ydin- hormonin reseptorin (NHR) ilmentävä syöpä solulinjoja, kuten LNCaP eturauhasen [kanssa androgeenireseptorin (AR)] [4] tai MCF-7 rinta syöpäsolulinjoissa [estrogeenireseptori (ER)] [3]. Rakenteellinen samankaltaisuus EBR nisäkkään steroidien [6] on ehdotettu mahdollisimman syynä hormonaalista spesifisyyden. Kuitenkin molekyylitasolla EBR spesifisyys ei ole selvitetty. Meidän aiemmat kokemukset osoittivat, että vaikka EBR (25 uM) oli voimakas apoptoottisten indusoija LNCaP (AR +) eturauhasen syöpäsoluja, se oli myös yllättävän tehokas apoptoosin indusoimiseksi DU 145 (AR) soluja. Tärkeää on, EBR hoito ei ollut sytotoksinen ja PNT1a normaalin eturauhasen epiteelisolujen [4]. Selventämiseksi terapeuttista potentiaalia EBR, tutkimme koko proteomiin LNCaP tai ilman EBR hoitoa.

käyttö kvantitatiivisia proteomic lähestymistapojen todennäköisesti antaa tietoa tärkeimmistä molekyyli allekirjoitukset ja yksityiskohtainen ymmärtäminen asianomaisia ​​tavoitteita [7]. SILAC (vakaa isotooppi Merkintäsäännösten Aminohapot soluvilielmässä) analyysi on massaspektroskopia (MS) -Yhdistetty proteomic lähestymistapa ilman radioaktiivinen leimaaminen. SILAC perustuu sisällyttämistä tietyn ”kevyt” (

12C merkitty L-lysiiniä tai L-arginiini) tai ”raskas” (

13C merkitty L-lysiiniä tai L-arginiini) muoto aminohappo osaksi proteiineja. Muutaman solunjakautuminen kukin tiettyä aminohappoa korvataan sen isotooppi analogiset ja sisällytetty syntetisoituneeseen proteiineihin [8]. Tässä tutkimuksessa käytimme SILAC lähestymistapa tutkia uusia apoptoottisen potentiaalia EBR androgeenien reagoiva LNCaP eturauhasen syöpäsoluja.

Havaitsimme, että EBR vaikutti merkittävästi ilmaisun profiilia 160 proteiinien mukana erilaisissa solun toimintojen (cell tukirankansa, nukleiinihappo ja energia-aineenvaihduntaan, solukuolemaa ja proteiini ubikitinaatio) verrattuna käsittelemättömään kontrolliin näytteitä. Endoplasmakalvosto (ER) asukas kalretikuliini (CALR), kaperoniproteiinina, oli merkittävästi vaimentua keskuudessa 160 proteiineja. Olemme todenneet, että tasot ER stressin proteiineja muuttuneet, kun EBR hoidon LNCaP AR (+), ja sama profiili havaittiin myös ei-toiminnalliset AR ilmentävä DU145 eturauhassyöpäsolulinja. Muutokset ER stressin biomarkkereita laukaista apoptoosin kussakin solulinjassa; LNCaP-soluissa, apoptoosin aiheutettiin CHOP transaktivaa- ja translokaation tumaan. Lisäämällä rapamysiinin, kuten translationaalisen repressorin mTOR (nisäkkään rapamysiinin kohde), tai MG132, proteasomin estäjä, joka vähentää hajoaminen ubikitiinistä konjugoitujen proteiinien, muuttunut EBR indusoiman apoptoosin, mikä viittaa siihen, että ER stressiä aktivoitiin seuraavat EBR hoidon LNCaP-soluja. Todistaakseen suhde ER välittämän solukuoleman mekanismi jälkeen EBR hoidon, CALR plasmiditransfektiolla suoritettiin. EBR aiheuttama solujen elinkelpoisuuden menetys estyi vuonna CALR + LNCaP. Lisäksi kun CALR + LNCaP-soluja käsiteltiin EBR, emme tarkkailla ER stressiä välittämän apoptoottisia induktio, mikä viittaa siihen, että CALR on tärkeä tavoite EBR.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja vasta

Raskas lysiini ja arginiini [(13C6, 15N2) -L-lysiiniä ja (13C6) -L-arginiinia] saatiin Cambridge Isotooppi (Andover, MA); valo aminohappojen (L-lysiini ja L-arginiini) saatiin Sigma (St Louis, MO). Proteaasinestäjä cocktail saatiin Sigma (St Louis, MO). Vasta-aineet ER-stressi (BiP, CALNX, CALR, CHOP, IRE1α, PERK, ATF4, ATF6 ja PDI) ja apoptoosin (kaspaasi-12, kaspaasi-3, kaspaasi-9 ja PARP) saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Tunikamysiini ostettiin Sigma (St Louis, MO) ja liuotettiin DMSO: hon (10 mg /ml). PmCherry-koodattu CHOP plasmidi ostettiin Addgene (CHOP promoottori (-649 /+ 136) pmCherry-1, 36035). Kalsium vihreä väriaine määrittää solunsisäistä Ca

2+ tasoja ostettiin Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Rapamysiini ja MG132 ostettiin Tocris (Ellisville, MI, USA) ja Sigma (St. Louis, MO), tässä järjestyksessä.

Soluviljely

LNCaP (CRL-1740) ja DU 145 ( HTB-81) ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa saatiin American Type Culture Collection (ATCC). HEK-293 (CRL-1573) soluja käytettiin villityypin CALR mRNA eristäminen ja saatiin ATCC: stä. -Soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (PAN Biotech, Aidenbach, Saksa) ja 10000 U penisilliiniä /ml ja 10 mg streptomysiiniä /ml (PAN Biotech, Aidenbach , Saksa). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa (HERAcell 150; Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA).

Soluviljely vuonna SILAC mediassa

SILAC DMEM (Pierce Biotechnology) täydennettiin 10%: lla dialysoitua naudan sikiön seerumia (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1% streptomysiiniä /penisilliiniä. Raskas alustaan ​​lisättiin

13C

6 L-arginiinia ja

13C

6,

15N

2-L-lysiiniä. Valo alustaan ​​lisättiin normaalia L-arginiini ja L-lysiiniä. Sillä SILAC kokeita, LNCaP-soluja kasvatettiin rinnakkain joko kevyen tai raskaan median 5 päivän median korvaava 24 tunnin välein.

1-D SDS-PAGE erottaminen ja in-geeli trypsiinihajotuksen

Yhteensä solun proteiini eristettiin LNCaP-soluista käyttäen RIPA-puskuria (25 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS). Proteiini kvantitointi suoritettiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad Protein Assay) [9]. Näytteet, jotka sisälsivät yhdistetty 40 ug kokonaisproteiinia (20 ug ’raskas ”ja 20 ug'” kevyt ”), laimennettiin Laemmli-näytepuskuria (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), joka sisälsi 5% β-merkaptoetanolia. Seosta kuumennettiin sitten 5 min 90 ° C: ssa ja ladattiin 10% polyakryy- gels.1-D SDS-PAGE erotus suoritettiin mini Protean II-järjestelmän (Bio-Rad) 200 V: ssa 45 minuuttia. Bändit visualisoitiin Simply Blue Safe Stain (Life Technologies, CA, USA), ja kaistat olivat leikataan 12 osiin, jotka kuutioiksi osaksi ~ 1×1 mm ruudut. Sen jälkeen, kun värinpoistoliuosta 50% v /v asetonitriiliä (ACN), 25 mM ammoniumbikarbonaattia puskuria (bikarbonaatti-puskuri), proteiinit geelipalat pelkistettiin 10 mM ditiotreitolia (DTT) bikarbonaattipuskurissa, ja alkyloidaan inkuboimalla 50 mM jodiasetamidia bikarbonaattipuskurissa . Sen jälkeen kun geeli nestehukka 100% ACN, geelipalat peitti noin 50 ui 12,5 ug /ml trypsiiniä bikarbonaattipuskurissa in-geeliä ruoansulatusta. Inkubointi digestio suoritettiin 37 ° C: ssa 12 tuntia. Trypsiini inaktivoitiin muurahaishappoa 2%: n lopulliseen tilavuuteen, ja peptidit uutettiin ja puhdistettiin käyttämällä C18-Tip-pylvästä (ZipTips, Millipore, Medford, MA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [10].

GeLC- MS /MS ja data-analyysi

peptidit kuivattiin tyhjiösentrifugissa ja suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan 0,1% tilavuus /tilavuus trifluorietikkahappo (TFA) /H

2O. Peptidinäytteet ladattiin 2-ug kapasiteetin peptidi ansat (CapTrap; Michrom Bio-resurssit) ja erotettiin käyttäen C18 kapillaarikolonnia (15 cm 75 mm, Agilent), jossa Agilent 1100 LC pumppu tuottaa liikkuva faasi 300 nl /min. Gradienttieluointi käyttämällä liikkuvia faaseja A (1% ACN /0,1% muurahaishappoa, tasapainottaa H

2O) ja B (80% ACN /0,1% muurahaishappoa, tasapainottaa H

2O) oli seuraava (prosentit B, saldo A): lineaarinen 0-15% 10 min, lineaarinen 60% 60 min, lineaarinen 100% 65 min. Nano ESI MS /MS suoritettiin käyttäen HCT Ultra ioniloukku massaspektrometri (Bruker). ESI toimitettiin käyttäen distaalisen-pinnoite spray Silica kärki (id 20 um, kärki sisempi id 10 pm, Uusi tavoite, Ringoes, NJ). Massaspektrit hankittiin positiivisionisella tilassa, kapillaarinen jännite -1100 V ja aktiivinen ioni maksu ohjaus ansa skannausta 300-1500 m /z; käyttämällä automaattista vaihtoa MS ja MS /MS tilat, MS /MS pirstoutumisen suoritettiin kaksi runsain ionien kummallakin taajuuksia käyttäen törmäyksen aiheuttama dissosiaatio aktiivinen syrjäytyminen (jätetty jälkeen kahden spektrin ja vapautunut 2 min). Koko järjestelmä on täysin hallinnassa HYSTAR 3.2 ohjelmisto.

Massaspektrit tietojenkäsittely suoritettiin käyttäen Mascot Distilleriä (versio 2.4.3.3), jossa haku ja määrän työkalupakki vaihtoehtoja. Luodut de-isotoped huippu lista annettiin in-house Mascot palvelin 2.4.0 etsimiseen vastaan ​​SwissProt tietokantaversio 2013_01 (538849 sekvenssit; 191337357 jäämät). Mascot hakuparametrit vahvistettiin seuraavasti: laji, Homo sapiens (20233 sekvenssit); entsyymi, trypsiini kanssa maksimaalinen 2 väliin pilkkominen; kiinteä muutos: kysteiini carbamidomethylation; muuttuja muutokset: metioniinin hapetus, Gln- pyro-Glu (N-termi Q), Glu pyro-Glu (N-termi E), Label: 13C (6) 15N (2) (K), ja Label 13C (6) (R); 0,90-Da massa toleranssi prekursoripeptidi ioneja; ja 0,6 Da MS /MS fragmentti-ionit. SILAC kvantitointi suoritettiin Mascot Distillerissä käyttäen SILAC K + 8 R + 6 kvantifiointimenetelmä; SILAC tunnusluvut raskaan ja kevyen peptidi paria laskettiin Simpsons integrointimenetelmää, vähintään 1 peptidi on ainutlaatuinen sekvenssi ja 0,05 merkittävien kynnyksen. Seuraavia kriteereitä käytettiin arvioimaan proteiinin tunnistus: yksi tai useampi ainutlaatuinen peptidien ioni pisteet ≥45 ja kahden tai useamman ainutlaatuista peptidien ioni pisteet ≥30 (p 0,05 kynnys); proteiinit tunnistettu uutettiin käyttämällä MS Data Miner (MDM) [11]. Määrällisesti proteiineja, joilla ≥ 2 ja ≤ 0,5-kertainen muutos valittiin ja ryhmittyivät biologisia toimintoja, polku ja verkon analyysin avulla Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto (www.ingenuity.com) bioinformatiikan analyysi.

rakentaminen p-EGFP CALR plasmidi

Kokonais-RNA eristettiin HEK-293 ihmisen alkion munuaissoluja käyttäen TRIPure (Roche) mukaan valmistajan merkintöjä. Ensimmäisen juosteen cDNA puhtaaksi käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). CALR cDNA monistettiin käyttäen suunniteltu CALR geenispesifisiä kloonaus alukkeita: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ’; käänteinen, 5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3 ’. Protokolla sisältyi ensimmäisen denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 3 min, jota seurasi 30 sykliä, joissa 30 sekuntia. denaturointi 94 ° C: ssa, 30 s ja pariutuminen 55 ° C: ssa ja 45 sek. ja pidennys 72 ° C ° C: ssa, minkä jälkeen lopullinen pidennysvaiheen 72 ° C: ssa 10 min. Kymmenen mikrolitraa PCR-tuotteen ja 1 ug pEGF-LC3.1 plasmidit digestoitiin 10 U /ul EcoRI- ja Bglll (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa) 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Ruoansulatusta tuotteet alistettiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla ja sitten uutettiin agaroosigeelistä. Ligaatio PCR-tuotteen: plasmidi valmistettiin käyttäen 1: 1, 1: 3 ja 1: 5-suhteet T4 DNA-ligaasilla (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa). Rekombinantti-DNA transformoitiin HB101-soluja, jotka oli valmistettu käyttäen CaCl

2 menetelmällä. Positiiviset kloonit valittiin käyttämällä ampisilliinia (Amp) LB-agarmaljoille. Kaikki pesäkkeet poimittiin ja kasvatettiin 1 ml Amp + LB ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Plasmidit joka pesäke eristettiin käyttämällä QIAprep Spin Miniprep sarakkeet (Qiagen, Valencia, CA, USA). Plasmidit valitaan kymmenen pesäkettä käytettiin templaatteina monistamaan CALR geeni käyttämällä kloonauksen alukkeina PCR: ssä. Yksi valittu monistettu positiivinen plasmidi sekvensoitiin vahvistamaan Open Reading Frame (ORF) EGF-CALR -fuusiogeenin (İontek, Turkki). Sekvensoitu rekombinantti plasmidia käytettiin yli-ilmentyminen kokeissa.

Ohimenevä transfektio pEGFP-CALR plasmidi

LNCaP-soluja ympättiin yön yli 6-kuoppaisilla levyillä tiheydellä 3×10

5 solua /kuoppa. Noin 1 ug /ul pCMV-CALR läsnä ollessa transfektioreagenssia (Fugene HD, Roche, Mannheim, Saksa) valmistettiin seerumittomassa alustassa. Seosta inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa ja lisättiin varovasti tipoittain päälle soluihin. Sen jälkeen, kun 48-tunnin plasmidin transfektion jälkeen solut käsiteltiin 25 uM EBR, ja kokonais-RNA eristettiin CALR ilmentymisen analyysiä tai proteiinin uuttoa western blottauksella.

Ohimenevä transfektio CHOP-promoottori (-649 /+ 136) pmCherry -1 plasmidi

aktiivisuuden määrittämiseksi CHOP, LNCaP-solut transfektoitiin reportteri-konstrukti CHOP-promoottori (-649 /+ 136) pmCherry-1 (Addgene plasmidi 36035) käyttämällä Fugene-HD mukaisesti valmistajan ohjeiden ( Roche, Mannheim, Saksa), ja kloonit resistenttejä kanamysiinille (500 ug /ml Sigma, St Louis, MO, USA) syntyi.

arviointi apoptoottisen solukuoleman anneksiini V-FITC: llä värjäys

LNCaP-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille-levyille (3×10

5 solua /kuoppa), ja sitä käsiteltiin 25 uM EBR: ssa 24 tuntia. Sekä kelluva ja kiinnittyneet solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen anneksiini V: n sitoutumisen ja inkuboitiin anneksiini V-FITC: llä ja PI valmistajan ohjeiden mukaisesti (BD Biosciences, Bedford, MA). Tuhat tapahtumaa näytettä kohden hankittu Accuri C6 (BD Biosciences). Fluoresenssiemissiot kerättiin 530 nm ja 570 nm: band-pass suodattimet FITC ja PI, vastaavasti. Tiedot esitetään pistekuvioita (anneksiini fluoresenssi x-akselin suuntaan; PI fluoresenssi y-akseli). Numerot läsnä neljä neljännestä prosenttiosuutta elinkelpoisten (alhaalla vasemmalla), nekroottinen (ylhäällä vasemmalla), varhainen apoptoottinen (alhaalla oikealla), ja myöhäinen apoptoottiset (ylhäällä oikealla) soluihin arvioitiin käyttämällä BD Accuri C6 ohjelmisto (BD Biosciences).

Western blot-analyysi

Soluja viljeltiin 60 mm petrimaljoille täydelliseen alustaan. Media heitettiin pois, ja solut pestiin jääkylmällä 1 x PBS: lla ja lyysattiin ProteoJET nisäkässolun lyysipuskuria (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa). Kokonaisproteiinia tasot määritettiin käyttämällä Bradford-menetelmällä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [9]. Kokosoluliuotteista erotettiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin sähkön päälle polyvinylidenedifluoride (PVDF) (Roche, Mannheim, Saksa) suoritettiin elektroforeesi. Membraanit pestiin tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween-20 (TBS-T) [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 0,05% Tween-20] (Tween 20, Sigma Ultra, St. Louis, MO, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa, joka sisälsi TBS-T maidon yön yli 4 ° C: ssa. PVDF-kalvoille inkuboitiin puskurissa, joka sisälsi 5% (v: v) kuorittua maitoa liuos sopivia vasta-aineita CALR, CALNX, BiP, IRE1α, CHOP, ATF4, ATF6, PERK, PDI, Caspase 12, pilkottiin kaspaasi 9, kaspaasi 3, PARP, pilkottu PARP, β-aktiini (kukin laimennettu 1: 1000) ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Anti-kani sekundääristä vasta-ainetta, valmistettiin 1: 1000 laimennos 5% (v: v) kuorittua maitoa liuosta (CST, Denvers, MA, USA). Kalvoja huuhdeltiin TBS-Tween 20 ja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön yli. Lisäyksen jälkeen parantaa kemiluminesenssin reagenssia, signaalit HRP-kytketty vasta-aineet havaittiin käyttämällä ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kaikki tulokset toistettiin vähintään kolme kertaa ja edustavat blotit annettu.

mittaus solunsisäisen Ca

2+ tasoilla

LNCaP eturauhassyövän solut käsiteltiin EBR: ssa 12 h, ja solunsisäinen Ca

2+ tasot määritettiin kalsium green-1 (1 umol /l, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) värjäys 30 minuuttia. Virtaussytometria-analyysi värjätään solut suoritettiin virtaussytometrillä Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Kalsium green-1-värjättyjen solujen havaittiin fluoresenssimikroskopialla (viritys 506 nm, emissio: 531 nm).

Tilastollinen

Tilastollinen merkittävyys arvioitiin käyttäen yksisuuntaista parittomia t-testiä . P 0,05 otettiin tason merkitys. Western blot tulokset toistettiin vähintään kolme kertaa. Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja normalisoidaan p-aktiini.

Tulokset

Proteome EBR-käsiteltyjen LNCaP

Jos haluat saada maailmanlaajuinen näkökulma muutosten koko proteomi, LNCaP-soluja käsiteltiin EBR (25 uM) ja altistettiin SILAC hoitoon. Kaikkiaan 964 proteiineja tunnistettiin tällä tekniikalla. Muutokset yli 2-kertainen (≥ 2 ja ≤ 0,5) välillä kevyet ja raskaat proteiinit pidettiin merkittävinä mukaan cutoffs aiempien tutkimusten [10]. Määrällinen analyysi välillä pariksi näytteiden osoitti, että joukossa 964 proteiinit, 160 olivat muuttuneet merkittävästi 12 h EBR hoito (S1 taulukko).

toiminnallinen luonnehdinta tunnistettu proteiinien ja bioinformatiikan analyysi

seuraava analysoitu 160 ilmentyvät eri proteiineja suhteessa biologisen toiminnan, polku ja verkkoon IPA ohjelmistoa. Kuten on esitetty kuviossa 1, mukaan biologisen toiminnan analyysi, EBR-muutettu proteiineilla on toimintoja solujen kasvun ja lisääntymisen (16,6%), solukuoleman ja eloonjäämisen (14%), solu kokoonpano ja organisaatio (13,3%), solujen toiminnan ja huolto (13,3%), nukleiinihappo, aineenvaihduntaa (5%), DNA: n replikaation (4%), proteiinisynteesiä ja proteiinien laskostumista (3,7 ja 1%, vastaavasti) (kuvio 1). Analyysi kanoninen väyliä (p ≤ 0,05) tunnistetaan aldosteronin signalointi epiteelisoluissa sekä solujen metaboliareittiä (mukaan lukien UDP-N-asetyyli-d-galaktosamiinin biosynteesin, glukoneogeneesiä, rasvahappojen biosynteesi, proteiini ubikitinaation reitin, solun tukirangan merkinanto- ja muut) (kuvio 2). CALR osoitti merkittävää muutosta 12 h EBR hoidon pisteet 150, 11 tulitikut, raskas /kevyt suhde 0,4372 ja 4 peptidit (S1 taulukko). Lisäksi mukaan molekyylit liittyvät SILAC analyysitulosten CALR säädeltiin vähentävästi mukaan 2,287 kontrolliin verrattuna näytteitä (taulukko 1).

ympyrädiagrammina esittää 160 differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien.

Käyrä edustaa isäntäsolun toimintojen kanssa korkeimman pistemäärän (y-akseli), joka perustuu määrän säädellään eri tavalla proteiineja. Uudelleenprintattu Nerokkuus Pathways Analysis nojalla CC BY lisenssin luvalla QIAGEN Silicon Valley, alkuperäinen copyright 2000-2013.

EBR aiheuttama modulaatio CALR ilmaisun

Differentially ilmaisi proteiinit seuraavat EBR hoidon kartoitettiin 7 erityisiä toiminnallisia verkkoja kunkin verkkoon, joka sisältää 11 tai enemmän ”focus” jäseniä. Verkot kohteisiin vastasi solukuoleman ja selviytymistä, solu kokoonpano ja organisaatio, cellular kompromissi, solujen toiminnan ja huollon, lääkeainemetaboliaan, rasva-aineenvaihduntaan, solujen morfologia ja solujen toimintaa. CALR havaittiin merkittävä proteiinin soluvasteen, solu kokoonpano ja organisaatio verkkojen (kuvio 3A). Koska CALR on kaperoniproteiinina ja koska muutokset että CALR lauseke johtaa levitettyyn proteiinivaste ja ER stressiä, havaitsimme vuorovaikutusta CALR muiden molekyylien havaitsemiseksi todisteita UPR seuraavat EBR hoidon LNCaP eturauhassyövän solut. Vaikka otamme IPA polun analyysiä jälkeen EBR hoidon, järjestelmä ennustaa, että lämpö shock kaperoniproteiinina perhe voisi myös ollut mukana EBR aiheuttaman stressin olosuhteissa, kuten kuviossa 3B. Lisäksi, IPA vertailu EBR vaikutus muiden tunnettujen syöpälääkkeiden kanssa aiheuttaa samanlaisia ​​vaikutuksia osoitti, että EBR voi toimia ER-stressi indusoija, kuten tunikamysiini ja pystyy muuttamaan lämpösokkiproteiinien ja CALR (kuvio 3C).

A) punainen, sääteli proteiinit; vihreä, merkittävästi vaimentua proteiinit; valkoinen, proteiineja tiedetään olevan verkossa, mutta ei tunnistettu tutkimuksessamme. Värien osoittaa muutoksen suuruuden proteiinin ekspressiotasoja. Muodot ovat osoitus molekyyli- luokan (eli proteiini perhe). B) IPA osoittavat reittejä saattaa liittyä EBR aiheuttama solujen muutoksia, C. tunikamysiinillä, kuin syöpälääke aiheuttaa samanlaisen vaikutuksen. Liityntäraiteet molekyylit osoittavat molekyyli suhteita. Nuoli tyylit esiin erityisiä molekyyli suhteita ja suuntaavuus vuorovaikutusta. Uudelleenprintattu Nerokkuus Pathways Analysis nojalla CC BY lisenssin luvalla QIAGEN Silicon Valley, alkuperäinen copyright 2000-2013.

validointi proteiinin tunnistamisessa ja niiden määrän

Koska proteiini vuorovaikutusverkosto ja polku analyysi paljasti muuttaminen UPR vasteen eturauhasen syöpäsoluja altistetaan EBR, me seuraavaksi määritellään ilmaus tasoa muiden UPR proteiinien western blottauksella. Olemme vahvistaneet, että muutokset suhde CALR LNCaP-soluissa olivat yhdenmukaisia ​​niistä johdetut SILAC tutkimuksista (kuvio 4A, vasen paneeli). Kuten on esitetty kuviossa 4, vaikka EBR hoito vaimentua ilmentymistason CALNX, molekyyli- kaperonin BiP on voimistunut. Liiallinen kertyminen väärin laskostuneen proteiinin ER laukaisee dissosiaatiota BiP- ER kalvoon sijaitsee reseptorit kuten IRE1α, PERK ja ATF6 merkittävänä ER stressiä vastaus. Yhteisymmärryksessä muuttunut BiP- ilmaisun profiili, IRE1α, PERK ja ATF6 oli voimistunut seuraavat EBR hoidon LNCaP-soluissa (kuvio 4A, vasen paneeli). Olemme myös päättäneet ekspressiotasot muiden ER stressiin liittyvät proteiinit, kuten CHOP, ATF4 ja PDI proteiinin kokonaismäärästä lysaatit. Havaitsimme, että altistuminen LNCaP solujen EBR lisäsi ilmentymistä CHOP sekä sytoplasman ja ydinvoiman jakeet (kuvio 4C). Mielenkiintoista, PDI, stressiproteiiniannostelun runsaasti ER, ei koholla vastauksena EBR hoitoon. Liiallinen ja pitkäaikainen ER stressiä laukaisee apoptoosin. Tämän mukaisesti havainnon, EBR aikariippuvainen aktivoitu kaspaasi-12, kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 ja indusoi lohkaisu PARP (kuvio 4A, vasen paneeli). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin DU145 eturauhasen syöpäsoluja altistetaan EBR (kuvio 4A, oikea paneeli). Anneksiini-V /PI-värjäyksen tulokset vahvistivat, että EBR: n indusoiman apoptoosin LNCaP-soluissa (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittavat, että EBR: n indusoiman apoptoosin kautta UPR-akselin sekä syöpäsolujen riippumatta toiminnallisen AR ilmaisua.

A) kokonaismäärä proteiini eristettiin sen jälkeen, kun EBR hoidon, ja ilmaisu profiilit ER stressin biomarkkereita, kaspaasien ja PARP pilkkominen määritettiin immunoblottauksella käyttäen sopivia vasta-aineita. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. B) noin 2 x 10

5-solut ympättiin kuuden kuoppalevylle ja käsiteltiin EBR 12 ja 24 h. Anneksiini V-PI värjäys suoritettiin määrittämään apoptoottisia solupopulaatioiden. Fluoresenssisignaalit anneksiini V-FITC: llä ja PI: raportoidaan x-akselilla ja y-akselilla, vastaavasti. Numeroista neljä neljännestä prosenttiosuutta elinkelpoisten (alhaalla vasemmalla), nekroottinen (ylhäällä vasemmalla), varhainen apoptoottinen (alhaalla oikealla) ja myöhäinen apoptoottiset (ylhäällä oikealla) soluja. C) jälkeen 12-h EBR hoitoa, soluliman ja ydin- proteiinit eristettiin ja erotettiin 12% SDS-geelille, siirrettiin PVDF-kalvolle ja blotattiin anti-CHOP-aineella. D) LNCaP-solut transfektoitiin reportteri-konstrukti CHOP-promoottori (-649 /+ 136) pmCherry-1. CHOP aktivointi visualisoitiin fluoresenssimikroskopian. Eksitaatio: 575 nm Säteilyn: 601.

Jos haluat varmistaa, että tulos EBR: n indusoiman apoptoosin liittyvät UPR, LNCaP-solut transfektoitiin reportterikonstruktio CHOP promoottori (-649 /+ 136 ) pmCherry-1-plasmidi. Kuten on esitetty kuviossa 4D, EBR selkeästi indusoi CHOP toimintaa ja tuloksena puncta kuvio LNCaP-soluissa. Edelleen vahvistaa vaikutuksen EBR on ER stressiin liittyvät apoptoosin, me esti mTOR rapamysiinillä hoito estää

de novo

mRNA ja proteiinisynteesiä. Inhibitio mRNA-synteesin johtaa kertyminen taittamattoman /väärin laskostuneen proteiinin ER ja ovat siten mahdollisesti lievittää ER stressin aiheuttama solukuolema [12]. Havaitsimme, että yhtäaikainen käsittely rapamysiinin merkitsevästi esti EBR aiheuttamaa solujen elinkelpoisuuden menetys (kuvio 5A) ja apoptoosin (kuvio 5B, vasen paneeli) LNCaP-soluissa. Vuonna Päinvastoin, 26S-proteasomin estäjä MG132 yhteistyössä hoidon entisestään solujen elinkelpoisuuden menetys (kuvio 5A) ja apoptoosin (kuvio 5B, oikea paneeli). Mukaan saatujen tietojen ehdotamme, että läsnäolo MG132 esti EBR aiheuttamaa hajoamista väärin laskostuneen proteiinien ja pahentaa apoptoottisen vasteen LNCaP eturauhasen syöpäsoluja. Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, että EBR-solukuolema mekanismi välittyy UPR eturauhasen syöpäsoluja.

A) Solujen elävyys aiheutuvaa yhteistyössä hoidon rapamysiinin (10 nM) tai esikäsittely jossa MG132 (10 uM), kun läsnä on EBR (25 uM) 12 tunnin ajan mitattiin MTT-määrityksellä. B) vaikutus rapamysiinin tai MG132 +/- EBR määritettiin PARP immunoblottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

CALR on tärkeä tavoite EBR

alkaa ymmärtää molekyylitason mekanismina EBR-indusoidun UPR, me transfektoitiin ohimenevästi LNCaP jossa on GFP-merkitty pCMV-CALR plasmidi (kuvio 6A). Samanaikaisesti käytimme tunikamysiinillä positiivisena kontrollina aktivoimiseksi ER stressiä AR-herkkien LNCaP. Vaikka CALR yli-ilmentyminen estää EBR-riippuvaisen solun elinkyvyn menetykseen, se ei aiheuttanut sama vaikutus seuraavat tunikamysiini jälkeen (kuvio 6B). Vaikka tunikamysiinillä aktivoitu ER stressiä reitin säätelemällä ilmentymistä CALR, CALNX, BiP ja CHOP, EBR käsittely vain indusoi säätelyä CHOP mutta vaimentua CALR ja CALNX. CALR yli-ilmentyminen väheni mahdollista vaikutusta EBR on ER signalointi pelaajia, joka osoitti, että CALR on kriittinen kohde EBR LNCaP-soluissa. Lisäksi ehdotamme, että EBR eroaa tunikamysiinillä kautta aktivoimalla eri tavoitteet ER stressin koneen (kuvio 6C).

A) vaikutusta 12-h EBR hoidon jälkeen pEGFP-CALR plasmiditransfektiolla tehtiin näkyväksi kautta GFP pisteitä LNCaP. Tunikamysiini käsittely suoritettiin positiivisena kontrollina. B) vaikutus EBR in pEGFP-CALR plasmidi-transfektoiduissa LNCaP-soluissa 12-h EBR hoidon määritettiin MTT: llä. C) vaikutus EBR on ER stressiä ja apoptoosin biologisten merkkiaineiden CALR-transfektoiduissa LNCaP määritettiin immunoblottauksella. Tunikamysiini-käsiteltyjen solujen lysaatit käytettiin positiivisena kontrollina; β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Seuraavaksi määritetään apoptoottisen tehokkuuden EBR sekä paino- ja CALR + LNCaP-soluja. Kuten on esitetty kuviossa 6C, EBR aktivoitu kaspaasi-12, joka huipentui PARP pilkkominen LNCaP paino- soluissa, mutta ei CALR + LNCaP-soluja (kuvio 6C). Koska CALR on tärkeä säätelijä solunsisäistä Ca

2+ puskurointikyky, joka myös laukaisee apoptoosin, tutkimme Ca

2+ tasoille EBR hoidon (Kuva 7). Havaitsimme, että EBR hoito lisäävät vapautumista Ca

2+ 6-kertaiseksi LNCaP-soluissa.

Soluja käsiteltiin EBR 12 tuntia ja värjättiin kalsiumia vihreä. Fluoresenssin intensiteetti määritettiin FACS virtauksen ja fluoresenssimikroskopia (eksitaatio 506 nm, emissio: 531 nm).

Lopuksi ehdotetaan, että EBR indusoi apoptoosia eturauhassyövän soluissa aiheuttaa ER stressin CALR downregulation ja Ca

2+ vapauttaa sytosoliin (Kuva 8).

keskustelu

EBR, kasvien kasvunsääde, on hiljattain ehdotettu ehdokkaaksi kemoterapeuttinen lääke, koska