Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

miR-23b sijaitsee kromosomissa numero 9 ja erilaisia ​​rooleja eri elimet erityisesti mitä tulee syövän kehittymisen. Kuitenkin toiminnallinen merkitys miR-23b-3p in munuaissolukarsinooma (RCC) ei ole raportoitu.

Menetelmät ja tulokset

mitattu miR-23b-3p tasot 29 paria munuaissolukarsinooma ja niiden normaalin Hyväksytty kudoksia käyttäen reaaliaikaista PCR. Ilmaisu taso miR-23b-3p korreloi 5 vuoden pysyvyys munuaisten syöpäpotilailla. 15 tapauksessa (52%), miR-23b-3p-ekspressio havaittiin olevan korkea. Kaikki potilaat, joilla on kohtalainen tai alhainen miR-23b-3p ilmaisu selvisi 5 vuotta, kun taas ne, joilla on korkea miR-23b-3p ilme, vain 50% selvisi. Sen jälkeen kaatamalla miRNA-23b-3p ilmentyminen RCC solulinjoissa, siellä oli apoptoosin induktio ja vähentää invasiivisia ominaisuuksia. MiR-23b-3p osoitettiin suoraan kohdistaa PTEN geenin kautta 3’UTR toimittaja määrityksissä. Esto miR-23b-3p indusoi PTEN geenin ilmentymisen kanssa kaventumiseen PI3-kinaasi, yhteensä Akt ja IL-32. Immunohistokemia osoitti puute PTEN-proteiinin ilmentymistä syöpäsoluissa alueilla kudosnäytteiden jossa ilmaus miR-23b-3p oli korkea. Olemme tutkineet

in vitro

vaikutukset ravinnon Chemo ehkäisevä aine genisteiini- Mir-23b-3p ilmaisua ja todennut, että se esti ilmentyminen miR-23b-3p RCC solulinjoissa.

Johtopäätökset

nykyinen tutkimus osoittaa, että miR-23b-3p on onkogeenisessä miRNA ja estää PTEN tuumorisuppressorigeeni RCC. Siksi inhibitio miR-23b-3p voi olla hyödyllinen terapeuttinen kohde hoidettaessa munuaissolukarsinooman.

Citation: Zaman MS, Thamminana S, Shahryari V, Chiyomaru T, Deng G, Saini S, et al. (2012) esto PTEN Gene Expression onkogeeninen miR-23b-3p munuaisten Cancer. PLoS ONE 7 (11): e50203. doi: 10,1371 /journal.pone.0050203

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2012; Hyväksytty 17. lokakuuta 2012 Julkaistu: 26 marraskuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat VA Merit Review, VA Program Project ja NIH Grant RO1CA130860 (PI: R. Dahiya). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

miRNA on osoitettu olevan osallisena erilaisissa munuaisten sairaudet [1]. miR-23b sijaitsee kromosomissa numero 9 klusterin miR-27b ja miR-24-1 [2]. On osoitettu, pelata erilaisia ​​rooleja eri elimissä erityisesti mitä tulee syövän kehittymisen. Syövät, kuten virtsarakon, ja suun okasolusyöpä [3] – [4] on osoitettu olevan yli ilmaistuna. Munuaissyövässä miR-23b-5p toimii mahdollisena oncomir tukahduttamalla proliini-oksidaasi, joka on uusi tuumorisuppressoriproteiinia [5]. Kun taas eturauhassyövässä [6], se roolissa kasvainsuppressorigeenin microRNA kuin se on kohdistettu onkogeenisel- transkriptiotekijä c-myc. Tämä johtaa lopulta kasvua proteiinin ilmentymisen pro-syöpä entsyymin mitokondrion gluta-, joka on kohde miR-23b [7]. Rintasyövässä sen on osoitettu olevan jopa säädellä miR-27b ja miR-24-1 mukaan oncosuppressor transkriptiotekijä ER [8]. Vastaavasti, maksasolukarsinoomassa se toimii tuumorisuppressorina kohdistamalla urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) ja c-met mikä laski muuttoliike ja proliferaatiota HCC-solujen [9]. Paksusuolen syöpä se toimii tukahduttaa syövän etäpesäkkeiden kohdistamalla prometastatic geenejä FZD7 tai MAP3k1 [10].

Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia miR-23b-3p munuaisten selkeä karsinooma. Huomasimme, että ilmentyminen miR-23b-3p nostettiin A-498 ja Caki-2 solulinjojen ja enemmistö kudosnäytteistä. Lisääntynyt ilmentyminen korreloi myös pienempi eloonjäämisaste munuaissyövän potilaille. Esto miR-23b-3p ilmentymisen A-498 ja Caki-2-solut aiheutti apoptoosin lisääntyminen ja lasku invasiivisia ominaisuuksia. PTEN-proteiinin ilmentyminen havaittiin nostetaan jälkeen kaatamalla miR-23b-3p A-498-solujen kanssa samanaikaisesti väheneminen ilmaus PI3-kinaasi, yhteensä Akt ja IL-32. PTEN-geenin osoitettiin olevan suoraan kohteena miR-23b-3p 3 ’lusiferaasireportterilla määrityksissä. Immunohistokemia osoitti puute PTEN-proteiinin ilmentymistä syöpäsoluissa alueilla kudosnäytteiden jossa ilmaus miR-23b-3p oli korkea.

Tulokset

miR-23b-3p on Up säännelty Munuaisten syöpä kudosnäytteitä ja munuaissyövän Solulinjat

Ymmärtääksemme kliinistä merkitystä miR-23b in munuaissyövän mittasimme miR-23b-3p tasot 29 paria ihmisen munuaisen syövistä (kaikki kirkas cell munuaissolukarsinooma) ja sovitetun normaalit kudokset reaaliaikaisella PCR: llä. 15 tapauksessa (52%), miR-23b-3p todettiin korotetaan (T /N [Kasvain /Normaali] oli yli 1,2). 5 näytettä (17%) ilmaisu oli kohtalainen (T /N 0,8-1,2). Expression of miR-23b-3p mitattiin myös viljellyissä munuaisten syöpäsolulinjoissa, A-498, ACHN, Caki-1, Caki-2 ja muut pahanlaatuiset normaali HK-2-soluissa. miR-23b-3p ekspression A-498-soluja oli noin 11x, että HK-2-solujen kun taas ACHN oli 4.1x, Caki-1 4.8x, ja Caki-2 5,8-kertainen (kuvio 1).

A) suhde T /N ilmentyminen kudosnäytteiden havaittiin olevan korkea enemmistö näytteistä. B) A-498 ja Caki-2-soluissa oli korkea ekspressio miR-23b-3p verrattuna ei pahanlaatuinen normaalia HK-2-solujen (T-kasvain, N-Normal), [p-arvo (A) 0,032; p-arvo (B) 0,018)].

Korrelaatio miR-23b-3p Expression kanssa Survival munuaisten Cancer

Ilmaisu taso miR-23b-3p korreloivat 5 vuotta selviytymisen potilaista. Niille potilaille, joilla on kohtalainen tai alhainen miR-23b-3p lauseke (n = 12) (kuvio 2), kaikki selvisi 5 vuotta tämän leikkauksen, kun taas ne, joilla on korkea miR-23b-3p (n = 12) lauseke, vain 50% selvisi (kuvio 2). Selviytymisen käyrä perustui potilaiden määrä (24), joka meillä oli eloonjääminen tietoa ulos yhteensä 29 potilasta. Ei korrelaatiota kasvaimen, vaihe ja miRNA-23b-3p tasot havaittiin.

toiminnallinen rooli miR-23b-3p A-498 solut

Valaistaan ​​toiminnallista roolia Mir-23b-3p munuaisten syöpään me pudotti ilmaus miR-23b-3p A-498 ja Caki-2 munuaissyöpäsoluissa kaupallisesti saatavilla miR-23b-3p estäjä. Anti-miR-Negatiivinen kontrolli # 1 käytettiin myös näissä kokeissa. MIR-23b-3p tason aleni yli 99%, verrattuna negatiiviseen kontrolliin A-498-solut (kuva 3a). Anti-miR-23b-3p transfektiolla Caki-2-solut myös vähensi taso miR-23b-3p ilmentymisen näissä soluissa (kuva 3b).

Expression of miR-23b-3p väheni yli 99% sen jälkeen, kun esto sekä A-498 (A) ja Caki-2-solut (B).

vaikutus solusyklin ja apoptoosi

The effects of miR-23b- 3p kaataa solun syklin ja apoptoosin analysoitiin virtaussytometrialla. Apoptoosimäärityksessä osoitti merkittävää kasvua kokonaismäärän apoptoottisten solujen (varhainen apoptoottinen plus apoptoottisten) sekä A-498 (8,87%) (kuvio 4a) ja Caki-2-soluja (11,74%) (kuvio 4b), jossa miR-23b- 3p kaataa verrattuna negatiiviseen kontrolliin [A-498 (3,37%) ja Caki-2 (3,68%)]. Ei tapahtunut merkittäviä muutoksia solusyklin sekä A-498 ja Caki-2-soluissa (tuloksia ei esitetä).

A) Apoptoosin määritys osoitti merkittävää kasvua kokonaismäärän apoptoottisten solujen (8,87%) että anti miR-23b-3p estäjä transfektoidut solut verrattuna negatiiviseen kontrolliin (3,37%) A-498-solut (p-arvo 0,029). B) In Caki-2-solujen kokonaismäärä apoptoottisten solujen (11,74%) on anti- miR-23b-3p-inhibiittori transfektoiduissa soluissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin (3,68%) (p-arvo 0,030).

Vaikutus Cell Invasion ja Migration Properties

Voit selvittää miR-23b-3p vaikuttaa munuaisten syöpäsolujen muuttoliikettä ja Invasion cytoselect 24 kuopan solumigraation ja invaasiota kit käytettiin. A-498 ja Caki-2-solut transfektoitiin anti-miR-23b-3p-inhibiittorin ja anti-miR-Negatiivinen kontrolli. Sekä A-498 ja Caki-2-solut osoittivat 30%: n lasku solujen invaasiota näytteissä, joissa miR-23b-3p estyi verrattuna negatiivisiin kontrolleihin (kuva 5a ja 5b). Mitään merkittävää muutosta muuttoliikettä havaittiin sekä A-498 ja Caki-2-soluissa (tuloksia ei esitetä).

Invasive ominaisuudet A-498 (A) ja Caki-2 (B) solut laski 30 % jälkeen miR-23b-3p kaataa kontrolleihin verrattuna. Y-akseli-absorbanssi 560 nm: ssä [p-arvo (A) 0,026; p-arvo (B) 0,030].

PTEN on Lisääntynyt jälkeen kaataa Mir-23b-3p A-498 solut

nähdä vaikutuksen miR-23b-3p ilme eri geenien apoptoosin ja hyökkäyksen tarkistimme proteiinin ilmentymistä useiden geenien mukana näissä prosesseissa. Pro apoptoottinen geeni PTEN havaittiin jopa säädellä jälkeen miR-23b-3p kaataa A-498-solut (kuvio 6A). Olemme myös löytäneet lasku proteiinin tasot PI3-kinaasi ja yhteensä Akt. Mielenkiintoista, lasku ilmaus tulehdusta sytokiinien IL32 havaittiin myös, kun miR-23b-3p kaataa. Proteiinin ilmentyminen kvantitoitiin optisella densitometrillä käyttäen ImageJ ohjelmiston versio 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Kertainen muutos laskettiin suhde nettointensiteetti kunkin näytteen transfektoitu anti-miR-23b-3p jaettuna GAPDH ja negatiivisen kontrollin transfektoitu näytteitä jaettuna GAPDH (Anti-miR-23b-3p transfektoitujen näytettä /GAPDH) /(Neg ohjaus miR transfektoitujen näytettä /GAPDH) (kuvio 6B).

A) Expression PTEN, PI3-kinaasi, Akt ja IL-32 A-498-soluissa, verrattuna negatiiviseen kontrolliin. GAPDH: ta käytettiin normalisoi ohjaus. B) määrälliset tiedot Western blot -analyysiin. PTEN oli up säännelty, kun taas PI3-kinaasi, Akt ja IL-32 ilmentyminen oli säädeltiin.

PTEN on välittömänä kohteena miR-23b-3p

Koska merkittävä kasvu apoptoosin havaittiin sekä A-498 ja Caki-2-soluissa ja lisääntynyt PTEN ilmentymistä A-498-solujen jälkeen miR-23b-3p kaataa, me katsoimme onko miR-23b-3p kohdistettu pro apoptoottisen geenin PTEN. Käyttämällä TargetScan (targetscan.org) ja microrna.org tunnistimme täydentävät sekvenssit miR-23b 3’UTR PTEN geenin (kuva 7a). Suoritimme lusiferaasireportterista määrityksiä käyttäen 3’PTEN -rakenne miR-23b-3p tai miR-ohjaus- ilmentävät A-498-soluissa ja havainneet vakaa vähentäminen Lusiferaasiaktiivisuuden (kuva 7b) in miR-23b-3p transfektantit viittaa siihen, että miR -23b-3p tukahduttaa PTEN suoraan.

A) Software analyysi osoittaa sekvenssit komplementaarisia siemen sekvenssit miR-23b-3p 3 ’UTR PTEN geenin. B) lusiferaasianalyysissä väheni suhteellisesti lusiferaasiyksiköt näytteissä yhteistyössä transfektoitu miR-23b-3p oli ja PTEN 3 ’UTR geenikonstruktion verrattuna kontrolliin konstruktioita (Neg Con-negatiivinen kontrolli, Con-Control Plasmidirakenne puuttuvat PTEN 3’ UTR sivustoja miR-23b-3p, PTEN-PTEN plasmidirakenne ottaa PTEN geenin 3’UTR sivustoja miR-23b-3p, (p-arvo 0,017).

ilmentäminen PTEN proteiinin normaali ja syöpä alueet Kudosnäytteiden jonka korkea ilmentyminen miR-23b-3p

lisäksi vahvistaa, että PTEN on tavoite miR-23b-3p pyysimme ekspressoimiseksi PTEN proteiinin normaaleissa ja syöpä alueilla potilaskudos näytteet, jotka oli suuri ilmaus miR-23b-3p, käyttäen immunohistokemia (IHC). Kymmenen näytettä, joilla on korkea miR-23b-3p-ilmeneminen. edustava esimerkki PTEN immunohistokemiaa esitetään kuviossa 8A.

A) edustaja kuvaa immunohistokemia (IHC) analyysit. B) Graafinen esitys tietoja, jotka osoittavat, että PTEN ilmentyminen oli korkea normaaleissa alueilla munuaisten syöpäpotilaan näytteitä taas syöpä- alueilla, joilla on korkea miR-23b-3p ilmaisua PTEN ei havaittu.

IHC värjäys tulokset for kudokset porrastettu nopeaa pisteet (prosenttia solut värjätään × intensiteetti tahra). Nopea pisteet saatu Tuumorinäytteissä normalisoitunut nopea pisteet niiden normaalin näytteen (T /N) ja Chi-neliö testi suoritettiin miR-23b-3p ekspressiotasot samalla potilaalla näytteistä (kuvio 8B). Kaikki normaalit näytteet ilmaisivat PTEN proteiinin joskin vaihteli tasoilla. PTEN värjäys oli poissa kasvain näytteistä, jotka ilmensivät korkeampia tasoja miR-23b-3p (p 0,001) (kuvio 8B).

Genistein Vähentää Expression of miR-23b-3p A-498 Cells

tarkasteltiin myös vaikutusta kemopreventiossa agentti, genisteiini (soija tuote), ilmenemistä koskevat miR-23b-3p A-498-soluissa. Käsittely genisteiini (25 uM) 96 tunnin ajan vähensi ilmaus miR-23b-3p 50%, kun taas suuremman pitoisuuden genisteiinin (50 uM) saman ajanjakson ajan vähentynyt ilmentyminen 45% (kuva 9).

miR-23b-3p ilmentyminen väheni 50% 25 uM genistein käsitellään A-498-soluja verrattuna käsittelemättömiin soluihin, 50 uM genisteiini laski miR-23b-3p ilmentyminen 45% (p-arvo 0,030).

keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että miR-23b-3p toimii onkogeenisessä microRNA munuaissolukarsinoomassa. Sen ilmentyminen lisääntyy munuaissolukarsinoomassa solulinjojen ja kudosnäytteet (kirkas cell carcinoma) verrattuna normaaliin munuaisten soluihin ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin, vastaavasti. Lisäksi olemme huomanneet, että korkea miR-23b-3p johtaa alentaa selviytymisen munuaisten syöpäpotilailla. Tutkia toiminnallista roolia miR-23b-3p sen ilmentyminen pudotettiin A-498 ja Caki-2 munuaissyöpäsolujen solulinjoissa. Tämä johti kasvuun solujen kokonaismäärässä apoptoosin molemmissa solulinjoissa verrattuna kontrolleihin. Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta solusyklin. Lisäksi A-498 ja Caki-2-solut osoittivat laski soluinvaasiota in miR-23b-3p pudotti soluissa, mutta ei merkittävää muutosta muuttoliike. Western-analyysi miR-23b-3p kaataa osoittivat lisääntynyttä PTEN ilmaisun ja vähenivät samanaikaisesti ilmaus PI3-kinaasin, Akt ja IL-32. PTEN todettiin olevan suora kohteena miR-23b-3p kautta reportterigeenin määritykset.

merkittävä muutos määrän apoptoottisten solujen jälkeen kaataa Mir-23b-3p sekä A-498 ja Caki -2 solut johtaa meidät etsimään geenien ja reittejä mukana apoptoosin. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PTEN voivat aiheuttaa apoptoosin kautta PI3-kinaasi riippuvaisen reitin [11]. PTEN toimii kasvainsuppressorigeenin toiminnan kautta sen fosfataasiproteiinin tuotteen [12], hajottavia PIP3 passiiviseksi fosfatidyyli (4,5) -diphosphate PIP2 [13], [14]. Tämä puolestaan ​​säätelee negatiivisesti pro-selviytymisen PI3K /Akt signalointireitin. Fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) reitin säätelee solujen eri prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen, kasvun, apoptoosin ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyn. PI3K: t ovat heterodimeerisiä lipidejä kinaaseja, jotka koostuvat sääntely- ja katalyyttinen alayksiköt koodataan eri geenit [15]. Yksi tärkeimmistä tehtävistä PI3K on syntetisoida toisiolähetiksi PtdIns (3,4,5) P3 (PIP3) peräisin PtdIns (4,5) P2 (PIP2). AKT, seriini /treoniinikinaasi, on useimpia materiaaleja, aktivoidaan värväyksen solukalvon läpi suoraan kosketukseen sen pleckstrin-homologia (PH) verkkotunnuksen PIP3 ja fosforylaation Thr308 ja Ser473. AKT toimii alavirtaan PI3K säädellä monien biologisten prosessien, kuten proliferaatiota, apoptoosin ja kasvua, mutta muut signaalinvälitysreittien tiedetään myös säätelevän PI3K ja saattaa olla mukana PI3K välittämän kasvaimien syntyyn. PTEN on yksi yleisimmin menetetty tuumorisuppressorigeeneille ihmisen syövässä. Aikana kasvainten kehittymiseen, mutaatioiden ja poistot PTENin esiintyä, jotka inaktivoivat sen entsymaattinen aktiivisuus, mikä lisää solujen lisääntymisen ja vähentää solukuolemaa. Usein geneettinen inaktivointi PTEN esiintyy glioblastooma, kohdun limakalvon syöpä, eturauhasen syöpiä; ja vähentää ilmentymistä monissa muissa kasvaimissa, kuten keuhko- ja rintasyövässä [15]. Tässä tutkimuksessa Western-analyysi osoitti myös, väheneminen IL-32 ilmentyminen sen jälkeen, kun estoa miR-23b-3p A-498-soluja. Emme seurata IL-32 viljelyalustassa. IL-32 on sytokiini ja sen pro-syöpä rooli on dokumentoitu useissa tutkimuksissa [16], [17], [18]. PI3-kinaasireitin on osoitettu indusoivan IL-32 ilmentyminen useissa tutkimuksissa [19], [20], [21], [22], erityisesti haimasyövän jossa sen pro- syöpä rooli on perustettu. Siksi nämä tutkimukset viittaavat siihen, että syy laski IL-32 ilmentyminen kun kaataa Mir-23b-3p on, että se vaikuttaa myös ilmaus PI3-kinaasin ja Akt. Ohjelmiston etsiä miR-23b-3p sitoutumiskohtia PI3-kinaasi ja Akt suorittivat kuitenkaan emme löytäneet todisteita siitä, että PI3-kinaasi ja Akt ovat kohdistu suoraa miR-23b-3p.

Genistein (40,5,7-trihydroxyflavone), yksi tärkeimmistä soija isoflavones, on laaja valikoima chemopreventive toimia. Syövän vastainen vaikutus genisteiinin on katsoneet useita signalointireittejä ja mekanismit, jotka vaikuttavat solukierron pysähtymisen, apoptoosin, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä, attribuutteja, jotka voivat estää kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen [23], [24]. Genisteiiniä on runsaasti soijatuotteita ja on todettu estäjänä Proteiinityrosiinikinaasien ja voi siten olla keskeinen rooli solujen kasvuun ja apoptoosin [25], [26]. Sen on raportoitu olevan estrogeenisiä ominaisuuksia, ja antineoplastinen useita kasvaintyypeissä [27]. Aiemmassa tutkimuksessa Hillman et. al. ovat osoittaneet, että yhdistelmä genisteiinin kanssa primaarisen kasvaimen säteilytys toimii tehokkaasti kuin terapeuttinen lähestymistapa, vakiintuneissa munuaisten kasvaimia, koska kasvaimen kasvua inhiboivat sekä ensisijainen ja metastaasien. Heidän tutkimuksessaan genisteiini- yksin ollut taipumus stimuloida kasvua ensisijainen munuaisen kasvain ja lisätä etäpesäkkeiden [28]. Siten nämä havainnot sai meidät seurata ekspression miRNA-23b-3p käsittelyn jälkeen A-498-solujen kanssa eri pitoisuuksilla genisteiinin. Löysimme 50%: n lasku ilmaus miR-23b-3p käsittelyn jälkeen A-498-solujen kanssa 25 uM genisteiini- 96 tuntia (kuvio 8). Aikaisemmassa tutkimuksessa [29] myös raportoitu laski miR-21 ilmentyminen hiiren ksenograftikasvaimissa muodostettu injektion jälkeen 25 uM genistein käsitellään A-498-solut subkutaanisesti nude-hiiriin verrattuna pienempiä kasvaimia muodostuu käsittelemättömän A-498-soluja. Olemme myös mitattu ilmaus miR-23b-3p näissä kasvaimissa ja löytäneet merkittävän muutoksen sen ilme.

Yhteenvetona miR-23b-3p on onkogeenin RCC ja suoraan estää PTEN kasvain estävä geeni. Näin miR-23b-3p voi olla käyttökelpoinen munuaissyövän diagnostinen markkeri ja terapeuttisena kohteena hoitoon munuaissolukarsinooman.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) munuaissyövän näytteitä saatiin San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01).

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen munuaisten syöpäsolulinjoissa A-498, ACHN, Caki-1, Caki-2, ja normaali munuaisten solulinja (HK-2) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Eheys solulinjojen vahvistettiin ATCC käyttämällä DNA: ta (STR) profilointi. Normaali munuaisten HK-2-soluja viljeltiin yhtenä kerroksena on Keratinosyyttien Serum Free Medium (K-SFM), johon oli lisätty 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (BPE), 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml penisilliiniä ja 50 mg /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Munuaisvaltimoiden syöpäsolulinjoja A-498 ja ACHN viljeltiin yhtenä kerroksena Eaglen Minimum Essential Medium, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-1 ja Caki-2 viljeltiin samalla tavalla McCoy’s5A media (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Kaikkia solulinjoja pidettiin inkubaattorissa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO2, 37 ° C: ssa.

Genisteiini hoito A-498 solut

A-498-soluja (60 -70% konfluentteja) käsiteltiin genisteiiniä (25 uM ja 50 uM). Genisteiini (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) liuotettiin DMSO: hon, ja solut, joita käsiteltiin vehikkelillä (DMSO) toimi kontrollina. Tuore genisteiini annettiin joka päivä muutos väliaineen, ja soluja inkuboidaan 4 päivän ajan.

Quantitative Reaaliaikainen PCR

reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR), täydentäviä DNA monistetaan inventoitu Gene Pitoisuus tuotteita, joissa on kahta geeniä aluketta ja yhtä TaqMan MGB koetin (6-FAM väriaine-leimattu) käyttämällä TaqMan Universal Fast PCR Master Mix on 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA). Lämpökäsittelyyn olosuhteissa mukana 95 ° C: ssa 20 sekuntia (s), 40 sykliä 95 ° C: ssa 3 s ja 60 ° C: ssa 30 s mukainen TaqMan Fast Universal PCR. Yhteensä microRNA uutettiin käyttäen miRNeasy kit Qiagen (Valencia, CA, USA). Sillä miRNA reaaliaikainen kokeissa cDNA-juoste syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 200 ng kokonais uutettiin miRNA. RNU48 käytettiin endogeenista ohjaus. Sitä käytetään myös endogeeninen kontrolli real-time PCR kokeissa, joissa miRNA eristettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) munuaisten näytteet. Yhteensä miRNA uutettiin FFPE näytettä seulotaan miRNA FFPE Kitin Qiagen.

Micro Dissection of munuaissyövän kudoksia ja RNA hiukkaserotus FFPE Human Munuaisten kasvainnäytteestä

Vieressä normaali ja syöpä- munuaiskudoksiin saatiin 29 edustaja FFPE kudosblokeista radikaalin nephrectomy yksilöitä patologian osaston Veterans Affairs (VA) Medical Center of San Francisco. Lohkot olivat munuaissyövän potilailla, jotka leikattiin klo VA Medical Center välillä 1980-2009. Osiot (4 pm) lohkoista valmistettiin, H Beckman Coulter).

Apoptosis Assay

apoptoosin, soluja 72 tuntia transfektion jälkeen otettiin kaksi värjättiin elinkelpoisuuden väriaine 7 amino-aktinomysiini D (7-AAD) ja anneksiini V-FITC: llä käyttämällä anneksiini V-FITC /7-amino-aktinomysiini D kit (Beckman Coulter), mukaisesti valmistajan protokollaa. Stained solut välittömästi analysoitiin virtaussytometrillä (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

cytoselect 24 kuopan solumigraation ja invaasiomääritys Kit (Cell Biolabs, Inc. ., San Diego, CA) käytettiin muuttoliikettä ja invaasiota määritykset 72 tuntia transfektion jälkeen (8 um, kolorimetrinen muodossa) mukaan valmistajan protokollaa.

Western Analysis

Kokosolun uutteita valmistettiin radioimmunosaostuskokeella puskurissa (RIPA; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA, 50 mmol l-1 Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 NaCl: a, 0,5% deoksikolaatti, 0,1% SDS: ää ja 1,0% NP-40) joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Basel, Sveitsi). Proteiinimääritykset suoritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonaisproteiinista (40 ug) suoritettiin elektroforeesi 12% SDS-PAGE-geeleillä ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen standardiprotokollia ja proteiineja kemiluminesenssilla. Vasta-aineet, mukaan lukien PTEN (cat. No. 9552S) ja Akt (cat. No. 4691S) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA, USA), PI3-kinaasi (cat no. Ab69870) ja IL-32 (cat no. ab62580) olivat Abcam (Cambridge, MA, USA), kun taas GAPDH (cat. no. sc-32233) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

proteiinin ilmentymisen tasojen määrä optisella densitometrian käyttämällä ImageJ ohjelmiston versio 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Kertainen muutos laskettiin suhde nettointensiteetti kunkin näytteen transfektoitu anti-miR-23b-3p jaettuna GAPDH ja negatiivisen kontrollin transfektoitu näytteitä jaettuna GAPDH (Anti-miR-23b-3p transfektoitujen näytettä /GAPDH) /(Neg ohjaus miR transfektoitiin näytettä /GAPDH).

Luciferase Reporter Assay

solut 24-kuoppalevyillä transfektoitiin 30 nM esi-miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-23b -3p (Applied Biosystems) ja PTEN-rakenne (luettelonro. HmiT015535, Genecopoeia, Rockville, MD, USA) tai kontrolli-rakenne, pEZX-MT01 (Genecopoeia) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ohjaus konstruktio puuttui miR-23b-3p kohdesivustot. Kaikki transfektio kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Lusiferaasiaktiivisuudeksi analysoitiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen dual-lusiferaasireport- määritys (Promega).

immunohistokemia

Immunovärjäys tehty munuaissyövän kudoksen diat [valmistettu formaliinilla kiinnitetyt, parafinoidut (FFPE) munuaissyövän kudosblokeista käyttäen mikrotomin (Leica)]. Objektilasit poistettiin parafiini ja antigeeni haku toteutettiin mikrossa diat 10 mmol /l natriumsitraattipuskuri. Laseja inkuboitiin yön yli anti-PTEN-vasta-aine (Soluviestintä). Värjäytyminen tehtiin käyttäen LABVISION Corporation (Thermo Fisher Scientific) Anti-Rabbit Värjäys System (LOT-RHD 80924) kohti valmistajan ohjeiden mukaan.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen StatView versio 5.0 Windows. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan eri ryhmiin. p-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Chi-square suoritettiin määrittämiseksi korrelaation miR-23b-3p ekspressiotasot ja PTEN-proteiinin ekspressiotasot kudosnäytteistä.

Kiitokset

Kiitämme Dr Roger Erickson tukea ja apua valmistelun käsikirjoituksen.