Krooninen sairaus

tiivistelmä

PTEN menetys ja konstitutiivisen aktivaation PI3K signalointireitin on yhdistetty pitkälle androgeenista riippumaton eturauhassyöpä. PTEN-puutosta eturauhassyövän C42Luc solujen hengissä seerumittomassa alustassa ja näyttää suhteelliset vastustuskykyä apoptoosin vaikka läsnä on PI3K estäjän ZSTK474. Silti, kun ZSTK474 yhdistetään käännös inhibiittorin sykloheksimidi, C42Luc solujen apoptoosia 6 tunnin kuluessa. Havaitsimme defosforylointia BAD (Bcl2 liittyvä kuolema promoottori) pääasiallisena apoptoosin säätelymolekyyli alavirtaan PI3K, ja menetys MCL-1 (myeloidisolun leukemia -1) merkittäväksi tavoitteeksi sykloheksimidin. Yhdistelmä MCL-1 pudotus ja ilmentyminen fosforylaation-puutteellinen mutantti BAD2SA on riittävä käynnistämään nopeasti apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa. Nämä tulokset vahvistetaan mekanismi synergistisen induktion apoptoosin yhdistelmä PI3K-estäjä ja proteiinisynteesin estäjää PTEN-puutosta syöpäsolujen.

Citation: Yancey D, Nelson KC, Baiz D, Hassan S, Flores A, Pullikuth A, et al. (2013) BAD defosforylaatio ja Vähentynyt ilmentyminen MCL-1 Pakotettava Rapid Apoptosis eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (9): e74561. doi: 10,1371 /journal.pone.0074561

Editor: Aamir Ahmed, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 19 marraskuu 2012; Hyväksytty: 05 elokuu 2013; Julkaistu: 05 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Yancey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat R01CA118329 avustusta National Cancer Institute George Kulik. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Taustaa

Useat tutkimukset ovat tunnistaneet fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) reitin kuin yksi tärkeimmistä tekijöistä, eturauhasen syövän synnyn ja etenemisen terapeuttisia vastus [1] – [3]. PI3K toimii välittäjänä solunsisäistä viestintää muodostamalla fosfatidyyli (3-5) -trifosfaattia (PIP3) kautta fosforylaation fosfatidyyli (4,5) -biphosphate (PIP2). Kun syntyy, PIP3 rekrytoi proteiineja sisältävä pleckstrin homologia (PH) domain (mukaan lukien AKT kinaasi) ja solukalvon, jossa he käyvät läpi konformaatiomuutos. Vuonna Akt tämä konformaation muutoksen johtaa pohjustus fosforylaatiota treoniini 308 by fosfoinositidi-riippuvaisen kinaasin 1 (PDK1) ja sen jälkeen aktivoiva fosforylaatio seriinillä 473 nisäkkään rapamysiinin kohde monimutkaisten 2 (mTORC2) [4]. Aktivoidut Akt translokoituu sytoplasmaan ja tumaan fosforyloivan useita alavirran kohde-solujen selviytymisen, kasvun, proliferaation ja solusyklin etenemisen [5]. Lipidi fosfataasi ja tuumorisuppressorigeenit PTEN (fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10) toimii negatiivisena säätelijänä Akt ja PI3K-reitin defosforyloimaan PIP3 ja muuntaa sen takaisin PIP2. Eturauhasen syöpä, ensisijainen mekanismi PI3K dysregulation on lakkaa toimimasta PTEN kautta homotsygoottisia deleetioita, heterotsygoottisuuden menetys, tai inaktivoivat mutaatiot [6], [7], jotka johtavat konstitutiiviseen aktivoitumiseen Akt.

androgeeniablaatio indusoi apoptoosia eturauhasen epiteelisolujen [8]. Vielä PTEN-negatiivinen eturauhassyövän solut eivät apoptoosia ilman androgeenien [9]. Samoin hiirten eturauhanen vapaalla PTEN pudotuspelit ovat alenemisesta apoptoosin ja vähentynyt eturauhasen surkastumista kun kastraatio [10]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että konstitutiivinen aktivaatio PI3K väylän PTEN-null edenneen eturauhassyövän kasvaimia edistää androgeeniriippumattomuuteen estämällä apoptoosin.

proteiinit BCL-2 perheen keskeinen rooli apoptoosin säätelemällä mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi (MOMP) ja vapauttamaan apoptoosia aiheuttavaa proteiinia, kuten sytokromi c, SMAC, ja apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) erottautuvat sisällä mitokondriot [11]. Bcl-2-proteiinin perheen on jaettu kolmeen ryhmään perustuen toiminnallisuuden ja läsnä konservoituneita BCL-2 homologia (BH1-4) domeenit: multidomain anti-apoptoottiset proteiinit, multidomain pro-apoptoottisia proteiineja, ja BH3-vasta-proteiineja. Vuorovaikutukset näiden ryhmien BCL-2-proteiinien määräävät, onko solu elää tai kuolee. Multi-domain anti-apoptoottiset proteiinit, kuten BCL-2, Bcl-x L, ja MCL-1 estää MOMP vuorovaikutuksessa ja eristämällä multidomain pro-apoptoottisten Bcl-proteiinien BAK ja BAX [12]. BAK ja BAX on BH1-3 verkkotunnuksia, jotka mahdollistavat oligomerisaatioon klo mitokondrion ulkokalvon ja myöhemmät MOMP kautta huokosten muodostumista [13]. BH3: een vain proteiineja, kuten BAD, NOXA, ja PUMA [14] – [16], kilpailukykyisesti sitovat ja neutraloivat anti-apoptoottisia proteiineja, jolloin BAX /BAK oligomerisaatioon ja edistää solukuolemaa, kun taas Bid ja Bim voi myös vuorovaikutuksessa ja aktivoida BAX ja BAK, helpottaa kalvo paikoilleen ja MOMP [11].

BH3-ainoastaan ​​proteiinien BCL-2 perheen toiminto vahdissa jotka säätelevät apoptoosia ja selviytymisen vastauksena solunulkoiseen ärsykkeiden sitoutumalla hydrofobisen uraan niiden anti-apoptoottisten kumppaneita. Jokainen BH3-vasta-proteiini on ainutlaatuinen profiili sitovia kumppaneita. Näin ollen, BAD on osoitettu sitoutuvan ja neutraloidaan BCL-2, Bcl-x L ja Bcl-w: [14], [17], syrjäyttäen BAK ja BAX ja edistää huokosten muodostumista. Kuitenkin muut anti-apoptoottiset proteiinit, kuten MCL-1 ja A1 ei neutraloidaan BAD, vaan sidotaan ja neutraloidaan NOXA ja PUMA, vastaavasti [15], [17], [18].

aiemmin olemme osoittaneet, että lisääntynyt BAD ilmentyminen edistää eturauhassyövän soluproliferaatiota [19]. Samalla, BAD fosforylaatio tila on merkittävä rooli apoptoosin asetuksessa toimimalla lähentyminen perustuu useiden antiapoptoottisten signalointireittien, kuten konstitutiivisesti aktiivinen PI3K [20]. BAD fosforylaatio seriinissä 112 ja 136 (perustuen hiiren sekvenssi) [21], [22] helpottaa vuorovaikutusta 14-3-3 saattajia, kun taas fosforylaation S155 sisällä BH3 domain häiritsee sitoutumista BCL-XL tai BCL-2 [23 ]. Tämän seurauksena, fosforylaatio inaktivoi pro-apoptoottisen funktion BAD estämällä vuorovaikutus BCL-2: n ja Bcl-XL. Nämä aiemmat tulokset ehdottivat, että PI3K inhibitio ja sitä seuraava BAD defosforylaatiota johtaisi apoptoosin PTEN-negatiivinen eturauhasen syöpäsoluja. Olemme kuitenkin havainneet, että vaikka nopea BAD defosforylaation, PI3K inhibitio ZSTK474 indusoi apoptoosia C42Luc eturauhasen syöpäsolujen suhteellisen myöhään ajankohtina (12-24 tuntia).

Havaitsimme, että MCL-1 ilmentymisen resistenssin hoitoja PI3K-estäjien ja BAD defosforylaatio. Toisaalta yhdistelmä MCL-1 tappio (aiheuttama sykloheksimidin tai shRNA Knockdown) ja BAD defosforylaatio laukaisee nopea apoptoosin. Nämä tulokset tunnistaa BAD ja MCL-1 on tärkein vartijaa proapoptootti- signalointia PTEN puutosta syöpäsolujen tutkittu.

Tulokset

Yhdistelmä PI3K estäjän ZSTK474 ja proteiini inhibiittorin sykloheksimidi indusoi nopeaa apoptoosia C42Luc eturauhassyövän solut

PI3K-signalointireitin konstitutiivisesti aktivoitu C42Luc eturauhasen syöpäsolujen takia poistetaan yhden alleelin lipidi- fosfataasin PTEN ja lukukehyksen muissa alleelin [ ,,,0],24]. Tämän seurauksena nämä eturauhassyövän solut eivät ole riippuvaisia ​​androgeenireseptorin tai muiden ulkoisten eloonjäämistekijät. Kun PI3K koulutusjakso estyy ZSTK474, C42Luc solujen apoptoosin, kuten käy ilmi seuranta solujen nopeutus mikroskopialla (kuvio 1A, kirjava baaria).

A) C42Luc soluja käsiteltiin joko 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml sykloheksimidiä, tai yhdistelmä, ja apoptoosin kirjattiin 24 tunnin käyttämällä nopeutus mikroskoopilla. Kumulatiivinen prosenttiosuus solujen pääsyn apoptoosin (pyöristys ja kalvon rakkuloituminen), on esitetty erityisiä ajankohtina 24 tunnin aikana. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. *,

p

0,05. B) Kaspaasi-3 aktivaation määritys C42Luc soluissa, joita käsiteltiin 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml sykloheksimidiä, tai yhdistelmä. 6 h kuluttua hoidon, solut hajotettiin, ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden solulysaateista mitattiin fluorogeenisen substraatin (DEVD-AFC). Tiedot esitetään kertainen induktio fluoresenssin intensiteetti normalisoitiin ohjaus (DMSO). *,

p

0,0001. C) immunofluoresenssi pilkottiin kaspaasi 3 (punainen) ja TUNEL (vihreä) in C42Luc käsiteltyjä soluja DMSO, 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml sykloheksimidiä, tai yhdistelmä. DAPI käytettiin visualisoimaan ytimiä. Kukin rivi paneeleita edustaa samaa näkökenttää. D) Western blot C42Luc soluja käsiteltiin joko 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml sykloheksimidiä, tai yhdistelmä. Kokosolulysaateista kerättiin osoitetussa aikoina ja koestettiin pBAD (Ser112) ja yhteensä BAD.

vertailu apoptoosin dynamiikan C42Luc soluissa käsitelty PI3K estäjän ZSTK474 yksin ja yhdessä käännös estäjä sykloheksimidi on osoittanut, että yhdistelmä indusoi apoptoosin nopeammin, joilla on huomattava määrä soluja kuolee 6 tunnin kuluttua. Hoidon jälkeen ZSTK474 tai sykloheksimi- yksin, apoptoosin kävi ilmeiseksi vasta 12 tuntia, joilla on huomattava määrä soluja kuolee 24 tunnin kuluttua hoitojen (kuvio 1A). Apoptoosin yhdistelmähoidon varmistettiin mittaamalla kaspaasiaktiivisuus kanssa fluorogeenisen substraatin DEVD-AMC, havaitseminen pilkkoa aktiivisen muodon kaspaasi 3, ja TUNEL-määritykset (kuvio 1 B, C).

Aiemmat julkaisuja useissa eri laboratorioissa, myös meidän, osoitti, että fosforylaation BH3-vasta-proteiinin BAD on keskeinen rooli apoptoosin sääntelyn alavirtaan PI3K signalointireitin eri solulinjoissa, mukaan lukien eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP ja C42 [20], [25] , [26]. Kuitenkin BAD defosforyloinnilla ollut eroa solujen käsitelty ZSTK474 yksin tai yhdistelmän ZSTK474 ja sykloheksimidin (kuvio 1 D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BAD defosforylaatio on joko vailla merkitystä tai riittämätön nopean induktion apoptoosin C42Luc eturauhasen syöpäsoluja.

Loss of MCL-1 herkistää syöpäsolujen indusoimaa apoptoosia PI3K-estäjä ZSTK474

Valaistaan ​​mekanismi nopea indusoiman apoptoosin sykloheksimidillä yhdistettynä ZSTK474, me käänsimme huomiota muihin BCL-2 proteiinit. Koska defosforyloitiin BAD voi sitoa BCL-XL, BCL-2, ja BCL-W, mutta voi olla vuorovaikutuksessa MCL-1, me arveltu, että MCL-1 voisi olla vastuussa viivästyy apoptoosin solujen defosforyloituun BAD. Toinen rivi todisteita tukemaan roolia MCL-1 apoptoosin asetuksessa on sen suhteellisen lyhyt puoliintumisaika, joka mahdollistaa dynaaminen sääntely MCL-1 tasot ekstrasellulaaristen ärsykkeet [27] ja tekee MCL-1 erityisen herkkä eston käännös sykloheksimidi.

eturauhasen syöpäsoluja yleisesti ilmaista kolme anti-apoptoottisten Bcl-proteiinit: BCL-XL, BCL-2, ja MCL-1 [28], [29]. Analyysi anti-apoptoottisen Bcl2 perheen proteiinin ekspressiotasot C42Luc soluissa, joita käsiteltiin pro-apoptoottisia aineita, osoitti, että MCL-1 ekspressio on olennaisesti vähentynyt käsiteltyjen solujen sykloheksimi- 6 tunnin ajan, ja solut käsiteltiin yhdistelmällä ZSTK474 ja sykloheksimidin (kuvio 2A). Sen sijaan ei ole merkittäviä vähennyksiä BCL-2: n ja Bcl-XL-ekspressiota havaittiin soluissa, joita käsiteltiin yhdistelmällä estäjiä. Silti, tämä korrelatiiviset todisteet jättää avoimeksi mahdollisuuden, että muut lyhytikäisiä proteiinit voivat osaltaan lisätä apoptoosin soluissa käsitelty ZSTK474 ja sykloheksimidillä.

A) Western blot-analyysi C42Luc soluja käsiteltiin joko 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml sykloheksimidiä, tai yhdistelmä 6 tuntia. Kokosolulysaateille koestettiin MCL-1, BCL-2, ja BCL-XL verrata vaikutuksia proteiinisynteesi-inhibiittorin ja koestettiin pBAD (S112) ja Pakt (S473 ja T308) tarkistaa vaikutukset PI3K-estäjä. B) Apoptoosin analysointi nopeutus mikroskoopilla. C42Luc soluja transfektoitiin ohimenevästi lentivirusvektori, joka koodaa GFP: tä ja MCL-1-spesifisiä shRNA tai sekoitetun ohjaus shRNA, ja käsiteltiin 5 uM ZSTK474 48 h transfektion jälkeen. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen ilmoitettuina ajankohtina käsittelyjen jälkeen määritettiin kuviossa 1A. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. *,

p

0,005; #,

p

0,001 Inset esittää Western blot endogeenisen MCL-1 ja β-aktiini (latauskontrollina) tasot C42Luc soluissa 48 tunnin kuluttua infektion lentivirusvektori ilmentävien MCL-1 spesifisten tai salattu shRNA. C) Kaspaasi-3 aktivaation määritys C42Luc transfektoitujen solujen shRNA kohdistaminen MCL-1 tai sekoitettua kontrollipeptidiä shRNA. Kaspaasin aktivaatio mitattiin 6 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai 5 uM ZSTK474. Hoidot lisättiin 48 tuntia transfektion jälkeen. *,

p

0,01; **,

p

0,05. D) Apoptoosin analysointi nopeutus mikroskopian C42Luc transfektoiduissa soluissa MCL-1-spesifisiä shRNA (raidalliset palkit) tai salattu shRNA (kirjava baaria) ja doksisykliini-indusoituva Flag-MCL-1. Kumulatiivinen prosenttiosuus apoptoottisten solujen ilmoitettuina ajankohtina määritettiin kuviossa 1A 24 tunnin kuluttua doksisykliinikäsittely. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. *,

p

0,01 #,

p

0,05. Inset esittää VVestern Flag-merkityn MCL-1 immunosaostettiin anti-FLAG hartsi ja koestettiin MCL-1 ilmentymisen.

suoraan testata roolia MCL-1 ensisijaisena välittäjänä cycloheximide- aiheuttama apoptoosin C42Luc soluissa, me laski MCL-1-proteiinin ilmentymistä käyttämällä shRNA knockdown. Apoptoosin analysointi kaspaasi määrityksessä ja aikaväli mikroskopia infektoiduissa soluissa lentivirusvektoria, joka ilmentää joko Mcl1 erityisiä shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä shRNA osoitti, että ZSTK474 indusoiman apoptoosin tehokkaammin solujen pudotus MCL-1 (kuvio 2B, C) . Toisaalta, ektooppinen ilmentyminen doksisykliini-indusoituva Flag-MCL-1-rakenne vähentynyttä apoptoosia soluissa, jotka on transfektoitu MCL-1 shRNA vastaavalle tasolle kuin soluissa, jotka on transfektoitu salattu shRNA (kuvio 2D). Lisääntynyt apoptoosi havaittiin myös ZSTK474 käsitellyissä soluissa, joissa MCL-1 ilmentymisen pudotettiin käyttämällä toista MCL-1-spesifisiä shRNA rakenteen, joka kohdistettuja 3′-UTR (Kuva S1). Yhdessä tulokset näistä kokeista osoittavat, että MCL-1 tappio vaikuttaa sykloheksimidille aiheuttama herkistyminen indusoimaa apoptoosia ZSTK474.

BIM on mukana apoptoosin sääntelyn C42Luc soluissa

BIM ja NOXA , BH3-ainoastaan ​​proteiineja Bcl2 perhe, on tunnistettu sidoskumppanien MCL-1. NOXA sitoutuu ensisijaisesti MCL1, kun taas BIM voi myös sitoa muiden anti-apoptoottisten proteiinien Bcl2 perheen sekä sitoutuvat ja aktivoi BAX [15], [30]. NOXA, mutta ei BIM, on tiettävästi mukana proteiinikompleksi että tavoitteet MCL-1 hajoamiselle [31]. Itse asiassa C42Luc käsitellyissä soluissa sykloheksimi-, NOXA hajosi taas BIM ilme pysyi vakiona (Kuva. 3A). Niinpä olemme keskittyneet analyysiin BIM. Yhdenmukainen aiempien raporttien, BIM havaittiin immunosaostumia FLAG helmet C42Luc solut, jotka ilmentävät FLAG-MCL-1 (Fig. 3B). Sen testaamiseksi, BIM osallistuu apoptoosin induktion yhdistelmä sykloheksimidi ja ZSTK474, käytimme kaksi BIM-erityistä shRNAs kaataa endogeenistä BIM proteiinia. Merkittävä väheneminen kaspaasiaktiivisuus sekä vähentynyt apoptoosia sekä C42Luc-shBIM1 ja C42Luc-shBIM2 solujen verrattuna hallita C42Luc soluihin, havaittiin käsittelyjen jälkeen sykloheksimi- ja ZSTK474 (Fig. 3C, D), mikä vahvistaa roolia BIM apoptoosin ja C42Luc soluja. Lisäksi vähentynyt apoptoosin havaittiin molemmissa C42Luc-shBIM1 ja C42Luc-shBIM2 soluissa verrattuna C42Luc transfektoitu konstruktilla, joka ilmaistaan ​​MCL-1-spesifisiä shRNA, mikä osoittaa, että BIM on mukana apoptoosin aloittamista ”alavirtaan” MCL-1 tappio.

A) NOXA ilmentyminen on vähentynyt C42Luc soluissa, joita käsiteltiin yhdistelmällä ZSTK474 ja sykloheksimidin. Western blot-analyysi MCL-1, NOXA, BIM ja β-aktiini (lastaus kontrolli) soluissa hoidettiin 4 ja 6 tuntia sykloheksimi-. B) Co-immunosaostus MCL-1 ja BIM soluista, jotka ilmaisivat doksisykliini-indusoituva FLAG-MCL-1. C) apoptoosi C42Luc solut, jotka ilmentävät kaksi BIM-erityistä shRNA ja vanhempien soluissa arvioitiin Viivästys mikroskoopilla. Soluja käsiteltiin ajoneuvon ((-) DMSO) tai niiden yhdistelmä sykloheksimidin ja ZSTK474 (+). Määrä apoptoosin (%) määritettiin kuviossa 1A. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. Tiedot 6 tunnin kuluttua altistuksesta esittelyyn. Erot% apoptoosi-ohjaus solujen (jotka ekspressoivat salattu shRNA) ja C42Luc BIM1 tai C42Luc BIM2 solut olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,05 ja p 0,0001, vastaavasti). Aseta osoittaa vähentynyt BIM ilmentymistä soluissa, jotka pysyvästi ilmensivät BIM-erityisiä shRNA. D) Apoptosis in C42Luc soluissa, jotka ilmaistaan ​​kahdella BIM-spesifisten shRNA tai kontrollivektori arvioitiin mittaamalla kaspaasiaktiivisuus. Soluja käsiteltiin 6 tunnin ajan vehikkelillä ((-) DMSO) tai niiden yhdistelmää sykloheksimidi ja ZSTK474 (+). Erot kaspaasiaktiivisuus välillä ohjaus solujen ja C42Luc BIM1 tai C42Luc BIM2 solut olivat tilastollisesti merkitseviä (p = 0,002 ja p = 0,05, vastaavasti). E) C42Luc soluja tai C42LucBIM2 soluja, jotka stabiilisti ilmentävät BIM-kohdistaminen shRNA transfektoitiin lentivirusvektorilla että ilmaista GFP ja joko salattu (scr) tai MCL-1 erityisiä shRNA2. Prosenttia apoptoosin GFP-positiivisten solujen määritettiin nopeutus mikroskoopilla. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat keskimääräistä ja keskivirheen neljä näkökentän. Laadullisesti samanlaisia ​​tuloksia saatiin C42LucBIM1 soluissa. Beeta-aktiini käytettiin lastaus valvonta (A) ja (C).

BAD defosforylaatio vastaa nopeasti indusoiman apoptoosin PI3K-estäjä ZSTK474 plus sykloheksimidin

Aiemmin osoitimme, että hoito PI3K estäjän laukaisee BAD defosforylointia S112 ja S136; käytettiin myös shRNA pudotus osoittaa, että BAD on tarpeen apoptoosin induktion PI3K-estäjien eturauhassyöpäsoluissa [20]. Silti useat tavoitteet PI3K signaloinnin lisäksi HUONO oli osallisena apoptoosin [32]. Sen määrittämiseksi, onko BAD defosforylaatio on riittävä indusoimaan nopeaa apoptoosia sykloheksimidin läsnä ollessa, C42Luc solut transfektoitiin doksisykliini-indusoituva fosforylaation-puutteellinen mutantti BAD, jossa Ser112 ja Ser136 korvattiin alaniineilla (BAD2SA). Kun sykloheksimidikäsittelylle, jotka on transfektoitu BAD2SA osoitti merkittävästi lisääntynyttä apoptoosia verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu villin tyypin BAD (WT-BAD) (kuvio 4A ja B). Yhdenmukainen keskeinen rooli BAD vuonna apoptoosin sääntelyä, eturauhassyövän solut BAD jäljittelevää ABT-737 (joka perustuu BH3 verkkotunnuksen BAD) aiheuttamaa lisääntynyttä apoptoosia yhdistettynä sykloheksimi-, samanlainen yhdistelmä sykloheksimidin kanssa PI3K estäjän ZSTK474 (kuvio 4C).

A) kaspaasi 3 aktivaatio C42Luc ja C42LucBAD2SA soluja, jotka ilmaisivat fosforylaatio puutosta BAD mutantti. Soluja käsiteltiin 100 ug /ml sykloheksimidiä 6 tuntia ennen määritystä. *,

p

0,01. B) Apoptoosin analysointi nopeutus mikroskoopilla. C42Luc solut transfektoitiin ohimenevästi doksisykliini-indusoituva HA-BAD2SA tai villityypin HA-BAD, ja doksisykliinillä (Dox) 48 tuntia transfektion jälkeen. 18 tunnin Dox hoidon, soluja käsiteltiin 100 ug /ml sykloheksimidiä, ja kumulatiivinen prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin Viivästys mikroskoopilla. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. *,

p

0,01 #,

p

0,03. Inset esittää Western blot-analyysi fosforyloidun BAD (pBAD112) ja yhteensä BAD ilmaisun C42Luc soluissa talteen 18 tunnin kuluttua Dox hoidon. Alemman kaistan vastaavat endogeenisen proteiinin, kun taas ylempi bändit vastaavat indusoitavasti ilmaistu HA-BAD konstruktioita. C) C42Luc soluja käsiteltiin 100 ug /ml sykloheksimidiä yhdessä 10 uM ABT-737, BH3 mimeetti perustuu BH-domeenin BAD tai ZSTK474. Apoptoosi analysoitiin nopeutus mikroskoopilla. Kumulatiivinen solukuoleman ilmoitetuilla ajankohtina näkyy. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. *,

p

0,01 **,

p

0,05 #,

p

0,001 ##,

p

0,002 .

Samanaikainen BAD defosforyloinnilla ja MCL-1 tappio on riittävä indusoimaan nopea apoptoosin C42 soluissa

Varmista, että BAD defosforyloinnilla ja MCL-1 tappio on riittävä indusoimaan nopea apoptoosin, C42Luc solut kotransfektoitiin BAD2SA ja MCL-1shRNA, ja apoptoosin arvioitiin nopeutus mikroskoopilla. -Solut kotransfektoitiin BAD2SA ja MCL-1 shRNA osoitti merkittävästi enemmän apoptoosia verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu yhdistelmä WT-BAD ja MCL-1 shRNA tai BAD2SA ja salattu shRNA (kuvio 5). Nämä tulokset tunnistaa BAD ja MCL-1 avaintekijöiksi säätelyssä apoptoosin C42Luc eturauhasen syöpäsoluja.

C42Luc solut kotransfektoitiin joko MCL-1-spesifisiä shRNA tai salattu shRNA yhdessä joko BAD2SA tai WT-BAD-konstrukti. 48 tuntia transfektion jälkeen, apoptoosin analysoitiin nopeutus mikroskoopilla. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. *,

p

0,05 **,

p

0,005 ***,

p

0,001.

käsitellä yleispätevyyttä apoptoosin induktion yhdistelmä sykloheksimidi ja ZSTK474 eturauhassyöpäsoluissa, arvioimme apoptoosin WFU3, PC3 ja DU145 solujen nopeutus mikroskopia ja kaspaasi-3 fluorometrisen määrityksissä. PTEN

– /- WFU3 hiiren eturauhasen epiteelisolut osoittivat apoptoosin induktion verrattavissa C42Luc soluihin (kuvio S2). Sen sijaan, apoptoosin induktion PC3 ja DU145-soluissa yhdistelmä sykloheksimidin ja ZSTK474 oli huomattavasti alhaisempi verrattuna C42Luc soluihin (vertaa kuviot 1A ja 6C), vaikka defosforyloitumista BAD ja menetys MCL-1 ilmentymisen käsiteltyjen solujen (kuvio 6A, B, C). Mutta kun nämä solulinjat ko-transfektoitiin ekspressiovektoreilla, jotka koodaavat MCL-1 shRNA ja BAD2SA kanssa mutatoitujen fosforylaatiopaikkaa, huomattava apoptoosin induktio havaittiin kaikissa solulinjoissa (kuvio 6D, kuvio 5). Tämä tulos johti meidät oletuksen, että eri herkkyyttä apoptoosia solulinjoissa voi riippua ilmentymisen profiilit Bcl2 perheen näissä soluissa.

A) Hoito yhdistelmällä sykloheksimi- ja ZSTK474 laukaisee MCL-1 tappio PC3, C42Luc ja DU145 soluja sekä HUONO defosforyloinnilla PTEN-puutosta PC3 ja C42Luc soluja. Solulysaatit valmistettiin 6 tunnin kuluttua käsittelyt koestettiin pS112BAD yhteensä BAD, ja MCL-1, käyttäen β-aktiini latauskontrollina. Apoptoosin C42Luc, PC3 ja DU145 solut arvioitiin (B) mitataan kaspaasi 3 toimintaa fluorogeenisen substraatin tai (C) Viivästys mikroskoopilla. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät. D) pudotus MCL-1 ja ektooppinen ilmentyminen fosforylaation puutteesta BAD oli riittävä indusoimaan apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa. PC3 tai DU145-solut kotransfektoitiin MCL-1-spesifisiä shRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä shRNA yhdessä joko BAD2SA tai WT-BAD-ekspressiokonstruktin. 48 tuntia transfektion jälkeen, apoptoosin analysoitiin nopeutus mikroskoopilla. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät.

Itse asiassa se on ollut aikaisemmin raportoitu, että PC3-solut ilmentävät korkeampia tasoja BCL-XL, kun taas DU145 solujen määrä aleni ilmaus BAX ( kuva 7A) [33], [34]. Koska on osoitettu, että knockdovvn BCL-XL herkistää soluja apoptoosin [35], olemme keskittyneet testaus roolista BAX ilmaisun apoptoottisen vasteen DU145 soluja. DU145-solut transfektoitiin GFP-BAX tai GFP ekspressiovektoreihin ja apoptoosia GFP-positiivisten solujen seurasi nopeutus mikroskopia. DU145 transfektoiduissa soluissa GFP-BAX osoittivat lisääntynyttä apoptoosia kun hoidettiin yhdistelmällä ZSTK474 ja sykloheksimidin. Näin ollen, BAX ilmentyminen palauttaa herkkyys DU145 eturauhasen syöpäsolujen indusoiman apoptoosin yhdistelmähoidot (kuvio 7).

A) Western blot -analyysi BAX ilmentymisen PC3, C42Luc, ja DU145-soluja. Solulysaatit valmistettu 6 tunnin kuluttua hoitojen koetettiin vasta-aineiden BAX ja β-aktiini. B) Western blot -analyysi: llä transfektoitujen solujen vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) tai GFP-BAX-kimeeran. C) Expression GFP-BAX kiihdyttää apoptoosia DU145 soluissa. Solut transfektoitiin GFP tai GFP-BAX ja apoptoosin analysoitiin nopeutus mikroskoopilla. Vähintään 100 solua laskettiin kussakin käsittelyssä. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat keskiarvosta neljän satunnaisesti valitun kentät.

Keskustelu

Mekanistiset ymmärrystä apoptoosin induktioon on tarpeen parantaa tehoa PI3K-estäjien

häiriöstä PI3K reitin on hyvin dokumentoitu eri syöpätyyppien, jossa noin 40% muuttunut PI3K signalointia ensisijainen eturauhasen kasvain sivustoja [36], [37] ja 100% muuttunut signalointi at metastaasien [38]. Eturauhasen syöpä, ensisijainen mekanismit PI3K dysregulaatio ovat lakkaa toimimasta PTEN kautta homotsygoottisia deleetioita, heterotsygoottisuuden menetys, tai inaktivoivat mutaatiot, jotka johtavat konstitutiiviseen aktivoitumiseen PI3K /Akt signalointia. Toiminnallinen tappio PTEN liittyy kehittynyt syövän etenemisessä, korkea Gleason asteen, ja yleinen huono ennuste, jossa korostetaan, että kemoterapeuttisen vaihtoehtoja kasvaimista aktiivisen PI3K /Akt signalointi [39] – [41].

Useita pienmolekyylisalpaajilla PI3K koulutusjakson, kuten yleiseurooppalainen PI3K-estäjien ZSTK474 (Zenyaku Kogyo Co) ja BKM120 (Novartis), ja kahden PI3K /mTOR-estäjä BEZ235 (Novartis) ovat jo tulleet varhaisen vaiheen kliinisissä tutkimuksissa hoidettaessa kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia , mukaan lukien eturauhassyöpä [42] – [44]. Kuitenkin aikaisemmin kokeet eivät ilmoittaneet merkittäviä parannuksia kliinisissä tuloksissa [45], [46].

parempi ymmärtäminen mekanismeja syöpäsolujen vastustuskyky PI3K esto on tarpeen valita optimaalisen terapeuttisen järjestelmiä kasvaimet aktiivinen PI3K signalointia. Tarkemmin tietoa proteiinit, jotka kontrolloivat apoptoosin PTEN-puutosta syöpäsolujen ohjaisi valintaa aineiden lisäämiseksi herkkyyttä eturauhasen syöpäsolujen apoptoosin.

BAD ja MCL-1 ovat kriittisiä apoptoosin säätelymolekyylien eturauhasessa syöpäsolut

aiemmin kuvatut signalointi verkosto yhteneviä signalointipolkujen jotka ohjaavat BAD fosforylaation ja siten, apoptoosin eturauhassyövän soluissa [20]. Osoitimme myös, että BAD pudotus tekee PTEN-puutosta eturauhassyöpä LNCaP-solujen epäherkkiä indusoiman apoptoosin PI3K-estäjien. Nämä aiemmat tiedot yhdessä tässä esitetyt tulokset osoittavat lisääntynyttä apoptoosia soluissa, jotka ilmentävät fosforylaatio puutteesta mutantti BAD2SA, viittaavat siihen, että BAD on kriittinen säätelijä apoptoosin kohteena PI3K signalointi. Näin ollen, BAD fosforylaatio näyttää olevan hyödyllinen biomarkkerina ennustaa antituumoritehoon PI3K-estäjien. Analyysi BAD fosforylaatio on erityisen tärkeää, ottaen huomioon, että muita signalointireittien aktivoidaan reseptorityrosiinikinaasien ja G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien voi fosforyloida BAD vaikka PI3K-reitti on aktiivinen. Huolimatta siis Akt defosforyloinnilla (rutiininomaisesti käyttää markkerina PI3K signalointia), soluja ei suoriteta apoptoosin jos BAD fosforyloituu muiden signaalinvälitysreittien.

Tuloksemme osoittavat, että BAD defosforyloinnilla itsessään ei riitä aiheuttamaan nopeaan apoptoosin eturauhasen syöpäsoluja. Analyysi mekanismien nopean indusoiman apoptoosin yhdistelmä PI3K-estäjien ja translaation inhibiittorit tunnistetaan MCL-1, joka on tärkeä apoptoosin-säätelymolekyyli. Sen ilme, kun vähentynyt, yhteistyötä BAD apoptoosin. Sekä BAD ja MCL-1 ilmentyy kaikkialla eturauhastuumoreissa [28], ja niitä voidaan dynaamisesti säätelevät fosforylaatio [20] (kun kyseessä on BAD) ja sekä fosforylaatio ja ubiquitylation (kun kyseessä on MCL-1) [47].

yli-ilmentyminen MCL-1 on liittynyt edennyt eturauhassyöpä, mukaan lukien korkean Gleason asteen ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, ja hematopoieettiset maligniteetit [28], [48]. MCL-1 on määritetty kriittiseksi säätelijänä solujen eloonjäämistä, ja edellyttää useita tasoja sääntelyä. Kopiointia, MCL-1-mRNA: n tasot ovat nopeasti indusoi useiden signaalitransduktioreaktioteiden, kuten MAP /ERK, PI3K /Akt ja JAK /STAT reitit, poikkeava aktivaatio erilaisissa maligniteetteja [49]. MCL-1-mRNA on myös tiukasti säännelty mir29 b [50]. MCL-1-proteiini on korkea vaihtuvuus läpi ubikitiinistä riippuvainen proteiinin hajoamista 26 S proteosomin. Terveillä soluissa BH3 verkkotunnus MULE E3 ligaasin sitoutuu hydrofobisen uraan MCL-1 erityisesti ja syrjäyttää sen vuorovaikutusta BAK ja BH3-vasta vartijaa [51]. MCL-1 fosforyloituu glykogeenisyntaasikinaasi- 3β (GSK3p) stressitilanteissa soluissa, joissa PI3K /Akt-reitti on aktiivinen, ja pohjustetaan varten ubikitinaatio jonka E3 ligaasilla β-TrCP [27], [47]. Korkea vaihtuvuus MCL-1 mahdollistaa dynaaminen sääntely MCL-1 ilmentymisen tasoilla transkription, translaation ja hajoamista. Nämä useita tasoja asetuksen korostavat roolia MCL-1 kriittiseksi apoptoosin säädin ja houkutteleva terapeuttinen kohde, sekä mahdollisen biomarkkereiden.

Aiemmin MCL-1 oli osallisena antiapoptooppinen signalointi IL