Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maligniteetti on suuri ongelma hoidetuilla potilailla immunosuppressiivisilla aineilla. Olemme osoittaneet, että käsittely kalsineuriinin estäjien (CNIs) voidaan aktivoituvat proto-onkogeenisen Ras, ja se voi edistää nopeaa etenemistä ihmisen munuaissyövän läpi yli-ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentymisen ja syövän solujen lisääntyminen estyi rapamysiini hoitoon, mikä viittaa potentiaaliseen osallistuminen nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitti tässä tuumorigeenisiä prosessissa. Täällä, tutkimme rooli mTOR reitin välittämisessä CNI- ja Ras aiheuttama yliekspressio VEGF ihmisen munuaissyöpäsoluissa (786-0 ja Caki-1). Huomasimme, että knockdovvn raptor (käyttäen siRNA) laski merkittävästi CNI aiheuttama VEGF-promoottorin aktiivisuutta havaittuna promoottori-lusiferaasianalyysissä, mikä viittaa rooli mTOR complex1 (mTORC1) in CNI aiheuttama VEGF transkriptio. On tunnettua, että mTOR aktivoituu fosforylaation jälkeen kun se on negatiivinen säätelijä PRAS40, joka on osa mTORC1. Havaitsimme, että CNI hoitoon ja aktivointi H-Ras (transfek- aktiivisen H-Ras-plasmidi), lisääntyi merkittävästi fosforylaatiota PRAS40, ja solujen transfektio käyttäen määräävän-negatiivinen plasmidi Ras, merkittävästi vähentynyt PRAS40 fosforylaatiota. Proteiinikinaasi C (PKC) -ζ ja PKC-δ, jotka ovat kriittisiä välittäjä molekyylejä varten CNI aiheuttama tuumorigeenisiä reitissä on muodostettu kompleksi PRAS40; ja olemme havainneet, että CNI-hoito lisäsi kompleksin muodostuminen PRAS40 ja PKC, erityisesti (PKC) -ζ. PKC-proteiinin inhibitiota, jossa käytetään farmakologisia estäjä merkittävästi vähentynyt H-Ras-indusoitua fosforylaatiota PRAS40. Yli-ilmentyminen PRAS40 munuaisten syöpäsoluissa huomattavasti alassäädetty CNI- ja H-Ras aiheuttama VEGF transkription aktivaation. Lopuksi havaittiin, että CNI käsittely lisäsi ilmentymistä phosho-PRAS40 munuaiskasvainten kudoksissa

in vivo

. Yhdessä fosforylaatio PRAS40 on kriittinen aktivointi mTOR in CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentymisen ja munuaisten syövän etenemisen.

Citation: Basu A, Banerjee P, Contreras AG, Flynn E, Pal S (2011) Calcineurin estäjän aiheuttama ja Ras-välitteisen yliekspressio VEGF munuaissyöpäsoluissa Koskee mTOR kautta asetukseen PRAS40. PLoS ONE 6 (8): e23919. doi: 10,1371 /journal.pone.0023919

Editor: Sujit Basu, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 01 elokuu 2011; Julkaistu: 23 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Basu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoittivat seuraavasti: 1) National Institutes of Health Grant R01 CA131145 (SP); 2) John-Merrill Grant ASN-AST (ja S. P.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset parannukset immunosuppressiivisten hoitojen ovat vähensi merkittävästi akuutin hylkimisreaktion allograftien, ja lisäsi eloonjäämistä elinsiirtopotilaiden [1], [2]. Nämä aineet voivat myös osaltaan lisätä kuolleisuus Lisääntyneen syöpäriski [3], [4], [5], [6]. On todettu, että syöpä edustaa toiseksi suurin kuolinsyy munuaisensiirtopotilailla, joilla on normaalia toimintaa siirteen [7]. On myös osoitettu, että siirteen ympäristö voi nopeuttaa uusiutumisen tai etenemisen syövän [3],. Siten hoitotavoitteet on kehitettävä, jotta estetään syövän kehittymisen käytöstä alle immunosuppressiivista hoitoa.

immunosuppressiivisten aineiden arvellaan kompromisseja immuunivalvonnan mekanismi (t) kasvainsolujen ja /tai häiritä normaalia DNA: n korjaukseen mekanismit [4], [5], [8]. Erityisesti kalsineuriinin estäjä (CNIs) ovat erinomaisia ​​immunosuppressiivisten aineiden estävän hyljinnän; mutta ne voivat edistää kasvua eri kasvaimia [9], [10], [11], [12]. Kalsineuriinin monimutkainen koostuu kolmesta alayksiköstä, katalyyttinen A, sääntely B, ja kalmoduliini [13]. Solujen kalsium aktivoi katalyyttinen alayksikkö sen toimivat seriini /treoniini-fosfataasi, jolloin aktivointi tumatekijä aktivoitujen T-solujen (NF-AT) perheen transkriptiotekijöiden [14]. CNI syklosporiini (CsA) sitoutuu cyclophylin, soluliman proteiinin, ja tuloksena monimutkainen sitoutuu sääntelyn B-alayksikön kalsineuriini ja estää aktivoinnin NFAT [15]. Sen lisäksi estämällä NFAT The CNIs voi myös säädellä muita molekyylejä tärkeässä osassa kasvaimen kasvua [16], [17]. Hojo

et al.

[9] osoitti, että CsA edistää syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden suoralla solujen vaikutuksesta (t) kautta transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β) tuotanto, joka on riippumaton sen vaikutus immuunijärjestelmään vastaanottavan. Koehl

et al.

[18] on raportoitu, että CsA hoito edistää kehitystä elinsiirron jälkeisen syöpä, joka on erittäin riippuvainen prosessi kasvaimen angiogeneesiä. Vastaavasti, Guba

et al.

[19] esitetään, että CsA hoito voi indusoida angiogeenistä sytokiinien.

verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on yksi tehokas angiogeeninen sytokiinien, joka toistaa tärkeässä osassa kasvaimen kasvua [20], [21]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että käsittely CNIs indusoi yli-ilmentymisen VEGF, ja edistää nopeaa etenemistä ihmisen munuaissyövän [22]. CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentyminen on säänneltyä sekä transkription ja posttranskriptionaalisella tason [22], [23]. Olemme myös havainneet, että CNIs voi aktivoida proto-onkogeenisen H-Ras ihmisen munuaisen syöpäsoluissa [24]; ja olemme osoittaneet, että CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentyminen on välittämien proteiinikinaasi C (PKC) -ζ ja PKC-δ [22], [23], jotka ovat mahdollisia alavirran kohteita Ras [25].

toisin CNIs, nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) estäjä rapamysiini (RAPA) voi olla täysin päinvastainen vaikutus kannalta kasvaimen kehitystä [10], [19], [26]. Elinsiirron saavien potilaiden RAPA hoitoa eivät kehittyä syöpä samaan tahtiin kuin saaneet muita immunosuppressiivisia aineita, kuten CNIs [27], [28]. On osoitettu, että RAPA hoito voi olla anti-angiogeeninen vaikutus [19]. Kiinnostavaa kyllä, olemme hiljattain osoittaneet, että RAPA hoito voi merkittävästi inhiboida CNI-indusoitu VEGF-mRNA: n stabiilisuuteen [23], ja CNI-indusoitua proliferaatiota ihmisen munuaissyövän soluihin [24]. Nämä tulokset osoittavat selvästi, mahdollisen roolin mTOR in CNI aiheuttama syntyreitit. Tueksi Näiden havaintojen on raportoitu, että Akt-mTOR koulutusjakson vaaditaan CNI aiheuttaman kasvaimen kasvua [29]. Lisäksi sekä PKC-ζ ja PKC-δ voi aktivoida Akt-mTOR-reitin [30], [31], [32], [33].

mTOR polku on keskeinen rooli solujen eloonjääminen kasvu, proteiinisynteesiä, solujen aineenvaihduntaan, ja angiogeneesi [34], [35]. Muutokset koulutusjakson säännellä mTOR esiintyä useissa kiinteiden maligniteetteja, kuten munuaisten syöpään [36], [37], [38]. mTOR, joka on konstitutiivisesti aktivoitu monissa syövissä mukaan vapautuneilla aktivoituminen onkogeenien tai menetyksen tuumorisuppressorigeeneille, toimii makromolekyylikompleksien [39]. MTOR complex1 (mTORC1), joka sisältää raptor, on RAPA herkkä; kun taas mTOR complex2 (mTORC2), joka sisältää rictor, on RAPA tunteeton [34], [39]. Äskettäin on osoitettu, että runsaasti proliinia Akt substraatti 40 kDa (PRAS40) voi säädellä negatiivisesti mTOR toimintaa [40], [41]. Ennen tilin fosforyloituu Akt, PRAS40 sitoutuu raptor ja sequesters raptor maasta mTORC1; tämä johtaa häiriöihin mTORC1 samanlainen vaikutus RAPA [40], [42]. Vuorovaikutus PRAS40 kanssa raptor kilpailee vuorovaikutusta raptor kanssa S6K1 ja 4E-BP1 [42], [43]. Lisäksi tämä vuorovaikutus PRAS40 on hyvin spesifinen mTORC1, koska PRAS40 ei liittävät tai häiritä mTORC2 [34].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että CNI aiheuttama ja Ras-PKC välittämää VEGF yliekspressio voidaan kanavoida mTORC1 signalointireitin, ja tämä välittyy sääntelyn PRAS40. Osoitamme, että CNI hoitoon ja aktivointi H-Ras: n ja PKC voi johtaa fosforylaatioon PRAS40; ja yli-ilmentyminen PRAS40 johtaa alas-säätely CNI- ja Ras aiheuttama VEGF transkription aktivaation. Tulokset Tutkimuksemme ehdottaa uusia rajat talk keskuudessa Ras, PKC ja mTOR säätelyssä CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentymisen.

Tulokset

osallistuminen on mTOR complex1 in kalsineuriini estäjien indusoiman VEGF yli-ilmentymän Human munuaissyöpäsoluissa

Olemme äskettäin osoittaneet, että hoito kalsineuriinin estäjien (CNIs) voi edistää VEGF yli-ilmentymisen ihmisen munuaissyöpäsoluissa kautta sekä transkription ja transkription jälkeisen määräyksiä [22], [23]. Olemme myös osoittaneet, että CNI aiheuttama VEGF-mRNA: n stabiilisuuteen, ja CNI aiheuttama munuaisten syöpäsolujen proliferaatiota, inhiboitui merkittävästi hoidon jälkeen kanssa mTOR inhibiittorin rapamysiini (RAPA) [23], [24]. Meidän havainnot selvästi mahdollista roolia mTOR in CNI aiheuttama syntyreitit. Täällä me ensin tutkinut roolin mTOR in CNI aiheuttama VEGF transkription aktivoitumista ihmisen munuaissyöpäsoluissa (786-0 ja Caki-1). Solut, jotka on transfektoitu VEGF-promoottori-lusiferaasiplasmidin, ja sitten käsiteltiin CNI syklosporiini (CsA) puuttuessa tai läsnä ollessa RAPA. Kuten kuviossa 1A on esitetty, CsA hoito edistää VEGF transkriptionaalista aktivaatiota 786-0 soluissa, ja RAPA hoito esti merkitsevästi CsA aiheuttama VEGF-promoottorin aktiivisuutta. Löysimme samanlainen tulos (tietoja ei esitetty) Caki-1-soluissa. Seuraavaksi myös havaittu, että CsA indusoi VEGF-proteiinin ilmentymisen havaittuna Western blot-analyysi; ja hoito RAPA esti merkittävästi CsA-indusoitu VEGF-ilmentymisen (kuvio 1 B).

A,

786-0 solut transfektoitiin 2,6-kb: n VEGF-promoottori-lusiferaasi-konstrukti (0,5 ug /hyvin). Transfektion jälkeen soluja viljeltiin 12 tunnin ajan, ja sitten sitä käsiteltiin yön yli (12 h), joilla on erilaiset yhdistelmät CsA (5,0 ug /ml) ja RAPA (10,0 ng /ml) tai pelkästään vehikkeliä (kontrolli). Seuraavat 24 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin, ja taita muutos lusiferaasin aktiivisuus laskettiin suhteellinen lusiferaasi laskee kustakin ryhmästä solujen verrattuna solujen vehikkeliä yksinään. Tiedot heijastavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet,

keskimäärin kolmena lukeman eri näytettä;

virhepalkkien,

SD.

B,

786-0 soluja käsiteltiin erilaisilla yhdistelmillä CsA (5,0 ug /ml) ja RAPA (10,0 ng /ml) tai pelkästään vehikkeliä (kontrolli) 24 tunnin ajan. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti-VEGF ja anti-β-aktiini kvantitoimiseksi proteiinin ekspressio VEGF: n ja β-aktiini vastaavasti. Pylväsdiagrammi alapuolella Western blot havainnollistaa suhteellista ilmentymistä VEGF densitometrialla, jossa signaalit olivat standardoitu ilmaus sisäisen valvonnan β-aktiini. Edustajalle kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet,

keskimäärin suhteellinen voimakkuus VEGF ilmaisun kolmesta eri blotteja;

baareja,

SD.

C,

786-0 solut transfektoitiin joko raptor siRNA (25 nM) tai kontrolli siRNA. Sen jälkeen 24 tunnin siRNA transfektiosta solut transfektoitu 2,6 kb VEGF promoottori-lusiferaarikonstrukti (0,5 ug /kuoppa). Sen jälkeen, kun 12 tunnin plasmidin transfektion jälkeen solut käsiteltiin yön yli (12 h) joko CsA (5,0 ug /ml) tai pelkästään vehikkeliä (kontrolli). Solut otettiin talteen, ja taita muutos lusiferaasin aktiivisuus laskettiin suhteellinen lusiferaasi laskee kustakin ryhmästä solujen verrattuna transfektoitujen solujen ohjaus siRNA ja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. Tiedot heijastavat kahden erillisen kokeen.

Sarakkeet,

keskimäärin kolmena lukemiin näytteitä;

virhepalkkien,

SD. Knockdovvn raptor varmistettiin Western blot-analyysi sen jälkeen, kun 48 tunnin siRNA transfektion (

oikea paneeli).

(A-B) *,

p

0,01 verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen ; **,

p

0,01 verrattuna vain CsA käsiteltyjä soluja. (C) *,

p

0,01 verrattuna ohjaus siRNA-transfektoiduissa ja ajoneuvojen käsiteltyjä soluja; **,

p

0,05 verrattuna ohjaus siRNA-transfektoiduissa ja CsA käsiteltyjä soluja.

vieressä tutki roolia mTOR complex1 (mTORC1) in CNI aiheuttama VEGF transkriptio. Kuten aiemmin, raptor on osa mTORC1 [34], [39]. Täällä, havaitsimme, että knockdovvn raptor käyttämällä siRNA merkittävästi vaimentua CNI aiheuttama VEGF-promoottorin aktiivisuutta (kuvio 1 C). Knockdovvn raptor (-70%) vahvistettiin Western blot -analyysillä (kuvio 1 C,

oikea paneeli

). Yhdessä nämä havainnot osoittavat selvästi osallistumista mTORC1 in CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentymisen munuaisten syöpäsoluja.

Hoito CNI ja aktivointi H-Ras Edistää fosforylaatio PRAS40

Olemme äskettäin osoittaneet, että CNI hoito voi aiheuttaa aktivoitumista H-Ras munuaisten syöpäsoluissa [24]. Tuoreessa raportissa [44], on osoitettu, että aktivointi Ras voi edistää mTOR signalointia. Kuten aiemmin käsiteltiin, PRAS40 toimii negatiivisena säätelijänä mTORC1, ja estää sen toimintaa alavirran signalointia tapahtumat [34], [40], [41]. Fosforylaation jälkeen, PRAS40 saa dissosioituvan raptor of mTORC1, ja siten mTOR aktivoituu. Kuten aiemmin kokeilu osoitti osallistumista raptor in CNI aiheuttama VEGF transkriptio, tässä halusimme arvioida, CNI hoito ja aktivointi H-Ras voisi säädellä PRAS40 fosforylaatiota. Ensin tarkistetaan ekspressiota fosfo-PRAS40 normaaleissa munuaisten epiteelisolujen (RPTEC), ja 786-0 ja Caki-1 munuaisten syöpäsoluja. Kautta Western blot-analyysi, havaittiin, että ekspressio fosfo-PRAS40 oli selvästi korkeampi 786-0 ja Caki-1-soluissa verrattuna RPTEC (kuvio 2A,

yläpaneeli

); kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta ilmentyminen koko PRAS40 näissä soluissa (kuvio 2A,

alempi paneeli

). Tämä havainto viittaa siihen, että mTOR reitti on aktiivinen munuaisten syöpäsoluja.

A,

ilmentyminen fosfo-PRAS40 ja PRAS40 mitattiin kokosolulysaateista RPTEC, 786-0, ja Caki-1 Western blot -analyysillä käyttäen anti-fosfo-PRAS40 ja anti-PRAS40.

B,

786-0 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (1,0 ja 5,0 ug /ml), CsA: ta tai pelkkää vehikkeliä (kontrolli) 3 tunnin ajan. Solut hajotettiin, ja ilmaisu fosfo-PRAS40 ja PRAS40 mitattiin Western blot-analyysi.

C,

Caki-1-soluja transfektoitiin joko kasvavia konsentraatioita (0,1-1,0 ug /kuoppa) H-Ras (12V) tai tyhjä ekspressiovektoriin (kontrolli) 24 tunnin ajan. Solut hajotettiin, ja ilmaisu fosfo-PRAS40, PRAS40, Ras, ja β-aktiini solulysaateista mitattiin Western blot-analyysi.

D,

Caki-1-soluja transfektoitiin joko eri pitoisuuksilla (0,5 ja 1,0 ug /kuoppa) määräävän-negatiivinen Ras (17N) tai tyhjä ekspressiovektoriin (kontrolli) 24 tunnin ajan. Solut hajotettiin, ja ilmaisu fosfo-PRAS40, ja PRAS40 mitattiin Western blot-analyysi. (A-D) edustaja kolmen erillisen kokeen vastaavia löydöksiä.

vieressä määritti CsA hoidon PRAS40 fosforylaatioon. 786-0 soluja käsiteltiin joko kasvavilla pitoisuuksilla CsA tai pelkkää vehikkeliä; ja ilmaisu fosfo-PRAS40 tutkittiin Western blot -analyysillä. Kuten kuvassa 2B, CsA hoito lisääntyi merkittävästi ekspressiotason fosfo-PRAS40 verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään (

yläpaneeli

); kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta ilmaus koko PRAS40 seuraavista CsA hoidon (

alempi paneeli

).

Seuraavaksi pyrimme vaikutuksen arvioimiseksi H-Ras aktivoinnin PRAS40 fosforylaatioon. Tätä varten, Caki-1-soluja transfektoitiin joko kasvavia pitoisuuksia ekspressoivan plasmidin aktivoitua muotoa H-Ras, H-Ras (12V), tai tyhjä ekspressiovektoriin. Transfektion jälkeen, ilmaus fosfo-PRAS40 ja yhteensä PRAS40 mitattiin. Huomasimme, että aktivointi H-Ras huomattavasti tasoa phosho-PRAS40 verrattuna vektori-transfektoiduissa ohjaus (kuvio 2C,

ensimmäisen paneelin

); ei ollut merkittävää muutosta yhteensä PRAS40 seuraavissa H-Ras aktivointi (kuvio 2C,

toinen paneeli

). Yli-ilmentyminen H-Ras (12V) näissä soluissa vahvistettiin Western blot -analyysillä (kuvio 2C,

kolmas paneeli

).

Lopuksi tarkastetaan vaikutus estämällä endogeenisen Ras on PRAS40 fosforylaatioon. Caki-1-solut transfektoitiin joko dominanttinegatiivinen mutantti Ras, Ras (17N), tai tyhjän vektorin, ja ilmaisu fosfo-PRAS40 mitattiin. Kuten kuviossa 2D on esitetty, inhibitio Ras vähentynyt ilmentyminen fosfo-PRAS40 (

yläpaneeli

); kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta ilmaus koko PRAS40 (

alempi paneeli

). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että CNI hoito ja aktivointi H-Ras-reitin ihmisen munuaisten syöpäsolut voivat aiheuttaa mTOR lisäämällä fosforylaation PRAS40.

PKC lomakkeet Complex PRAS40, ja voi aiheuttaa sen Fosforylaatio

edellisessä raportissa [22], olemme osoittaneet, että PKC-ζ ja PKC-δ ovat kriittisiä välittäjänä signalointi molekyylejä CNI aiheuttama VEGF transkription aktivaation; ja nämä PKC-isoformit voivat toimia mahdollisina alavirtaan kohteina aktiivisen Ras [25]. Täällä me pyrkineet onko PKC voisi säädellä fosforylaatiota PRAS40. Ensin tarkistetaan, oliko kompleksin muodostuminen PRAS40 ja joko PKC-ζ ja PKC-δ in RPTEC ja 786-0 soluja pohjapinta kunnossa. Immunosaostuksella, havaitsimme, että todellakin molemmat PKC-ζ ja PKC-δ voisi monimutkainen PRAS40 (kuvio 3A); kuitenkin, intensiteetti kompleksi oli paljon voimakkaampaa syöpäsoluissa verrattuna normaalin munuaistoiminnan epiteelisolujen. Olemme ensi tutkinut jos CNI hoito voisi moduloida kompleksin muodostuminen PRAS40 ja PKC-ζ ja PKC-δ in 786-0 soluissa. Kuten kuviossa 3B on esitetty, hoito CsA lisääntyi merkittävästi välisen kompleksin PRAS40 ja PKC-ζ verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään; kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta (dataa ei esitetty) kompleksin muodostuminen PRAS40 ja PKC-δ.

A,

lysaatteja RPTEC ja 786-0 solut immunosaostettiin anti- PRAS40.

B,

786-0 soluja käsiteltiin joko CsA (5,0 ug /ml) tai pelkästään vehikkeliä (kontrolli) 2 tunnin ajan. Solulysaatit immunosaostettiin anti-PRAS40. (A-B) Immunosaosteet (IP) on kiinni proteiini A-Sepharose-helmiä, keitettiin SDS-puskurissa, ja erotettiin SDS-PAGE: lla. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen joko anti-PKCζ, tai anti-PKCδ, tai anti-PRAS40.

C,

786-0 soluja käsiteltiin joko kasvavia konsentraatioita (50-250 nmol /L) kalfostiini C: n tai pelkästään vehikkeliä (kontrolli) 3 tunnin ajan. Solut hajotettiin, ja ilmaisu fosfo-PRAS40 ja PRAS40 mitattiin Western blot-analyysi.

D,

Caki-1-soluja esikäsiteltiin joko kalfostiini C (100 nmol /l) tai pelkästä; ja solut transfektoitiin joko H-Ras (12V) (1,0 ug /kuoppa) tai pelkästään vektorilla 24 tunnin, puuttuessa tai läsnä kalfostiini C. Solut hajotettiin, ja ilmaisu fosfo-PRAS40 ja PRAS40 mitattiin Western blot-analyysi. (A-D) edustaja kolmesta riippumattomasta kokeesta, joilla on samankaltaisia ​​havaintoja.

Seuraavaksi testasimme, mikäli inhibitio PKC kautta hoitoon farmakologisen inhibiittori voi vähentää fosforylaation PRAS40. 786-0 soluja käsiteltiin joko kasvavilla pitoisuuksilla kalfostiini C tai pelkkää vehikkeliä. Käsittelyn jälkeen ilmaus fosfo-PRAS40 ja yhteensä PRAS40 mitattiin Western blot-analyysi. Kuten kuviossa 3C on esitetty, hoito kalfostiini C merkittävästi vähentynyt taso phosho-PRAS40 verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään (

yläpaneeli

); kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta ilmaus koko PRAS40 (

alempi paneeli

). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että PKC voi liittyä PRAS40, ja säädellä sen fosforylaatio. Kuitenkin, se ei voi päätellä, jos on suora kompleksin muodostuminen PKC ja PRAS40, ja onko jokin muu liittyvät molekyylit ovat mukana PKC-välitteisen PRAS40 fosforylaation.

PKC-proteiinin inhibitiota down-regulation H-Ras-indusoidun fosforylaatio PRAS40

aiemmissa kokeissa olemme osoittaneet, että H-Ras aktivaatio voisi indusoida PRAS40 fosforylaatiota. Täällä, halusimme tutkia, jos esto PKC voisi alas-säädellä H-Ras aiheuttama fosforylaatiota PRAS40 munuaisten syöpäsoluja. Tätä varten, Caki-1-soluja transfektoitiin joko H-Ras (12V) tai tyhjän ekspressiovektoriin puuttuessa tai läsnä PKC-inhibiittorin kalfostiini C Transfektion jälkeen ilmentyminen fosfo-PRAS40 ja yhteensä PRAS40 mitattiin. Kuten on esitetty kuviossa 3D (

yläpaneeli

), aktivaatio H-Ras indusoi fosforylaation PRAS40 verrattuna vektori transfektoitiin kontrolli; ja esto PKC merkittävästi alassäädetty H-Ras aiheuttama PRAS40 fosforylaatio. Ei ollut merkittävää muutosta ilmaus koko PRAS40 seuraavien H-Ras aktivointi- ja PKC eston (kuvio 3D,

alempi paneeli)

. Nämä havainnot osoittavat selvästi, että Ras-PKC-reitin, joka on kriittinen CNI aiheuttama tuumorigeenisiä signalointi tapahtumia, voi fosforyloivat PRAS40, ja voi siten aktivoida mTOR.

yli-ilmentyminen PRAS40 Estää CNI- ja H-Ras-aiheuttama Transkription aktivointi VEGF

aikaisemmat kokeet ehdotti, että CNI aiheuttama ja Ras-välitteisen signalointireittien voitaisiin inaktivoida PRAS40 kautta fosforylaatio lisääntyy. Täällä me ensin tutkia, mikäli yliekspressio PRAS40 voisi estää CNI aiheuttamaa yliekspressio VEGF munuaissyöpäsoluissa. 786-0 solut kotransfektoitiin VEGF-promoottori-lusiferaasi-konstrukti ja joko PRAS40 yli-ilmentyminen plasmidin tai tyhjän ekspressiovektoriin. Soluja käsiteltiin joko CsA tai pelkkää vehikkeliä. Kuten on esitetty kuviossa 4A, CsA-hoito lisäsi VEGF transkription aktivaatio verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään; ja yli-ilmentyminen PRAS40 merkittävästi vähentää CsA aiheuttama VEGF-promoottorin aktiivisuutta. Yli-ilmentyminen PRAS40 transfektoiduissa soluissa varmistettiin Western blot -analyysillä (kuvio 4A,

alempi paneeli

).

A, top,

786-0 soluja yhteistyötä transfektoitu 2,6-kb: n VEGF-promoottori-lusiferaasi-konstrukti (0,5 ug /kuoppa) ja joko PRAS40 yliekspressio plasmidi (myc-PRAS40) (0,5 ug /kuoppa) tai tyhjän vektorin. Transfektion jälkeen soluja viljeltiin 12 tunnin ajan, ja sitten sitä käsiteltiin yön yli (12 h) joko CsA (5,0 ug /ml) tai pelkästään vehikkeliä (kontrolli). Seuraavat CsA hoito, solut otettiin talteen, ja taita muutos lusiferaasin aktiivisuus laskettiin suhteellinen lusiferaasi laskee kustakin ryhmästä solujen verrattuna solujen transfektoitu tyhjällä vektorilla ja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä.

A, pohja,

yli-ilmentyminen myc-PRAS40 plasmidi transfektoiduissa soluissa varmistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä anti-PRAS40; ja ilmaus β-aktiini mitattiin sisäistä valvontaa.

B,

Caki-1-solut ko-transfektoitiin 2,6-kb: n VEGF-promoottori-lusiferaasi-konstrukti (0,5 ug /kuoppa) ja erilaisia ​​yhdistelmiä H-Ras (12V), myc-PRAS40 ja tyhjän vektorin (0,5 ug /kuoppa kutakin plasmidia). Seuraavat 24 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin, ja taita muutos lusiferaasin aktiivisuus laskettiin suhteellinen lusiferaasi laskee kustakin ryhmästä solujen verrattuna solujen transfektoitu tyhjällä vektorilla. (A-B) Tiedot kuvastavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet,

keskimäärin kolmena lukeman eri näytettä;

virhepalkkien,

SD. In A, *,

p

0,01 verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoiduissa ja ajoneuvojen käsiteltyjä soluja; **,

p

0,01 verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoiduissa ja CsA käsiteltyjä soluja. B, *

p

0,01 verrattuna vektorilla transfektoidut solut; **,

p

0,01 verrattuna vektori-ja H-Ras (12V) -transfected soluja.

Seuraavaksi määritetty, jos yli-ilmentyminen PRAS40 voisi estää H- Ras aiheuttama VEGF transkription. Caki-1-soluja kotransfektoitiin VEGF-promoottori-lusiferaasi-konstrukti ja H-Ras (12V) puuttuessa tai läsnä ollessa PRAS40 yliekspression plasmidi. Ohjaus-solut transfektoitiin tyhjällä ekspressiovektoreilla. Kuten on esitetty kuviossa 4B, aktivaatio H-Ras lisääntyi VEGF-transkription aktivaatio verrattuna vektori-transfektoituja soluja; ja yli-ilmentyminen PRAS40 merkittävästi vähentynyt H-Ras aiheuttama VEGF-promoottorin aktiivisuutta. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että CNI- ja Ras aiheuttama signalointi tapahtumat voivat edistää VEGF transkription aktivaation käytettäessä mTOR-riippuvaisen reitin kautta sääntelyn PRAS40.

CNI Hoito Kasvattaa fosforylaatio PRAS40 munuaiskasvainten Kudokset

in vivo

Olemme äskettäin osoittaneet, että immuunivajaissa (

nu /nu

) hiiriä, CNI (CsA) käsittely merkittävästi vauhditti ihmisen munuaisten kasvaimia (786-0) läpi VEGF-angiogeneesiä, verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin [22]. Emme kuitenkaan ole arvioida ekspressiotaso fosfo-PRAS40 kasvaimissa. Niinpä tässä tutkimme tilan fosfo-PRAS40 näissä kasvaimen kudoksissa CsA saaneista sekä ohjaus hiirillä. Kuten kuvassa 5, ilmentymisen fosfo-PRAS40 lisääntyi merkittävästi (havaittuna laikkuja tummanpunainen värjäys) munuaiskasvainten kudoksissa saadaan CsA käsiteltyjen hiirten (

sivun oikeassa paneelissa

), verrattuna kasvaimen kudokset apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään (

sivun vasemmassa paneelissa

). Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta ilmentyminen koko PRAS40 kasvainkudoksissa saatu CsA-käsiteltyjen (

keskimmäinen oikea paneeli

) tai vehikkelillä käsitellyn ryhmän (

keskimmäinen vasen paneeli

). Meidän

in vivo

data on samanlainen kuin meidän

in vitro

havainnoista, ja se viittaa siihen, että CNI välittämää ja VEGF: n indusoimaa nopeutettua kasvua ihmisen munuaisten kasvaimia voi liittyä lisääntynyt fosforylaatioon PRAS40, jotka voivat johtaa aktivaatioon mTOR kautta.

Ihmisen munuaisten syöpäsolujen (1,0 x 10

6, 786-0) injektoitiin sc nude (

nu /nu

) hiiriä (

n

= 5 kussakin ryhmässä), ja ne hoidettiin joko CsA (10 mg /kg /vrk) tai ajoneuvon kanssa kontrollina . Kasvaimet kerättiin talteen päivänä 25 kasvaimen injektion jälkeen. Edustavia mikrovalokuvia kuvaavat immunohistokemiallinen ilmaus fosfo-PRAS40 (

ylälevyissä

) ja PRAS40 (

keskikuvat

) in korjattu munuaisten kasvain kudosten (suurennos X400).

Merkit tummanpunainen väri,

ilmentyminen phosho-PRAS40, joka oli merkittävästi lisääntynyt kasvaimen kudoksissa CsA-käsitellyistä hiiristä. H E, hematoksyliinillä ja eosiinilla. Edustavat kolmea eri kudosnäytteistä sekä CSA- ja ajoneuvon hoidetuissa ryhmissä.

Keskustelu

kehitys sekä nopea eteneminen syöpään on suuri ongelma hoidetuilla potilailla immunosuppressiivista aineet [3], [4], [5]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että kalsineuriinin estäjä (CNIs) voi edistää nopeaa etenemistä ihmisen munuaissyövän kautta yli-ilmentymisen VEGF [22], [23]; ja H-Ras ja PKC voi toimia kriittisiä välittäjänä signalointi molekyylejä CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentymisen [22], [24]. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, uusi polku, jossa CNI aiheuttama ja Ras-PKC-välitteiset signaalit voivat liittyä mTORC1 säätelemällä sen estävän molekyylin PRAS40, ja edistää VEGF yli-ilmentymisen.

Kuten aiemmin, CNIs välittävät niiden immunosuppressiivisten toiminta estämällä kalsineuriinin-NFAT polku [15]. Kuitenkin CNIs voi myös säädellä muita signalointimolekyylejä mukana VEGF: n ilmentymistä ja muiden geenien [16], [17]. Olemme äskettäin osoittaneet, että CNI hoito voi aktivoida H-Ras, ja voi myös aiheuttaa fosforylaatio sen loppupään tavoitteita, PKC-ζ ja PKC-δ; ja edistää yli-ilmentyminen VEGF ihmisen munuaissyöpäsoluissa [22], [23]. Chen

et al.

[45] ovat raportoineet, että CsA aiheuttama oksidatiivinen stressi voi säätää ylös ja aktivoi PKC-ζ in virusinfektoitua ihmisen B-soluja, jotka voivat johtaa induktion lymfoproliferatiivisten sairauksien elinsiirtopotilailla.

Mielenkiintoista, olemme osoittaneet, että CNI aiheuttama VEGF yli-ilmentymisen ja munuaissyövän soluproliferaation estyy RAPA hoito, mikä viittaa mahdolliseen rooliin mTOR in CNI aiheuttaman syntyreitit, johon Ras aktivointi [23], [ ,,,0],24]. Tueksi havaintojemme Carriere

et al.

[44] ovat äskettäin raportoitu, että mitogeenisesta ja onkogeeniset aktivointi Ras-reitin voi aiheuttaa mTORC1; se on myös osoitettu, että Akt-mTOR reitti tarvitaan CNI-indusoitua kasvaimen kasvun [29]. Lisäksi sekä PKC-ζ ja PKC-δ voi edistää induktion Akt-mTOR-reitin [30], [31], [32], [33]; ja PI-3K /Akt /mTOR-välitteiset signaalit voidaan kanavoida HIF ja SP1 [46], [47], kaksi suurta transkriptiotekijät VEGF ilmaisun [25], [48].

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että raptor, joka on osa mTORC1 on kriittinen CNI aiheuttama VEGF transkription aktivaation. Osoitamme, että CNI /Ras-indusoidun ja PKC-välitteisen yliekspressio VEGF ihmisen munuaisen syöpäsoluissa edellyttää PRAS40, negatiivinen säätelijä mTORC1 [34], [40], [41]. CNI-käsittely sekä aktivoinnin Ras ja PKC edistää fosforylaation PRAS40, joka voi johtaa induktion mTOR signalointireitin. Tutkimuksemme osoittaa rooli H-Ras säätelyssä PRAS40 fosforylaatioon; mutta emme voi sulkea pois roolit kahden muun Ras isoformia (K-Ras ja N-Ras) tässä prosessissa. Aikaisemmin osoitimme, että CNI hoito välittää nopean etenemisen ihmisen munuaisen kasvain läpi VEGF: n indusoimaa angiogeneesiä [22]; täällä, me osoitamme, että ilmaisulla fosfo-PRAS40 lisääntyy selvästi näissä munuaisten tuumorikudoksissa seuraavat CNI hoitoa. Yli-ilmentyminen PRAS40 vähentää merkittävästi CNI- ja Ras aiheuttama VEGF transkription aktivaation. Siten Tutkimuksemme viittaa selvästi siihen, että mTOR on kriittinen signalointi molekyyliä CNI aiheuttama tuumorigeenisia reitin (t), jotka voivat johtaa VEGF yli-ilmentymisen munuaissyöpään.