Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eturauhassyöpä on yleinen ja heterogeeninen sairaus, jossa androgeenireseptorin (AR ) signalointi on keskeinen rooli kehittymisessä ja etenemisessä. Alkuperäinen hoito edenneen eturauhassyövän on tukahduttamista androgen signalointi. Myöhemmin, oleellisesti kaikki potilaat kehittää androgeeniriippumattomaksi vaiheeseen, joka ei vastaa anti hormonihoito. Siten vaihtoehtoisia strategioita kohdistaminen uusia molekyylitason mekanismeja tarvitaan. β-TrCP on E3-ligaasi, joka kohdistuu eri alustoille olennaista monessa tumorigeneesin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä osoitamme, että β-TrCP ehtyminen tukahduttaa eturauhassyöpä ja tunnistaa asiaan kasvua valvontamekanismia. shRNA kohdistettu β-TrCP pienentää eturauhasen syöpäsolun kasvua ja yhteistyötä androgeeniablaatio

in vitro

ja

in vivo

. Olemme havainneet, että β-TrCP inhibitio johtaa ylössäätely aryylihiilivetyreseptori (AhR), joka välittää terapeuttista vaikutusta. Tämä ilmiö voi olla ligandi riippumaton, koska AhR ligandina 2,3,7,8-Tetraklooridibentso-p-dioksiini (TCDD) ei muuttanut eturauhasen syöpäsolun kasvua. Havaitsimme korkea AhR ilmaisun ja aktivoinnin tyvisoluissa ja atrofisen epiteelisolut ihmisen syövän varustettujen prostates. AhR ilmaisun ja aktivointi on myös huomattavasti korkeampi kasvainsoluissa verrattuna hyvänlaatuinen rauhasepiteeliin.

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että AhR aktivaatio voi olla syöpä vastapainona mekanismi eturauhasen. Katsomme, että yhdistämällä β-TrCP esto Androgeeniablaatio- voisivat hyötyä edenneen eturauhassyövän potilailla.

Citation: Gluschnaider U, Hidas G, Cojocaru G, Yutkin V, Ben-Nerijan Y, Pikarsky E (2010) β- TrCP esto Vähentää Eturauhassyöpä Cell Growth kautta ylössäätely aryylihiilivetyreseptori. PLoS ONE 5 (2): e9060. doi: 10,1371 /journal.pone.0009060

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 lokakuu 2009; Hyväksytty: 16 tammikuu 2010; Julkaistu: 05 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Gluschnaider et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Dr. Miriam ja Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, Eturauhassyöpä Foundation – Israel ja Eturauhassyöpä Research Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on kuudenneksi yleisin syöpä maailmassa ja kolmanneksi suurin syy syöpään miehillä. Kehittyneissä maissa, eturauhassyöpä kehittyy yhdessä jokaisen yhdeksän miestä yli 65-vuotias. Tämä on heterogeeninen sairaus kannalta sen kliinistä etenemistä ja tuloksia, mutta androgeenireseptorin signalointi näyttää olevan yhteinen piirre sen kehittämiseen ja etenemiseen [1]. AR signalointi tiedetään säätelevän normaali, hyvänlaatuinen ja syöpä eturauhasen solujen erilaisissa prosesseissa (esim. Erilaistumisen ja lisääntymisen). Lisäksi, on olemassa havaintoja osoittaa, että AR ilmentyminen on onkogeeninen eturauhasessa epiteelin ja edistää etenemistä androgeeniriippumattomuuteen [2] – [8]. Alkuhoidoksi pitkälle ja metastaattisen eturauhassyövän on tukahduttamista androgeenituotanto erityisillä lääkkeiden tai kirurgisen kastraation. Myöhemmin, oleellisesti kaikki potilaat kehittää androgeeniriippumattomaksi vaiheeseen, joka ei vastaa anti hormonihoito. Jälkimmäinen vaihe on aina tappava; Näin, vaihtoehtoisia strategioita kohdistaminen uusia molekyylitason mekanismeja tarvitaan.

ubikitiinistä proteasomin järjestelmä on ratkaiseva tekijä lähes kaikki biologiset prosessit eukaryooteissa. Tässä reitissä proteiineja suunnattu hajoamista kovalenttisella ligaatiolla ubikitiinille, erittäin konservoitunut pieni proteiini. Proteiini ubikinaa- edellyttää yhtenäistä toimintaa E1 ubikitiinipromoottori aktivoivaan entsyymiin, E2 ubikitiinistä konjugointientsyymiä ja E3 ubikitiinistä proteiini ligaasia, joista viimeinen tuottaa useita ubikitiinipromoottori molekyylien kohdeproteiiniin [9] – [11]. Inhiboivaa koko ubikitiinipromoottori proteasomireitillä polku on terapeuttista arvoa syövän (esim Bortetsomibi, [12]). Koska proteasomiestäjät on dalmatialaistäpläisiä esto yhdellä näppäimen E3 voivat tarjota tarkempia hoitovaihtoehto vähemmän sivuvaikutuksia.

Beta-transdusiini toistoja sisältävät proteiinit (β-TrCP) toimivat substraattitunnistus alayksiköt että SCF

β-TrCP E3 ubikitiinipromoottori ligaasit. Nämä ligaaseihin ubiquitinate fosforyloidun alustoille erikseen ja on keskeinen rooli sääntelyn solunjakautumisen ja eri signaalitransduktioreaktioteiden, jotka puolestaan ​​ovat välttämättömiä monin tavoin tumorigeneesin [13]. On kaksi β-TrCP geenien nisäkkäiden genomien koodaavat kahta erittäin tarpeeton proteiineja β-TrCP1 ja β-TrCP2. Viime vuosina erilaiset β-TrCP substraattien mukana erilaisissa normaaleissa ja pahanlaatuisten polut löydettiin [14] – [23]. Kaksi hyvin tunnettu

bona fide

substraatteja ovat P-kateniinin ja IKB. Hajoaminen jälkimmäisen vapauttaa NF-KB menevän tuman ja aiheuttaa transkriptio [11], [24] – [27]. Toisaalta, β-kateniinin fosforyloituu, suoraan tunnustettu β-TrCP ja hajottaa proteasomista [24]. Siten β-TrCP on vastakkaiset vaikutukset kahteen keskeiseen onkogeenisia väyliä. Vaikka rooli β-kateniinin eturauhassyövässä on kiistanalainen [28], [29], on olemassa näyttöä siitä, että NF-KB: lla on pro-tuumorigeenisiä rooli eturauhassyövän [30] – [32]. Vastakkaiset vaikutus näihin kahteen onkogeenisiä proteiineja esimerkki monikäyttöisyyttä erityisen E3 ligaasilla. Lisäksi β-TrCP on suoraan sekaantunut useissa syöpätyypeissä [33] – [36], joten on uskottavaa tutkia tarkemmin rooliaan eturauhassyöpää.

Tässä työssä osoitamme, että β-TrCP esto estää eturauhassyövän kasvua osoittaa lisävaikutus Androgeeniablaatio-,

in vitro

ja

in vivo

. Tämä vaikutus on suurelta osin välittyy aktivoitumisen aryylihiilivetyreseptori (AhR), kuten kaatamalla tämä proteiini poistetaan vaikutuksen β-TrCP inhibition.

Tulokset

NF-KB: n aktivaatio korreloi Eturauhassyöpä Potilaiden tulos

β-TrCP on tärkeä E3 ligaasilla tiedetään säätelevän monia erilaisia ​​alustoja. NF-KB on hyvin tunnettu transkriptiotekijän säätelee negatiivisesti IKB, mikä välillisesti positiivisesti moduloidaan β-TrCP. Osallistuminen NF-KB eturauhassyövässä on hyvin tutkittu ja aikaisemmat tutkimukset osoittivat sen tumorogeenistä roolia eturauhasen. Myös äskettäin osoitus NF-KB osallistuminen etenemisen eturauhassyöpä androgeeniriippumattomaksi vaiheessa [37]. Jotta vahvistaa merkitystä tämän tekijä eturauhassyövän etenemiseen testasimme sen aktivoinnin tilaan ensisijainen ihmisen eturauhassyöpänäytteissä käyttäen immunohistokemiallista värjäystä vasta-aineita p65 (kuvio 1A). 131 eturauhassyöpä yksilöitä, täplikäs yhteen kudokseen microarray dia potilaista, joilla on eri Gleason laadut analysoitiin. 39% näytteistä osoitti ainakin jotkut p65: n positiivinen ytimet (kuvio 1 B). Analysoimme myös 14 eturauhassyöpäetäpesäkkeet, 64% oli positiivisia (kuvio 1A, B). Asetamme arvioida korrelaatio eturauhassyövän Gleason pisteet ja NF-KB: n aktivoitumisen. Todellakin, löysimme yhdistyksen välillä (p = 0,014, Fisherin tarkka testi). Kävi ilmi, että NF-KB tumavärjäystä oli voimakkaampi potilailla, joilla on korkeampi Gleason tai etäpesäkkeitä nostamalla sitä mahdollisuutta, että NF-KB voidaan korreloida ennusteeseen. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, me immunstained 80 ensisijainen kasvaimia varten p65, potilailta, jotka tehtiin eturauhasen ja josta meillä oli kliinistä seurantaa. 77% potilaista, joiden ensisijainen kasvain näytteet värjättiin negatiivisesti ydin- p65, ei osoittanut toistuminen jopa 8 vuotta post eturauhasen. Sen sijaan, tauti uusiutui 65% NF-KB-positiivisilla potilailla (kuvio 1C). Toinen tärkeä pro-onkogeenisen β-TrCP substraatti on β-kateniinin. Koska β-TrCP eston parantaa β-kateniinin vakautta ja edistää kasvaimen kehittymisen, se oli tarpeen valvoa myös β-catening korrelaatio eturauhassyövän potilaiden tuloksista. Nuclear lokalisointi β-kateniinin aktivointi ei korreloinut sairauden vakavuuden samassa kohortin potilaista (kuva S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat kliinistä hyötyä estämiseksi β-TrCP eturauhassyövässä. Silti lukuisat β-TrCP alustoille (37, jossa on mahdollisesti enemmän tunnistettava) esteenä kattavan analyysin ne kaikki samalla tavalla, ja edellyttää suoraa lähestymistapaa tutkia hyödyllisyyttä β-TrCP esto eturauhassyövässä.

Eturauhassyöpä osat immunovärjättiin käyttäen p65-vasta-aineita. A. Edustavia mikrovalokuvia primaarikasvain (vasemmalla) ja imusolmukkeen etäpesäke (oikealla) samasta potilaasta. B. Prosenttia negatiivisia, positiivisia ja vahvasti positiivisia tapauksia täplikäs kudoksen mikrosirulla osoitetuista Gleason tulokset (p = 0,0014, Fisherin tarkka testi). C. ensisijainen eturauhasen kasvain (n = 131) immunovärjättiin p65 ja arvioitiin NF-KB: n aktiivisuutta. Kaplan-Meier juoni paljastui korrelaatio NF-KB asema ja riski taudin uusiutumisen. Sininen, voimakkaasti värjätään näytteitä; Punainen, heikosti värjätään näytteitä; Green, negatiivinen värjättiin näytteet (p = 0,02).

β-TrCP esto Vähentää Eturauhassyöpä Cell Growth

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus β-TrCP estoa eturauhasen syöpäsolujen kasvua . Tätä varten me rakensimme doksisykliini indusoituva shRNA lentivirusvektorilla kohdistettu sekä β-TrCP1 ja β-TrCP2, joiden kanssa transdusoitu kaksi androgen-herkkien ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, LNCaP ja LAPC4. Doksisykliini käsittely trasnduced LNCaP johti tehokkaaseen knock down sekä β-TrCP geenien (85% ja 75% β-TrCP1 ja β-TrCP2, vastaavasti), kuten määritettiin käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR: llä (qRT-PCR – kuvio 2A). Tähän liittyi IκBα vakauttaminen sekä ennen seuraavaa TNF stimulaation, mikä osoittaa tehokkaan induktio proteiinin säätelyä alaspäin (kuvio 2B). Arvioidaan seurauksena β-TrCP kaataa eturauhasen syöpäsolujen, me seurataan doksisykliini-käsitellyn ja käsittelemättömän LNCaP yhdeksän päivää ja mitataan solujen kasvua

in vitro

. Kuvio 2C esittää vähentyneen solukasvua jälkeen joko β-TrCP estoa tai androgeeniablaatio hoitoon (alhaalla vasemmalla ja ylhäällä oikealla paneeli, vastaavasti). Lisäksi yhteisöön β-TrCP esto Androgeeniablaatio- esittää additiivinen vaikutus (kuvio 2C oikea alapaneeli ja kuvio 2D). Seuraavaksi me määrällisesti solujen kasvua käyttäen XTT menetelmää ja vahvistaneet morfologisia analyysi (kuvio 2D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin LAPC4-soluja (kuvio S2).

LNCaP-solut infektoitiin lentivirusvektori, joissa indusoituvan doksisykliini riippuvainen β-TrCP shRNA. A. Soluja käsiteltiin 72 tunnin ajan 1 ug /ml doksisykliiniä ja RNA-tasot ja β-TrCP1 ja β-TrCP2 mitattiin käyttämällä qRT-PCR. B. Western blot-analyysi uutteissa käsiteltyjen solujen TNF, doksisykliini tai MG-132 immunoblotattiin joko IKB tai tubuliinia. C. edustaja mikrovalokuva solujen käsiteltävä ilmoitetulla ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. D. XTT-määritys, jota käytetään määrittämään solun kasvun eri ajankohtina. DOX, doksisykliini; NT, ei hoitoa; FCS, väliaine, joka sisälsi vasikan sikiön seerumia; CSS, väliaine, joka sisältää androgeenireseptorin köyhdytettyä seerumia (puuhiilellä puhdistettua seerumi). Virhepalkkien, SD. * Merkittävästi erilainen kuin käsitellyistä soluista ja toisistaan, p-arvo 0,01, t-testi.

poissulkemiseksi shRNA armottoman vaikutuksia, käytimme aiemmin kuvattua β-TrCP hallitseva negatiivinen konstruktio josta puuttuu F-box domain [33]. Tämä vaihtoehto vakauttaa β-TrCP alustoille, koska se sitoo fosforyloidun tavoitteet, mutta ei rekrytoida ylimääräisiä komponentteja SCF monimutkaisia, jotka ovat kriittisiä E3 ligaasin katalyyttinen aktiivisuus. Β-TrCP eston vaikutuksia käyttäen hallitseva negatiivinen muoto, olivat olennaisesti samanlaisia ​​kuin shRNA tuloksia (kuvio S3A ja B).

β-TrCP esto toimii yhteistyössä androgeeniablaatio

In vivo

analysoimiseksi edelleen vaikutuksen β-TrCP inhibition ihmisen eturauhassyövän kasvaimen kasvua, käytimme ksenograftimallissa. Me pistetään LNCaP kuljettavat indusoituvaa β-TrCP shRNA rakentaa osaksi ihonalaiskerroksessa 39 immunosuppressoitunut

Balb /c Rag1

– /- uroshiirillä. 25 hiirtä (64%) kehittyi havaittavissa ja mitattavissa kasvaimet jälkeen 30 vuorokautta injektion. Koska alkuperäisen kasvaimen kehitys oli hieman heterogeeninen koon ja kinetiikka, me satunnaisesti jakautuneet nämä 25 hiiret neljään hoitoryhmään: 1. Ehjä käsittelemätön hiiriä (NT, n = 4; kasvaimen keskimääräisen tilavuuden 123,1 ± 70,7); 2. Hiiret annetaan tetrasykliiniä juomaveteen johtaen β-TrCP esto (Tet, n = 5; kasvaimen keskimääräisen tilavuuden 80,3 ± 98,2); 3. kuohitut hiiret johtaen androgeeniablaatio (Cast, n = 7; kasvaimen keskimääräisen tilavuuden 121,6 ± 95,0); 4. Kastrointi plus tetrasykliiniä (Cast + Tet, n = 8; kasvaimen keskimääräisen tilavuuden 180,3 ± 143,9). Ei ollut merkitsevää eroa kasvaimen keskikoon hoitoa aloitettaessa neljän ryhmän. Monitoroimme kasvaimen kasvua kerran viikossa, ja uhrasi hiiret 30 päivää lähettää hoidon aloittamisesta. RNA: ta kasvaimia Tet käsitellyistä hiiristä osoittivat β-TrCP kaataa vaihtelee 50%: sta 80% (kuvio 3A). Samanlainen kuin meidän

in vitro

havaintojen estämällä β-TrCP vähensi kasvainten kasvua tai ilman androgeeniablaatio (kuvio 3B). Analyysi kasvaimen leviämisen käyttämällä BrdU immunovärjäystä paljasti, että hiirissä, joita käsiteltiin sekä androgeeniablaatio ja β-TrCP inhibitio osoitti alimman leviämisen hinnat (kuvio 3C ja kuvio S4). Kasvaimen kasvun hidastuminen ei voitu selittää apoptoosin kautta, koska anti lohkaista kaspaasi-3 immunovärjäys ei havaittu eroja hoitoryhmien (kuvio 3D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin AT2.1 rotan eturauhassyövän pysyvästi transfektoitujen solujen indusoituvan dominantti negatiivinen β-TrCP siirtogeenin (kuvio S2B). Lopuksi tuloksemme osoittavat, että β-TrCP esto estää eturauhassyövän kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

ja näyttää lisäävä vaikutus Androgeeniablaatio-.

LNCaP laakeri tetrasykliiniä aiheuttama β-TrCP shRNA konstruktio injektoitiin ihon alle immunosuppressoitunut

Rag1

– /- hiirissä. Hiiret (n≥4 kussakin ryhmässä) olivat joko käsittelemättömiä (NT), käsiteltiin tetrasykliiniä niiden juomavedessä (Tet), fyysisesti kastroitu (Cast) tai molempia (Cast + Tet) 30 päivän ajan. Tuumoritilavuudet mitattiin viikoittain. (A). qRT PCR sekä β-TrCP isoformeja suoritettiin RNA uutetaan kasvaimet kerättiin päivänä 30 (B) Kasvaimen kasvu kinetiikka. Kudosleikkeet värjättiin BrdU (C) tai aktivoitu kaspaasi 3 (D) ja lisääntymistä ja apoptoosia tulokset vastaavasti määritelty jokaiselle kasvain. Näkyy ovat keskiarvo ± keskihajonta (A) tai ± S.E.M. (B, C ja D). * P-arvo 0,05, ** p-arvo = 0,0002, t-testi; p-arvo C viittaa t-testiä.

aryylihiilivetyreseptori (AhR) ylössäädellään upon β-TrCP esto ja androgeeniablaatio

Valaistaan ​​molekyyli polkuja, jotka ovat vastuussa kasvua inhiboivan vaikutuksen β-TrCP ehtyminen yhdessä androgeeniablaatio teimme monenlaisia ​​mikrosiruanalyysillä. LAPC4 infektoidut solut shβ-TrCP lentivirusvektori, jätettiin joko hoitamatta tai käsitelty 72 tuntia doksisykliini, puuhiilellä puhdistettua seerumin tai molempia. cDNA näytteet altistettiin microarray-analyysillä käyttämällä U133 Affimetrix chips hyvää ~30,000 koetinsarjojen. Sitten pyrittiin määrittämään geenejä, jotka ovat yhteistoiminnassa vaikuttavat sekä androgeeniablaatio ja β-TrCP esto. Niistä ilmen- tymisen lisääntymisen geenit olivat mahdollisia tulehduslääkkeet geenit (esim ANXA1) ja joukossa näkyvästi vaimentua olivat eturauhasen geenit (esim KLK2). Kuitenkin kaikkein dramaattinen kasvu oli ilmaus aryylihiilivety (dioksiini) reseptori (AhR). Tämä geeni on säädelty, kun joko androgeeniablaatio tai β-TrCP inhibition ja on kaikkein eniten geenimuutoksen, koska yhdistelmähoito (kuvio 4). Voisimme ominaisuus AhR tason säätelyä ß-TrCP ehtyminen, sillä doksisykliini yksin ei muuttanut reseptorin mRNA (kuva S5).

. LAPC4 infektoiduissa soluissa indusoituvan β-TrCP shRNA käsiteltiin 72 tuntia osoitetun hoidon, suoritettiin RNA: n uutto ja cDNA-microarray-analyysi (Affymetrix). Kun tietoja normalisointi, geeniekspressioprofiilien vertailtiin hoitoa ja käsittelemätön kontrolli näytteitä. A. Heat kartta dendrogrammissa osoittaa kymmenen pisimmälle ylös (punainen) ja alas (vihreä) geenien vuoksi kombinaatio. Kertainen muutos viittaa yhdistettyyn hoitoon antureista arvot suhteessa kontrolliin. Expression of β-TrCP isoformien on esitetty alla. B. LAPC4 soluja esiintyy samaa lentivirusvektori ja käsiteltävä ilmoitetulla joutuivat RNA ja qRT PCR-analyysillä kanssa lueteltuja alukkeita. CSS, puuhiilellä puhdistettua seerumi; DOX, doksisykliini; Virhepalkkien, SD.

Ahr on ligandi aktivoida transkriptiotekijä mukana organogeneesin, vieroitus endo- ja vierasperäiset aineet ja välittämisessä monipuolinen elinspesifiseen myrkyllisiä vasteita dioksiinien. Tämä reseptori kuuluu perus helix- silmukka-helix (bHLH) /PAS (Period -aryyli hiilivety reseptori ydin- translocator-Yhden ajattelevien) perheen heterodimeerinen transkription sääntelyviranomaisten. bHLH /PAS proteiinit ovat osallisena valvontaan erilaisiin fysiologisiin prosesseihin, kuten vuorokausirytmiä, urut kehittäminen, neurogenesis, aineenvaihduntaa ja stressi vastaus hypoksia [38] – [40]. Viimeaikaiset tutkimukset paljastivat yhteyden AhR ja eturauhassyöpää sekä

in vitro

ja

in vivo

, joka osoittaa, että AhR vuorovaikutuksessa ja estää AR. Lisäksi AhR toimii E3 ligaasilla AR [41] ja AhR

null

TRAMP hiiret osoittavat lisääntynyt eturauhasen kasvaimien syntyyn [42]. Käytimme qRT PCR vahvistaa cDNA erilaisia ​​analyysi. Olemme havainneet, että vaikka kukin hoito yksinään lisäsi AhR RNA-tasot yli 2 taittuu, yhdistetty hoito johti yli 4-kertaisesti säätelyyn ylöspäin sekä LAPC4 (kuvio 4B) ja LNCaP-soluja (kuvio S6). Voit testata toiminnallinen aktiivisuus AhR mittasimme mRNA-tasoja sen kanoninen tavoite P450 1A1 (CYP1A1). Meidän analyysit osoittavat, että CYP1A1 kohoamiseen korrelaatio AhR tasot 4 hoitoryhmissä (kuva 4B). On huomattava, että tämä säätelyä tapahtui lisäämättä eksogeenistä AhR ligandia. Lisäksi on voimakas AhR ligandin TCDD lisättiin vielä CYP1A1 säätelyä (kuvio 5C ja tietoja ei näytetty).

LNCaP-soluja infektoitiin indusoitavissa lentivirusvektori varten Shahr yksinään (A) tai yhdessä shβ-TrCP (B) oli käsiteltiin 72 tuntia asianomaiset hoidot ja solujen kasvu mitattiin XTT-määrityksellä. C. qRT PCR vahvisti β-TrCP ja AhR tehokas kaataa. D. Western blotit osoittavat β-kateniinin stabilointi jälkeen β-TrCP esto ja vahvistaa AhR proteiinin tason nousua tai kaataa vuoksi asiaa shRNAs. DOX, doksisykliini; FCS, vasikkasikiön seerumi; CSS, puuhiilellä puhdistettua seerumia. Virhepalkkien, SD.

Kasvu Suppression vaikutus β-TrCP estäminen välittyy kautta ylössäätely aryylihiilivetyreseptori

tutkimiseksi merkitys AhR aktivointia seuraavaa β- TrCP ehtyminen, ensin tartunnan LNCaP-solujen indusoituvan AhR shRNA. Vaikka doksisykliinikäsittely vähensivät AhR mRNA-tasojen emme voineet havaita mitään vaikutusta solujen kasvuun (kuvio 5A). Seuraavaksi -infektio LNCaP joissa indusoituvan β-TrCP shRNA kanssa indusoituva AhR shRNA vektori. Lisäksi doksisykliiniä keskipitkän kaksinkertaisen Knockdown solujen vähensivät β-TrCP mRNA-tasoja, samanlainen yhden knockdown solut; mutta kuten odotettua, nämä solut AhR tasot laskivat sen sijaan kasvoi sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 5C, D). Siten kaksinkertainen knockdown solujen avulla voimme testata, onko kasvua estävää vaikutusta β-TrCP modulaatio välittyy kautta AhR säätelyä. Itse asiassa kaksinkertainen knockdown LNCaP, β-TrCP ehtyminen ole vähentänyt solujen kasvua tai ilman androgeeniablaatio (kuvio 5B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin eri shRNA suunnattu vastaan ​​AhR (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, lisäys voimakas eksogeenisen ligandin TCDD ei vähentänyt solujen kasvua yksin; eikä sillä myöskään ollut vaikutusta minkään eri hoitoja (Kuva S7). Tämä viittaa siihen, että tämä AhR vaikutus on ligandi riippumaton. Western blot analyysi vahvisti β-kateniinin stabilointi ja AhR mRNA ylösajon yhteydessä β-TrCP eston (kuvio 5C). Näin ollen kaksinkertainen pudotus tulokset osoittavat, että suurin osa vaikutuksesta β-TrCP pudotus välittyy ylössäätely AhR.

AhR Expression eturauhassyöpäpotilailla

huomioiminen AhR säätelyä, kun β-TrCP inhibitio eturauhassyöpäsoluissa sai meidät tarkastaa AhR tilan eri vaiheissa eturauhasen syöpä. Käsitellä tätä tavoitetta, keräsimme 39 yksilöitä ensisijainen eturauhassyövän kasvaimia päässä Hadassah Medical Center. Tästä kohortin, 17 potilasta kärsi tauti uusiutuu. Suoritimme immunohitochemical anti AhR värjäystä ja seurataan sytoplasmaattinen ja ydinvoiman AhR ilme. Ensin havaittiin korkea AhR tyvisoluissa sijaitsee hyvänlaatuinen rauhanen kehä (kuvio 6A). Mielenkiintoista, proliferatiiviset tulehduksellinen surkastuminen (PIA), pidetään esiasteleesio eturauhassyöpää osoitti erittäin vahva sytoplasmista ja tumavärjäystä (kuvio 6B). Käytimme subjektiivinen pisteet 0-3 kvantitoimiseksi värjäytymisen intensiteettiä normaaleissa ja pahanlaatuiset epiteelisolut kussakin näytteessä. Analyysimme osoittaa säätelyä AhR sekä sytoplasman ja ydinvoiman paikoista pahanlaatuinen epiteelin (kuvio 6C, D, p 0,001, Mann-Whitneyn testi). Emme kuitenkaan ole havaita korrelaatio AhR ilmentymistä tuumorisoluissa ja taudin uusiutumisen (tuloksia ei ole esitetty).

Prostate leikkeet immunovärjättiin AhR vasta-aineella. Valomikroskooppikuvat voimakkaat AhR ilmentymistä tyvisoluissa (nuolet A) ja proliferatiiviset tulehduksellinen surkastuminen (B). C. Korkeampi AhR ilmentymistä, havaitaan pahanlaatuiset rauhaset (T) verrattuna normaaliin rauhaset (N). D. Normaali ja pahanlaatuiset rauhaset pisteytettiin käyttäen 0-3 mittakaavassa. Keskiarvoja ± SEM. näytetään (p-arvo 0,001, Mann-Whitneyn testi).

Keskustelu

Eturauhassyöpä on heterogeeninen sairaus, joka käsittää monia geneettisiä ja fenotyyppisiä ominaisuuksia. Yksi tärkeä tunnusmerkki eturauhasen syöpä on etenemistä androgen riippumaton vaihe (AI) jälkeen hormonihoito. Syitä tähän siirtymistä ei täysin tunneta ja adjuvantti hoitoja vahvistaen hormonaalista manipulointia tarvitaan. Yksi tekijä, joka on usein osallisena syövän etenemisen monenlaisia ​​syöpä on NF-KB. Täällä vahvistaa, että NF-KB on usein aktivoidaan edennyt eturauhassyöpä potilailla (kuvio 1). Lisäksi NF-KB: n aktivaatio korreloi eturauhassyövän uusiutumisen (kuvio 1C). Yksi suurimmista sääntelyviranomaisten NF-KB on E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla SCF

β-TrCP, joka kohdistuu IKB sekä monia muita substraatteja ubikitinaation ja hajoaminen, [27]. p-TrCP ajatellaan pelata pro-tuumorigeenisiä rooli tietyntyyppisten syöpien [43]. Perustuen havaittuun ylössäätely NF-KB: n, oli tärkeää seurata toinen yhteinen pro-onkogeenisen β-TrCP substraatti, β-kateniinin, joka on myös osallisena eturauhassyövän [28], [29], [44]. Emme kuitenkaan voi havaita korrelaatiota β-kateniinin aktivointi ja eturauhassyövän uusiutumisen (kuva S1), mikä viittaa siihen, että vain jotkut β-TrCP tavoitteet ovat merkityksellisiä taudin etenemistä. Arvioimaan koko laajuudessaan β-TrCP vaikutuksia, ryhdyimme estää β-TrCP eturauhasen syöpäsolujen ja seurata sen vaikutuksia eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Meidän

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset osoittivat, että kun β-TrCP esto eturauhasen syöpäsolujen kasvua vähenee. Olemme voisi myös havaita additiivinen vaikutus, kun yhdistetään β-TrCP inhibition Androgeeniablaatio- (kuvio 2 ja 3). Valaista mekanismeja kasvun tukahduttaminen β-TrCP inhibition, teimme cDNA erilaisia ​​analyysi ja havaittiin lisäaineen ylössäätely AhR (kuvio 4). AhR on aiemmin osoitettu toimimaan E3 ligaasilla AR [41], antaa meille mahdollista yhteyttä AR signalointia. Lisäksi olemme huomanneet, että AhR ilme on korkeampana yhdistyvät androgeeniablaatio ja β-TrCP esto. Siksi arveltu, että säätely on AhR voitaisiin välittäjänä kasvua estävää vaikutusta β-TrCP pudotus eturauhassyöpäsoluissa. Tätä käsitystä tukivat aikaisempien raporttien osoittavat estävää roolia AhR eturauhassyöpää. Morrow

et al

osoitti AhR ligandia riippuvaisen kasvun estämistä LNCaP-soluissa. Samoin muut tutkimukset ovat myös sekaantuneet androgeenireseptorin vuonna AhR kasvun estäminen [45], [46]. Tutkimuksessamme lakkauttamalla AhR

sinänsä

LNCaP-soluissa ei muuttanut eturauhasen syöpäsolujen kasvua (kuvio 5A), mikä viittaa siihen, että pohjapinta tasot AhR eivät aiheuta estävää vaikutusta, ellei kannustanut ligandin. Toisaalta lisäämällä AhR ilmentymisen kautta β-TrCP ehtyminen liittyi huomattava ligandista riippumattoman kasvun hidastuminen. AhR ehtyminen kääntänyt kasvua vaimentava vaikutus β-TrCP knockdovvn, jopa androgeeniablaatio, jotka osoittavat, että AhR säätelyä, jota myös todettu muiden stressitekijöiden (esim surkastuminen, tulehdus ja androgeeniablaatio) selittää β-TrCP estävä vaikutus (kuvio 5). Mielenkiintoista, ligandi käyttö ei vaikuttanut solujen kasvuun, vaikka se ei ylössäätävät ilmaus Classic AhR tavoite CYP1A1. Nämä tulokset ligandin ja CYP1A1 itsenäinen AhR eturauhassyövän soluissa.

Chesire

et al

tunnistanut AhR otaksutuksi β-kateniinin tavoite LNCaP [47]. Kuten me osoittavat, että β-TrCP ehtyminen stabiloi β-kateniinin yhdessä säätelyä AhR (kuvio 5D), on mahdollista, että syy AhR korkeus seuraavat β-TrCP ehtyminen on β-kateniinin stabilointi.

tutkimukset osoittavat uusi ligandi riippumaton strategia vauhdittaa AhR ilmaisun keinona tukahduttaa eturauhassyövän kasvua. Tämä strategia voidaan myös kaikui luonnonhistorian eturauhassyövän. Huomasimme, että AhR normaalisti ilmaistu pienillä tasoilla eturauhasen epiteelin tyvi- soluja (sytoplasmista ja tumavärjäystä, kuvio 6A) ja on olennaisesti upregulated alueilla proliferatiivisten tulehduksellisten surkastuminen (PIA), pidetään esiasteleesio syöpään (kuvio 6B). AhR aktivaatio tyvi- ja atrofisen soluja voidaan siksi pitää syöpävastaisena mekanismi. On mahdollista, että microenvironmental tulehduksellinen signaalit ovat vastuussa tällaisista stressiä signalointia. Mutaatio yhden alleelin β-TrCP1 tunnistettiin yhdessä ihmisen eturauhassyövän järjestelmällisesti näytön Wnt-reitin mutaatioiden [48]. Kuitenkin tämä mutaatio on todennäköisesti ole vaikutusta NF-KB-reitin kuin muut alleeli ja mahdollisesti molemmat β-TrCP2 alleelit olivat villityypin. Samoin tietojemme mukaan aktivoivat mutaatiot NF-KB-reitin ollut toistaiseksi ole raportoitu ihmisen eturauhasen kasvaimia. Kuitenkin, NF-KB tiedetään välittävän pahanlaatuisiksi konstitutiivisesti yliaktiivista tässä kasvaintyyppi kautta useita mekanismeja. Olemme päätellä, että eri stressi signaaleja, kuten tulehdus, surkastuminen ja androgeeniablaatio ylössäätää AhR ilmentymistä sekä normaaleissa ja pahanlaatuisten eturauhasen solujen ja harjoittaa suojamekanismi. Inhiboiva β-TrCP at edenneen taudin vaiheissa voi olla merkitystä strategioiden kehittämisessä tehostaa tuotteiden eturauhassyöpälääkkeille.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kokeet ihmisen kudoksissa hyväksynyt Institutional Review Board, Hadassah-Hebrew University Medical Center. Johtuen taannehtivuus Tutkimuksen ja ilmoituksen mukaan Helsingin, osallistujien ei saatu jatkuvasti ajan tasalla. Lisäksi meidän IRB luopua tarvetta kirjallinen suostumus. Kaikki hiiret kokeet hyväksynyt IACUC.

Dominant Negative β-TrCP (WD) B

vallitsevat negatiiviset β-TrCP (WD) B kloonattiin käyttäen E3RS ulkopuolelle pCDNA3 -EE-hE3RS plasmidit alukkeilla 5′-3 ’eteenpäin: GCGGCCGCTATGGACCC-GGCCGAG (jossa

Notl

päällä sen 5′); käänteinen: TTATCTGGAGATGTAGGTGT; tuote kloonattiin TA-vektoriin (Invitrogen). Viimeinen vektori leikattiin

AvrII /Asp718

, täytetään ja tylppä ligoitiin. Asiaa fragmentti leikattiin ja liitettiin pFLAG-CMV ™ -2 ekspressiovektoriin (Sigma-Aldrich), jossa

Notl /BamHI

. Tämä menettely tuotti WD konstruktio puuttuu osa F-box ja konjugoitu FLAG. WD-FLAG lisättiin alle kaksisuuntainen teracycline promoottori ilmentävät GFP. Saatu plasmidi transfektoitiin AT2.1 Rat eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät tetrasykliini trans-aktivaattori, käyttäen Fugene-reagenssia (Roche Applied Science). Transfektoidut solut valittiin käyttämällä hygromysiiniä ja neomysiinille (Sigma-Aldrich), joka sisältää median stabiilin klooni, joka ilmentää vallitsevaa negatiivista β-TrCP lisättäessä tetrasykliini tai sen johdannaista doksisykliini.

Inducible β-TrCP ja AhR shRNA

ihmisen shRNA 5’GUGGAAUUUGUGGAACAUC 3 ’kohdistettu β-TrCP1 ja β-TrCP2 rakennettiin osaksi Pter plasmidiin ja insertoidaan modifioitu pRRL.sin.PPT.tetO7.MCS.PRE lentivirusvekto-. Vektori koostuu HI-promoottori, tet-operaattorin shRNA koodaussekvenssin ja eF1α ohjaavan promoottorin tet-repressori on fuusioitunut eGFP. Virus tuotanto ja infektio toteutettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [49]. Kohdistaa AhR käytimme seuraavia shRNA sekvenssit: 1. 5 ’CAGCUGAAUUAAAUAACAU 3’; 2. 5 ’CAGACAGUAGUCUGUUAUA 3’. Jotka molemmat osoittautuivat tehokkaiksi kaatamalla reseptorin (esitetyt tiedot vastaavat niitä saada jälkimmäisen sekvenssin). shRNA ilmentyminen indusoituu vasta Tetrasykliini tai doksisykliini (Sigma-Aldrich) anto. Vektori yksin käytettiin kontrollina. Double pudotti LNCaP-solut suunnitellut koinfektoida shβ-TrCP solujen lentivirusvektoreita kuljettavat joko edellä kuvatun sekvenssin.

Cell Culture

DMEM, RPMI 1640, trypsiini EDTA, penisilliini streptomysiiniliuos, L-glutamiinia, vasikan sikiön seerumia (FCS), puuhiilellä puhdistettua seerumi (CSS) ostettiin Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel.