Krooninen sairaus

tiivistelmä

FoxO proteiinit ovat tärkeitä sääntelyviranomaisten solujen aineenvaihduntaan ja tunnustetaan olevan solmuja useita signalointireiteissä, etenkin ne, joihin liittyy PI3K /AKT ja mTOR. FoxO proteiineja lähinnä toimivat transkriptiotekijät, mutta tuore tutkimus osoittaa, että sytosolin FoxO1 osallistuu säätelyssä autophagy. Esillä olevassa tutkimuksessa, huomaamme, että sytosolin FoxO1 todellakin stimuloi solujen autophagy useita syöpäsolulinjoissa, ja että se säätelee ei vain pohjapinta autophagy vaan myös indusoi rapamysiinillä, ja että vasteena ravinteiden puutetta. Nämä havainnot osoittavat, miten tärkeää on FoxO1 solujen aineenvaihdunnassa sääntelyn riippumaton sen transkriptiotekijän toiminto. Toisin kuin FoxO1, löydämme läheistä sukua FoxO3a on negatiivinen säätelijä autophagy useita syöpäsolulinjoissa, aikaisemmin tuntematon funktio tämän proteiinin, eroaa sen tehtävä hyvänlaatuinen fibroblasti ja lihassoluissa. Induktion autophagy jonka knockdovvn FoxO3a ei todettu välittyvän kautta tukahduttaminen mTORC1 signaloinnin; pikemminkin, sääntelyn rooli FoxO3a on autophagy määritettiin kyvyllään kopiointia tukahduttaa FoxO1. Tämä monimutkainen vuorovaikutus FoxO1 ja FoxO3a ehdottaa monimutkainen checks- ja saldot-suhde FoxO3a ja FoxO1 säätelyssä autophagy ja solujen aineenvaihduntaa.

Citation: Zhu WL, Tong H, Teh JT, Wang M (2014) Forkhead laatikko proteiini O3 transkriptiotekijä säätelee negatiivisesti Autophagy sisään ihmisen syöpäsoluja estämällä Forkhead Box Protein O1 Expression ja Sytosoliset arvosanojen. PLoS ONE 9 (12): e115087. doi: 10,1371 /journal.pone.0115087

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 18 marraskuu 2014; Julkaistu: 29 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Agency for Science, Technology and Research (A * STAR) ja National Medical Research Council of Singapore. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Autophagy on erittäin konservoitunut soluprosessin, keskeinen vaste solun ravinto /energia sekä kasvutekijä tila [1], [2]. Oikein, yksi tärkeimmistä ylävirtaan säätelijöitä autophagy on PI3K-AKT-mTOR signalointi, anturit kasvutekijän stimulointi, aminohappojen ja solujen energiatasot, jotka ovat keskeisiä solujen kasvua ja lisääntymistä [3] – [5]. Todellakin, autophagy säädellään rinnan solujen aineenvaihduntaan ja lisääntymistä, jotka muodostavat integroidun vastaus ulkoisiin ja sisäisiin ympäristöissä. Esimerkiksi kun ravinteiden ja energian taso nähdään alhainen, solujen lisääntymistä ja anabolista vaikutusta lasku taas autophagy nousee antaa energiaa ja makromolekyylien keskeisiin solutoiminnoille [6]. Vaikka esto autophagy voi johtaa solukuolemaan, pidentyneen induktion liiallisen catabolic toimintaa, kuten autophagy, voi myös johtaa solun kuoleman; molemmat näistä prosesseista voidaan hyödyntää uusia lähestymistapoja syövän hoitoon [7] – [10]. Siksi perusteellinen ymmärtäminen autophagy sääntelyn eri solussa yhteyksissä on tärkeää luoda mahdollisuuksia terapeuttiseen manipulointi tätä prosessia.

Forkhead laatikko proteiinin O transkriptiotekijöitä (FoxOs) ovat evoluutiossa konservoituneita proteiineja, jotka vievät sääntelyn solmut useita signalointipolkujen tärkeää soluvasteen ulkoiseen energia, ravitsemus, ja kasvutekijä ärsykkeet. Sellaisenaan ne ovat mukana säännellä anabolisia ja kataboliset tilat solujen ja kasvun, proliferaation ja solukuoleman päätöksiä [11] – [17]. Se ei ole yllättävää, että toimintahäiriö näiden proteiinien vaikutuksia patologisten prosessien, kuten diabetes, ikääntyminen ja syöpä [12], [16] – [19].

FoxO proteiinien on raportoitu olevan säätävät solun autophagy, prosessi, joka on läheisesti sidottu anabolisten /katabolisessa tilan solun. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että FoxO3a erityisesti edistää ilmentymistä autophagy geenien, mikä lisää autophagy [20] – [22]. Nämä ja muut havainnot ovat johtaneet ajatukseen, että FoxO proteiinit ovat yleensä aktivaattoreita autophagy kautta toimivat transkriptiotekijät [23], [24]. Tässä näkymässä, toimintoja eri FoxO proteiineja ovat samankaltaisia, sekä päällekkäisiä suhteen edistämiseen autophagy, jossa jakautumista kudoksiin osuus niiden erilaiset vaikutukset spesifisissä solu- yhteyksissä. Yksi tärkeä painopiste sääntelyn FoxO proteiinien on ollut heidän solusijaintipaikan, joka on reversiibelisti säätelee niiden translaation jälkeiset modifikaatiot, ensisijaisesti, että fosforylaation [25] – [28], ja asetylointi [29], [30] vastauksena ympäristön ärsykkeisiin. Nämä translaation jälkeiset modifikaatiot ovat läheisesti yhdistetty solun lokalisointi FoxO proteiinien ja niiden vuorovaikutus -efektiboksejamme ja siksi pidetään tärkeänä säätelyssä tason toimintaa näiden proteiinien [31], [32]. Itse asiassa viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että sytosolin FoxO1 voi edistää autophagy, vastauksena ravitsemukselliset stressi, jonka suora vuorovaikutus Atg7, osoittaa monimutkaisia ​​tehtäviä tämän ryhmän proteiinien säätelyssä autophagy [33].

Se oli äskettäin raportoi, että FoxO3a voi edistää FoxO1 riippuvainen autophagy ihmisen sikiön munuaisen ja hiiren alkion fibroblasti-solut, jotka välittävät FoxO3a up-regulation of PI3K katalyyttisen alayksikön, myöhemmin AKT aktivointi ja lisääntynyt sytosolin jakelu FoxO1 [34]. Sen sijaan havaitsimme, että FoxO3a inhiboi sijaan parantaa niitä autophagy useita syöpäsolulinjoissa. Edelleen, FoxO3a tukahduttaminen autophagy näyttää välittyvän alas säätelystä transkriptiota FoxO1 tarjoaa uutta tietoa, miten FoxO3a ja FoxO1 voivat olla vuorovaikutuksessa ja aiheuttavat vastakkaisia ​​vaikutuksia solun autophagy. Nämä havainnot ovat paljastaneet odottamattoman roolia FoxO3a vuonna autophagy, ja korosta monimutkaisuus FoxO signalointi ja sen biologisia vaikutuksia eri solu- yhteyksissä.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

vasta-aineet tunnistamaan ihmisen GAPDH, FoxO1 (C29H4), FoxO3a (75D8), p-4EBP1 (T37 /46), p-S6 (S240 /244), Atg5, lippu, ja histoni H3 olivat Cell Signaling Technology (Danvers, MA); Vasta-aineet LC3 (APG8A) oli peräisin Abgent (San Diego, CA). Proteaasinestäjä cocktail oli Roche (Basel, Sveitsi). Kaikkia solulinjoja käytettiin tutkimuksessa saatiin perin American Type Culture Collection.

Soluviljely ja lääkehoito

Soluja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 DMEM (Invitrogen, North Andover, MA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Hyclone, Novato, CA), 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen). Lisähoitoa eri estäjien, kuten rapamysiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), sykloheksimidiä (Sigma-Aldrich), ja klorokiinin (Sigma-Aldrich) suoritettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää; jokaisesta hoidon edellytys on merkitty vastaava luku legenda. Erilaisiin nälkään hoitoon, solut olivat kulttuuri seerumia, tai D-glukoosia väliaineessa, vastaavasti.

siRNA: t, pohja- ja plasmidit

siRNA-1 FoxO1 (5′- UUG UAC AGG UGU CUU CAC UUG GGU C-3 ’), siRNA-1 FoxO3a (5′-AUU GAC CAA ACU UCC CUG GUU AGG C-3′) ja siRNA of Atg5 (5’-AUU CCA UGA GUU UCC GAU UGA UGG C -3 ’) ostettiin Invitrogen; siRNA-2 FoxO1 (5’-ACA UGC UCA GCA GAC AUC UGC AGU U-3 ’) [35] ja FoxO3a (5′-GAG CUC UUG GUG GAU CAU C-3′) [36], syntetisoitiin Sigma- Aldrich. Forward- ja reverse-alukkeita Real-time PCR olivat: FoxO1, 5’-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3 ’ja 5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′; FoxO3a, 5’-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3 ’ja 5′-TCGTCCTGGACTTCATCCA AC-3′; Atg4c, 5’-GCAGGAGATTGGTATGGACCAGCT-3 ’ja 5′-GGATGCCTT GCTTCTTCAACTGCT-3′; LC3, 5’-AGACCTTCAAGCAGCGCCG-3 ’ja 5′-ACACTGACAATTTCATCCCG-3′; Atg7, 5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3 ’ja 5′-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3′; Atg12, 5’-TCTATGAGTGTTTTGGCAGTG-3 ’ja 5′-ATCACATCTGTTAAGTCTCTTGC-3′; Bnip3, 5’-GCCCGGGATGCAGGAGGAGA-3 ’ja 5′-GAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′; 18S, 5’-AAGTTCGACCGTCTTC TCAGC-3 ’ja 5′-GTTGATTAAGTCCCTGCCCTTTG-3’. Flag-FoxO1 [37] ja Flag-FoxO3a [38] ekspressioplasmidit hankittiin Addgene (Cambridge, MA). Flag-FoxO1-ADb (deleetio tähteiden 208-220 ja FoxO1) ja lippu-FoxO3a-3A (alaniinisubstituutiolla Thr 32, Ser 253 ja Ser 315 FoxO3a) ekspressioplasmidit käyttäen QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene , Santa Clara, CA). Flag-FoxO3a (r), joka on leveä tyyppi FoxO3a koodaama proteiini cDNA resistenttejä siFoxO3a käytimme tutkimuksessa, muodostettiin mutatoimalla kahdeksan siRNA-1 FoxO3a kohdistaminen emäsparin villin tyypin Flag-FoxO3a plasmidi käyttäen QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Kaikki plasmidit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Tandem fluoresoiva mRFPGFP-LC3 plasmidi oli lahja Dr. Tamotsu Yoshimori [39].

Transfektio siRNA tai ekspressiovektoreilla

Transfektiot tehtiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), joka perustuu valmistajan protokollan ; transfektoidut solut altistettiin haluttuun hoitoja 24-48 tuntia transfektion jälkeen, kuten on kuvattu vastaava luku legendoja.

sytosoliin-tuma fraktiointi

Kerätyt solut suspendoitiin kylmään puskuriin (100 mM Tris HCl pH 7,6, 15 mM Mg (OAc)

2, 10 mM KOAc, 10 mM PMSF: ää, 0,5% NP40, 1% proteaasiestäjäseostabletit) ja jätettiin jäille 20 minuutin ajan, ennen kuin sentrifugoimalla 2500

g

5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatanttifraktio kerättiin sytoplasminen uute. Pelletti pestiin kerran samalla puskurilla ennen kuin se suspendoidaan 4 ° C: ssa tumien liuottava puskuri (100 mM Tris-HCI, pH 7,6, 42 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM PMSF, 2% SDS, 1% proteaasiestäjäseostabletit ). Seuraavat 10 min jäissä inkuboinnin, suspensiota sonikoitiin 3 minuuttia jäillä ennen sentrifugointia 12000

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti jae otettiin talteen tumauutteen.

Immunoblottausmääritys ja analyysi

Solut altistettiin hoidon ilmoitettu asianmukaisella kuvioselityksessä otettiin talteen, hajotettiin, ja proteiinipitoisuus määritetään standardin protokollan. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus-analyysi suoritettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia menettelyä (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

konfokaali kuvantaminen ja analyysi

Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä , jonka jälkeen läpäiseväksi kylmällä metanolilla. Solujen meni läpi immuunifluoresenssivasta merkintöjä, kiinteä, läpäiseviksi soluja inkuboitiin estopuskurilla (5% normaalia vuohen seerumia, 0,3% Triton X-100 PBS: ssa) 1 h huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen inkubaatio sopivasti laimennettua vasta-ainetta vasta-aineen laimennus puskurilla (1% BSA, 0,3% Triton X-100 PBS: ssä) yli yön 4 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sen jälkeen inkuboitiin joko FITC-vuohen anti-kani (1:1000) tai Rhodamine-vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineita (1:1000), tarvittaessa, vasta-laimennuspuskuriin 1 h huoneenlämmössä. Kaikki konfokaali kuvat otettiin Carl Zeiss LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla (Oberkochen, Saksa). Imaging tulokset analysoitiin Metamorph Analysis Software (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). Rinnakkaispaikantumisen tehokkuutta MRFP kuin GFP fluoresoivien signaalien mitattiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Kvantitatiivinen PCR

Solut altistettiin siRNA pudotus tai geenin yli-ilmentyminen protokollia kerättiin standardin protokollan. Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämän jälkeen, ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin vakio-olosuhteissa, joissa Superscript Ensimmäisen juosteen synteesi System (Invitrogen). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA). Määrä transkriptin normalisoitiin tasolle ribosomien proteiinien 18S.

Tietojen analysointi

Tilastoeroja arvioitiin Studentin

t

testiä. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä p 0,05 (*) ja

p

0,01 (**).

Tulokset

FoxO3a säätelee negatiivisesti autophagy, toisin kuin FoxO1 joka edistää autophagy

Useat raportit ovat osoittaneet osallistumista FoxO proteiinien säätelyssä autophagy, mutta täsmällisesti tämän asetuksen ja roolit eri FoxO proteiinit voivat olla tässä prosessissa, erityisesti roolit eri FoxO proteiinien eri solun yhteydessä, vaatii lisäselvityksiä. Tukahduttaminen FoxO1 tasojen eturauhassyövän PC3-soluissa siRNA Knockdown estyy solujen autophagy, molemmat perusolosuhteissa ja indusoi rapamysiini (Fig. 1A) tai seerumin ja glukoosin poisto (Fig. 1 B). Kaksi siRNA kohdistaminen FoxO1 tukahdutettiin autophagy PC3-soluissa, arvioituna LC3-II tasolle, mikä viittaa tavoite erityinen vaikutus tämän asetuksen (Fig. 1 C). Nämä tiedot ovat sopusoinnussa ajatus, että FoxO1 on positiivinen säätelijä autophagy [23], [33], [34]. Tutkia roolia FoxO3a PC3-soluissa, samanlaiset tutkimukset suoritettiin käyttäen siRNA kohdistamista FoxO3a. Yllättäen päinvastainen vaikutus havaittiin, kun tukahduttaminen FoxO3a ilmaisun; siRNA: t kohdistaminen FoxO3a parannettu pohjapinta autophagy samoin kuin aiheuttama rapamysiini, mitattuna lipidoitunut LC3 tasot (Fig. 1 D). Tämä vähennys FoxO3a ilmaisun entisestään autophagy aiheuttama joko seerumin tai glukoosin nälkään (Fig. 1 E), mikä viittaa yleisesti osallistumista FoxO3a säätelyssä autophagy vastauksena ravitsemuksen ja kasvun signaaleja PC3 syöpäsoluja. Induktion autophagy mukaan FoxO3a tukahduttaminen validoitiin kaksi FoxO3a kohdistaminen siRNA (Fig. 1 F), pienenee todennäköisyys tämän ollessa off-tavoite vaikutus. Aiemmat tutkimukset lihasputkia ja fibroblasteissa ovat osoittaneet, että FoxO3a on merkittäviä rooleja edistämisessä autophagy [20], [34]; Siksi tämä tulos viittaa monimutkainen ja solujen asiayhteyskohtaisia ​​roolit FoxO3a säätelyyn autophagy. Se näytti todennäköiseltä, että on olemassa selviä eroja välillä lihas- ja fibroblastisolujen ja epiteelin johdettuja syöpäsoluja tässä asetuksessa. Sen määrittämiseksi, oliko yllättävä negatiivisen säätelyn autophagy mukaan FoxO3a rajoittui PC3 eturauhassyöpäsoluihin, tutkimme vaikutus FoxO3a hiljentämisen HCT116 paksusuolen ja MDA-MB-231 rintasyövän solulinjoissa. Samanlainen havainto PC3-soluissa, knockdovvn FoxO3a johti LC3-II korkeus molemmissa solulinjoissa (Fig. 2A), mikä osoittaa tämän negatiivisen säätelyn autophagy by FoxO3a ei rajoitu yhteen tasyöpäsolulinja.

(A) immunoblot-analyysi lysaatit PC3-soluja, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA (siLuc), tai että kohdistaminen FoxO1 (siFoxO1), kanssa tai ilman rapamysiinin hoitoa. PC3-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA 48 tuntia ennen seuraavaa käsittelyä DMSO, 20 nM tai 100 nm rapamysiini (Rap) 24 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta ja käsittelyyn. (B) PC3-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA 48 h ennen median muutoksen, minkä jälkeen solut altistettiin osoitettuun kasvuolosuhteiden; nämä olosuhteet ovat DMEM: n läsnä (normaali) tai puuttuessa 10% FBS (seerumin -) tai puuttuessa D-glukoosia (10% FBS), kuten on osoitettu. Solut kerättiin 6 tunnin altistuksen jälkeen nämä ehdot, ja käsiteltiin immunoblot analyysi osoittaa proteiineja. (C) knockdovvn FoxO1 kaksi kohdistaminen siRNA estää autophagy PC3-soluissa. (D, E, F) esittävät samoja tutkimuksessa menettelyjä (A, B, C), mutta siRNA kohdistaminen FoxO3a PC3-soluissa. Kaikki kokeet on tehty kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla.

(A) PC3, MDA-MB-231, ja HCT116-solut transfektoitiin ohjaus siRNA (siLuc), tai että kohdistaminen FoxO3a (siFoxO3a). Sen jälkeen solut altistettiin valvoa ajoneuvoon tai 50 uM klorokiinin 72 h transfektion jälkeen 3 h ennen solujen lysaatit valmistelu immunoblot analyysi osoitti proteiineja. (B) Konfokaalimikroskopia MDA-MB231 solujen, jotka ilmentävät stabiilisti tandem loisteputki MRFP-GFP-LC3 transfektion joko ohjaus tai FoxO3a siRNA. Kuvat on otettu 72 h transfektion jälkeen osoitti siRNA. (C) kvantitatiivinen analyysi kuvia esitetyssä kokeessa paneeli B käyttämällä MetaMorph ohjelmistoa määrittämään keskimäärin RFP-positiivisten hiukkasia per solu ohjaus (siLuc) ja siFoxO3a käsiteltyjä soluja. (D) rinnakkaispaikantumisen analyysi RFP ja GFP kuvattu koe paneeli B arvioida autophagic etenemistä. RFP ja GFP rinnakkaispaikantumisen merkitty Pearson Kertoimet analysoitiin ImageJ ohjelmisto. Sekä (C) ja (D), ja gt; 50 solut analysoitiin kullekin tilalle. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. ( ”**”,

p

0,01), ja yksityiskohtaiset menetelmät kuvataan Kokeelliset menettelytavat. (E) PC3-solut transfektoitiin ohjaus siRNA (siLuc), tai että kohdistaminen Atg5 (siAtg5), FoxO3a (siFoxO3a), tai molempien yhdistelmää, kuten on osoitettu. Solut kerättiin talteen 72 h transfektion jälkeen, ja lysaatit käsiteltiin analyysiä varten.

kuvio LC3-I ja LC3-II-tasoja yksin ei ole riittävä kuvaamaan varsinaista autophagy prosessi, joko lisääntynyt aloittamista ja autophagy tai vähentynyt etenemisen autophagy on lysosomaalisen hajoamisen järjestelmä voi johtaa siihen, että korkeus LC3-II-tasoja. Selventää roolia FoxO3a tässä prosessissa, päätimme vaikutus FoxO3a hiljentäminen todellisiin autophagy vuo käyttämällä kahta lähestymistapaa. Yksi lähestymistapa mukana käsittelemällä soluja klorokiinin läsnä ollessa FoxO3a pudotus, joka tehtiin kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa, ts PC3, MDA-MB-231 ja HCT116-soluissa. Tukahduttaminen FoxO3a johti kertymistä LC3-II näissä soluissa; ja lisäksi klorokiinin entisestään lisänneet LC3-II-tasoja, mikä viittaa siihen, että FoxO3a vaimennus lisääntynyt LC3-II kautta autophagy induktion (Fig. 2A). Toinen lähestymistapa mukana mittaus etenemisen autophagosomes osaksi hapan autophagolysosomes konfokaalisella kuvantaminen. MDA-MB-231-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti tandem fluoresenssi proteiinin MRFP-GFP-LC3 transfektoitiin FoxO3a siRNA tai kontrolli-siRNA; myöhemmin, kolokalisaation GFP RFP, indikaattorina autophagosome-lysosomifuusio ja proteiinien hajoamista, tutkittiin [39]. GFP fluoresenssi on labiili happamissa olosuhteissa; siksi menetys vihreää florescence joka havaitaan siirtyy muualle ja RFP peräisin GFP seuraa kasvu happamuutta autophagosomes kun ne kehittyä autophagolysosomes. Tässä järjestelmässä, FoxO3a hiljentäminen ei ainoastaan ​​lisännyt LC3 positiivisia pesäkkeitä, mutta myös vähentää merkittävästi GFP kolokalisaation kanssa RFP, mikä tila nousi autophagy vuon (Fig. 2B, 2C, 2D). Edelleen, siRNA välittämä vähentäminen Atg5 tasojen esti autophagy aiheuttama FoxO3a taintumisen (Fig. 2E), jotka osoittavat, että tukahduttaminen FoxO3a edistää autophagy induktion käytettäessä Atg5 riippuvaisella tavalla. Nämä tiedot selvästi, että vaikka FoxO1 edistää autophagy odotetusti, FoxO3a säätelee negatiivisesti prosessiin näissä syöpäsoluissa, pelaa päinvastainen merkitys.

edelleen testata hypoteesia, että FoxO3a on negatiivinen säätelijä autophagy syöpäsolun linjat, kohdespesifinen pelastus tutkimus suoritettiin PC3-soluissa ektooppinen ilmentyminen FoxO3a (r), joka koodaa samaa proteiinia sekvenssi kuin villin tyypin FoxO3a mutta sisälsi hiljaiset mutaatiot jolloin se vastustuskykyisiä FoxO3a siRNA. Immunoblot-analyysi osoitti, että ektooppinen ekspressio FoxO3a (r) vaimentaa sekä perus- autophagy ja autophagy aiheuttama FoxO3a pudotus, verrattuna, että solut, jotka ilmentävät vektoria ohjaus (Fig. 3A). Syytä huomata, ilmaus muodossa FoxO3a, kutsutaan FoxO3a-3A (sitä ei voi fosforyloida AKT), joka yksinomaan tumassa [20], inhiboi autophagy niin paljon kuin villityypin FoxO3a, että paikallinen sekä tumassa ja sytosolissa (Fig. 3B). Nämä havainnot ehdottivat, että FoxO3a säätelee negatiivisesti autophagy kautta ydin, todennäköisimmin transkription toiminto.

(A) PC3-soluja transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai kohdistaminen FoxO3a; kukin ryhmä soluja myös kotransfektoidaan joko ektooppinen ekspressiovektorilla ohjaus tai että nimenomainen FoxO3a (r). Solulysaatit kerättiin immunoblot 72 tuntia transfektion jälkeen. (B) PC3-solut transfektoitiin 3 eri ekspressioplasmideilla, jotka ovat vektori-Flag-ohjaus, Flag-FoxO3a tai Flag-FoxO3a-3A, vastaavasti; solulysaateista valmistettiin 72 h transfektion jälkeen ja immunoblot-analyysi osoitti proteiineja.

FoxO3a asetuksen autophagy välittyy FoxO1

Todettiin, että pudotus on FoxO3a johti kasvua FoxO1 proteiinin taso (Fig. 4A), nostamalla mahdollisuus, että FoxO1 välittää autophagy induktio päivästä FoxO3a tukahduttaminen. Tutkia suhdetta FoxO1 ja FoxO3a säätelyssä autophagy, me samanaikaisesti tukahdutti ilmaus näiden kahden proteiineja. Samanaikainen knockdovvn FoxO1 paitsi estetty pohjapinta autophagy odotetusti, mutta myös täysin poisti korkeus autophagy aiheuttama FoxO3a taintumisen (Fig. 4A), mikä viittaa siihen, että FoxO1 on välttämätön autophagy induktioon johtuvat FoxO3a tukahduttaminen. Transfektio kaksi eri siRNA: iden kohdistaminen FoxO3a sekä johtanut kohonnut FoxO1 proteiinin taso (Fig. 4B), jotka tekevät mahdollisuus off-tavoite vaikutukset siRNA: iden epätodennäköinen skenaario. Johdonmukaista vaikutusta proteiinin tasot, arviointi transkriptio reaaliaikaisella PCR lisääntyi FoxO1 ilmaisun kanssa FoxO3a taintumisen (Fig. 4C), mikä viittaa siihen, että FoxO3a transkriptionaalisesti säätelee FoxO1 tasolla. Lisäksi solujen käsittely sykloheksimidillä samanaikaisesti FoxO3a pudotus eliminoitu kasvu FoxO1 proteiinin taso (Fig. 4D), joka tarjoaa lisänäyttöä FoxO3a ekspressiota sääteleviä, ei vakautta FoxO1. Yhdessä nämä tiedot tukevat päätelmää, että kasvu FoxO1 johtuva FoxO3a Knockdown todennäköisesti seurausta lisääntynyt transkriptio ja synteesi FoxO1.

(A) PC3-solut transfektoitiin siRNA lusiferaasin (siLuc) , FoxO1 (siFoxO1), tai FoxO3a (siFoxO3a), tai yhdistelmä, kuten on osoitettu. Solut kerättiin talteen 72 h transfektion jälkeen, ja solulysaateista käsitellään immunoblot analyysi osoitti proteiineja. (B) FoxO3a Knockdown kahdella FoxO3a kohdistamista siRNA havainnollistamaan vaikutusta FoxO1 proteiinin tasolla. (C) Reaaliaikainen PCR-analyysi FoxO1 ja FoxO3a mRNA-tasot valvonta siRNA (harmaa) tai FoxO3a siRNA (musta) transfektoiduista soluista. Solut kerättiin ja käsitelty 48 h transfektion jälkeen; 18S ribosomaalinen RNA analysoitiin normalisoinnin ohjaus. Tiedot esitettiin keskiarvona ± S.D. ( ”**”,

p

0,01). (D) PC3-solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai FoxO3a siRNA kuten on osoitettu. Seuraavat 48 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin joko DMSO-kontrollin tai 10 ug /ml sykloheksimidiä 24 h kuten ennen on korjattu immunoblot analyysi osoitti proteiineja. FoxO1 /GAPDH suhde kutakin ehto on esitetyn jälkeen bändi kvantifiointiin ImageJ. (E) Reaaliaikainen PCR-analyysi endogeenisen FoxO1 ekspressiotaso PC3-soluissa, jotka oli transfektoitu joko kontrolliplasmidilla (vektori) tai ilmentävät FoxO3a (r); kussakin ryhmässä plasmidin transfektoitujen solujen joko ohjaus siRNA tai FoxO3a siRNA otettiin samanaikaisesti käyttöön. Solut kerätään RNA valmistelua ja q-PCR-analyysi 72 h transfektion jälkeen; FoxO1 transkriptin tasot analysoitiin, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. 18S käytettiin normalisoinnin ohjaus. Tiedot esitettiin keskiarvona ± S.D. ( ”**”,

p

0,01). Kaikki kokeet on tehty kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia mahdollisia kielteisiä transkription säätelyyn FoxO1 mukaan FoxO3a, me arvioinut FoxO3a ilmentymisen vaikutus endogeeniseen FoxO1 transkriptio. Kun tuodaan PC3 soluihin, suora vaikutus FoxO3a (r) on FoxO1 ilmentymistä havaittiin, tai ilman samanaikaista knockdovvn FoxO3a. Inhiboivaa vaikutusta FoxO3a (r) on pohjapinta FoxO1 ilmentyminen oli vaatimaton, mutta merkittävä. Sen sijaan käyttöön FoxO3a (r) lähes kokonaan hävitetty kasvu FoxO1 transkription indusoi FoxO3a siRNA, tuo sen takaisin lähelle perustasoon (Fig. 4E). Tämä FoxO3a pelastus tutkimus tarjoaa suoraa näyttöä varten FoxO3a eston FoxO1 transkription PC3-soluissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että FoxO3a säätelee negatiivisesti solujen autophagy estämällä transkription FoxO1, positiivisena säätelijänä autophagy ja solujen aineenvaihduntaa.

Korkeus soluliman FoxO1, jotka johtuvat FoxO3a tukahduttaminen, indusoi autophagy

on vakiintunut, että FoxO1 säätelee positiivisesti autophagy jonka kasvu transkriptiota joidenkin autophagy geenejä [23], [24]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat saatu vakuuttavia todisteita siitä, että sytosolin FoxO1 edistää autophagy riippumaton sen transkription sääntelytoiminnan [33], [34]. Tämä nykyinen tutkimus on tähän mennessä osoittaneet, että suppressio FoxO3a kasvoi transkription ja yhteensä FoxO1protein tasolla, joka on syy koholla autophagy. On kuitenkin epäselvää, onko tämä FoxO1 riippuvainen autophagy johtuu pääasiassa sen ydin- tai soluliman toiminto. Meidän pyrkivät määrittelemään tähän kysymykseen käyttämällä muutamia erilaisia ​​lähestymistapoja. Fraktiointi PC3 solulysaattia seuraavat knockdovvn FoxO3a paljastui huomattava nousu sytosolin FoxO1, kun taas määrä ydin- FoxO1 säilyvät ennallaan (kuvio. 5A). Tämä tulos viittaa siihen, että lisääntynyt FoxO1 johtuvat FoxO3a tukahduttaminen enimmäkseen kertyy sytosoliin. Me spekuloida, että tämä pääasiassa sytosolin korkeus FoxO1 oli todennäköinen syyllinen aktivointia autophagy seuraavista FoxO3 Knockdown, sopusoinnussa viime aikoina raportit [33], [34]. Yhdenmukainen jakotislaamalla tutkimuksessa RT-PCR kvantitoimiseksi tunnettuja FoxO kohdegeenien mukana autophagy, kuten Atg4c, Atg7, LC3, Atg12, ja Bnip3, ei havaittu merkittävää kasvua ilmaisun yhteydessä FoxO3a pudotus vaikka FoxO1 nostettiin odotetusti (kuvio . 5B).

(A) PC3-solut transfektoitiin siRNA lusiferaasin (-) tai FoxO3a (siFoxO3a) kuten on osoitettu, ja korjataan immunoblot analyysi osoitti proteiinien 72 h transfektion jälkeen; katso Kokeelliset menetelmät lisätietoja. Histoni H3 ja GAPDH käytettiin latauskontrollina ydin- ja sytosolin proteiineja, vastaavasti. Bändi määrä suhteet, FoxO1 /GAPDH ja FoxO1 /histoni H3, kunkin kunto saatiin käyttämällä ImageJ. (B) Reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisen ilmentymisen tasot ilmoitetaan autophagy liittyvien geenien 48 h transfektion jälkeen PC3-solujen ohjaus siRNA (musta) tai kahden eri siRNA: ita kohdistaminen FoxO3a (vaalean ja tumman harmaa, vastaavasti). Tiedot esitettiin keskiarvona ± S.D. (C, D) yli-ilmentyminen transkriptio toiminto ei käytössä /sytosolin muodossa FoxO1, FoxO1-ADb, lisää autophagy. Määrät LC3 positiivisia rakkulan sekä PC3 (paneeli C) ja H1299 (paneeli D) soluja verrattiin saman analyysin välillä Flag-FoxO1-ADb yli-ilmentävien solujen ja un-transfektoiduissa soluissa. FITC ja rodamiini tagged sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin havaitsemiseen anti-LC3 tai anti-Flag-tag, vastaavasti. Autophagy taso kussakin solussa populaation kvantifioitiin käyttäen MetaMorph ohjelmistot; tiedot piirrettiin oikealla puolella kunkin paneelin. 50 solut analysoitiin kullekin tilalle. Aineisto esitetään keskiarvona ± S.E.M. ( ”**”,

p

0,01).

suoraan arvioida sytosolin FoxO1 on autophagy PC3 syöpäsoluissa, otimme käyttöön soluihin sisältävä ekspressiovektori Flag-merkitty FoxO1 modifioitu on viallinen DNA: ta sitovaa mutaatio, FoxO1-ADb [33]. FoxO1-ADb näin ilmaistuna ei-toiminnallinen, kuten transkriptiotekijän ja kiinnostavaa, lähes yksinomaan lokalisoitu sytosoliin. Molemmissa PC3-soluissa (kuvio. 5C) ja H1299-soluissa (kuvio. 5D), Flag-FoxO1-ADb proteiini yksinomaan lokalisoitu sytosoliin odotetusti [33] ja Flag-FoxO1-ADb ilmentävien solujen (punainen) oli selvästi korkeampi on autophagosomes kuin YK-transfektoiduissa soluissa. Kuva-analyysi osoitti tilastollisesti merkitsevä korkeus autophagosome soluissa, jotka ilmentävät cytosolically lokalisoitu FoxO1. Nämä tiedot tarjoavat suoria todisteita tukemaan käsitystä, että sytosolin kertyminen FoxO1 näissä syöpäsoluissa todellakin edistää autophagy, riippumaton sen ydin- toiminnon.

Sytosoliset FoxO1 välittämää induktio autophagy on riippumaton tukahduttaminen mTORC1 aktiviteetti

mTORC1 on hyvin tunnustettu anturi ravitsemuksen ja kasvutekijän signalointi; se estää autophagy vastauksena kasvuun signalointi. Siksi tutkimme aktiivisuus mTORC1 signaloinnista FoxO1 tai FoxO3a ilmentyminen tukahdutetaan kanssa siRNA. FoxO3a Knockdown johtanut merkittävään korkeus autophagy katsottuna edellä; ei merkittäviä muutoksia rakenteessa fosfo-4EBP1 ja fosfo-S6 havaittiin solujen FoxO3a Knockdown kun autophagy oli merkittävästi indusoi (Fig. 6A, DMSO), mikä viittaa siihen, että nousu autophagy aiheuttamien FoxO3a Knockdown oli todennäköistä ei estämällä mTORC1 . Syytä huomata, FoxO1 pudotus välittämä alaspäin säätely autophagy mukana oli estämällä mTORC1 signaloinnin, joka perustuu sekä fosfo-4EBP1 ja fosfo-S6 kuvioita (Fig. 6B, DMSO), jotka myös tukevat käsitystä, että FoxO sääntely autophagy oli ei välittyvä klassinen mTORC1 signalointi tässä tapauksessa.

(A) PC3-solut transfektoitiin siRNA kohdistaminen FoxO3a kuten. Seuraavat 48 h transfektion jälkeen solut altistettiin rapamysiinin hoitoa 24 tuntia ennen käsittelyä varten immunoblot analyysi osoitti proteiineja. (B) PC3-solut tehtiin samankaltainen tutkimus, kuten on kuvattu (A), paitsi siRNA kohdistaminen FoxO1 käytettiin kuten on osoitettu. Kaikki kokeet on tehty kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla.

edelleen arvioimista vuorovaikutusta mTOR signalointi ja FoxO säädelty autophagy, yhdistimme joko FoxO3a tai FoxO1 Knockdown kanssa rapamysiinin hoitoa PC3-soluissa.