Krooninen sairaus

tiivistelmä

saastuminen normaalien solujen on lähes aina läsnä Tuumorinäytteissä ja vaikuttaa niiden molekyylitason analyysit. DNA: n metylaatio, vakaa epigeneettisiä muutoksia, on riippuvaista solutyypistä ja eri syövän ja normaaleja soluja. Tässä pyrittiin osoittamaan, että DNA: n metylaatio voidaan käyttää arvioimaan osa syöpäsolujen kasvaimen DNA-näytteestä, käyttäen ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) esimerkkinä. Ensinnäkin, jota Infinium HumanMethylation450 BeadChip array, me eristetty kolme genomialuetta (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, ja

RAPGEFL1

) i) erittäin metyloituja neljässä ESCC solulinjoissa, ii) tuskin metyloituja yhdistetyssä näytteessä on ei-syöpä limakalvoja, yhdistettyä näytettä normaalin ruokatorven limakalvojen, ja ääreisvalkosoluista, ja iii) usein metyloitavaa 28 ESCCs (

TFAP2B

, 24/28;

ARHGEF4

, 20/28, ja

RAPGEFL1

, 19/28). Toiseksi, käyttämällä kahdeksan paria syövän ja ei-syöpäsolujen näytettä valmistettiin laser talteenotto mikrodissektion, olemme vahvistaneet, että vähintään yksi kolmesta alueesta oli lähes täysin metyloitu ESCC soluissa, ja kaikki kolme aluetta olivat lähes täysin metyloitumaton ei-syöpä solut. Olemme myös vahvistaneet, että DNA: n kopioiden määrä korjauksilla kolmen alueen 15 ESCC näytteet olivat harvinaisia, ja ei vaikuttanut arvio osa syöpäsoluja. Sitten osa syöpäsolujen kasvaimen DNA-näytteestä määriteltiin korkeimman metylointi tason kolmella alueella, ja varmistimme korkea korrelaatio osa arvioi DNA: n metylaation murto merkki ja osa arvioi patologi (r = 0,85; p 0,001). Lopuksi, havaitsimme, että kun korjaus syöpäsolun sisältöä, CpG saarilla promoottorialueille kasvainten synnyssä oli lähes täysin metyloitu. Nämä tulokset osoittavat, että DNA: n metylaatio voidaan käyttää arvioimaan osa syöpäsolujen kasvaimen DNA-näytteestä.

Citation: Takahashi T, Matsuda Y, Yamashita S, Hattori N, Kushima R, Lee Y-C, et al. (2013) Arvio osa syöpäsolujen kasvaimeen DNA näytteestä DNA Metylointi. PLoS ONE 8 (12): e82302. doi: 10,1371 /journal.pone.0082302

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty 22 lokakuuta 2013 Julkaistu: 02 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Takahashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat kolmannen aikavälin Kattava Cancer Ohjaus strategialle terveysministeriön, Labour and Welfare, Japani (https://www.mhlw.go.jp), ja Project for Development of Innovative Research on Cancer Therapeutics (P- DIRECT) alkaen opetus-, kulttuuri- Sports, Science, and Technology, Japani (https://p-direct.mext.go.jp). T.T. ja Y. M. ovat vastaanottajien Research Resident Fellowship säätiön edistämisen Cancer Research (https://www.fpcr.or.jp). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

saastuminen normaalien solujen, kuten normaali epiteelisolujen, fibroblastit, ja ääreisvalkosoluista, on lähes aina läsnä tuumorin näytteissä. Tällainen saastuminen vaikuttaa tuloksiin syövän genomin analyysien [1-4], ja RNA ilmaisun analyysi [5,6]. Jos osa syöpäsolujen kasvaimen DNA-näyte voidaan helposti arvioida, voidaan tehdä tarkempi analyysi ilman näytteitä, joilla on erittäin alhainen kasvainsolun sisältöä, ja normalisoimalla raakadatan perusteella osa syöpäsoluja. Perinteisesti murto syöpäsolujen kasvaimen näyte on arvioitu patologisen analyysin avulla lähialueiden kohdat. Kuitenkin valmistelu Tällaisten osien on joskus vaikeaa tai mahdotonta johtuen näytteen saatavuuden, ja ennen kaikkea asiantuntija patologit ovat tarpeen tällaisen analyysin.

voittamiseksi näitä kysymyksiä, tekniikoita arvioida murto syöpäsoluja äskettäin kehitetty yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) microarray ja seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) [7-10]. Kanssa SNP mikrosirun, osa syöpäsolut voidaan laskea tunnistamalla genomialuetta kopio numero muutoksia ja mittaamalla aste alleelinen epätasapaino käyttää SNP genomialuetta [7-9]. Jossa NGS, kasvain-mutaatioita voidaan tunnistaa, ja osa syöpäsolut voidaan laskea perustuen mutanttialleelin taajuus [10]. Koska nämä tekniikat kehitettiin alun perin analysoimiseksi SNP tai mutaatioita, ne kärsivät monimutkaisia ​​laskentakaavoja, kalliiden reagenssien, ja olisi tutkittava pariksi normaalia näytteitä.

DNA: n metylaatio on vakaa epigeneettisiä muutoksia, ja jotkut genomiset alueet ovat metyloitu solutyypissä riippuvalla tavalla [11-13]. Syövän ja normaalien solujen, monet genomialuetta raportoidaan differentiaalisesti metyloitavaa monenlaisia ​​syöpiä, ja jotkut niistä ovat kausaalisesti osallisena syövän kehittymisen ja etenemisen [14-18]. Tällaisia ​​differentiaalisesti metyloitu genomialuetta, tiettyjä genomista alueet voivat olla täysin metyloitu syöpäsoluissa, mutta vielä täysin metyloitumaton normaaleissa soluissa, kuten normaali epiteelisolujen, fibroblastit, ja ääreisvalkosoluista. Jos näin on, DNA: n metylaatio tasoilla erityisten genomialueiden voi heijastaa osa syöpäsolujen näytteessä (kuvio 1A), ja tällainen arviointi osa syöpäsolujen DNA-metylaatio voi tulla käyttökelpoinen menetelmä syövän tutkimuksiin.

(A) käsite arviointi osa syöpäsolujen kasvaimen DNA näytteestä DNA: n metylaatio. (B) valinta tietyn genomialueiden, jotka olivat täysin metyloitu ESCC soluissa ja täysin metyloitumaton erilaisissa normaaleissa soluissa, jonka genominlaajuisia metylointianalyysi käyttäen Infinium HumanMethylation450 BeadChip array. Neljätoista CpG sivustot valittiin lopulta, ja ne olivat peräisin 11 genomialuetta. (C) kolme genomista alueilla (TFAP2B,

ARHGEF4

, ja

RAPGEFL1

) valittu komponenttien murto-merkki. Gene rakenne ja sijainti CpG saaren näkyvät yläosassa, ja β arvot CpG sivustoja analysoitiin Infinium helmi array näkyvät. CpG-sivusto tunnistetaan Infinium helmi matriisi on boxed suorakulmio katkoviivalla. CpG kartta ympärillä CpG sivusto (t) tunnistetaan näkyy alareunassa. Pystyjuovasta (kiinteät ja rikki) osoittavat CpG sivustoja ja katkoviivat esittävät CpG kohteissa, joiden β arvot mitattiin helmi array. Suljettu nuolet osoittavat alukkeiden MS-HRMA.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin osoittamaan, että DNA: n metylaatio voidaan käyttää vain murto-merkki estimointiin murto syöpäsolujen kasvaimen DNA-näytteestä, käyttäen ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) näytteiden esimerkkinä. Tätä varten teimme genomin laajuinen metylointianalyysi etsiä tiettyä genomialuetta täysin metyloitu ESCC soluissa ja täysin metyloitumaton erilaisissa normaaleissa soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus suoritettiin hyväksyntää Institutional Review Board of National Cancer Center Hospital, Osaka City University Hospital, ja National Taiwan University Hospital. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikille yksilöille.

Näytteet ja ESCC Solulinjat

Yhteensä 160 ESCC kerättiin National Cancer Center Hospital, Osaka City University Hospital, ja National Taiwan University Hospital. 160 ESCC näytteet koostuivat 39 biopsianäytteissä ja 121 kirurgisista näytteistä. Biopsia näytteet olivat peräisin 39 potilasta, joille tehtiin Endoskooppinen biopsia ja todettiin olevan ESCC (33 uros ja 6 nainen, keski-ikä = 63, vaihteluväli 30-78). Näytteet säilytettiin RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), -80 ° C: ssa. Kirurginen näytteet olivat peräisin 121 potilasta, joilla oli diagnosoitu olevan histologisesti invasiivisia ESCC ja oli tehty esophagectomy (98 mies- ja 23 naaras, keski-ikä = 65, vaihteluväli 41-82). Niistä 121 kirurgisista näytteistä, 25 näytteet saatiin näytteistä upotettiin parafiiniin vahaa jälkeen kiinnitys formaliinilla tai 70% etanolia, ja muut 96 näytteet on saatu näytteistä tallennetaan RNAlater (Applied Biosystems) resektion jälkeen. Lisäksi laser capture mikrodissektion (LCM) suoritettiin kahdeksan kirurgisista näytteistä upotettiin parafiiniin vahaa käyttäen LM200 (Arcturus, Mount View, CA, USA) edellä kuvatulla [19].

neljä ESCC solulinjoissa KYSE30, KYSE50, KYSE220, ja KYSE270 [20] hankittiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani). Genominen DNA uutettiin käyttäen fenoli /kloroformi-menetelmällä.

Genominlaajuiset DNA metylointianalyysi

Genominlaajuiset seulonnasta erilaisesti metyloitua CpG sivustot suoritettiin käyttäen Infinium HumanMethylation450 BeadChip array, joka kattaa 482421 CpG sivustoja (Illumina, San Diego, CA, USA ) kuten aiemmin on kuvattu [21]. 11551 CpG sivustoja sukupuolikromosomeiksi suljettiin, ja loput 470870 CpG sivustoja käytettiin analyysiin. Metylointi taso Jokaisen CpG sivuston edusti β arvo, joka vaihteli 0 (täysin metyloitumaton) 1 (täysin metyloitu).

metylaatioherkät High Resolution Sulamispiste Analysis (MS-HRMA) B

MS-HRMA, ensimmäisen, 1 ug DNA: ta pilkottiin

Bam

HI käsiteltiin natriumbisulfiitin ja suspendoitiin 40 ui: aan TE-puskuria, kuten on kuvattu [22]. Toinen PCR suoritettiin käyttäen 1 ul: n erä natriumbisulfiitin-käsitellyn DNA: n, alukkeiden kykenevät monistamaan sekä metyloidun ja metyloitumattoman DNA: n (taulukko S1) [23], SYBR Green I (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, MD, USA), ja iCycler lämpösyklilaitteeseen (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Kolmanneksi HRMA PCR-tuotteen tehtiin saamiseksi sulamisprofiili PCR-tuotteen piirtämällä fluoresenssin negatiivinen derivaatta lämpötilan mukaan (-dF /d

T

vs.

T

), käyttämällä iCycler Thermal Cycler ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories, Ver. 2.1). Lopuksi, metylaatio taso näytteen arvioitiin vertaamalla sen sulamispiste profiili kuin täysin metyloitu ja metyloitumaton valvonta, sekä seoksia, 0, 20, 40, 60, 80, ja 100% metyloituja valvontaa. Kuten täysin metyloitu ohjaus, genomista DNA: ta käsiteltiin

Sss

I metylaasia (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) käytettiin. Koska täysin metyloitumaton ohjaus, natriumbisulfiitti modifioidun DNA: iden saatu ei-syöpä ruokatorven limakalvojen ilman metylaation analysoitujen alueiden käytettiin.

Perimän DNA Kopioi numero Analysis

Kopioi numero korjauksilla genomialueiden analysoitiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR käyttämällä iCycler lämpösyklilaitteeseen (Bio-Rad Laboratories) kanssa SYBR vihreä I (BioWhittaker Molecular Sovellukset). Määrä DNA-molekyylejä näytteessä mitattiin kolmella alueella, jotka reunustavat kandidaattigeeneihin ja valvonta-geenit [

ALB

(4q13.3),

GAPDH

(12p13) ja

KCNA1

(12p13.32)] sijaitsee kromosomi alueille harvoin kopioluku muutoksia. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S2. Määrä DNA-molekyylejä kolmen kandidaattigeenien normalisoitiin kuin torjunta-geenejä. Normalisoitu määrä DNA-molekyylejä näytteessä verrattiin ihmisen leukosyyttien DNA saada kopioluvun muutoksia. Kaikki analyysi tehtiin kolmena kappaleena. Merkittävät kopioluvun muutoksia (voitto tai tappio) määriteltiin yli 1,5-kertainen tai alle 0,67-kertainen pieneneminen.

Patologiset Analyysi Fraktio Syöpäsolut

Vuodesta parafinoidut kirurgisista näytteistä, sarja viipale kohdissa 3 um paksuus valmistettiin. Yksi osa on värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla, ja loput osat käytettiin DNA: n eristämiseksi. Kokenut patologi (R. K.) arvioitu osa syöpäsolujen mikroskoopilla tarkasteltuna.

TILASTOANALYYSI

Korrelaatio osa syöpäsolujen arvioima osa merkki ja että arvioi patologi analysoitiin Pearsonin tuote-hetki korrelaatiokertoimet. Ero keskimääräisessä jakeet syöpäsolujen analysoitiin Studentin t-testiä, ja ero varianssit syöpäsolun fraktio analysoitiin Levenen testi. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen PASW tilastojen versio 18.0 (SPSS Japan Inc., Tokio, Japani), ja tulokset pidettiin merkittävinä, kun p-arvot 0,05 saatiin kaksipuolinen testi.

Tulokset

valinta tiettyjen alueiden Genominlaajuiset Screening

Genominlaajuiset metylaatio analyysi suoritettiin käyttäen DNA i) 28 ESCCs saatu endoskooppinen biopsia, ii) neljä ESCC solulinjoja (KYSE30, KYSE50, KYSE220, ja KYSE270), iii) ääreisvalkosoluista yhden terveen vapaaehtoisen, iv) altaan normaalin ruokatorven limakalvojen neljä terveillä vapaaehtoisilla, ja v) poolin ei-syöpä ruokatorven limakalvojen kahdeksan ESCC potilailla. Etsimme CpG sivustoja, jotka olivat erittäin metyloituja (β arvo 0,8) kaikissa neljässä ESCC solulinjat ja tuskin metyloitu (β arvo 0,1) perifeerisen veren leukosyyteistä, altaan normaalin limakalvojen, ja poolin ei-syöpä limakalvoja, ja eristetty 2752 CpG sivustoja 470870 informatiivinen CpG sivustoja. Vuodesta 2752 CpG sivustoja, valitsimme 14 CpG sivustoja jonka ilmaantuvuus hypermetylaation (β arvo 0,5) on 28 ESCCs oli yli 50% (kuvio 1 B).

14 CpG sivustoja olivat peräisin 11 genomialuetta, jota määritellään alueiden 500bp mukavuussyistä (taulukko 1). Vuodesta 11 genomialuetta, me ulkopuolelle

SOX2OT

, joka oli raportoitu olevan erittäin monistaa ESCC soluissa [24], ja kolme aluetta ilman tunnettuja geenejä. Seitsemän muilla alueilla, yritimme suunnitella alukkeita MS-HRMA, joka tunnetaan herkkä ja spesifinen menetelmä arvioida DNA metylaatiotasoilla [25]. Pystyimme suunnittelemaan alukkeita kolmesta alueesta (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, ja

RAPGEFL1

) (kuvio 1 C).

No.

Gene symboli

Gene nimi

Chr

nt, numero

Probe ID

Suhde CpG-saarekkeen

kannan geeni

esiintyminen

1

TFAP2B

** Transkriptiotekijän AP-2 beta650791202cg27260772IslandBody2450791419cg22248052IslandBody142

SOX2OT

Sox2 päällekkäisiä transcript3181438216cg05513806S_ShoreBody223

ARHGEF4

** Rho guaniininukleotidiä vaihto tekijä (GEF) 42131792772cg13024709IslandBody204

RAPGEFL1

** Rap guaniininukleotidiä vaihto tekijä (GEF) kaltaisia 11738347603cg20668644IslandBody1938347968cg24903006S_ShoreBody1938347710cg00129651IslandBody145

GRK7

*G proteiini-reseptorin kinaasi 73141516705cg25640519S_ShoreBody186

–

2200327334cg07835424Island-187

–

2119607885cg09385093Island-188

KCNA3

*Potassium jänniteherkkiin kanava, ravistin liittyviä alaperheessä jäsen 31111217194cg20302133Island1stExon159

BCAT1

* haaraketjuaminohapot-happo transaminaasin 1, cytosolic1225055967cg20399616IslandBody1410

KLF16

* Kruppel kaltainen tekijä 16191857004cg04998634IslandBody1411

–

1170630558cg23089825Island -14Table 1. genomialuetta tunnistaa BeadChip analyysi.

HUOMAUTUS:

ilmaantuvuus taajuuden hypermetylaation (βvalue 0,5) 28 ESCCs. ** Alukkeet HRMA onnistuneesti suunniteltu. * Alukkeet HRMA ei suunnitella. CSV Lataa CSV

Arviointi Kolmen Alueet murto Marker

Varmista, että kolme aluetta olivat täysin metyloitumaton ei-syöpäsoluja, ja täysin metyloidut syöpäsoluissa, analysoimme niiden metylaatiotasoilla in i ) kahdeksan LCM-puhdistettu ei-syöpäsolujen näytettä kahdeksan ESCCs, ii) kahdeksan LCM-puhdistettiin syöpäsolujen näytettä kahdeksan ESCCs, iii) kahdeksan ESCCs ennen LCM, iv) ääreisvalkosoluista yhden terveen vapaaehtoisen, ja v) neljä ESCC solulinjoissa (kuvio 2A).

(A) metylointi tasoilla kolmen alueen analysoitiin i) kahdeksan LCM-puhdistettu ei-syöpäsolujen näytettä kolmesta ESCCs, ii) kahdeksan LCM-puhdistettiin syöpäsolujen näytettä kolmen ESCCs, iii) kahdeksan ESCCs ennen LCM, iv) ääreisvalkosoluista yhden terveen vapaaehtoisen, ja v) neljä ESCC solulinjat. Yksi tai useampi kolmesta alueesta olivat lähes täysin metyloitu puhdistettua syöpäsoluissa ja syöpäsolulinjoilla, ja kaikki olivat tuskin metyloituja ei-syöpäsoluja. (B) Kopioi numero korjauksilla kolme aluetta analysoitiin kvantitatiivisella PCR: llä käyttämällä 15 ESCCs.

kahdeksan LCM-puhdistettu ei-syöpäsolujen näytettä ja ääreisvalkosoluista, kaikki kolme aluetta olivat lähes täysin metyloitumaton, ja neljä ESCC solulinjat, ne kaikki olivat täysin metyloitu. Kahdeksan LCM-puhdistettiin syöpäsolujen näytettä, ainakin yksi kolmesta alueesta oli lähes täysin metyloitu. Kuitenkin

TFAP2B

näytteen Et5T,

ARHGEF4

vuonna Et1T, Et2T, Et4T, ja Et5T, ja

RAPGEFL1

vuonna Et2T olleet täysin metyloitu, johtuen mahdollisesti heterogeenisuus syöpäsoluja. Tällaiset alueet eivät sovellu murto merkkiaineena tiettyjä näytteitä. Samaan aikaan alueen korkein metylaation tason LCM-puhdistettu syöpäsolun näytteet osoittivat myös korkeimmalla metylaation taso ESCCs ennen LCM. Siksi korkein metylointi tason kolmella alueella katsottiin heijastaa osa syöpäsolujen ESCCs.

metylaatio tason alueen näytteessä voidaan vaikuttaa kopiomäärä muuttaminen alueella. Siksi olemme analysoineet kopioluvun muutoksia kolmella alueella käyttäen 15 ESCCs (kuvio 2B). Sillä

ARHGEF4

, ei merkittävää kopioluvun muutoksia havaittiin. Sitä vastoin

TFAP2B

ja

RAPGEFL1

merkittäviä kopioluvun muutoksia havaittiin alhaisilla taajuuksilla (

TFAP2B

, 1,64-1,65 kertaiseksi muutoksia kolmessa 15 ESCCs;

RAPGEFL1

, 0,60-kertainen muutos yhdessä 15 ESCCs). Jos oletetaan, että 2-kertaisesti tai 0,5-kertainen kopioluvun muutoksia olivat läsnä syöpäsoluissa, poikkeama mitatun metylaation tason todellisesta osa syöpäsolujen laskettiin olevan pienempi kuin 17,2% (kuvio S1). Myös ilmaantuvuus huomattava kopioluvun korjauksilla

TFAP2B

ja

RAPGEFL1

oli matala (

TFAP2B

, 20%;

RAPGEFL1

, 6,7%) . Siksi vaikutus kopioluvun muutoksia on

TFAP2B

, ja

RAPGEFL1

pidettiin vähän estimoinnissa murto syöpäsoluja. Lopuksi määritellään osa syöpäsolujen kuin korkein metylointi tason kolmella alueella.

Analyysi tarkkuus Murtoluvun Marker

analysoidaan onko syöpäsolun murto arvioima osa merkki todella heijastuu osa syöpäsolujen arvioidaan mikroskoopilla tarkasteltuna. Mittasimme metylaatiotasoilla kolme aluetta 20 ESCCs (kuvio 3A), ja arvioitu osa syöpäsolujen kussakin näytteessä, käyttäen korkeimman arvon kolmella alueella. Vuonna 20 ESCCs,

TFAP2B

,

ARHGEF4

, ja

RAPGEFL1

osoittivat korkeimmat arvot yhdeksässä, yhdeksän, ja kaksi näytettä, vastaavasti. Itsenäisesti, osa syöpäsolujen arvioitiin mikroskooppitarkastelussa leikesarjojen. Pystyimme tarkkailla hyvä korrelaatio näiden kahden menetelmän välillä (r = 0,85; p 0,001) (kuvio 3B). Tämä tulos vahvisti, että osa syöpäsolujen arvioima osa merkintää tarkasti heijastuu todellinen osa syöpäsolujen kasvaimen näytteestä.

(A) metylointi tasot kolmella alueella analysoitiin 20 ESCCs MS-HRMA. Osa syöpäsolujen kussakin näytteessä määriteltiin suurimpana metylaation tason kolmella alueella. (B) välinen korrelaatio osa syöpäsolujen arvioima osa merkki ja arvioinut mikroskoopilla tarkasteltuna. Korrelaatio kahden menetelmän laskettuna Pearsonin tuote-tulomomenttikorrelaatiokertoimen, oli riittävän korkea (r = 0,85).

soveltaminen fraktion Marker

sovellettu osa merkki verrata jakeet syöpäsolujen välillä biopsianäytteissä ja kirurgisista näytteistä. Fraktiot, syöpäsolujen 39 biopsianäytteissä ja 96 kirurgisista näytteistä arvioitiin käyttäen osa markkeri. Niistä 135 näytettä,

TFAP2B

,

ARHGEF4

, ja

RAPGEFL1

oli korkein arvot 60, 37, ja 38 näytettä, vastaavasti, ja korkeimmat arvot määriteltiin kuten jakeet syöpäsolujen näytteissä. Keskimääräinen osa syöpäsolujen biopsianäyttei- (keskiarvo ± SD, 53,5 ± 17,1%, alue, 7,3-86,7%) ei ollut merkittävästi erilainen kuin kirurgisen yksilöt (56,7 ± 18,9%; 14,0-87,3%) (p = 0,377) (kuvio 4A). Varianssit olivat suuria sekä biopsianäytteissä ja kirurgisista näytteistä, ja ei ollut merkittävää eroa biopsianäytteissä ja kirurgisista näytteistä (p = 0,076). Tämä vahvisti, että saastuminen normaaleissa soluissa on pidettävä huolta analysointia varten kasvaimen DNA-näytteiden tuntemattomia syöpäsolun sisältöä.

(A) soveltaminen osa markkerin vertailuun osa syöpäsolujen välillä biopsianäytteissä ja kirurgisista näytteistä. Fraktiot syöpäsolujen 39 biopsianäytteissä ja 96 kirurgisista näytteistä arvioitiin osa markkeri, ja mitään merkittävää eroa ei havaittu. (B) soveltaminen osa markkerin DNA metylointianalyysi. Raaka-β-arvot kaksi CpG-sivustoja [cg22879515 (MIR34B), cg23180938 (CDO1)] korjattiin syöpäsolu sisällön 28 ESCCs. Jotkut ESCCs oli lähes täydellinen metylointi (β arvo ≥ 0,8).

fraktio markkeri sovellettiin myös jättää vaikutus saastumisen normaalien solujen DNA: n metylaatio analyysiin. Tätä tarkoitusta varten valitsimme CpG sivustojen 200 bp transkription aloituspaikkoja (TSS200) kahden kasvaimeen synnyssä (cg22879515 (

MIR34B

) [26], ja cg23180938 (

CDO1

) [27]), ja arvioidaan jakaumat niiden β saadut arvot alkuperäisen genominlaajuisia metylointianalyysi. CpG sivustoja TSS200 kasvainten synnyssä käytettiin, koska niitä ei odoteta olevan mitään tai täydellinen metylointi syöpänäytteissä koska kasvu etu niiden metylaatio. Βvalues ​​Kahden CpG sivustot olivat alle 0,1 reuna leukosyyttien, altaan normaalin limakalvojen, ja poolin ei-syöpä limakalvoja, ja kaksi CpG sivustoja pidettiin lähes kokonaan metyloitumaton normaaleissa soluissa. Raaka-β arvot kaksi CpG-sivustoja ja βvalues ​​korjattu syöpäsolun sisältö [Korjattu β-arvo = β-arvo /(murto-osa ESCC solujen näyte (%) /100)] verrattiin (kuvio 4B). Käyttämällä β arvot korjataan osa merkki, jotkut näytteet osoittivat täydellistä metylaatio (β arvo ≥ 0,8), jotkin näytteet osoittivat lähes metylaatio (β arvo 0,2). Tämä tulos viittaa siihen, että käyttämällä osa merkki, pystyimme minimoida saastumisen normaalien solujen DNA kasvain DNA näytteiden metylointianalyysi.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osa syöpäsolujen käytettäessä ESCC näytteessä onnistuneesti arvioitiin käyttäen DNA metylaatiotasoilla kuin murto merkki. Tämän saavuttamiseksi, me eristetty kolme genomista aluetta (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, ja

RAPGEFL1

), jotka olivat erittäin ja usein metyloitunut ESCC soluissa, mutta ei normaaleissa soluissa , jonka genominlaajuisia metylointianalyysi. Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa osa syöpäsolujen kasvaimen DNA-näyte arvioitiin käyttäen DNA: n metylaation. Äskettäin differentiaalisesti metyloidut genomialuetta syövän ja normaaleja soluja on tunnistettu monia syöpien [14-18]. Siksi voimme odottaa tunnistaa tiettyjä genomialuetta erittäin ja usein metyloitavaa muissa syöpäsolujen, mutta ei normaaleissa soluissa. Mittaamalla DNA: n metylaatio tasoja tällaisia ​​erityisiä genomisten alueiden, osa syöpäsolut voidaan arvioitiin myös DNA-näytteiden muiden syöpien.

tarkkuus osa merkki varmistettiin vertaamalla osa syöpäsolujen arvioima osa markkeri kanssa arvioidaan mikroskoopilla tarkasteltuna. Hyvä tarkkuus tukivat hyvä korrelaatio jakeet syöpäsolujen arvioidaan kahdella eri menetelmällä (r = 0,85). Myös metylaatiotasoilla kahden CpG sivustoja TSS200 kahden kasvaimen synnyssä (

MIR34B

ja

CDO1

) korjattiin, ja jotkut syöpä näytteet osoittivat lähes täydellistä metylaatio. Sirontakuvaajaan analyysi β arvot ennen ja jälkeen korjauksen osoitti, että jotkin näytteistä alhainen β arvot oli huomattava nousu (kuva S2). Käytännössä meidän osa merkki on se etu yli mikroskooppinen tutkimus, koska sitä voidaan käyttää näytteiden ainoastaan ​​DNA ja omistautumista kokenut patologeja ei ole välttämätöntä. Meidän osa merkki on myös etulyöntiasema lähestymistapoja käyttäen SNP mikrosirujen ja NGS, koska sitä voidaan käyttää myös ilman pariksi normaali näytteitä, ja voidaan analysoida suhteellisen helposti ja edullisesti. Siksi käyttö murto merkki on kohtuullisella tarkkuudella, ja käytännön etuja muihin menetelmiin.

Yksi rajoitus myös osa merkki on, että arviointi voidaan vaikuttaa heterogeenisuus syöpäsoluja, koska kolme aluetta eivät ole aina täysin metyloitu syöpäsoluissa. Koska syöpäsolut ovat teoriassa klonaalisen, heterogeenisyys katsottiin johtuvan metylaatio tai demetylaatio aikana syövän etenemisen. Minimoida vaikutus heterogeenisuus syöpäsoluja, kolme aluetta valittiin ne, joilla on korkein ilmaantuvuus hypermetylaation (βvalue 0,5) kesken 28 ESCCs. Meillä on myös vahvistanut, että käyttämällä kahdeksaa pariksi LCM puhdistettiin syöpä ja ei-syöpäsolujen näytettä, ainakin yksi kolmesta alueesta oli lähes täysin metyloitu tahansa syöpäsoluja. Toinen rajoitus on, että kopiomäärä muutokset voivat vaikuttaa arvion. Jos haluat jättää vaikutusten kopioluvun muutoksia koskevan arvion, tutkimme myös kopiomäärä korjauksilla kolmen alueen 15 ESCCs, ja vahvisti, että kopioluvun muutoksia, jotka voivat aiheuttaa suuren poikkeaman arvioimiseksi osa syöpäsolujen ei havaittu näillä kolmella alueella. Näiden ominaisuuksien johdosta, osa merkki on tehty kolmesta alueesta voidaan käyttää valtaosa ESCCs. Lopuksi näyte Et3N, joka on LCM-puhdistettu ei-syöpäsolujen näyte, kolme aluetta olivat hieman metyloituja. Tämän katsottiin johtuvan epätäydellisen puhdistuksen LCM koska rajat syöpäsolun klustereita ja ei-syöpä soluklusterien olivat erittäin epäselviä tässä näytteessä.

Lopuksi, DNA: n metylaatio voidaan käyttää estimoinnin osa syöpäsolujen kasvaimen DNA-näytteestä. Estimointia pidetään käytännöllinen ja tarkka menetelmä molekyylitason analyysi syövän kudosten, joissa normaalit solut ovat lähes aina saastuneet. DNA metylaatio jae markkeri odotetaan olevan erittäin edullinen monin tavoin syöpätutkimukseen.

tukeminen Information

Kuva S1.

Mitattu metylaatio tason ja todellisen osa syöpäsoluja. Olettaen 2-kertainen kopioluvun voitto oli läsnä syöpäsoluissa, todellinen osa syöpäsolujen laskettiin [Mitattu metylointi taso (%) /(200-Mitattu metylaatio taso (%))] x100. Olettaen 0,5-kertainen kopioluvun tappio oli läsnä syöpäsoluissa, todellinen osa syöpäsolujen laskettiin [2xMeasured metylointi taso (%) /(100 + Mitattu metylaatio taso (%))] x100. Poikkeama mitattujen metylaation tason todellisesta osa syöpäsolujen laskettiin olevan pienempi kuin 17,2% sekä 2-kertainen vahvistus ja 0,5-kertainen menetys.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082302.s001

(TIF) B Kuva S2.

vertailu β arvot ennen ja jälkeen korjauksen. Raaka β arvot kaksi CpG sivustoja [cg22879515 (

MIR34B

), cg23180938 (

CDO1

)] korjattiin syöpäsolu pitoisuus 28 ESCCs. X-akseli esittää raaka-β-arvoja, ja y-akseli esittää β-arvot korjauksen jälkeen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082302.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Alukkeet ja olosuhteet MS-HRMA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082302.s003

(DOCX) B Taulukko S2.

Alukkeet ja olosuhteet kvantitatiivinen PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082302.s004

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme herra Mark Glaire varten oikoluku meidän käsikirjoituksen ja National Cancer Center Research Core Facility valmistelua jaostojen parafinoidut kirurgisista näytteistä tässä tutkimuksessa.